Tài liệu thực tập vi sinh

Kháng sinh đồ: là thử nghiệm độ nhạy của KS trong phòng thí nghiệm - E-test - Kirby-Bauer - Pha loãng trong ống nghiệm 2.Nguyên tắc của phương pháp Kirby-Bauer: tẩm KS vào đĩa giấy với n

TÀI LIỆU THỰC TẬP VI SINH

-PHẦN TÓM TẮT LÝ THUYẾT-THỰC HÀNH

KHÁNG SINH ĐỒ

1 Kháng sinh đồ: là thử nghiệm độ nhạy của KS trong phòng thí nghiệm

- E-test

- Kirby-Bauer

- Pha loãng trong ống nghiệm

2.Nguyên tắc của phương pháp Kirby-Bauer: tẩm KS vào đĩa giấy với nồng độ thích hợp sẽ khuếch tán ra mặt thạch chung quanh, ngăn cản sự phát triển của VK

3 Phương pháp Kirby-Bauer:

- Ưu:

+ Phương pháp này dễ làm + Ứng dụng trong VS lâm sàng + Cùng 1 lúc phát hiện được nhiều loại KS

- Nhược:

+ Chỉ định tính

4 Đặc điểm đĩa KS (giấy):

- Đường kính 6mm

- Được bảo quản trong các ống chứa chất bảo quản (hút ẩm) ở t ≤ -40C

- Khi chuẩn bị dùng thì để ở t = 2-80C

5 Môi trường làm KS đồ (Kirby-Bauer): MHA (Muller Hinton Agar)

6 Kích thước mầm cấy (Kirby-Bauer): 108 CFU/ml

7 Độ đục chuẩn: 0.5 Mc Faland (McF) (hoặc so độ đục với dd BaSO4.2H2O)

8 Thời gian ủ khi làm KS đồ: 18-24h/370C

9 Nhìn đĩa KS đọc kết quả:

- Có vòng vô khuẩn : VK nhạy với KS, đo đường kính và dựa vào bảng

+ Nhạy + Trung gian + Kháng

- Không có vòng vô khuẩn: VK kháng KS

10 Tên phương pháp khuếch tán trên đĩa thạch: Kirby-Bauer

11 Lưu ý khi đọc KS đồ theo phương pháp Kirby-Bauer:

- VK mọc sát đĩa giấy, không có vòng vô khuẩn: kháng

- Nếu có 2 vòng vô khuẩn: đọc theo vòng trong (trừ trường hợp sd KS

Sulfonamid và VK cấy là Proteus)

- Có vòng vô khuẩn: đo đường kính so với bảng NCCLS và kết luận

* Lưu ý vòng vô khuẩn:

- Vòng vô khuẩn trong vắt: ???

- Vòng vô khuẩn đục: đề kháng rồi ???

12 Phương pháp pha loãng liên tiếp:

- Ưu: Định lượng (MIC)

- Nhược: tốn công, tốn thời gian, chỉ làm được 1 loại KS

13 Môi trường thực hiện KS đồ theo phương pháp pha loãng liên tiếp: NB

(Nutrient Broth: môi trường dinh dưỡng lỏng)

14 Điều kiện đọc KQ KS đồ theo phương pháp pha loãng liên tiếp:

- Ống 1 phải trong

- Ống 10 phải đục

- Độ trong giảm dần từ ống 1 → 10

- Độ đục tăng dần từ ống 1 → 10

15 KS đồ theo phương pháp E-test:

- Ưu: định tính và định lượng

- Nhược: đắt tiền

VI KHUẨN ĐƯỜNG RUỘT

- Có 3 môi trường phân lập: MC (Mac Conkey), SS (Shigella, Salmonella), EMB (Eosin Methylen Blue)

1 Lý thuyết: tính chất trực khuẩn đường ruột:

- Gr(-), hiếu khí/kị khí tùy nghi

- Đa số di động (1 số không di động như Shigella, Klebsiella)

- Glu(+) (Gas(±))

- Khử Nitrate → Nitrite

- Oxidase (-)

- Lac(±)

2 Thực hành:

* Cho đĩa petri chứa môi trường phân lập:

- MC (Mac Conkey): hồng

+ TT: + Mấy loại khúm vi khuẩn?

