Nghiên cứu bào chế tiểu phân nano artesunat pha tiêm hướng điều trị ung thư (FULL TEXT)

ĐẶT VẤN ĐỀ Artemisinin (ATN) và các dẫn chất như artesunat (ART) là sản phẩm của quá trình chiết xuất và bán tổng hợp từ cây thanh hao hoa vàng Artemisia annua L.. Ngoài tác dụng chống sốt rét, nhiều nghiên cứu gần đây còn cho thấy ART có tác dụng ức chế nhiều dòng tế bào ung thư [26]. Tuy nhiên, ART là dược chất không bền, độ ổn định phụ thuộc nhiều vào các yếu tố như nhiệt độ, độ ẩm, pH cũng như dung môi trong quá trình bào chế và bảo quản. Do đó, nhằm tăng độ ổn định cũng như sinh khả dụng, công nghệ nano có thể được áp dụng. Các dạng bào chế chứa TP nano có khả năng giải phóng thuốc tại đích tác dụng với liều lượng và khoảng thời gian như dự kiến, đặc biệt với các tế bào khối u, kết quả làm tăng hiệu quả điều trị và giảm thiểu độc tính cho cơ thể người bệnh [58]. Bên cạnh liposome, TP nano sử dụng chất mang polyme cũng là một trong những dạng bào chế nano thu hút được khá nhiều nghiên cứu. Một trong những polyme tổng hợp có khả năng phân hủy sinh học được sử dụng khá phổ biến là acid poly (lactic-co-glycolic) (PLGA) do có khả năng kiểm soát và duy trì giải phóng dược chất, độc tính thấp, tương thích sinh học với nhiều mô và tế bào [116]. Ngoài ra, các polyme thân nước như chitosan (CS) hay PEG có thể được sử dụng nhằm thay đổi đặc tính bề mặt của các tiểu phân nano (viết tắt là TP nano) PLGA như tăng cường sự bám dính sinh học hoặc giúp làm giảm sự hoạt hóa bổ thể, giảm sự tương tác bắt giữ bởi các đại thực bào, do đó giúp kéo dài thời gian tuần hoàn của TP nano, tạo cơ hội phân phối thuốc đến các khối u đích và điều chỉnh tỷ lệ giải phóng dược chất [44]. Trên cơ sở đó, luận án đã được thực hiện với tiêu đề ―Nghiên cứu bào chế tiểu phân nano artesunat pha tiêm hướng điều trị ung thư” với các mục tiêu bao gồm: 1. Xây dựng được công thức và quy trình bào chế tiểu phân nano artesunat ở quy mô phòng thí nghiệm; 2. Xây dựng được công thức và quy trình bào chế bột đông khô pha tiêm chứa tiểu phân nano artesunat ở quy mô phòng thí nghiệm; 3. Đề xuất được tiêu chuẩn cơ sở và đánh giá độ ổn định của bột đông khô pha tiêm chứa tiểu phân nano artesunat; 4. Đánh giá được tác dụng ức chế tế bào ung thư in vitro và in vivo của tiểu phân nano artesunat.

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ TRƢỜNG ĐẠI HỌC DƢỢC HÀ NỘI HỒ HOÀNG NHÂN NGHIÊN CỨU BÀO CHẾ TIỂU PHÂN NANO ARTESUNAT PHA TIÊM HƢỚNG ĐIỀU TRỊ UNG THƢ LUẬN ÁN TIẾN SĨ DƢỢC HỌC HÀ NỘI, NĂM 2019 MỤC LỤC LỜI CAM ĐOAN LỜI CẢM ƠN MỤC LỤC DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT DANH MỤC CÁC BẢNG, BIỂU DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ ĐẶT VẤN ĐỀ .1 Chƣơng TỔNG QUAN 1.1 Đại cƣơng artesunat 1.1.1 Công thức 1.1.2 Tính chất vật lý 1.1.3 Các yếu tố ảnh hưởng đến độ ổn định artesunat 1.1.4 Các phương pháp định lượng artesunat 1.1.5 Tác dụng ức chế tế bào ung thư 1.1.6 Cơ chế gây tác dụng ức chế tế bào ung thư 1.2 Tiểu phân nano polyme 1.2.1 Đặc điểm 1.2.2 Một số phương pháp bào chế tiểu phân nano polyme 10 1.2.3 Vài nét việc cải thiện đặc tính bề mặt tiểu phân nano PLGA chitosan PEG 11 1.2.4 Phương pháp