ĐÁNH GIÁ HIỆU QUẢ CỦA VACCINE CIRCUMVENT PVC TRONG PHÒNG PORCINE CIRCOVIRUS TYPE 2 TRÊN HEO TỪ 84 NGÀY TUỔI ĐẾN XUẤT THỊT

BỘ GIÁO DỤC ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP HỒ CHÍ MINH KHOA CHĂN NI – THÚ Y **************** HUỲNH VĂN TÍN ĐÁNH GIÁ HIỆU QUẢ CỦA VACCINE CIRCUMVENT PVC TRONG PHÒNG PORCINE CIRCOVIRUS TYPE TRÊN HEO TỪ 84 NGÀY TUỔI ĐẾN XUẤT THỊT Khóa luận đệ trình để đáp ứng yêu cầu cấp Bác sĩ ngành Thú y chuyên ngành dược Giáo viên hướng dẫn: ThS NGUYỄN THỊ THU NĂM PGS.TS TRẦN THỊ DÂN KS NGUYỄN ĐÌNH HỊA Tháng 2/2010 i XÁC NHẬN CỦA GIÁO VIÊN HƯỚNG DẪN Họ tên sinh viên thực tập: Huỳnh Văn Tín Tên luận văn: “Đánh giá hiệu vaccine Circumvent PCV phòng Porcine Circovirus Type heo từ 84 ngày tuổi đến xuất thịt” Đã hoàn thành luận văn theo yêu cầu giáo viên hướng dẫn ý kiến nhận xét, đóng góp Hội Đồng chấm thi tốt nghiệp Khoa ngày…/…/2010 Giáo viên hướng dẫn ThS Nguyễn Thị Thu Năm ii LỜI CẢM TẠ  Để có ngày hơm Con xin thành kính ghi ơn ba mẹ, người hết lòng chăm sóc, lo lắng ni dạy nên người  Tơi xin bày tỏ lòng nhớ ơn sâu sắc đến PGS.TS Trần Thị Dân, ThS Nguyễn Thị Thu Năm, thầy cô Bộ môn Sinh Lý – Sinh Hóa, Khoa Chăn Ni Thú Y, Trường Đại Học Nơng Lâm TP.HCM tận tình hướng dẫn em suốt thời gian thực tập  Chân thành biết ơn Ban giám hiệu Trường Đại Học Nông Lâm TP.HCM Ban chủ nhiệm Bộ môn Sinh Lý – Sinh Hóa TS Nguyễn Tất Tồn, ThS Nguyễn Thị Phước Ninh tồn thể q thầy tận tình giảng dạy, truyền đạt kiến thức, kinh nghiệm quý báu suốt thời gian em học tập trường Anh Nguyễn Đình Hòa cơng ty Intervet Việt Nam Ltd cô chú, anh chị em trại chăn ni heo Minh Tồn nhiệt tình giúp đỡ tạo điều kiện cho suốt thời gian thực tập  Chân thành cảm ơn Tập thể lớp Dược Y 31 toàn thể bạn bè thân quen động viên, ủng hộ chia khó khăn với tơi thời gian qua iii TĨM TẮT KHÓA LUẬN Đề tài nghiên cứu “Đánh giá hiệu vaccine Circumvent PCV phòng Porcine Circovirus Type heo từ 84 ngày tuổi đến xuất thịt” 92 heo lô TN 93 heo lô ĐC, phân thành đợt, thí nghiệm bố trí theo kiểu thí nghiệm yếu tố, tiến hành trại chăn ni heo Minh Tồn từ 16/06/2009 đến 25/09/2009 Kết đạt được: Ở 165 ngày tuổi 96,77 % heo lơ TN dương tính PCV2, lơ ĐC dương tính 100 % HGKT lần lấy máu 84 165 ngày tuổi heo TN 4953, 7585 lô ĐC 1718, 11782 Số lượng hồng cầu, bạch cầu, hàm lượng Hb số Ht heo lúc 84 165 ngày tuổi lô ĐC lô TN nằm giới hạn sinh lý bình thường, số lượng tiểu cầu lúc 84 ngày tuổi lô TN 49,72 ngàn/mm3, ĐC 71,63 ngàn/mm3 ; 165 ngày