+ Lac(+): hồng cánh sen + Lac(-): trắng trong/đục, vàng + LT: + Chất chỉ thị: đỏ trung tính

+ Chất ức chế: muối mật, crystal violet + Lactose

- EMB (Eosin Methylen Blue): tím

+ TT: + Số loại khúm

+ Lac(+): tím than + Lac(-): trong

+ Ánh kim (+): E.coli

+ LT: + Chất chỉ thị, ức chế: Eosin, Methylen Blue

+ Lactose

- SS (Shigella, Salmonella): vàng

+ TT: + Số loại khúm

+ Lac(+): đỏ, hồng + Lac(-): trong + H2S(+): chấm đen ở giữa + LT: + Chất chỉ thị: đỏ trung tính

+ Chất ức chế: Muối mật, Brilliant green

+ Lactose.

* Thử nghiệm hóa sinh:

- Môi trường TSI, KIA (Kliger Iron Agar): có thạch đứng và thạch nghiêng/ sử

dụng kim cấy.

Glu(+),

Lac(+)

Glu(+), Lac(-)

Glu(+), H2S(+)

Glu(+), Gas(+)

Chuẩn

Pseudomonas

+ Riêng môi trường TSI (Triple Suger Iron) có thêm đường Sucrose, giúp tìm ra những VK lên men Lactose chậm (nhiều ngày)

- Môi trường SIM (Sulfide Indole Motility): bán lỏng, khảo sát sự di động, sinh H2S và sinh Indole / sử dụng kim cấy

Ống nghiệm

đục

Không đục ống nghiệm (đục theo đường cấy)

Sau khi nhỏ

TT Kovac’s (+) đỏ

Sau khi nhỏ

TT Kovac’s (-) vàn

H2S(+) màu đen (toàn ống nghiệm → Mot(+)) + Indole: khảo sát sự sinh men Tryptophanase

Tryptophane Indole + Pyruvic acid + Ammonia

Indole + p-dimethylaminobenzaldehyde (Kovac’s) → Dimethylammonium (đỏ)

- Môi trường Citrate (Sodium citrate + Agar): thạch nghiêng / sử dụng vòng cấy.

Thạch nghiêng (L)

Thạch đứng (G)

Cit(+) Cit(-)

Môi trường màu xanh blue

Môi trường màu xanh lá cây + Thử nghiệm khả năng sử dụng được carbon từ muối citrate của VK

+ Chấ chỉ thị: Bromothymol Blue

- Môi trường MR-VP (Methyl Red – Voges Proskauer): môi trường lỏng / sử dụng

vòng cấy.

+ Thử nghiệm Methyl Red: phát hiện VK lên men Glucose mạnh

+ Sau đó cho NaOH 40% để trung hòa acid

+ Thử nghiệm Voges Proskauer: phát hiện VK sử dụng đường Glucose theo hướng khác (sử dụng thuốc thử α-napthol)

- Môi trường Stuart’s Urea Broth: lỏng / sử dụng vòng cấy.

+ Chất chỉ thị: đỏ phenol

+ Xác định VK có sản xuất men Urease không

pH 6,8/ Ure(-) - vàng

Chuẩn pH 8,1/ Ure(+) - đỏ cánh

sen

CẦU KHUẨN GRAM DƯƠNG

Staphylococci

(Tụ cầu khuẩn)

Streptococci

(Liên cầu khuẩn)

Pneumococcus

(Phế cầu khuẩn)

- Hình cầu, xếp thành chùm

- Môi trường MSA chứa 7,5%

NaCl chỉ cho Staphylococci

mọc

- Hình bầu dục, xếp thành chuỗi

- Chỉ mọc trên các môi trường giàu dinh

- Hình mũi giáo, ngọn nến; xếp thành đôi

- Tan trong muối mật

- Test nhạy cảm với Coagulase(+) Coagulase(-)

dưỡng (thạch

máu-BA, thạch nâu-CA)

Optochin → phân biệt phế cầu với liên cầu

MSA

Mannitol(+)

→ vàng

Coagulase(+)

→ S.aureus

MSA Mannitol(-) Coagulase(-)

→

S.epidermidis S.saprophyticu s

Tụ cầu vàng tiết Hemolysin →

tan huyết

Tiết Streptolysin → tiêu hyết

Catalase(+) ≠ liên cầu, phế cầu Catalase(-) Catalase(-)

1 Thử nghiệm Catalase: phân biệt Staphylococci (+) với Streptococci (-).

2 Thử nghiệm Coagulase: phân biệt Staphylococcus aureus với Staphylococci

khác

- Trên lam: tìm Coagulase liên kết

- Trên ống nghiệm: tìm Coagulase tự do

- Kết quả: + Coagulase(+): làm đông đặc huyết tương → S.aureus.

