NGHIÊN CỨU CHẾ PHẨM DÙNG NGOÀI TRỊ NẤM DA CÓ NGUỒN GỐC TỪ DƯỢC LIỆU

ỦY BAN NHÂN DÂN TP.HCM SỞ KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ BÁO CÁO NGHIỆM THU (Đã chỉnh sửa theo góp ý Hội đồng nghiệm thu) NGHIÊN CỨU CHẾ PHẨM DÙNG NGỒI TRỊ NẤM DA CĨ NGUỒN GỐC TỪ DƯỢC LIỆU CHỦ NHIỆM ĐỀ TÀI PGS TS Nguyễn Đinh Nga CƠ QUAN QUẢN LÝ PGS TS Trịnh Thị Thu Loan CƠ QUAN CHỦ TRÌ THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH THÁNG 12/ 2016 TÓM TẮT NỘI DUNG NGHIÊN CỨU Mục tiêu đề tài bào chế thuốc dùng từ dược liệu trị bệnh da nấm Từ kết công bố chọn thân rễ Riềng nếp, vỏ Bơng móng tay, tinh dầu hương nhu trắng, tinh dầu Nghệ vào nghiên cứu làm thành phần cho chế phẩm Thân rễ riềng nếp vỏ Bơng móng tay chiết xuất để có ngun liệu dầu riềng (DR), cao bơng móng tay (cao BMT) Các nguyên liệu với tinh dầu Hương nhu trắng (TD HNT) tinh dầu Nghệ xác định tác động kháng nấm nấm da, Malassezia Candida phương pháp pha loãng Bằng phương pháp khuếch tán bàn cờ, tìm phối hợp DR-TD HNT (1:10), DR-Methyl lawsonTD HNT (1:100:10) Qua mơ hình thử nghiệm kháng nấm ex vivo, phối hợp DR-TD HNT chọn để nghiên cứu bào chế Phối hợp có số ưu điểm: i) cộng lực kháng nhóm nấm thử nghiệm; ii) giảm hàm lượng DR phối hợp nên tránh kích ứng; iii) có khả thấm tốt qua móng ức chế nấm da Candida; đồng thời kết ex vivo giúp xác định hàm lượng DR chế phẩm 0,26%, TD HNT 2,6% (tính theo khối lượng) DR TD HNT nghiên cứu xây dựng tiêu chuẩn sở để kiểm định nguyên liệu trước đưa vào bào chế Với thành phần cho tác động kháng nấm DR 0,26% TD HNT 2,6%, tá dược nghiên cứu để có cơng thức bản, từ tối ưu hóa để có cơng thức bào chế Gel nhũ tương Từ công thức bào chế 100g gel nhũ tương đạt tiêu chuẩn cảm quan, độ dàn mỏng, độ đồng khối lượng, tính kháng nấm Từ cỡ lơ nâng lên kg 10 kg - Thành phẩm khơng kích ứng da thỏ đạt tiêu chuẩn lô thử nghiệm 100 g Từ kết kiểm định lô thành phẩm, đề nghị tiêu chuẩn sở cho thành phẩm Thành phẩm cỡ lô 10 kg đạt tiêu chí tiêu chuẩn sở Độ ổn định thành phẩm: - Điều kiện cấp tốc: sau tháng theo dõi, thành phẩm đạt tiêu chuẩn pH, tác động kháng nấm không đạt cảm quan - Điều kiện dài hạn: thành phẩm đạt tiêu chuẩn sau thời gian bảo quản 16 tháng I SUMMARY OF RESEARCH CONTENT The aim of this study is to prepare a topical product with medicinal plants that use to cure dermatophycosis causing by fungi From results that were announced, greater galangal rhizome, balsam fruit peel, occimum gratissimum essential oil and curcumin oil were used on researches Galangal rhizome, balsam fruit peel were extracted to have galangal oil and balsam extract These extractions, occimum gratissimum essential oil and curcumin oil were tested for the antifungal activity against dermatophytes, Candida spp and Malassezia spp By using checkerboard method, two combinations between galangal oil - occimum gratissimum essential oil (1:10) and galangal oil-methyl lawson- occimum gratissimum essential oil (1:100:10) shown synergist effect in three testing fungi By using ex vivo model in isolate human nails infected with Candida, we selected the combination galangal oil - occimum gratissimum essential oil (0,26; 2,6)% to prepare a topical medication This combination shows some advantage: i) synergist effect; ii) decrease of galangal oil quantity; iii) can be permeable though nail to effect in C albicans and T rubrum In addition, the results of ex vivo testing may be used in estimating quantity of compounds in medication as 0,26% of galangal oil and 2,6% of occimum gratissimum essential oil By using GC and some tests, the galangal oil and occimum gratissimum essential oil were standardized to use in product Composition