tuổi lô TN 68,95 ngàn/mm3, lô ĐC 76,24 ngàn/mm3 Tỷ lệ bạch cầu trung tính, bạch cầu đơn nhân giai đoạn 165 ngày tuổi có khác biệt lô Tỷ lệ tiêu chảy lô TN 19,57 % lô ĐC 13,98 %, tỷ lệ ngày tiêu chảy lô TN 0,174 % lô ĐC 0,168 % Tỷ lệ ho lô TN 60,87 % lô ĐC 61,29 %, tỷ lệ ngày ho heo TN 1,5 % ĐC 1,9 % Heo có biểu viêm da lô TN chiếm 25 %, lô ĐC chiếm 25,81 %; heo bị viêm khớp lô TN chiếm 2,17 %, ĐC chiếm 5,38 % Tỷ lệ heo chết lô TN 5,43 %, lô ĐC 21,51 % Tỷ lệ sưng hạch bẹn lúc mổ khám tử trại lô TN 40 %, lô ĐC 100 % Mức độ tổn thương phổi lô ĐC 51,86 %, TN 52,49 % Khi khảo sát bệnh tích lúc giết thịt, lơ ĐC có 33,33 % heo có biểu sưng hạch bẹn cạn, lơ thí nghiệm 15,07 % Hạch bẹn xuất huyết lô TN 16,44 %, lô ĐC 43,14 % Khi xuất thịt, trọng lượng bình quân lô TN 85,84 kg/con lô ĐC 84,52 kg/con, tăng trọng tuyệt đối lô TN 535,60 g/con/ngày lơ ĐC 530,90 g/con/ngày Hệ số chuyển hóa thức ăn heo lơ TN 2,97, ĐC 2,98 iv MỤC LỤC TRANG Trang tựa…………………………………………………………………………… i Xác nhận giáo viên hướng dẫn ii Lời cảm tạ iii Tóm tắt khóa luận iv Mục lục v Danh sách chữ viết tắt ix Danh sách bảng x Danh sách hình xi Danh sách biểu đồ xii Chương MỞ ĐẦU 1.1 Đặt vấn đề 1.2 Mục đích yêu cầu 1.2.1 Mục đích 1.2.2 Yêu cầu Chương TỔNG QUAN 2.1 Giới thiệu sơ lược trại chăn nuôi heo Minh Toàn 2.1.1 Vị trí địa lý 2.1.2 Nhiệm vụ trại 2.1.3 Cơ cấu đàn 2.1.4 Thiết kế chuồng trại 2.1.4.1 Khu chuồng nái hậu bị, mang thai, chờ phối 2.1.4.2 Khu nái đẻ 2.1.4.3 Khu chuồng heo cai sữa 2.1.4.4 Chuồng nuôi heo thịt 2.1.5 Quy trình chăm sóc ni dưỡng 2.1.5.1 Chế độ cho ăn v 2.1.5.2 Nước uống 2.1.5.3 Chế độ tắm 2.1.5.4 Chế độ theo dõi 2.1.6 Quy trình vệ sinh thú y 2.1.6.1 Vệ sinh thức ăn 2.1.6.2 Vệ sinh nguồn nước 2.1.6.3 Vệ sinh chuồng trại 2.1.6.4 Vệ sinh công nhân khách tham quan 2.1.6.5 Vệ sinh dụng cụ thú y 2.1.6.6 Quy trình tiêm phòng bệnh 2.2 Porcine Circovirus type (PCV2) hội chứng PMWS PCV2 2.2.1 Giới thiệu PCV2 2.2.2 Hội chứng còi cọc heo sau cai sữa PCV2 2.2.3 Lịch sử phát bệnh 10 2.2.4 Phân loại 11 2.2.5 Hình thái, tính chất vật lý – hóa học 11 2.2.6 Sự tổ chức hệ gen 12 2.2.7 Truyền nhiễm học 12 2.2.7.1 Loài vật mắc bệnh 12 2.2.7.2 Chất chứa bệnh 12 2.2.7.3 Đường truyền lây 13 2.2.7.4 Cách sinh bệnh 13 2.2.7.5 Miễn dịch bệnh PCV2 13 2.2.7.6 Dịch tễ học 14 2.2.8 Triệu chứng 14 2.2.9 Bệnh tích đại thể vi thể 15 2.2.10 Chẩn đoán 17 2.2.11 Điều trị, phòng kiểm sốt bệnh PCV2 18 2.2.11.1 Điều trị 18 vi 2.2.11.2 Phòng kiểm sốt bệnh 18 2.3 