+ Coagulase(-): không làm đông đặc huyết tương

3 Thử nghiệm lên men đường Mannitol: Staphylococci aureus lên men Mannitol,

sinh acid làm đổi màu chỉ thị đỏ phenol từ đỏ sang vàng

- Ống MSA từ đỏ sang vàng: Mannitol(+)

- Ống MSA vẫn giữ màu: Mannitol(-)

4 Thử nghiệm Hemolysin: Staphylococcus aureus sinh Hemolysin ly giải hồng

cầu

- Tiêu huyết (+): xung quanh khúm VK xuất hiện vòng sáng tiêu huyết

5 Thử nghiệm kháng Novobiocin: S.saprophyticus có khả năng đề kháng

Novobiocin

- Đường kính vòng vô khuẩn < 16mm: Staphylococcus saprophyticus.

- Đường kính vòng vô khuẩn > 16mm: Staphylococci Coagulase(-) khác.

6 Taxo A: thử nghiệm nhạy cảm với Bacitracin

- Dùng để phân biệt Streptococcus tiêu huyết β nhóm A.

- Kết quả: - Có vòng vô khuẩn → Streptococcus tiêu huyết β nhóm A.

- Không có vòng vô khuẩn → Taxo A(-)

7 Thử nghiệm CAMP:

- Streptococci nhóm β tiết yếu tố CAMP có tác dụng hiệp đồng tan huyết với β-hemolysin của S.aureus.

8 Taxo P: thử nghiệm nhạy cảm với Optochin

- Dùng để phân biệt Pneumococcus.

- Kết quả: - Đường kính vòng vô khuẩn ≥ 14mm: Pneumococcus

- Đường kính vòng vô khuẩn < 14mm: dùng thí nghiệm tan trong muối mật (Bile Esculin)

CẦU KHUẨN GRAM ÂM (Neisseria)

- Song cầu Gr(-) đứng thành đôi có 2 mặt lõm quay vào nhau

- Có 2 loại thường gây bệnh cho người: N.meningitidis (Menigococcus-màng não cầu) và N.gonorrhoae (Gonococcus-lậu cầu).

- Thử nghiệm lên men đường nhanh: định danh

+ Maltose(+): Menigococcus.

+ Maltose(-): Gonococcus.

ĐỀ THI THỰC TẬP – THAM KHẢO

TRẠM 1:

- Đọc kết quả thí nghiệm Mannitol/MSA (đỏ)

+ Môi trường MSA, chất chỉ thị: đỏ phenol

+ Ủ 350C/18-24h

+ Có VK mọc hay không?

+ Kết quả: + Vàng: Mannitol(+)

+ Đỏ: Mannitol(-) TRẠM 2:

- Đọc thí nghiệm Coagulase/huyết tương (vàng)

+ Môi trường huyết tương

+ Thử nghiệm phân biệt Staphylococcus aureus và các loại Staphylococci

khác

+ Kết quả: + Huyết tương đông vón, lợn cợn: Coagulase(+)

+ Huyết tương lỏng: Coagulase(-) + Chú ý: quan sát KQ trong 10s đầu

TRẠM 3:

- Thí nghiệm tiêu huyết (Hemolysin)/thạch máu

+ Môi trường (BA: Blood Agar)

+ Có VK mọc hay không?

+ Kết quả: + Có vòng sáng quanh khúm VK: (+)

+ Không có vòng sáng: (-) TRẠM 4:

- Thử nghiệm kháng Novobiocin/thạch nâu (CA)

+ Ủ 350C/18-24h

+ Kháng (-): d vòng vô khuẩn ≤ 16mm: Staphylococcus saprophyticus + Nhạy cảm (+): d vòng vô khuẩn > 16mm: Staphylococcus aureus hoặc các

Staphylococci Coagulase(-) khác.