of topical medicament with the galangal oil - occimum gratissimum essential oil as principal compounds, the excipients were determined and harmonized standards to have basic formulation From basic formulation, the products in 100 g of batch were prepare, these products attained perceptible, thin level, uniform of mass and the antifungal activity Base on the results, three batches were raised to kg and then 10 kg These products were not irritated rabbid skin and achieved quality standards as batch of 100g From the analysed results of three batches of 10 kg, quality standards for a topical product were suggested The products are stability at room temperature and 75% of relative humidity after 16 months II MỤC LỤC TÓM TẮT NỘI DUNG NGHIÊN CỨU I MỤC LỤC III DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT VI DANH MỤC BẢNG VII DANH MỤC HÌNH ẢNH, SƠ ĐỒ, ĐỒ THỊ X PHẦN MỞ ĐẦU CHƯƠNG TỔNG QUAN 1.1 Bệnh da vi nấm thuốc dùng điều trị 1.1.1 Tỷ lệ bệnh da nấm Việt Nam 1.1.2 Thuốc dùng trị bệnh da nấm 1.2 Một số dược liệu có tác động kháng nấm gây bệnh da 1.3 Tổng quan dược liệu dự kiến đưa vào nghiên cứu 1.3.1 Cây Riềng nếp (Alpinia galanga Swartz Zingiberaceae) 1.3.2 Cây Bơng móng tay 1.3.3 Tinh dầu Hương nhu trắng (TD HNT) 10 1.3.4 Tinh dầu Nghệ 11 CHƯƠNG NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP 12 2.1 Nghiên cứu thành phần cho tác động kháng nấm đưa vào công thức bào chế chế phẩm 12 2.1.1 Kiểm định thân rễ riềng nếp vỏ bơng móng tay mặt thực vật 14 2.1.2 Phương pháp chiết xuất DR cao BMT 16 2.1.3 Xác định hoạt tính kháng nấm DR, cao BMT, tinh dầu nhóm nấm gây bệnh da 18 2.1.4 Nghiên cứu khả phối hợp DR với cao BMT tinh dầu 20 2.1.5 Xác định tác động kháng nấm ex vivo nguyên liệu phối hợp 22 2.2 Xây dựng tiêu chuẩn sở cho nguyên liệu (DR TD HNT) 23 2.2.1 Xây dựng tiêu chuẩn sở cho phân đoạn dầu riềng 24 2.2.2 Xây dựng tiêu chuẩn sở cho tinh dầu hương nhu trắng 30 2.3 Nghiên cứu cơng thức bào chế chế phẩm dùng ngồi trị nấm da 35 2.3.1 Thăm dò cơng thức 35 2.3.2 Các bước tiến hành bào chế 35 2.3.3 Đánh giá thông số trình nghiên cứu 36 III 2.3.4 Thiết kế tối ưu hóa cơng thức 37 2.3.5 Đánh giá độ bề vật lý thành phẩm 38 2.3.6 Đánh giá tính kích ứng da thành phẩm 38 2.3.7 Đánh giá tính kháng nấm in vitro & ex vivo thành phẩm 40 2.3.8 Xây dựng tiêu chuẩn kiểm nghiệm thành phẩm 41 2.4 Nâng cấp cỡ lô từ quy mô thử nghiệm 100 g lên quy mô kg 10 kg 48 2.5 Theo dõi độ ổn định thành phẩm 48 2.5.1 Độ ổn định dài hạn 48 2.5.2 Độ ổn định cấp tốc 48 CHƯƠNG KẾT QUẢ 50 NỘI DUNG NGHIÊN CỨU THÀNH PHẦN CHÍNH CHO TÁC ĐỘNG KHÁNG NẤM ĐƯA VÀO CÔNG THỨC BÀO CHẾ CHẾ PHẨM 50 3.1 Chiết xuất nguyên liệu dự kiến đưa vào nghiên cứu 50 3.1.1 Chiết xuất DR từ thân rễ riềng nếp 50 3.1.2 Chiết xuất cao bơng móng tay 51 3.1.3 Tinh dầu hương nhu trắng 51 3.1.4 Tinh dầu nghệ 52 3.2 Kết quả phối hợp giữa DR với cao BMT tinh dầu 53 3.2.1 Sàng lọc cặp phối hợp có khả bổ sung tác động 53 3.2.2 Khảo sát kiểu phối hợp tỉ lệ phối hợp giữa chất chiết 54 3.3 Tác động kháng nấm ex vivo nguyên liệu 56 3.3.1 Mức độ thấm qua móng đạt nồng độ kháng nấm da chất thử 56 3.3.2 Tác động kháng nấm ex vivo nguyên liệu mơ hình móng nhiễm Candida albicans 57 3.3.3 Tác động kháng vi nấm DR – TD HNT 59 NỘI DUNG XÂY DỰNG TIÊU CHUẨN CƠ SỞ CHO NGUYÊN LIỆU 61 3.4 Tiêu chuẩn hóa DR 61 3.4.1 Phân lập chất đối chiếu từ DR sắc ký cột chân không 61 3.4.2 Xây dựng quy trình định lượng GA dầu riềng sắc ký khí 67 3.4.3 Tác động kháng nấm phân đoạn dầu riềng chủng nấm lâm sàng in vitro 71 3.4.4 Xây dựng tiêu chuẩn sở cho dầu riềng 71 3.5 Tiêu chuẩn hóa tinh dầu hương nhu trắng 73 3.5.1 Xây dựng quy trình định lượng eugenol 73 IV 3.5.2 Thẩm