Nguyên nhân làm chậm lớn heo nuôi thịt 19 2.4 Sơ lược vaccine Circumvent TM PVC 20 2.5 Lược duyệt cơng trình nghiên cứu ngồi nước 21 2.5.1 Trong nước 21 2.5.2 Ngoài nước 22 Chương NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 23 3.1 Thời gian địa điểm thực đề tài 23 3.1.1 Thời gian 23 3.1.2 Địa điểm 23 3.1.3 Đối tượng nghiên cứu 23 3.2 Nội dung nghiên cứu 23 3.3 Phương pháp tiến hành 24 3.3.1 Bố trí thí nghiệm 24 3.3.2 Phương pháp lấy mẫu kiểm tra hiệu giá kháng thể tiêu sinh lý máu… 24 3.3.3 Phương pháp xác định suất heo thí nghiệm 25 3.3.4 Theo dõi ghi nhận biểu lâm sàng heo thí nghiệm 25 3.3.5 Đánh giá bệnh tích đại thể vi thể 26 3.3.5.1 Bệnh tích đại thể 26 3.3.5.2 Bệnh tích vi thể 27 3.4 Công thức tính 27 3.5 Phương pháp xử lý số liệu 27 Chương KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 28 4.1 Tỷ lệ huyết dương tính với PCV2 28 4.2 Hiệu giá kháng thể lơ thí nghiệm thời điểm lấy máu 29 4.3 Kết khảo sát tiêu sinh lý máu 30 4.3.1 Số lượng hồng cầu, bạch cầu, tiểu cầu, hàm lượng Hb số Ht 30 4.3.2 Công thức bạch cầu 32 vii 4.4 Biểu lâm sàng, bệnh tích heo mổ khám tử heo giết mổ 35 4.4.1 Triệu chứng lâm sàng đàn heo thí nghiệm 35 4.4.2 Bệnh tích đại thể heo mổ khám tử trại 37 4.4.3 Đánh giá mức độ tổn thương phổi lúc giết thịt 40 4.4.4 Tỷ lệ xuất dạng bệnh tích đại thể lúc giết thịt 42 4.4.5 Bệnh tích vi thể heo giết mổ 45 4.5 Năng suất heo thí nghiệm 49 4.5.1 Trọng lượng heo giai đoạn 84 ngày tuổi đến xuất thịt 49 4.5.2 Lượng thức ăn tiêu thụ trung bình hệ số chuyển hóa thức ăn 50 4.5.3 Đánh giá hiệu kinh tế 50 Chương KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 52 5.1 Kết luận 52 5.2 Đề nghị 52 TÀI LIỆU THAM KHẢO 54 PHỤ LỤC 59 viii DANH SÁCH CÁC CHỮ VẾT TẮT ADN: Deoxyribonucleic acid ARN: Ribonucleic acid APP: Actinobacillus pleuropneumoniae ĐC: Đối chứng ELISA: Enzyme Linked Immuno Sorbent Assay HGKT: Hiệu giá kháng thể IHA: Indirect Heamagglutination IPMA: Immuno Peroxidase Monolayer Assay Ig: Immunoglobulin ORF1: Open Reading Frames ORF2: Open Reading Frames PCV: Porcine circovirus PCR: Polymerase Chain Reaction PCV1: Porcine circovirus type PCV2: Porcine circovirus type PRDC: Porcine Respiratory Disease Complex PDNS: Porcine Dermatitis and Nephropathy Syndrome PK 15: Pig kidney 15 PPV: Porcine Parvovirus PRRS: Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome PWMS: Post Weaning Multisystemic Syndrome SIV: Swine Influenza Virus TN: Thí nghiệm ix DANH SÁCH CÁC