TRẠM 5:

- Thử nghiệm nhạy cảm Bacitracin (Taxo A)

+ Kháng (Taxo A(-)): không có vòng vô khuẩn

+ Nhạy (Taxo A(+)): có vòng vô khuẩn: Streptococcus tiêu huyết β nhóm A.

TRẠM 6:

- Thử nghiệm nhạy cảm Optochin (Taxo P)

+ Dùng để phân biệt Pneumococcus và các Streptococci tiêu huyết α khác (Streptococcus viridans).

+ Kháng (Taxo P(-)): đường kính vòng vô khuẩn < 14mm: làm thêm thử

nghiệm tan trong muối mật (Bile Esculin) để xác định Pneumococcus.

+ Nhạy (Taxo P(+)): đường kính vòng vô khuẩn ≥ 14mm: Pneumococcus.

TRẠM 7:

- Đọc kết quả kháng sinh đồ trên đĩa thạch (Kirby Bauer):

+ Có vòng vô khuẩn → đo đường kính (mm) → nhạy cảm/trung gian/kháng + Không có vòng vô khuẩn → kháng

TRẠM 8:

- Đọc phết VK nhuộm Gram trên KHV:

+ Màu đỏ: Gr(-) / Màu tím: Gr(+)

+ Hình cầu: cầu khuẩn / Hình que: trực khuẩn

+ KQ: cầu/trực khuẩn Gr(±), sắp xếp: rải rác, chuỗi, đôi, chùm (cầu khuẩn); rải rác, bó (trực khuẩn); phẩy khuẩn, xoắn khuẩn (trực khuẩn)

TRẠM 9:

- Đọc KQ cấy vạch 3 chiều xem có bao nhiêu loại khúm?

TRẠM 10:

- Đọc kết quả phết VK kháng nhuộm Gram

+ Trả lời có hay không trực khuẩn kháng acid (Acid Fast Bacilli):

+ AFB(+) + AFB(-) TRẠM 11:

- Đọc KQ môi trường KIA (đỏ)

+ Môi trường: KIA

+ Glucose(+)

+ Lactose(+): vàng / (-): đỏ

+ Gas(+): có lỗ khí, thạch bị đẩy, vỡ / (-): không có khí

+ H2S(+): đen / (-): không đen

TRẠM 12:

- Đọc KQ môi trường Citrate (xanh lá)

+ Citrate(+): xanh dương (pH=7,6)

+ Citrate(-): xanh lá cây (pH=6,9)

TRẠM 13:

- Đọc KQ môi trường Urea (tím sen)

+ Urea(+): mặt khum chất lỏng màu tím đậm

+ Urea(-): mặt khum tím nhạt

TRẠM 14:

- Đọc KQ môi trường SIM (bán lỏng):

+ H2S(+): đen / (-): không đen

+ Di động(+): đục xung quanh đường cấy / (-): không đục xa đường cấy + Indole(+): nhỏ Kovac’s → đỏ / (-): vòng

TRẠM 15:

- Đọc KQ cấy vạch 3 chiều trên môi trường MC:

+ Môi trường: MC

+ Mấy loại khúm

+ Lac(+): đỏ, hồng (nhìn xung quanh khúm) / (-): trắng, vàng

TRẠM 16:

- Đọc KQ môi trường phân lập SS:

+ Môi trường: SS

+ Có mấy loại khúm

+ Lac(+): đỏ, hồng (nhìn xung quanh khúm) / (-): trắng, vàng

+ H2S(+): đen / (-): không đen

TRẠM 17:

- Đọc KQ môi trường phân lập EM: (thạch tím than)

+ Môi trường: EM

+ Mấy loại khúm

+ Lac(+): tím / (-): trong

+ Ánh kim(+): E.coli

CÂU HỎI LÝ THUYẾT

Bài 1: Dụng cụ cơ bản, phương pháp nhuộm Gram, nhuộm Ziehl-Neelsen.

