bảo quản lạnh tế bào động vật

Giải đông tế bào Cấy truyền tế bào lớp đơn Nuôi cấy huyền phù tế bào Đông lạnh tế bào... Tiếp tục nuôi cây trong tủ ấm cho đến khí tế bào hình thành lớp đơn sau đó tiến hành cấy truyền

TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG NGHIỆP HÀ NỘI

KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC

NUÔI CẤY DÒNG TẾ BÀO SF9 CỦA

frugiperda)

GVHD TS Nguyễn Hữu Đức

Học viên Nguyễn Hữu Giới

Nguyễn Thị Minh Hiền Nguyễn Thị Nhã

Phạm Thị Hải

Đỗ Thị Thủy Đinh Thị Thanh Tâm

Lê Duy Trung

HÀ NỘI – Tháng 3/2014

 Được tạo ra từ các dòng tế bào IPLB-Sf-21-AE bởi Cherry và Smith tại trường ĐH Texas A &M Dòng tế bào IPLB-Sf-21-AE được phân lập

từ năm 1970 từ mô buồng trứng

nhộng của loài Spodotera frugipera.

 Đặc điểm:

+ Kích thước tế bào nhỏ, đồng đều giúp việc hình thành các lớp đơn và các mảng.

+ Phát triển tốt trong lớp đơn

+Thích ứng với môi trường huyết thanh.

• Dòng tế bào Sf9 rất dễ bị nhiễm virus, có mặt nhiều

ở nhân Autographa california (AcNPV baculovirus),

và có thể được sử dụng là vecto biểu hiện với tất

cả các baculovirus

• Tế bào Sf9 thường được sử dụng để tách và lan

truyền baculoviral tái tổ hợp và để sản xuất protein tái tổ hợp

Mục đích

Giải đông tế bào

Cấy truyền

tế bào lớp đơn

Nuôi cấy huyền phù

tế bào

Đông lạnh tế bào

Môi trường

• Lấy tế bào ra khỏi lớp Nito lỏng hoặc băng khô và rã đông

bằng nước ấm 37 o C không quá 1 phút

• Tế bào sau khi rã đông được đưa vào ống ly tâm và ly tâm 2000v/phút trong 5 – 10 phút Sau khi ly tâm gạn lấy dịch nổi đưa vào trong môi trường nuôi cấy trong tủ ấm ở 27 o C để tế bào bám dính trong 30 - 45 phút.

• Sau khi tế bào bám dính loại bỏ môi trường (sử dụng DMSO)

• Nuôi tế bào trong môi trường mới.

• Sau 24h thay môi trường làm cho khả năng sống lại của tế bào đạt 70 % Tiếp tục nuôi cây trong tủ ấm cho đến khí tế bào hình thành lớp đơn sau đó tiến hành cấy truyền.

Rã đông tế bào

Cấy truyền tế bào lớp đơn

Vật liệu

và thiết bị

Các bước tiến hành

Một số lưu ý

Cấy chuyền tế bào lớp đơn

(Phosphate Buffered Saline

Dulbecco) không chứa Ca,

Mg hoặc phenol đỏ.

 Trypsin.

Các bước thực hiện

 Loại bỏ môi trường cũ từ bình tế bào sơ cấp

 Rửa TB bằng dung dịch DPBS (khoảng 2ml cho 10cm2 diện tích bề mặt)

 Rửa để loại bỏ dung dịch DPBS

 Bổ sung Trypsin khoảng 0,5ml cho 10cm2 bề mặt

 Ủ bình môi trường ở nhiệt độ phòng trong 2 phút

 Quan sát bằng kính hiển vi khi thấy TB tách ra < 90%

TB thì tăng thời gian ủ, Kiểm tra sau 30s Khi >90%

TB đã tách ra thí nghiêng bình để các TB ráo nước

Bổ sung tương đương thể tích môi trường tăng sinh trước khi ủ ấm Loại bỏ môi trường trên bề mặt lớp tế bào bằng pipet nhiều lần

 Chuyển TB vào bình tam giác 15ml và ly tâm 2000xg trong 5 – 10 phút.