BẢNG TRANG Bảng 2.1 Thành phần dinh dưỡng thức ăn loại cám Bảng 2.2 Quy trình tiêm phòng Bảng 3.1 Bảng bố trí thí nghiệm 24 Bảng 3.2 Bảng phân bố mẫu xét nghiệm 24 Bảng 4.1 Tỷ lệ huyết dương tính với PCV2 lúc 84 165 ngày tuổi 28 Bảng 4.2 Biến thiên HGKT kháng virus PCV2 29 Bảng 4.3 Số lượng hồng cầu, bạch cầu, tiểu cầu, hàm lượng Hb số Ht heo lúc 84 165 ngày tuổi 30 Bảng 4.4 Công thức bạch cầu lúc 84 165 ngày tuổi lô TN ĐC 32 Bảng 4.5 Tỷ lệ xuất số triệu chứng lâm sàng heo TN ĐC từ 84 ngày tuổi đến xuất thịt .35 Bảng 4.6 Tỷ lệ xuất dạng bệnh tích đại thể heo mổ khám tử trại 37 Bảng 4.7 Mức độ hư hại phổi lúc giết thịt 40 Bảng 4.8 Tỷ lệ xuất dạng bệnh tích đại thể lúc giết thịt 42 Bảng 4.9 Các biến đổi bệnh tích vi thể phổi gan heo khảo sát 45 Bảng 4.10 Các biến đổi bệnh tích vi thể hạch phổi, hạch bẹn hạch ruột heo khảo sát .46 Bảng 4.11 Trọng lượng trung bình, tăng trọng bình quân tăng trọng tuyệt đối heo từ giai đoạn 84 ngày tuổi đến xuất thịt 49 Bảng 4.12 Lượng thức ăn tiêu thụ trung bình hệ số chuyển hóa thức ăn heo thí nghiệm từ 84 ngày tuổi đến xuất thịt 50 Bảng 4.13 Hiệu kinh tế 50 x PHỤ LỤC Xử lý số liệu thống kê Chỉ trình bày giá trị có ý nghĩa mặt thống kê One-way Analysis of Variance: HGKT lô lúc 84 ngày tuổi Source DF NT SS MS F P 175906614 175906614 17.65 Error 68 677707724 Total 69 853614338 0.000 9966290 Individual 95% CIs For Mean Based on Pooled StDev Level N Mean StDev + -+ -+ -+ 36 4953 3932 34 1781 2038 ( * ) ( * ) + -+ -+ -+ Pooled StDev = 3157 1500 3000 4500 6000 One-way Analysis of Variance: HGKT lô lúc 165 ngày tuổi Analysis of Variance for HGKT Source DF NT SS MS F 254204403 254204403 10.33 Error 56 1.378E+09 Total 57 1.633E+09 P 0.002 24615306 Individual 95% CIs For Mean Based on Pooled StDev Level N Mean StDev -+ -+ -+ - 31 7585 5308 ( * ) 27 11782 4529 ( -* -) -+ -+ -+ - Pooled StDev = 4961 7500 10000 59 12500 One-way Analysis of Variance: Số lượng tiểu cầu lúc 84 ngày tuổi Analysis of Variance for TC Source DF SS MS F NT P 8127 8127 10.29 Error 66 52149 790 Total 67 60276 0.002 Individual 95% CIs For Mean Based on Pooled StDev Level N Mean StDev -+ -+ -+ - 36 49.72 28.47 ( * -) 32 71.62 27.69 ( * -) -+ -+ -+ - Pooled StDev = 28.11 48 60 72 One-way Analysis of Variance: Số lượng bạch cầu lúc 165 ngày tuổi Analysis of Variance for BC Source DF SS MS F P NT1 31.49 31.49 7.07 0.012 Error 57 151.36 4.45 Total 58 182.84 Individual 95% CIs For Mean Based on Pooled StDev Level N