1 Nguyên tắc nhuộm Gram:

- Alcol 950 sẽ tẩy màu của hợp chất “tím Gentian – Iod” của VK Gr(-)

2 Bộ thuốc nhuộm Gram:

- Tím Gentian, Lugol, Alcol 950,Đỏ Safranin

3 VK Gr:

- Gr(+): có 40 lớp Peptidoglycan chiếm 50% vật liệu cấu tạo TB.

- Gr(-): có 1-2 lớp Peptidoglycan chiếm 5-10% vật liệu cấu tạo TB.

4 Nhỏ dầu Cèdre quan sát ở vật kính 100X để tăng độ chiết quang.

5 Tiêu cự là gì:

- Là khoảng cách nhìn rõ nhất từ tiêu bản đến vật kính

6 Tiêu cự các vật kính:

- 10X: 16 mm

- 40X: 4 mm

- 100X: 1 mm

7 Độ phóng đại = độ phóng đại thị kính x độ phóng đại vật kính

8 Dụng cụ cơ bản trong PTN VS gồm: đèn cồn, kim cấy, vòng cấy, ống nghiệm,

hộp Petri.

9 Thời gian trả lời kết quả xét nghiệm VK là 3 ngày.

10 Đặc điểm cấu tạo của trực khuẩn kháng acid:

- Dài, mãnh, bắt màu đỏ

- Kháng lại sự xâm nhập của phẩm nhuộm do có lượng lớn lipid ở lớp cỏ

11 Trực khuẩn kháng acid chỉ bắt màu với thuốc nhuộm Carbonfuchsin.

12 Bộ thuốc nhuộm của phương pháp nhuộm kháng acid:

- Carbonfuchsin, Methylen Blue, Dung dịch acid-alcol (HCl 3% - Alcol 700)

13 Công dụng của dung dịch acid-alcol:

- Tẩy màu Carbonfuchsin của TB biểu mô, bạch cầu

14 Công dụng của Methylen Blue:

- Bắt màu xanh đối với TB biểu mô, bạch cầu

Bài 2: Phân lập vi khuẩn.

1 Nguyên tắc cấy vạch 3 chiều:

- Làm cạn dần mầm cấy

2 Mục đích của việc làm cạn dần mầm cấy:

- Phân lập VK

3 Môi trường cấy vạch 3 chiều:

- NA (Nutrient Agar)

Bài 3: Chỉ tiêu xét nghiệm nước về VSV.

1 Coliform đánh giá tình trạng vệ sinh chung của nguồn nước.

2 Faccal coliform đánh giá vi sinh vật nguồn nước.

3 Faccal streptococci là bằng chứng nguồn nước nhiễm phân.

4 Clostridium perfringens đánh giá chất lượng khử khuẩn mẫu nước.

5 Staphylococcus gây tiêu chảy trong ngộ độc thực phẩm.

Bài 4: Kiểm tra vi sinh không khí.

1 Cho biết các loại VSV mọc trên các môi trường sau:

BA cho tất cả VSV mọc 370C/5-10% CO2/24h

MC cho trực khuẩn Gr(-) mọc 370C/24h

SA cho vi nấm mọc 370C/72h

2 Các môi trường dùng để kiểm tra vi sinh không khí là:

- BA, MC, SA

3 Kể tên các phương pháp kiểm tra vi sinh không khí:

- Phương pháp lắng bụi Koch

- Phương pháp hút bụi bằng màng lọc Gelatin

- Phương pháp hút bụi trực tiếp lên mặt thạch đặt trong máy hút

4 Mục đích kiểm tra vi sinh không khí:

- Phát hiện VSV gây bệnh qua đường hô hấp trong không khí

- Đánh giá tình trạng vệ sinh các cơ sở SX thực phẩm, các cơ sở y tế

- Đánh giá hiệu quả biện pháp khử trùng ở các cơ sở y tết

- Điều tra tình trạng ô nhiễm do VSV có thể gây dịch

Bài 5: Kháng sinh đồ.