định quy trình định lượng eugenol tinh dầu hương nhu trắng 76 3.5.3 Tác động kháng nấm tinh dầu hương nhu trắng chủng nấm lâm sàng in vitro 79 3.5.4 Xây dựng tiêu chuẩn sở cho tinh dầu hương nhu trắng 80 NỘI DUNG NGHIÊN CỨU CÔNG THỨC 81 3.6 Nghiên cứu công thức 81 3.6.1 Thăm dò cơng thức 81 3.6.2 Thiết kế tối ưu hóa cơng thức 83 NỘI DUNG NÂNG CẤP CỠ LƠ VÀ HỒN THIỆN CÁC BƯỚC BÀO CHẾ 89 Mục tiêu: Ba lô thành phẩm lô 10 kg 89 3.7 Nâng cấp cỡ lơ hồn thiện quy trình bào chế 89 NỘI DUNG CÁC TIÊU CHUẨN CỦA THÀNH PHẨM 92 3.8 Đánh giá tính kháng nấm in vitro & ex vivo thành phẩm 92 3.9 Đánh giá tính kích ứng da 95 3.10 Kết quả xây dựng tiêu chuẩn kiểm nghiệm thành phẩm 96 3.10.1 Tính chất 96 3.10.2 Độ đồng 96 3.10.3 pH 96 3.10.4 Định tính 97 3.10.5 Định lượng eugenol chế phẩm phương pháp HPLC 98 NỘI DUNG ĐỘ ỔN ĐỊNH CỦA THÀNH PHẨM 105 3.11 Kết quả độ ổn định thành phẩm 105 CHƯƠNG KẾT LUẬN 107 NỘI DUNG NGHIÊN CỨU THÀNH PHẦN CHÍNH CHO TÁC ĐỘNG KHÁNG NẤM ĐƯA VÀO CÔNG THỨC BÀO CHẾ CHẾ PHẨM 107 NỘI DUNG XÂY DỰNG TIÊU CHUẨN CƠ SỞ CHO NGUYÊN LIỆU 107 NỘI DUNG NGHIÊN CỨU VÀ TỐI ƯU HĨA CƠNG THỨC CƠNG THỨC 108 NỘI DUNG NÂNG CẤP CỠ LƠ VÀ HỒN THIỆN CÁC BƯỚC BÀO CHẾ 109 NỘI DUNG BẢNG TIÊU CHUẨN THÀNH PHẨM 110 NỘI DUNG THEO DÕI ĐỘ ỔN ĐỊNH CỦA THÀNH PHẨM 110 PHỤ LỤC 111 TÀI LIỆU THAM KHẢO 123 V DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT Tiếng Việt Tiếng Anh 2-methoxy-1,4-napthoquinon 2-methoxy-1,4-napthoquinone Viết tắt MNQ Bơng móng tay BMT Chất chuẩn nội Dầu riềng Galanga acetat Galanga acetate GA Hệ số nồng độ ức chế Fractional inhibitory concentration FIC Hương nhu trắng ketoconazol Nấm da 10 Nồng độ diệt nấm tối thiểu Minimum fungicidal concentration MFC 11 Nồng độ ức chế tối thiểu Minimum inhibitory concentration MIC 12 Phân đoạn PD 13 Phân đoạn dầu riềng PDDR 14 Sắc ký lỏng hiệu cao TT Internal standard IS DR HNT ketoconazole KTZ ND High-performance liquid HPLC chromatography 15 Sắc ký lớp mỏng Thin layer chromatography SKLM 16 Số đơn vị khuẩn lạc Colony forming unit CFU 17 Tinh dầu Hương nhu trắng TDHNT 18 Tinh dầu Trầu không TDTK VI DANH MỤC BẢNG Bảng 1.1 Tác động kháng nấm cao DL tinh dầu Bảng 2.1 Tác động kháng nấm chất chiết xuất dự kiến đưa vào nghiên cứu 13 Bảng 2.2 Tiêu chuẩn sở bột thân rễ riềng nếp 14 Bảng 2.3 Tiêu chuẩn sở vỏ bơng móng tay 15 Bảng 2.4 Nguồn gốc tiêu chuẩn tinh dầu 16 Bảng 2.5 Phương pháp pha lỗng theo hình bàn cờ 21 Bảng 2.6 Các chương trình nhiệt độ khảo sát 25 Bảng 2.7 Cách pha mẫu dung dịch khảo sát tính tuyến tính 26 Bảng 2.8 Các chỉ tiêu cần theo dõi DR 28 Bảng 2.9 Pha dung dịch eugenol để khảo sát tính tuyến tính 32 Bảng 2.10 Pha dung dịch TD HNT eugenol để khảo sát độ 32 Bảng 2.11 Mức độ phản ứng da thỏ 39 Bảng 2.12 Phân loại phản ứng da thỏ 40 Bảng 2.13 Pha dung dịch khảo sát độ tuyến tính 44 Bảng 2.14 Pha dung dịch khảo sát độ xác 45 Bảng 2.15 Pha dung dịch khảo sát độ 45 Bảng 2.16 Các chỉ tiêu thử nghiệm số lượng mẫu cho lô 49 Bảng 2.17 Kế hoạch lấy mẫu khảo sát độ ổn định 49 Bảng 3.1 Kết chiết xuất dầu riềng từ thân rễ riềng nếp 50 Bảng 3.2 Tác động kháng nấm DR 50 Bảng 3.3 Kết chiết xuất cao Bơng móng tay 51 Bảng 3.4 Tác động kháng nấm cao BMT 51 Bảng 3.5 Nồng độ tối thiểu ức chế vi nấm tinh dầu hương nhu trắng chiết xuất cất kéo nước (TD HNT 1) từ Công ty tinh dầu thiên nhiên (TD HNT 2) 52 Bảng 3.6 Tác động kháng nấm tinh dầu nghệ 52 Bảng 3.7 Hiệu phối hợp giữa DR chất vi nấm 53 Bảng 3.8 Hiệu tỷ lệ phối hợp giữa DR - TD HNT Candida, nấm da Malassezia furfur 54 Bảng 3.9 Hiệu kháng nấm da phối hợp DR: methyl lawson 54 Bảng 3.10 Tỷ lệ phối hợp thành phần cho tác dụng hiệp lực Candida albicans, Malassezia furfur T rubrum 55 VII Bảng 3.11 So