đánh giá số đặc tính lý hóa tiểu phân nano 14 1.2.5 Phương pháp đưa tiểu phân nano vào dạng thuốc tiêm 18 1.2.6 Một số nghiên cứu tiểu phân nano PLGA chức hóa bề mặt cách kết hợp với chitosan hay PEG hóa 19 1.3 Ứng dụng công nghệ nano điều trị bệnh ung thƣ 25 1.3.1 Đặc điểm sinh học khối u liên quan đến việc thiết kế hệ mang thuốc nano 25 1.3.2 Đánh giá tác dụng ức chế tế bào ung thư tiểu phân nano 26 1.3.3 Một số chế phẩm nano sử dụng điều trị bệnh ung thư 27 1.3.4 Một số nghiên cứu tác dụng ức chế tế bào ung thư tiểu phân nano chứa dẫn chất artemisinin 28 CHƢƠNG ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 33 2.1 Đối tƣợng nghiên cứu 33 2.1.1 Nguyên liệu 33 2.1.2 Tế bào động vật thí nghiệm 34 2.1.3 Thiết bị nghiên cứu 34 2.2 Địa điểm nghiên cứu 35 2.3 Nội dung nghiên cứu 36 2.4 Phƣơng pháp nghiên cứu 36 2.4.1 Bào chế tiểu phân nano artesunat 36 2.4.2 Đánh giá đặc tính lý hóa tiểu phân nano artesunat 41 2.4.3 Bào chế bột đông khô pha tiêm chứa tiểu phân nano artesunat 46 2.4.4 Đánh giá đặc tính bột đơng khô pha tiêm chứa tiểu phân nano artesunat 47 2.4.5 Theo dõi độ ổn định 52 2.4.6 Đánh giá tác dụng ức chế tế bào ung thư in vitro in vivo 53 2.4.7 Xử lý số liệu 56 CHƢƠNG KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 57 3.1 Kết bào chế tiểu phân nano artesunat 57 3.1.1 Bào chế tiểu phân nano ART/PLGA-CS phương pháp nhũ hóa bốc dung mơi hấp phụ vật lý 57 3.1.2 Bào chế tiểu phân nano ART/PLGA-CS phương pháp phun điện trường 64 3.1.3 Bào chế tiểu phân nano ART/PLGA-PEG 69 3.2 Kết đánh giá đặc tính lý hóa tiểu phân nano artesunat 80 3.2.1 Đối với tiểu phân nano ART/PLGA-CS 80 3.2.2 Đối với tiểu phân nano ART/PLGA-PEG 84 3.3 Kết bào chế bột đông khô pha tiêm chứa tiểu phân nano artesunat 88 3.3.1 Bào chế bột đông khô chứa tiểu phân nano artesunat 88 3.3.2 Bào chế bột đông khô pha tiêm chứa tiểu phân nano artesunat 20 mg 93 3.4 Kết đánh giá đặc tính bột đơng khô pha tiêm chứa tiểu phân nano artesunat 95 3.4.1 Một số đặc tính bột đơng khô pha tiêm chứa tiểu phân nano artesunat 95 3.4.2 Hình thái tiểu phân nano ART/PLGA-PEG sau đơng khơ 96 3.4.3 Phổ nhiễu xạ tia X 96 3.4.4 Phân tích phổ hồng ngoại 97 3.4.5 Phân tích nhiệt vi sai 98 3.4.6 Khả giải phóng hoạt chất in vitro 98 3.5 Kết đề xuất tiêu chuẩn sở độ ổn định bột đông khô pha tiêm chứa tiểu phân nano artesunat 99 3.5.1 Đề xuất tiêu chuẩn sở bột đông khô pha tiêm chứa tiểu phân nano artesunat 99 3.5.2 Độ ổn định bột đông khô pha tiêm chứa tiểu phân nano artesunat 100 3.5.3 Độ ổn định hỗn dịch chứa tiểu phân nano artesunat sau phân tán lại 105 3.6 Kết đánh giá tác dụng ức chế tế bào ung thƣ in vitro tác dụng ức chế khối u in vivo tiểu phân nano artesunat 106 3.6.1 Đánh giá tác dụng ức chế tế bào ung thư in vitro tiểu phân nano artesunat 106 3.6.2 Đánh giá tác dụng ức chế khối u in vivo tiểu phân nano artesunat 110 CHƢƠNG BÀN LUẬN 113 4.1 Bào chế tiểu phân nano artesunat .113 4.1.1 Đối với trường hợp sử dụng PLGA chitosan 113 4.1.2 Đối với trường hợp sử dụng PLGA PEG 119 4.2 Đánh giá đặc tính lý hóa tiểu phân nano artesunat 124 4.2.1 Đối với trường hợp sử dụng PLGA chitosan 124 4.2.2 Đối với trường hợp sử dụng PLGA