Đang tải... (xem toàn văn)
Sinh học phân tử là khoa học nghiên cứu các hiện tượng sống ở mức độ phân tử. Phạm vi nghiên cứu của môn học này có phần trùng lặp với một số môn học khác trong sinh học đặc biệt là di truyền học và hóa sinh học. Sinh học phân tử chủ yếu tập trung nghiên cứu mối tương tác giữa các hệ thống cấu trúc khác nhau trong tế bào, bao gồm mối quan hệ qua lại giữa quá trình tổng hợp của DNA, RNA và protein và tìm hiểu cách thức điều hòa các mối tương tác này. Hiện nay, sinh học phân tử và sinh học tế bào được xem là nền tảng quan trọng của công nghệ sinh học. Nhờ phát triển các công cụ cơ bản của sinh học phân tử như các enzyme cắt hạn chế, DNA ligase, các vector tạo dòng, lai phân tử, kỹ thuật PCR... sinh học phân tử ngày càng đạt nhiều thành tựu ứng dụng quan trọng.
Vai trò của các RNA trong điều hòa biểu hiện gene miRNA: Thế hệ gene silencer • MicroRNAs (miRNAs): phân tử RNA có chiều dài 19-24 bp • Tham gia vào q trình điều hòa q trình dịch mã mRNA • miRNA thành viên nhóm RNA điều hòa bao gồm small interfering RNA (siRNA) • miRNAs điều hòa biểu gene đích theo kiểu “downstream”, bao gồm yếu tố điều hòa phiên mã, oncogene, gene ức chế ung thư • Người ta phát số lượng lớn miRNA Sự có mặt miRNA khác mô mô ung thư Giới thiệu miRNA • miRNAs đoạn RNA sợi đơn, nhỏ, khơng mã hóa (non-coding RNA) có chiều dài từ 19-24 nt • Gene mã hóa cho miRNA phiên mã từ DNA không dịch mã thành protein • miRNA tạo thành từ phiên mã ban đầu (pri-miRNA) Các pri-miRNA tạo thành cấu trúc “stemloop” gọi pre-miRNA Sau chuyển thành miRNA hoạt động Giới thiệu miRNA • miRNA có khả tác động đến nhiều mRNA • Có khoảng 1.000 miRNA genome người, khoảng 30% gene người điều hòa miRNA • Đối với số gene người, có miRNA liên quan đến điều hòa hoạt động • Hơn 80% miRNA có tính đặc hiệu mơ • miRNA làm “câm” gene đích nhiều chế khác miRNA động vật, thực vật ? • Ở thực vật miRNA bổ sung với mRNA đích gần hồn hảo với khơng có mismatch • Ở động vật đa bào, miRNA bổ sung khơng hồn hảo miRNA tác động đến nhiều vị trí phân tử mRNA nhiều mRNA khác • Ở động vật đa bào, vị trí cơng miRNA vùng đầu 3’ UTR mRNA • Ở thực vật vị trí cơng 3’ UTR vùng CDS Nguồn gốc miRNA • Hầu hết gene mã hóa microRNA nằm vùng intergenic • Gene mã hóa miRNA có promoter điều khiển đơn vị điều hòa riêng • Khoảng 40% gene miRNA nằm vùng intron gene mã hóa protein gene khơng mã hóa protein • 6% miRNA người có tượng sửa chữa RNA “RNA editing” đa dạng miRNA Nguồn gốc • Gene mã hóa cho miRNAs dài nhiều so với phân tử miRNA sau xử lý • Nhiều miRNA nằm intron phân tử pre-mRNA tế bào chủ sử dụng chung yếu tố điều hòa phiên mã, mơ hình biểu (expression profile) • Các gene mã hóa cho miRNA lại phiên mã promoter riêng chúng Ứng dụng miRNA • Việc phát miRNA xem tín hiệu để phát ung thư dự đoán bệnh nguy hiểm • miRNAs xem công cụ điều trị dựa nguyên lý antisense, ức chế oncogene ức chế miRNA • Trong tương lai, liệu phân tích bioinformatics genome, proteome, transcriptome tăng cường hiệu ứng dụng phân tử Sinh tổng hợp miRNA • miRNA phiên mã RNA