sánh nồng độ DR, methyl lawson TDHNT riêng rẽ phối hợp 55 Bảng 3.12 Mức độ thấm qua móng chất thử thể qua vòng ức chế T rubrum 56 Bảng 3.13 Sự phát triển vi nấm móng sau tiếp xúc với chất thử 58 Bảng 3.14 Nồng độ MIC MFC chất thử 58 Bảng 3.15 Hiệu kháng nấm phối hợp (DR: TDHNT) 59 Bảng 3.16 Tác động ức chế phát triển C albicans ex vivo 60 Bảng 3.17 Tác động diệt C albicans móng chất thử 61 Bảng 3.18 Kết tách phân đoạn từ dầu Riềng 61 Bảng 3.19 Kết khảo sát hoạt tính kháng nấm phân đoạn tự sinh đồ 62 Bảng 3.20 Kết khảo sát tính tương thích hệ thống 68 Bảng 3.21 Kết khảo sát độ tuyến tính 69 Bảng 3.22 Kết khảo sát độ lặp lại 70 Bảng 3.23 Kết khảo sát độ 70 Bảng 3.24 Tác động kháng chủng nấm men nấm da DR 71 Bảng 3.25 Kết đo tỷ trọng tương đối DR 72 Bảng 3.26 Kết đo chỉ số khúc xạ DR 72 Bảng 3.27 Kết định lượng GA DR 73 Bảng 3.28 Khảo sát chương trình nhiệt độ định lượng eugenol TD HNT 74 Bảng 3.29 Kết khảo sát tính tương thích hệ thống mẫu eugenol chuẩn 76 Bảng 3.30 Kết khảo sát tính tương thích hệ thống mẫu thử 76 Bảng 3.31 Kết khảo sát độ tuyến tính - định lượng eugenol TD HNT 77 Bảng 3.32 Kết khảo sát độ xác 78 Bảng 3.33 Kết khảo sát độ 79 Bảng 3.34 Tác động kháng nấm TD HNT chủng nấm lâm sàng 79 Bảng 3.35 Tiêu chuẩn sở TD HNT 80 Bảng 3.36 Thành phần số công thức thăm dò 81 Bảng 3.37 Kết hoạt tính kháng nấm cơng thức thăm dò 82 Bảng 3.38 Các mức khảo sát biến xi 83 Bảng 3.39 Dữ liệu bào chế kiểm nghiệm theo mơ hình D - Optimal 83 Bảng 3.40 Kết luyện mạng 84 Bảng 3.41 Ảnh hưởng x1, x2 lên biến phụ thuộc y1 85 VIII Bảng 3.42 Ảnh hưởng x2, x3 lên biến phụ thuộc y1 85 Bảng 3.43 Ảnh hưởng x1, x3 lên biến phụ thuộc y1 85 Bảng 3.44 Ảnh hưởng x1, x2 lên biến phụ thuộc y2 86 Bảng 3.45 Ảnh hưởng x1, x3 lên biến phụ thuộc y2 86 Bảng 3.46 Ảnh hưởng x2, x3 lên biến phụ thuộc y2 86 Bảng 3.47 Ảnh hưởng x1, x2 lên biến phụ thuộc y3 87 Bảng 3.48 Ảnh hưởng x1, x3 lên biến phụ thuộc y3 87 Bảng 3.49 Ảnh hưởng x2, x3 lên biến phụ thuộc y3 87 Bảng 3.50 Kết tối ưu hóa phần mềm BC-Pharsoft 88 Bảng 3.51 Kết đánh giá lô thành phẩm cỡ lô 1kg 89 Bảng 3.52 Kết đánh giá tính đồng giữa lơ thành phẩm cỡ lô 10 kg 91 Bảng 3.53 Kết kiểm nghiệm thành phẩm gel nhũ tương chứa DR TDHNT (n=3) 91 Bảng 3.54 MIC thành phẩm hàm lượng chất MIC thành phẩm 92 Bảng 3.55 Đường kính kháng nấm Nizoral thành phẩm vi nấm đối chiếu 93 Bảng 3.56 Đường kính vòng ức chế chế phẩm Nizoral nấm da 94 Bảng 3.57 Kết thử tính kích ứng da thỏ 95 Bảng 3.58 Kết xác định pH chế phẩm 96 Bảng 3.59 Kết khảo sát tính tương thích hệ thống (n=6) 98 Bảng 3.60 Kết khảo sát độ tuyến tính định lương eugenol chế phẩm 99 Bảng 3.61 Kết khảo sát độ xác quy trình định lượng eugenol 101 Bảng 3.62 Kết khảo sát độ quy trình định lượng eugenol 102 Bảng 3.63 Kết kiểm nghiệm chế phẩm chứa DR TD HNT (n=3) 102 Bảng 3.64 Kết khảo sát độ ổn định cấp tốc (Bảo quản: t = 40 oC, RH 75%) 105 Bảng 3.65 Kết khảo sát độ ổn định dài hạn (30 oC, RH 75%) 106 IX Phụ lục Kết quả chiết cao BMT PL 2.1 Hiệu suất chiết cao BMT Mẫu Vỏ quả BMT (g) 10 10 10 10 10 10 Cao BMT (g) 0,0896 0,0862 0,0935 0,0933 0,0927 0,0893 Hiệu suất % 0,896 0,862 0,935 0,933 0,927 0,893 PL 2.2 Hàm lượng methyl lawson cao BMT Mẫu Khối lượng cao BMT (mg) 10,01 10,05 10,04 10,02 10,05 10,03 Delta OD 0,588 0,688 0,663 0,611 0,668 0,615 Hàm lượng methyl lawson cao BMT (µg/ml) (%) 7,83 78,3 8,89 88,9 8,83 88,3 8,14 81,4 8,89 88,9 8,19 81,9 MIC (µg/ml) 16 16-32 32 32 16-32 16 112 Phụ lục Tác động kháng nấm in vitro PDDR, cao BMT tinh dầu PL 3.1 Tác động kháng Candida non albicans in vitro cao chiết tinh dầu Candida non albicans Chủng 020 Chủng 051 Chủng 065 Chủng 100 Chủng 122 Chủng 279 Chủng 463 Chủng 498 Chủng 