 Cho một lượng nhỏ dịch huyền phù TB vào trong môi trường nuôi cấy và loại bỏ một mẫu để đếm

 Xác định tổng số TB

 Pha loãng dịch huyền phù với mật độ phù hợp cho dòng

TB Dùng pipet lấy một lượng thích hợp cho vào bình nuôi mới và cho vào trong tủ ấm

Các bước thực hiện

Một số lưu ý

Nuôi cấy huyền phù tế bào

Cánh quạt thẳng

 Các TB lớp đơn ở pha log đạt mật độ 1 x106 TB /ml

 Loại bỏ các TB từ bình, đếm TB để đảm bảo khả năng

 Khi các TB đạt mật độ 2-2,5 x106 TB /ml bổ sung thêm

môi trường để pha loãng để mật độ TB đạt 1x106 TB /ml trong khoảng 24 – 72 h Cần kiểm tra mật độ và khả năng sống cử TB hàng ngày Khi TB đạt mật độ cho phép thì

có thể chuyển sang bình spinner có thể tích lớn hơn

Các bước tiến hành

 Lưu giữ TB khi mật độ TB đạt 2-2,5 x106 TB /ml và phải đảm bảo mật độ Tb không lớn hơn 4x106 TB /ml và phải giữ mật độ TB ở pha log trên 1 x106 TB /ml

 Không cần thay đổi môi trường khi nuôi TB Cần loại bỏ

TB và bổ sung thêm môi trường để pha loãng đến mật

độ TB thích hợp và cung cấp thêm dinh dưỡng

 Đông lạnh TB ở nồng độ cao Mật độ TB đông lạnh 1x107

TB/ml và khả năng sống 90%

 Luôn luôn sử dụng các môi trường đông lạnh đã được khuyến cáo Môi trường đông lạnh có chứa chất bảo quản lạnh DMSO hoặc glycerol

 Sử dụng các ống trữ lạnh để lưu giữ các TB Các ống này có thể được giữ trong nitơ lỏng hoặc pha khí trong nitơ lỏng

 Các thiết bị phải được vô trùng

Đông lạnh TB

Vật liệu

 Dịch nuôi cấy chứa các TB đang

sinh trưởng ở pha log.

 Môi trường đông lạnh chứa 60%

môi trường Grace 30% FBS

10% DMSO.

 Các chất dùng trong bảo quản

lạnh như DMSO hoặc glycerol

 Chuẩn bị môi trường đông lạnh giữ ở 2 – 8 o C cho đến khi sử dụng.

 Đối với TB lớp đơn, nhẹ nhành tách TB ra khỏi các bình nuôi cấy

 Xác định TB tổng số, tùy theo mật độ TB mong muốn để tính toán lượng môi trường đông lạnh.

 Ly tâm dịch huyền phù TB 1000- 2000xg trong 5 – 10 phút.

 Gạn lấy dịch nổi.

 Đưa các dịch nổi vào môi trường đông lạnh với mật độ thích hợp.

 Phân chia dịch huyền phù TB vào trong các ống trữ lạnh.

 Đông lạnh TB bằng thiết bị điều chỉnh nhiệt độ làm lạnh ,giảm nhiệt độ khoảng 1oC trong 1 phút Ngoài ra đạt các ống trữ lạnh chứa TB trong buồng isopropanol và giữ ở -80 o C qua đêm.

 Chuyển các tế bào đông lạnh vào trong nitơ lỏng, và lưu trữ chúng trong giai đoạn khí trong nitơ lỏng.

Các bước tiến hành

Các yếu tố ảnh hưởng đến

nuôi cấy TB sf9

 Tế bào Sf9 có kích thước đồng đều, dễ thao tác, và hình thành tốt các lớp đơn và các mảng TB

dễ nuôi cấy, không cần CO2 thích hợp với môi trường có bổ sung huyết thanh

Kết luận

 O'Reilly, D R., Miller, L K., and Luckow, V A (1992) Baculovirus Expression Vectors: A Laboratory Manual (New York, N Y.: W H Freeman and Company)

 Vaughn, J L., Goodwin, R H., Tompkins, G J., and McCawley, P (1977) The Establishment of Two Cell

Lines from the Insect Spodoptera frugiperda

(Lepidoptera: Noctuidae) In Vitro 13, 213-217.

 Wickham, T J., Davis, T., Granados, R R., Shuler, M L., and Wood, H A (1992) Screening of Insect Cell Lines for the Production of Recombinant Proteins and Infectious Virus in the Baculovirus Expression System Biotechnol Prog 8, 391-396.

Tài liệu tham khảo

CÁM ƠN SỰ CHÚ Ý LẮNG NGHE CỦA THẦY GIÁO VÀ CÁC BẠN