PEG 126 4.3 Bào chế bột đông khô pha tiêm chứa tiểu phân nano artesunat 128 4.4 Đánh giá đặc tính lý hóa, vi sinh bột đơng khô 133 4.5 Độ ổn định bột đông khô pha tiêm .136 4.6 Tác dụng ức chế tế bào ung thƣ in vitro in vivo 138 4.6.1 Tác dụng ức chế tế bào ung thư in vitro 138 4.6.2 Tác dụng ức chế tế bào ung thư in vivo 141 4.7 Đóng góp luận án 146 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 147 DANH MỤC CÁC CƠNG TRÌNH ĐÃ CÔNG BỐ TÀI LIỆU THAM KHẢO PHỤ LỤC DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT ACN Acetonitril AFM Kính hiển vi lực nguyên tử (Atomic Force Microscopy) ART Artesunat ATN Artemisinin ATNs Artemisinin dẫn chất C6 Coumarin CD Cyclodextrin CS Chitosan DCM Dicloromethan DHA Dihydroartemisinin DMEM Dulbecco's Modified Eagle Medium DMSO Dimethylsulfoxid DNA Acid deoxyribonucleic DSC Phân tích nhiệt vi sai (Differential Scanning Calorimetry) EPR Hiệu ứng tăng tính thấm lưu giữ (Enhanced Permeability and Retention effect) FDA Cục quản lý Dược phẩm Thực phẩm Mỹ (US Food and Drug Administration) FT-IR Phổ hồng ngoại biến đổi Fourier (Fourier transform Infrared Spectroscopy) HPLC Sắc ký lỏng hiệu cao (High performance liquid chromatography) i.p Đường tiêm màng bụng (Intraperitoneal injection) i.v Đường tiêm tĩnh mạch (Intravenous injection) KTTP Kích thước tiểu phân trung bình theo cường độ (Z-Average, Intensity Distribution) LC-MS Sắc ký lỏng, khối phổ (Liquid Chromatography – Mass Spectrometry) LLC Ung thư phổi Lewis chuột (Lewis Lung Cancer) MPS Hệ thực bào đơn nhân (Mononuclear Phagocytic System) NP/s Tiểu phân nano (Nanoparticle/s) PBS Phosphat Buffer Salin PDI Hệ số đa phân tán (Polydispersity Index) PEG Poly ethylen glycol PLGA Acid poly(lactic-co-glycolic) PL Phụ lục PM Hỗn hợp vật lý (Physical mixture) RES Hệ lưới nội mô (Reticulo-Endothelial System) ROS Các gốc oxy hoạt động (Reactive Oxygen Species) SEM Kính hiển vi điện tử quét (Scanning Electron Microscopy) SRB Sulforhodamine B TEM Kính hiển vi điện tử truyền qua (Transmission Electron Microscopy) TP nano Tiểu phân nano XRD Phổ nhiễu xạ tia X (X-Ray Diffraction) DANH MỤC CÁC BẢNG, BIỂU Bảng 1.1 Các nghiên cứu tác dụng ức chế phát triển khối u in vivo chuột artemisinin dẫn chất Bảng 1.2 Một số chế phẩm nano sử dụng điều trị bệnh ung thư 27 Bảng 2.1 Danh mục nguyên liệu, hóa chất sử dụng 33 Bảng 3.1 Ký hiệu mức biến độc lập 59 Bảng 3.2 Ký hiệu, mức biến phụ thuộc điều kiện tối ưu hóa 60 Bảng 3.3 Các công thức thực nghiệm đặc tính lý hóa TP nano ART/PLGA-CS .60 Bảng 3.4 Công thức tối ưu TP nano ART/PLGA-CS 63 Bảng 3.5 Kết số đặc tính lý hóa TP nano ART/PLGA-CS bào chế theo công thức tối ưu (n=3) 63 Bảng 3.6 Các mức thơng số thiết yếu q trình phun điện trường kép tạo TP nano nhân - vỏ ART/PLGA-CS 64 Bảng 3.7 Ký hiệu mức biến độc lập 72 Bảng 3.8 Ký hiệu biến phụ thuộc điều kiện tối ưu hóa 72 Bảng 3.9 Các công thức thực nghiệm bào chế TP nano ART/PLGA-PEG 73 Bảng 3.10 Kết tối ưu hóa phần mềm MODDE 8.0 .77 Bảng 3.11 Một số đặc tính TP nano bào chế theo công thức tối ưu (n=3) 78 Bảng 3.12 Ảnh hưởng phương pháp tinh chế hỗn dịch nano ART 79 Bảng 3.13 So sánh số đặc điểm trình bào chế TP nano