961 Chủng 969 Chủng 977 Chủng 1185 TD HNT 0,6 0,6 0,6 0,6 0,6 0,6 0,6 0,6 0,6 0,6 0,6 0,6 DR 0,125 0,125 0,125 0,5 0,06 0,06 0,06 0,06 0,06 MIC (mg/ml) TD Nghệ Cao BMT >5 >5 >5 >5 >5 >5 >5 >5 >5 >5 >5 >5 0,016 0,016 0,016 0,016 0,016 0,016 0,008 0,016 0,016 0,008 0,016 0,016 Methyl lawson 0,008 0,016 0,032 0,016 0,016 0,016 0,016 0,016 0,016 0,008 0,016 0,016 KTZ (x 10-3) 0,03 2 0,06 2 0,03 0,03 PL 3.2 Tác động kháng chủng Candida albicans phân lập từ bệnh phẩm cao chiết tinh dầu Chủng nấm Candida albicans ATCC 10231 Chủng 007 Chủng 008 Chủng 032 Chủng 058 Chủng 072 Chủng 079 Chủng 095 Chủng 111 Chủng 115 Chủng 120 Chủng 160 Chủng 219 Chủng 265 Chủng 267 Chủng 323 Chủng 348 Chủng 390 Chủng 492 Chủng 934 Chủng 976 TD HNT 0,6 0,6 0,6 0,6 0,6 0,6 0,6 0,6 0,6 0,6 0,6 0,6 0,6 0,6 0,6 0,6 0,6 0,6 0,6 0,6 0,6 DR 1 1 1 1 2 1 2 2 0,5 0,125 MIC (mg/ml) TD Nghệ Cao BMT >5 >5 >5 >5 >5 >5 >5 >5 >5 >5 >5 >5 >5 >5 >5 >5 >5 >5 >5 >5 >5 0,016 0,016 0,016 0,016 0,016 0,016 0,032 0,016 0,016 0,016 0,016 0,016 0,016 0,016 0,016 0,016 0,016 0,016 0,016 0,016 0,016 Methyl lawson 0,008 0,016 0,008 0,016 0,008 0,016 0,016 0,016 0,016 0,016 0,016 0,016 0,016 0,016 0,016 0,008 0,016 0,008 0,016 0,016 0,016 KTZ (x 10-3) 0,03 16 0,03 0,03 8 0,03 0,03 0,25 0,03 0,25 0,5 0,03 0,25 0,03 16 113 PL 3.3 Tác động kháng Malassezia spp in vitro các cao chiết tinh dầu Chủng nấm M globosa M60 M globosa M61 M sympodialis M9 M sympodialis M11 M sympodialis M19 M sympodialis M26 M sympodialis M44 M sympodialis M45 M sympodialis M46 M sympodialis M47 M sympodialis M50 M sympodialis M52 M sympodialis M53 M sympodialis M54 M sympodialis M56 M sympodialis M57 M sympodialis M58 TD HNT 2,5 2,5 2,5 1,25 1,25 1,25 0,6 0,6 0,6 1,25 0,6 0,6 0,6 0,6 0,6 0,3 2,5 DR 0,008 0,008 0,03 0,015 0,06 0,015 0,03 0,06 0,03 0,125 0,03 0,03 0,03 0,03 0,06 0,03 0,06 MIC (mg/ml) TD Cao Nghệ BMT >5 >5 >5 >5 >5 >5 >5 >5 >5 >5 >5 >5 >5 >5 >5 >5 >5 0,008 0,008 0,008 0,002 0,128 0,016 0,128 0,004 0,004 0,008 0,008 0,016 0,008 0,008 0,016 0,008 0,008 Methyl lawson 0,008 0,008 0,008 0,002 0,128 0,016 0,128 0,004 0,004 0,008 0,008 0,016 0,008 0,008 0,016 0,008 0,008 KTZ (x 10-3) 16 – 32 16 – 32 – 16 2 2 2 2 2 PL3.4 Tác động kháng Malassezia furfur in vitro các cao chiết tinh dầu Chủng nấm M furfur ATCC 44344 M furfur M1 M furfur M4 M furfur M6 M furfur M7 M furfur M8 M furfur M10 M furfur M14 M furfur M15 M furfur M16 M furfur M17 M furfur M20 M furfur M21 M furfur M23 M furfur M30 M furfur M31 TD HNT 0,6 0,6 0,3 0,6 2,5 0,6 2,5 1,25 0,6 0,6 0,6 0,6 1,25 1,25 0,6 1,25 DR 0,125 0,06 0,015 0,03 0,015 0,03 0,015 0,015 0,015 0,015 0,015 0,06 0,015 0,008 0,03 0,06 MIC (mg/ml) TD Cao Nghệ BMT >5 0,128 >5 0,128 >5 0,128 >5 0,008 >5 0,008 >5 0,008 >5 0,008 >5 0,008 >5 0,008 >5 0,008 >5 0,016 >5 0,008 >5 0,008 >5 0,008 >5 0,016 >5 0,016 Methyl lawson 0,128 0,128 0,128 0,008 0,008 0,008 0,008 0,008 0,008 0,008 0,016 0,008 0,008 0,008 0,016 0,016 Ketoconazol (x 10-3) 2 8 2 2 1 114 Chủng nấm M furfur M38 M furfur M40 M furfur M51 M furfur M55 M furfur M59 M furfur M64 M furfur M68 TD HNT 0,6 2,5 0,6 0,6 0,6 2,5 0,6 DR 0,06 0,125 0,03 0,03 0,03 0,06 0,06 MIC (mg/ml) TD Cao Nghệ BMT >5 0,128 >5 0,128 >5 0,128 >5 0,128 >5 0,008 >5 0,008 >5 0,008 Methyl lawson 0,128 0,128 0,128 0,128 0,008 0,008 0,008 Ketoconazol (x 10-3) 2 PL 3.5 Tác động kháng nấm da in vitro các cao chiết tinh dầu Chủng nấm T rubrum D15-57 T rubrum D27-50 T rubrum D43-13 T rubrum D02 T mentagrophytes T simii D37-75 T interdigitale D54-95 T interdigitale D45-15 T interdigitale D38-8 T tonsurans D47-17 T tonsurans D06-31 T tonsurans D02-19 T verucosum D23-44 TD HNT 0,3 0,3 0,6 0,3 0,3 0,3 0,6 0,3 