1 Kể tên 3 phương pháp làm KSĐ:

- Phương pháp Kirby-Bauer

- Phương pháp pha loãng liên tiếp

- Phương pháp E-Test

2 Kể tên 3 vật liệu chính để làm KSĐ:

- Đĩa KS

- Môi trường

- Huyền dịch VK

3 Môi trường tiêu chuẩn làm KSĐ bằng phương pháp Kirby-Bauer là MHA.

4 Độ đục McFarland là: 0,5 = 108 CFU/ml

5 MIC là nồng độ tối thiểu (µg/ml) ức chế sự phát triển của VK quan sát được

bằng mắy thường.

Bài 6: Vi khuẩn đường ruột.

1 Tính chất chung của Enterobacteriaceae:

- Trực khuẩn Gr(-); đa số di động trừ Shigella, Klebsiella; Glu(+), Oxidase(-).

2 4 loại VK đường ruột gây bệnh thường gặp:

- E.coli (gây tiêu chảy): ETEC, EIEC, EHEC, VTEC

- Shigella (gây lị trực trùng): nhóm A: S.dysenteriae (thường gặp ở VN)

nhóm B: S.flexneri (thường gặp ở VN)

nhóm C: S.boydii nhóm D: S.sonnei

- Salmonella (gây thương hàn).

- Yersinia (gây dịch hạch).

3 Môi trường chuyên chở thường dùng là Cary-Blair.

4 Kể tên 3 môi trường phân lập: MC, EMB, SS

5 Kể tên 5 môi trường sinh hóa: KIA, MR-VP, SIM, Urea, Citrate

6 Quy trình phân lập Enterobacteriaceae:

- Bệnh phẩm → Cary-Blair → EMB, MC, SS → chọn khúm → KIA/TSI:

oxidase(-) → PƯ sinh hóa cơ bản

7 Trong môi trường EMB có ánh kim chắc chắn có E.coli.

8 Trong môi trường KIA nồng độ Glucose/Lactose: 1/10

9 Môi trường TSI khác KIA ở chỗ có thêm đường sucrose.

10 Thạch TSI khảo sát tính chất gì của VK?

- Biết sơ khởi về dạng VK đang phân lập, khảo sát 4 tính chất sinh hóa Glu, Lac, H2S, Gas

11 Thạch TSI khảo sát thêm tính chất gì của VK?

- Tìm ra những VK lên men Lac chậm vì đa số VK đường ruột lên men Lac chậm đều lên men Suc sau 1 ngày

12.Môi trường citrate khảo sát tính chất gì của VK:

- Xem VK có sử được citrate như nguồn năng lượng không

13 Chất chỉ thị trong môi trường Citrate là Bromothymol Blue.

14 Môi trường Urea khảo sát VK có sinh Urease không.

15 Môi trường SIM khảo sát VK có sinh H 2S, Indole, di động không.

16 Phản ứng Indole dùng thuốc thử Kovac’s.

Trắc nghiệm:

1 Công dụng của đèn cồn là

a Khử khuẩn

b Diệt khuẩn

c Bảo vệ

d Tất cả đều đúng

2 Khi mở nắp ống nghiệm phải nghiên ống nghiệm 1 góc:

a 45 0

b 900

c 1350

d 1800

3 Gr(+) khác Gr(-) ở chỗ:

a Lớp lipid

b Lớp biểu bì

c Lớp peptidoglycan

d Lớp mỡ

4 Kích thước của VK được tính bằng đơn vị:

a nm

b mm

c µm

d cm

5 Phương pháp nhuộm Gram còn gọi là phương pháp nhuộm:

a Đơn

b Kép

c Nóng

d Lạnh

6 Phương pháp nhuộm Gram 2 màu tương phản là:

a Đỏ/hồng

b Vàng/đỏ

c Tím/xanh

d Tím/đỏ

7 Phương pháp nhuộm kháng acid có 2 thành phần thuốc:

a Tím/đỏ

b Đỏ/xanh

c Vàng/hồng

d Tím/xanh

8 Mục đích của cấy vạch 3 chiều là gì?

a Nhân chủng VK

b Làm tăng số lượng VK

c Tách rời từng khúm VK riêng

d Dễ nhận dạng

9 Phương pháp nhuộm kháng acid còn được gọi là phương pháp:

a Đơn

b Kép

c Ziehl-Neelsen

d Lạnh

10 Khi đọc kết quả nhuộm Gram:

a Hình dạng

b Màu sắc

c Sắp xếp

d Cả 3