Mean StDev -+ -+ -+ -+- 31 14.362 1.870 27 12.489 2.351 ( * -) ( * ) -+ -+ -+ -+- Pooled StDev = 2.110 12.0 13.2 60 14.4 15.6 One-way Analysis of Variance: Tỷ lệ bạch cầu đơn nhân lúc 165 ngày tuổi Analysis of Variance for BC mono Source DF SS MS NT1 287.1 287.1 Error 57 511.7 15.0 Total 58 798.7 F P 19.07 0.000 Individual 95% CIs For Mean Based on Pooled StDev Level N Mean StDev + -+ -+ 31 14.421 27 8.765 4.018 ( -* -) 3.717 ( -* ) + -+ -+ Pooled StDev = 3.879 9.0 12.0 15.0 One-way Analysis of Variance: Tỷ lệ bạch cầu trung tính lúc 165 ngày tuổi Analysis of Variance for BC TT Source DF SS MS F P NT 481.0 481.0 6.53 0.015 Error 34 2504.6 73.7 Total 35 2985.6 Individual 95% CIs For Mean Based on Pooled StDev Level N Mean StDev -+ -+ -+ - 31 29.737 7.730 ( -* -) 27 37.059 9.450 ( -* ) -+ -+ -+ - Pooled StDev = 8.583 30.0 35.0 61 40.0 Chi-Square Test: Tỷ lệ ngày ho Số ngày Số ngày con không ho ho Total 233 15301 15534 261.52 15272.48 249 12847 220.48 12875.52 Total 482 13096 28148 28630 Chi-Sq = 6.917 DF = 1, P-Value = 0.009 Chi-Square Test: Tỷ lệ chết, loại thải Total Số Số con không chết chết 87 12.43 79.57 20 73 12.57 80.43 25 160 Total 92 93 185 Chi-Sq = 10.220, DF = 1, P-Value = 0.001 62 Chi-Square Test: Tỷ lệ hạch bẹn sưng lúc mổ khám tử trại Sưng 2 3.75 1.25 5.25 Total Không sưng Total 1.75 12 Chi-Sq = 5.600, DF = 1, P-Value = 0.018 Chi-Square Test: Tỷ lệ hạch bẹn sưng lúc giết mổ Expected counts are printed below observed counts Total Sưng Không sưng Total 11 62 73 16.48 56.52 17 34 11.52 39.48 28 96 51 124 Chi-Sq = 5.730, DF = 1, P-Value = 0.017 63 Chi-Square Test: Tỷ lệ hạch bẹn xuất huyết lúc giết mổ Expected counts are printed below observed counts Xuất huyết Total Không xuất huyết Total 12 61 20.02 52.98 22 29 13.98 37.02 34 90 73 51 124 Chi-Sq = 10.754, DF = 1, P-Value = 0.001 Chi-Square Test: Tỷ lệ nhục hóa lúc giết mổ lúc giết mổ Expected counts are printed below observed counts Nhục hóa 64 60.08 10.92 35 11 38.92 Total khơng nhục hóa Total 99 71 46 7.08 18 117 Chi-Sq = 4.235, DF = 1, P-Value = 0.040 64 One-way Analysis of Variance: So sánh trọng lượng lúc heo 84 ngày tuổi Analysis of Variance for C3 Source DF SS MS F P NT 183.2 183.2 4.26 0.040 Error 184 7994.8 43.0 Total 185 8178.0 Individual 95% CIs For Mean Based on Pooled StDev Level N Mean StDev + -+ -+ 92 33.35 6.21 93 31.37 6.87 ( * ) ( * ) + -+ -+ Pooled StDev = 6.556 31.5 33.0 65 34.5 2.Vật liệu hóa chất sử dụng phòng thí nghiệm  