0,6 0,3 0,3 0,6 0,08 PDDR 0,04 0,04 0,01 0,02 0,04 0,02 0,02 0,01 0,01 0,01 0,02 0,01 0,01 MIC (mg/ml) TD Cao Nghệ BMT 1,25 0,002 1,25 0,002 1,25 0,002 1,25 0,002 1,25 0,008 1,25 0,002 2,5 0,008 1,25 0,008 1,25 0,008 2,5 0,002 0,63 0,002 1,25 0,002 1,25 0,002 Methyl lawson 0,001 0,001 0,001 0,002 0,004 0,001 0,004 0,004 0,004 0,001 0,0005 0,001 0,001 Ketoconazol (x 10-3) 4 1 0,5 32 16 16 0,5 1 115 Phụ lục Kết quả khảo sát hiệu quả phối hợp giữa chất chiết PL 4.1 Tỷ lệ phối hợp DR-TD HNT Candida spp Vi nấm MIC riêng rẽ Hàm lượng DR, TD Tỷ lệ phối (µl/ml) HNT PH (µl/ml) hợp (DR: DR TD HNT DR TD HNT TD HNT) C albicans 2,5 1,25 C glabrata ND32 2,5 1,25 C tropicalis PNT31 0,3 1,25 0,6 1,25 1,25 0,16 0,08 0,16 0,08 0,6 0,6 0,6 0,6 0,6 0,3 0,3 1: 2: 2: 1: 1: 1: 1: FIC Kiểu tác động 0,75 1 0,75 0,75 0,5 cộng lực cộng lực cộng lực cộng lực cộng lực cộng lực hiệp lực PL 4.2 Kết phối hợp DR với cao BMT nấm da Vi nấm M gypseum T mentagrophytes MIC riêng rẽ (μl/ml) DR 0,06 0,125 BMT 64 64 Hàm lượng DR, cao BMT / PH (μl/ml) DR BMT 0,015 32 0,03 32 FIC Kiểu tác động 0,75 0,75 Cộng lực Cộng lực PL 4.3 Kết phối hợp DR-TD HNT Vi nấm C albicans M furfur T rubrum T mentagrophytes MIC riêng rẽ (μl/ml) DR 0,5 0,25 0,02 0,04 TD HNT 0,6 0,3 0,3 0,3 Hàm lượng DR, TD HNT PH (μl/ml) DR TD HNT 0,25 0,15 0,125 0,08 0,01 0,08 0,01 0,08 FIC Kiểu tác động 0,75 0,75 0,75 0,5 Cộng lực Cộng lực Cộng lực Hiệp lực PL 4.4 Kết phối hợp DR – TD nghệ trren nấm da Vi nấm M gypseum T rubrum T mentagrophytes MIC riêng rẽ (μl/ml) PDDR 0,025 0,05 0,05 TDN 2,5 2,5 1,25 Hàm lượng DR, TD nghệ/ PH (μl/ml) PDDR TDN 0,013 0,63 0,006 0,6 0,013 0,3 FIC Kiểu tác động 0,75 0,4 0,5 Cộng lực Hiệp lực Hiệp lực 116 Phụ lục Xây dựng quy trình định lượng GA DR sắc ký khí Độ đặc hiệu quy trình định lượng GA DR FID1 A, (MAI19JUN\DC 0012.D) Norm 900 800 700 600 500 400 300 200 100 10 12 14 12 14 12 14 Hình PL 5.1 Sắc ký đồ dung môi FID1 A, (MAI26JUN\TTC00004.D) Norm 900 800 5.420 - Menthol 700 600 500 400 300 200 100 10 Hình PL 5.2 Sắc ký đồ mẫu chuẩn nội FID1 A, (MAI26JUN\TTC00005.D) 10.684 - Gagangal acetate Norm 900 800 700 600 500 400 300 200 100 10 117 Hình PL 5.3 Sắc ký đồ mẫu đối chiếu GA FID1 A, (MAI04JUN\REFE 01.D) Norm 10.691 - Gagangal acetate 900 800 5.424 - Menthol 700 600 500 400 300 200 100 10 12 14 14 14 Hình PL 5.4 Sắc ký đồ mẫu đối chiếu GA có chuẩn nội FID1 A, (GA6JUN13\TEST_B_1.D) Norm 900 10.689 - Gagangal acetate 800 700 600 500 400 300 200 100 10 12 Hình PL 5.5 Sắc ký đồ mẫu thử khơng có chuẩn nội FID1 A, (GA6JUN13\TEST 00.D) Norm 10.689 - Gagangal acetate 900 800 700 5.422 - Menthol 600 500 400 300 200 100 10 12 Hình PL 5.6 Sắc ký đồ mẫu thử có chuẩn nội 118 FID1 A, (MAI26JUN\TTC00002.D) 10.740 - Gagangal acetate Norm 3500 3000 2500 2000 5.418 - Menthol 1500 1000 500 10 12 14 Hình PL 5.7 Sắc ký đồ mẫu thử thêm chất đối chiếu 119 Phụ Lục Độ đặc hiệu quy trình định lượng eugenol GC Hình PL 6.1 Sắc ký đồ mẫu dung mơi pha mẫu Hình PL 6.2 Sắc ký đồ mẫu chuẩn nội (IS) 120 Hình PL 6.3 Sắc ký đồ mẫu eugenol chuẩn Hình PL 6.4 Sắc ký đồ mẫu thử tinh dầu hương nhu trắng Hình PL 6.5 Sắc ký đồ mẫu thử thêm chuẩn 121 Phụ Lục Danh mục thiết bị sử dụng đề tài Hệ thống sắc ký khí HP 6890 công ty cổ phần Dược phẩm OPC Bình Dương, cột mao quản HP INNOWax (30m x 0,32mm x 0,25µm), detector FID Hệ thống sắc ký khí SHIMADZU GC-14B Khoa Dược, Đại Học Y Dược Thành Phố Hồ Chí Minh Máy khuấy Heidolph RZR 2051 (Đức) Máy khuấy Moulinex (Pháp) Máy Emulsify Mixer (Sang-Yuh, Đài Loan) 122 TÀI LIỆU THAM KHẢO TÀI LIỆU TIẾNG VIỆT Hồng Văn Minh (2000), Chẩn đốn bệnh da liễu hình ảnh và cách điều trị, Nhà xuất y học Nguyễn Đinh Nga (2006), Nghiên cứu số