pol II thành dạng tiền miRNA (pri-miRNA), bước gắn mũ đầu 5’, polyadenin hóa 3’ • pri-miRNA xử lý phức hợp “microprocessor complex” chứa enzyme RNase III Drosha, double-strandedRNA-binding protein, Pasha/DGCR8 • Kết tạo pre-miRNAs khoảng 70-nucleotides gấp lại thành dạng cấu trúc stem-loop khơng hồn hảo Sinh tổng hợp miRNA • pre-miRNA chuyển vào tế bào chất phức hợp karyopherin exportin (Exp5) phức hợp Ran-GTP Ran (ras-related nuclear protein) phức hợp protein nhỏ gắn GTP (thuộc siêu họ RAS) cần thiết cho chuyển RNA proteins thơng qua lỗ nhân • Ran GTPase gắn Exp5 tạo thành phức hợp heterotrimer với pre-miRNAs pre-miRNAs trải qua bước xử lý bổ sung enzyme RNAse III Dicer tạo miRNA RNA sợi kép khoảng 22 nt • Dicer khởi đầu hình thành RNA-induced silencing complex (RISC), RISC chịu trách nhiệm cho việc “câm” gene biểu miRNA RNAi miRNA siRNA Khác biệt siRNA miRNA: • Tiền chất siRNA “long dsRNA” • Tiền chất miRNA dạng RNA hairpin miRNA siRNA • siRNAs thường tổng hợp hóa học sau đưa vào tế bào (21 nt dsRNA) siRNA bắt cặp hồn tồn với gene đích • miRNAs có nguồn gốc nội sinh, trải qua trình xử lý tạo thành miRNA trưởng thành gắn vào mRNA Tuy nhiên, mức độ bổ sung khơng phải 100% Vì miRNA có xu hướng làm giảm trình dịch mã mRNA phá hủy shRNA (short interfering hairpin RNA) • Tiền chất cho miRNA vùng bên phân tử RNA tạo thành cấu trúc hairpin • Khi cấu trúc hairpin bị phân cắt drosha enzyme cấu trúc khơng có “stem loop” với đầu nhơ • Dicer phân cắt tiếp theo, cấu trúc “loop” bị cắt bỏ tạo thành dsRNA dài 21 nt với đầu nhơ • Khi bị phân cắt dicer, tập tính chúng giống siRNA miRNA • Việc phân cắt mRNA ức chế dịch mã mRNA phụ thuộc vào mức độ tương đồng đoạn oligo với mRNA đích siRNA shRNA • shRNA: sử dụng muốn knockdown gene • siRNA: phương pháp ưu tiên cho việc sàng lọc • Với shRNA người dùng cần phải có thao tác phức tạp siRNA: ü cloning ü xác nhận đoạn insert ü điều khiển mức độ biểu shRNA tế bào ü tế bào bị chết số gene bị knockdown ü khó khăn đưa vào tế bào ü Khó kiểm sốt hiểu quy luật với trình tự có cấu trúc loop miRNA siRNA mRNA giữ lại hoặc bị phân giải mRNA bị phân giải miRNA siRNA • Khác với siRNA, miRNA hướng RISC điều hòa giảm mức độ biểu ức chế dịch mã hoạt động siRNAs tham gia vào q trình cắt mRNA • Việc lựa chọn chế cải biến sau phiên mã thường không định nguồn gốc RNA làm câm gene (siRNA hay miRNA), định mức độ bổ sung Nếu miRNA bổ sung hoàn hảo gần bổ sung hồn tồn với gene đích, phân cắt đặc hiệu mRNA • Các miRNA nội sinh (endogenously expressed miRNAs) thường bắt cặp khơng hồn hảo với gene đích ức chế cách can thiệp vào q trình dịch mã miRNA-tham gia điều hòa trình biểu gene Eukaryote Cơ chế ức chế dịch mã của mRNA bởi miRNA Cơ chế ức chế dịch mã mRNA bởi miRNA Ức chế khởi đầu dịch mã Ức chế kéo dài polysome miRNA tham gia vào deadenyl hóa loại bỏ mũ nhờ phức hợp CAF1/CCR4 deadenylase complex Dcp1/2 decapping complex ... Dicer (siRNA, miRNA) Dcr-1 (siRNA, miRNA) Dcr-2 (siRNA) Dcr-1 (siRNA, miRNA) DCL1 (miRNA, siRNA) DCL2 (siRNA, virus) DCL3 (siRNA, heterochroma