Các tiêu sinh lý máu  Kính hiển vi  Buồng đếm Neubauer  Lá kính (lamelle)  Ống trộn hồng cầu, bạch cầu  Bơng gòn, cồn methanol  Dung dịch pha loãng hồng cầu (HgCl2)  Dung dịch pha lỗng bạch cầu  Dầu xem kính  Máy bấm bách phân  Thuốc nhuộm eosin xanh methylene  Ống nghiệm Wintrobe giá để ống nghiệm  Ống tiêm kim dài 15cm  Máy ly tâm  HCl N/10 (pha từ ống chuẩn)  Nước cất  Huyết sắc kế Shali gồm ống đo giữa, ống so màu chuẩn hai bên  Đũa khuấy thủy tinh  Pipette có vạch 20 cmm ống hút cao su  Ống nhỏ giọt  Đánh giá quy trình ELISA Bộ Kit SERELISA PCV2 Ab Mono Blocking (của tập đồn SYNBIOTICS) chẩn đốn kháng thể kháng PCV2 huyết lấy từ heo tiêm vaccine heo đối chứng, công ty Intervet Tp HCM cung cấp Hóa chất thành phần kit  Bốn đĩa, đĩa 12 dải giếng nhạy với kháng thể kháng PCV2 liên kết đặc hiệu với kháng nguyên PCV2 66  Dung dịch rửa đậm đặc (W) nồng độ 10X  Dung dịch pha loãng mẫu (SD)  Đối chứng âm (N)  Đối chứng dương (P)  Dung dịch pha loãng conjugate (CD)  Conjugate (CJ) kháng thể đơn dòng kháng PCV2 (có gắn với peroxidase)  Cơ chất peroxidase (PS)  Dung dịch kết thúc (S)  Phim dính Thực số tiêu sinh lý máu 3.1 Xác định số lượng hồng cầu Hút máu đến vạch 0,5; cột máu liên tục, khơng lẫn bọt khí, dùng cồn lau đầu ống hút Pha loãng: cho ống hút vào lọ dung dịch pha loãng hồng cầu hút dung dịch pha loãng đến vạch 101 Như hồng cầu pha loãng 200 lần Trộn máu: lắc hình số khoảng phút Cho máu vào buồng đếm đếm: đếm hồng cầu ô trung bình khu vực đếm hồng cầu (4 góc giữa) Trong ô trung bình đếm 16 ô nhỏ Trong ô nhỏ, đếm tất hồng cầu nằm gọn ô hồng cầu nằm cạnh cạnh trái Như biết số hồng cầu 80 nhỏ 67 Cơng thức tính Số HC mm3 = A  4000  200 = A x 10.000 16 Trong A = Số hồng cầu đếm 80 ô, lấy A chia cho 80 (5 x 16) ta có số hồng cầu ô nhỏ 4000 = 400 x 10 (1/400mm2 diện tích nhỏ, 1/10mm chiều cao từ mặt buồng đếm đến lamelle) 200 độ pha loãng máu 3.2 Xác định số lượng bạch cầu Làm tương tự bước xác định số lượng hồng cầu pha loãng máu dung dịch pha loãng bạch cầu Hút dung dịch pha loãng đến vạch 11, bạch cầu pha loãng 20 lần Đếm máu: Trên buồng đếm Neubauer đếm ô vuông góc với tổng số 64 trung bình Cách đếm giống đếm hồng cầu Cơng thức tính Số BC mm3 = A 10 20 = A x 50 Trong 1/10 mm = chiều cao từ buồng đếm đến lamelle 20 = tỷ lệ pha lỗng Chia 1mm3 có 16 trung bình đếm 64 (4mm3) 3.3 Xác định công thức bạch cầu Phết máu lên lame sau cố định cồn methanol nhuộm dung dịch eosin xanh methylene Quan sát toàn