thuốc kháng vi nấm gây bệnh lang ben, Đại học Y Dược TP HCM Nguyễn Đinh Nga cs (2011), "Tác dụng kháng Candida albicans in vitro ex vivo 2-methoxy-1,4-naphthoquinon", Y học TP Hồ Chí Minh 15 (PB1), tr 324328 Nguyễn Khắc Viện (1996), "Tình hình bệnh ngồi da bệnh nhân nội trú khoa da liễu Viện quân y 103 từ 6/1993-6/1994", Nội san da liễu 2, tr 6-26 Nguyễn Vũ Giang Bắc cs (2012), "Khảo sát mức độ đáp ứng số chủng nấm da ly trích từ bệnh nhân với ketoconazole", Y học TP Hồ Chí Minh 16 (PB1), tr 90-92 Phạm Hồng Khâm cs (2011), "Một số đặc điểm dịch tễ học bệnh nấm da bệnh viện da liễu bệnh phong Hà Nam ( 9-2009 đến 10-2010)", Y học thực hành (765), tr 86 Tôn Nữ Phương Anh cs (2012), "Nghiên cứu tình hình bệnh nấm da bệnh nhân đến xét nghiệm khoa Ký sinh trùng bệnh viện Trường Đại học Y Dược Huế", Phòng chống sốt rét Trần Việt Hùng (1995), "Góp phần nghiên cứu cấu bệnh ngồi da phòng chống bệnh nấm da số đơn vị đội", Luận văn thạc sĩ y học, tr 1-50 TÀI LIỆU TIẾNG NƯỚC NGOÀI Rowe R C et al (2009), Handbook of pharmaceutical excipients, Pharmaceutical Press; American Pharmacists Association, London; Greyslake, IL; Washington, DC, pp 110-114, 150-151, 247-250, 474-475, 549-553, 592-594, 596-598, 754-755 10 Adebolu T et al (2005), "Antimicrobial activity of leaf extracts of Occimum gratissimum on selected diarrhoea causing bacteria in southwestern Nigeria", African Journal of Biotechnology (7), pp 682-684 11 Ameen M (2010), "Epidemiology of superficial fungal infections", Clinics in dermatology 28 (2), pp 197-201 123 12 Chudiwal A et al (2010), "Alpinia galanga Willd.-An overview on phytopharmacological properties", Indian Journal of natural products and resources (2), pp 143-149 13 da Silva Barros M E et al (2007), "Evaluation of susceptibility of Trichophyton mentagrophytes and Trichophyton rubrum clinical isolates to antifungal drugs using a modified CLSI microdilution method (M38-A)", Journal of medical microbiology 56 (4), pp 514-518 14 Ficker C E et al (2003), "Inhibition of human pathogenic fungi by members of Zingiberaceae used by the Kenyah (Indonesian Borneo)", Journal of ethnopharmacology 85 (2), pp 289-293 15 Gupta P et al (2014), "Evaluating the anti Mycobacterium tuberculosis activity of Alpinia galanga (L.) Willd axenically under reducing oxygen conditions and in intracellular assays", BMC complementary and alternative medicine 14 (1), pp 16 Hemant Khambete et al (2010), "Gelified emulsion for sustain delivery of itraconazole for topical fungal diseases", Internationcal Journal of Pharmacy and Pharmaceutical Sciences (1), pp 104-112 17 ICH Harmonised Tripartite Guideline (2005), Validation of Analytical Procedures: Text and Methodology Q2(R1), International Conference on Harmonisation of Technical Requirements for Registration of Pharmaceuticals for Human Use, Geneva, pp 1-13 18 Jain A et al (2011), "Development of antifungal emulsion based gel for topical fungal infection(s)", IJPRD (03) 19 Janssen A et al (1985), "Acetoxychavicol acetate, an antifungal component of Alpinia galanga", Planta medica 51 (06), pp 507-511 20 Karaca N et al (2004), "In vitro susceptibility testing of dermatophytes: comparison of disk diffusion and reference broth dilution methods", Diagnostic microbiology and infectious disease 48 (4), pp 259-264 21 Kubota K et al (2001),occurrence and antioxidative activity of 1′-acetoxychavicol acetate and its related compounds in the rhizomes of Alpinia galanga during cooking, Food flavors and chemistry: advances of the new millennium Proceedings of the 10th 124 International Flavor Conference, Paros, Greece, 4-7 July 2000., Royal Society of Chemistry, pp 