PLGA bao CS hay PEG 88 Bảng 3.14 Ảnh hưởng tá dược tạo bánh đến chất lượng sản phẩm đơng khơ .89 Bảng 3.15 Ảnh hưởng thể tích đến hình thức sản phẩm đơng khơ 92 Bảng 3.16 Ảnh hưởng thời gian đông khô đến chất lượng sản phẩm 93 Bảng 3.17 Một số đặc tính bột đơng khơ pha tiêm chứa TP nano ART 95 Bảng 3.18 Đề xuất tiêu chuẩn sở bột đông khô pha tiêm chứa TP nano ART .100 Bảng 3.19 Chỉ tiêu hình thức, thời gian phân tán lại bột đông khô sau thời gian bảo quản điều kiện ± 3oC điều kiện thực (15-35oC, 50-90%) 101 Bảng 3.20 Hàm lượng nước, kích thước tiểu phân phân bố kích thước tiểu phân sau phân tán lại bột đông khô chứa TP nano ART bảo quản điều kiện ± 3oC điều kiện thực (15-35oC, 50-90%) (n=3) 102 Bảng 3.21 Phần trăm hàm lượng ART, giới hạn tạp chất độ vô khuẩn bột đông khô bảo quản điều kiện ± 3oC 103 Bảng 3.22 Độ ổn định hỗn dịch chứa TP nano ART sau phân tán lại điều kiện ± 3oC điều kiện thực (15-35oC, 50-90%) 106 Bảng 3.23 Giá trị IC50 công thức bao PEG tế bào LLC 110 Bảng 3.24 Sự thay đổi khối lượng chuột thí nghiệm dùng đường tiêm tĩnh mạch đuôi (n=6) 110 Bảng 3.25 Sự phát triển khối u tiêm tĩnh mạch .111 DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ Hình 1.1 Cơng thức cấu tạo ART Hình 2.1 Sơ đồ quy trình bào chế tiểu phân nano ART/PLGA-CS 37 Hình 2.2 Minh họa trình phun điện trường kép bào chế TP nano dạng nhân – sợi 38 Hình 2.3 Sơ đồ quy trình tinh chế cột lọc tiếp tuyến 40 Hình 2.4 Sơ đồ quy trình bào chế TP nano ART/PLGA-PEG sử dụng PLGA-PEG 40 Hình 2.5 Bố trí thí nghiệm đánh giá khả ức chế khối u in vivo bột pha tiêm chứa TP nano ART mơ hình chuột gây u dịng tế bào LLC dùng đường tiêm tĩnh mạch đuôi .56 Hình 3.1 Ảnh hưởng tỷ lệ CS PLGA tới KTTP zeta TP nano ART (n=3) 57 Hình 3.2 Ảnh hưởng pH dung dịch CS đến đặc tính lý hóa TP nano ART/PLGA-CS (n=3) 58 Hình 3.3 Ảnh hưởng nhiệt độ hấp phụ CS đến đặc tính lý hóa TP nano ART/PLGA-CS (n=3) 59 Hình 3.4 Hình ảnh mặt đáp KTTP điều kiện khác nhau: nhiệt độ = 25oC (A), pH dung dịch CS = 4,0 (B), tỉ lệ CS/PLGA (kl/kl) = 0,6; zeta TP nano ART/PLGA-CS pH dung dịch CS = 4,0 62 Hình 3.5 Hình ảnh SEM TP nano ART/PLGA-CS đại diện cho công thức FM1-FM4 65 Hình 3.6 Hình ảnh SEM TP nano ART/PLGA-CS đại diện cho công thức FM5-FM8 66 Hình 3.7 Hình ảnh SEM TP nano ART/PLGA-CS đại diện cho công thức FM9-FM12 67 Hình 3.8 Hình ảnh SEM TP nano ART/PLGA-CS đại diện cho công thức: FM13-FM16 68 Hình 3.9 Ảnh hưởng tỷ lệ PLGA-PEG đến đặc tính lý hóa TP nano ART/PLGA-PEG 69 Hình 3.10 Ảnh hưởng tỷ lệ dược chất/polyme đến đặc tính lý hóa TP nano ART/PLGA-PEG 70 ... bốc dung mơi [119]  Nhũ hóa khuếch tán dung mơi Đối với phương pháp này, q trình tạo thành TP nano đòi hỏi việc sử dụng ba pha pha dầu, pha nước, pha pha loãng Đối với dược chất thân dầu, pha. .. khơ pha tiêm chứa TP nano artesunat - Dự thảo tiêu chuẩn sở theo dõi độ ổn định bột đông khô pha tiêm chứa TP nano artesunat - Đánh giá tác dụng ức chế tế bào ung thư in vitro in vivo TP nano artesunat. .. chứa tiểu phân nano artesunat 88 3.3.2 Bào chế bột đông khô pha tiêm chứa tiểu phân nano artesunat 20 mg 93 3.4 Kết đánh giá đặc tính bột đơng khơ pha tiêm chứa tiểu phân nano artesunat