tiêu kính hiển vi với vật kính 10 Nhỏ giọt dầu lên góc vết phết máu xoay qua vật kính 100 Dịch chuyển tiêu bản, quan sát đếm loại bạch cầu Từ lập công thức 68 3.4 Xác định hàm lượng hemoglobin (Hb) Xác định hàm lượng Hb có 100 ml máu Lấy ống nhỏ giọt hút dung dịch HCl N/10 cho vào ống đo huyết sắc kế Shali đến vạch số 2, để yên giá đo Lắc máu kháng đông Gắn ống hút cao su vào pipette có vạch 20 cmm Lau khơ máu quanh pipette Thổi hết máu kháng đông pipette vào dung dịch HCl hút acid ống đo để rửa pipette vài lần, sau lắc ống trộn máu acid Lắc cho phản ứng xảy hoàn toàn phút Sau phút nhỏ giọt nước cất liên tục khuấy Trộn dung dịch ống đo giống với ống màu chuẩn hai bên giá đo Kết ghi nhận vạch dung dịch dâng lên ống đo (đơn vị: g%) 3.5 Xác định số hematocrit (Ht) Dùng ống tiêm kim dài hút máu cho vào ống Wintrobe sau đem ly tâm với tốc độ 3000 vòng/ phút 30 phút Đọc kết lấy trung bình cộng mức cao mức thấp phần hồng cầu lắng xuống Khảo sát hiệu chủng ngừa vaccine kỹ thuật ELISA 4.1 Nguyên tắc kit SERELISA Bộ kit SERELISA® PCV2 Ab Mono Blocking sử dụng kỹ thuật miễn dịch enzyme để xác định kháng thể kháng PCV2 phân huyết heo Gồm có bước Đối chứng mẫu cho vào giếng nhạy với kháng thể kháng PCV2 (Ab1) liên kết đặc hiệu với kháng nguyên PCV2 tinh Nếu diện kháng thể kháng PCV2 mẫu phân huyết thanh, liên kết với kháng nguyên Sau rửa thành phần không liên kết, conjugate - peroxidase kháng PCV2 (conj-HRP) thêm vào Nếu khơng có kháng thể kháng PCV2 đặc hiệu mẫu, conjugate - peroxidase kháng PCV2 liên kết với kháng nguyên 69 Sau bước rửa thứ hai, conjugate - peroxidase bộc lộ cách thêm vào chất, chất chuyển conjugate – peroxidase thành sản phẩm phát màu Mật độ quang ghi nhận sử dụng để xác định xem có hay khơng diện kháng thể Hình 3.1 Bộ kit SERELISA® PCV2 Ab Mono Blocking (Sản phẩm tập đồn Synbiotics) 4.2 Pha loãng mẫu Bảng 4.1 Tiền pha loãng mẫu nồng độ 1:10; 1:100; 1:1000 Tiền phlỗng Chuẩn bị 10-Jan 10 µl huyết + 90 µl dung dịch pha loãng mẫu SD 1/100 10 µl huyết pha lỗng 1:10 + 90 µl SD 1/1000 10 µl huyết pha lỗng 1:100 + 90 µl SD 70 4.3 Tiến hành phản ứng Đầu tiên tiến hành phân bố mẫu đối chứng Sau lắc lọ, thêm 100µl đối chứng âm (N) vào giếng A1, A2 A3; 100µl đối chứng dương (P) vào giếng B1, B2, B3 Sau phân phối 90 µl dung dịch pha lỗng mẫu SD cộng thêm 10 µl dung dịch huyết tiền pha loãng (1:10, 1:100, 1:1000) A NC NC NC S7-1:100 S7-1:1000 S7-1:10000 B PC PC PC S8-1:100 S8-1:1000 S8-1:10000 C S1-1:100 