601-607 22 Latha C et al (2009), "Antiplasmid activity of 1′-acetoxychavicol acetate from Alpinia galanga against multi-drug resistant bacteria", Journal of ethnopharmacology 123 (3), pp 522-525 23 Lee D G et al (1999), "Antifungal mechanism of a cysteine-rich antimicrobial peptide, Ib-AMP1, from Impatiens balsamina against Candida albicans", Biotechnology Letters 21 (12), pp 1047-1050 24 Lima E et al (1993), "In vitro antifungal activity of essential oils obtained from officinal plants against dermatophytes", Mycoses 36 (9‐10), pp 333-336 25 Matasyoh L G et al (2007), "Chemical composition and antimicrobial activity of the essential oil of Occimum gratissimum L growing in Eastern Kenya", African Journal of Biotechnology (6) 26 National Committee for Clinical Laboratory (1998), Performance standards for antimicrobial susceptibility testing 8th edition, M100-S8,, NCCLS, Wayne, PA 27 O'Shaughnessy E M et al (2006), "Antifungal interactions within the triple combination of amphotericin B, caspofungin and voriconazole against Aspergillus species", Journal of Antimicrobial Chemotherapy 58 (6), pp 1168-1176 28 Pandey A et al (2011), "Formulation and evaluation of in vitro antimicrobial activity of gel containing essential oils and effect of polymer on their antimicrobial activity", Int J Pharm Pharm Sci (1), pp 234-237 29 Peter K V (2012), Handbook of herbs and spices, Vol 2, Elsevier, pp 304-306 30 Phongpaichit S et al (2005), "Antifungal activities of extracts from Thai medicinal plants against opportunistic fungal pathogens associated with AIDS patients", Mycoses 48 (5), pp 333-338 31 Prabhu K et al (2009), "Ocimum gratissimum: a review of its chemical, pharmacological and ethnomedicinal properties", Open Complement Med J 1, pp 115 32 Rakesh P Patel et al (2009), "Formulation and Evaluation of Carbopol Gel Containing Liposomes of Ketoconazole", International Journal of Drug Delivery Technology (2), pp 42-45 125 33 Reems M R et al (2006), "Ex vivo comparison of one versus two distal screws in mm model 11 interlocking nails used to stabilize canine distal femoral fractures", Veterinary Surgery 35 (2), pp 161-167 34 Shahin M et al (2011), "Optimized formulation for topical administration of clotrimazole using Pemulen polymeric emulsifier", Drug development and industrial pharmacy 37 (5), pp 559-568 35 Silva M et al (2005), "Antifungal activity of Occimum gratissimum towards dermatophytes", Mycoses 48 (3), pp 172-175 36 Smijs T G et al (2007), "A novel ex vivo skin model to study the susceptibility of the dermatophyte Trichophyton rubrum to photodynamic treatment in different growth phases", Journal of Antimicrobial Chemotherapy 59 (3), pp 433-440 37 Venkatesan G et al (2007), "Trichophyton rubrum the predominant etiological agent in human dermatophytoses in Chennai, India", African Journal of Microbiology Research (1), pp 9-12 38 Yang X et al (2001), "Isolation of an antimicrobial compound from Impatiens balsamina L using bioassay‐guided fractionation", Phytotherapy Research 15 (8), pp 676-680 126 ... Việt Nam có nguồn dược liệu phong phú đa dạng vẫn chưa có chế phẩm tiện lợi với giá hợp lý cho người dân, đồng thời sử dụng nguồn nguyên liệu sẵn có nghiên cứu dạng chế phẩm từ dược liệu cần... bệnh da nghề nghiệp công nhân khai thác than khoảng 40,8%, bệnh nấm da có tỷ lệ mắc cao 27,5% 1.1.2 Thuốc dùng trị bệnh da nấm Thuốc dùng trị bệnh da vi nấm đa số thuốc tân dược, thuốc từ dược liệu. .. tài: Nghiên cứu chế phẩm dùng ngồi trị nấm da có nguồn gốc từ dược liệu Chủ nhiệm đề tài: PGS.TS Nguyễn Đinh Nga PGS.TS Trịnh Thị Thu Loan Cơ quan chủ trì: Trung tâm khoa học cơng nghệ Dược Sài