S1-1:1000 S1-1:10000 S9-1:100 S9-1:1000 S9-1:10000 D S2-1:100 S2-1:1000 S2-1:10000 S10-1:100 S10-1:1000 S10-1:10000 E S3-1:100 S3-1:1000 S3-1:10000 S11-1:100 S11-1:1000 S11-1:10000 F S4-1:100 S4-1:1000 S4-1:10000 S12-1:100 S12-1:1000 S12-1:10000 G S5-1:100 S5-1:1000 S5-1:10000 S13-1:100 S13-1:1000 S13-1:10000 H S6-1:100 S6-1:1000 S6-1:10000 S14-1:100 S14-1:1000 S14-1:10000 Phủ phim dính lên giếng, sau lắc nhẹ đĩa tay ủ giếng ± phút 37oC ± 3oC Bước pha loãng conjugate CJ với nồng độ 1:100 dung dịch pha lỗng CD Sau cho 100 µl dung dịch conjugate pha lỗng vào giếng phủ phim dính lên Ủ đĩa với conjugate ± phút 37oC ± 3oC Lấy cẩn thận phim dính rửa lại lần dung dịch đệm rửa (dung dịch đệm rửa chuẩn bị cách pha loãng dung dịch rửa đậm đặc 1:10 với nước cất) Để phát hiện, thêm 100 µl chất đệm peroxiase (PS) giếng ý không phủ phim dính lên giai đoạn trộn lẫn cách lắc nhẹ đĩa tay Cơ chất ủ 30 phút  5phút, 20oC  5o, tránh ánh sáng Sau thêm 50µl dung dịch kết thúc (S) vào giếng Lắc nhẹ đĩa tay, không để bọt khí xuất giếng Cuối cùng, tiến hành đo mật độ quang bước sóng đơi 450 630nm bước sóng đơn 450nm xác nhận tính hiệu lực thí nghiệm 71 Kết thí nghiệm cho hợp lý OD trung bình đối chứng âm (N) > 0,5 OD trung bình đối chứng dương (P) < 0,3 Đọc giải thích kết dựa theo cơng thức Log (titer) = a + b x Logit (SNc) Hoặc Titer = 10 (a +b x Logit (SNc)) SNc = OD( S )  OD( P) OD( N )  OD( P) Với a = 2,5; b = - 0,70 SNc: “Sample to Negative corrected ratio” SNc tính riêng cho độ pha loãng a Nếu SNc (1:10000) < 0,0976 , hiệu giá > 15000 đơn vị Elisa (Eu) b Nếu 0,7437 > SNc(1: 1000) > 0,0976  Hiệu giá = 10 x 10a + b x log SNc (1:10000) c Nếu SNc(1: 10000) > 0,7437 o SNc(1: 1000) < 0,7437  Hiệu giá = 10a + b x log SNc (1:1000) o SNc(1: 1000) > 0,7437  SNc(1: 100) < 0,95  Hiệu giá = 10a + bx log SNc (1:100) SNc(1:100) > 0,95  Hiệu giá = 72 73 ... ARN: Ribonucleic acid APP: Actinobacillus pleuropneumoniae ĐC: Đối chứng ELISA: Enzyme Linked Immuno Sorbent Assay HGKT: Hiệu giá kháng thể IHA: Indirect Heamagglutination IPMA: Immuno Peroxidase... 3100 3000 2900 2700 3000 Ca (%) Xơ tối đa (%) NLTĐ tối thiểu (kcal/kg) Tylosin (mg/kg) 50Max Colistin (mg/kg) 40Max 40Max 0,65 0,65 0,55 0,55 0,67 0,7 14 14 14 14 14 14 0,2 – 0,7 0,2 – 0,8 0,2 –... trùng gây bệnh khác, đáng ý Mycoplasma hyopneumoniae, Streptococcus suis, Pasteurella multocida, Actinobacillus pleuropneumoniae, Haemophilus parasuis (Kim ctv, 2004; Segales ctv, 2002) 2.2.3 Lịch