PHÂN LẬP, ĐỊNH SEROTYPE VIRUS GÂY BỆNH VIÊM PHẾ QUẢN TRUYỀN NHIỄM VÀ PHÒNG BỆNH CHO GÀ THỊT BẰNG VACCINE

PHÂN LẬP, ĐỊNH SEROTYPE VIRUS GÂY BỆNH VIÊM PHẾ QUẢN TRUYỀN NHIỄM VÀ PHÒNG BỆNH CHO GÀ THỊT BẰNG VACCINE NGUYỄN THỊ KIM YẾN Hội đồng chấm luận văn 1.. Mục tiêu nghiên cứu là xác định s

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP HỒ CHÍ MINH

*************************

NGUYỄN THỊ KIM YẾN

PHÂN LẬP, ĐỊNH SEROTYPE VIRUS GÂY BỆNH VIÊM PHẾ QUẢN TRUYỀN NHIỄM VÀ PHÒNG BỆNH CHO GÀ THỊT BẰNG VACCINE

LUẬN VĂN THẠC SỸ KHOA HỌC NÔNG NGHIỆP

Thành phố Hồ Chí Minh Tháng 12/2011

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP HỒ CHÍ MINH

PHÂN LẬP, ĐỊNH SEROTYPE VIRUS GÂY BỆNH VIÊM PHẾ QUẢN TRUYỀN NHIỄM VÀ PHÒNG BỆNH CHO GÀ THỊT BẰNG VACCINE

NGUYỄN THỊ KIM YẾN

Hội đồng chấm luận văn

1 Chủ tịch: TS TRẦN THỊ BÍCH LIÊN

Hội Thú y Việt Nam

2 Thư ký: TS NGUYỄN TIẾN THÀNH

Trường Đại học Nông Lâm TP.HCM

3 Phản biện 1: PGS.TS TRẦN ĐÌNH TỪ

Hội Thú y Việt Nam

4 Phản biện 2: TS NGUYỄN THỊ PHƯỚC NINH

Trường Đại học Nông Lâm TP.HCM

5 Ủy viên: TS NGUYỄN TẤT TOÀN

Trường Đại học Nông Lâm TP.HCM

LÝ L Ị CH CÁ NHÂN

Tôi tên Nguyễn Thị Kim Yến sinh ngày 20 tháng 03 năm 1972 tại huyện Di Linh, tỉnh Lâm Đồng Tốt nghiệp PTTH trại trường trung học phổ thông Di Linh, tỉnh Lâm Đồng năm 1990 Tốt nghiệp đại học hệ chính qui ngành Thú y tại Trường Đại Học Nông Lâm, thành phố Hồ Chí Minh năm 1996

Quá trình công tác:

Năm 1996: chuyên viên Trạm khuyến nông Đà Lạt, tỉnh Lâm Đồng

Năm 1999: chuyên viên Trạm khuyến nông Di linh, tỉnh Lâm Đồng

Năm 2003 đến nay: chuyên viên Trung tâm Nông nghiệp Di linh, tỉnh Lâm Đồng

Tháng 10 năm 2009 theo học Cao học ngành thú y tại Trường Đại học Nông Lâm, Thủ Đức, thành phố Hồ Chí Minh

Địa chỉ liên lạc: số 1110, đường Hùng Vương, thị trấn Di Linh, huyện Di Linh, tỉnh Lâm Đồng

Điện thoại: 0907122102

Email: Kimyen.ttnn@gmail.com

L Ờ I CAM Đ OAN

Tôi xin cam đoan những công bố trong luận văn này là trung thực và là một phần trong đề tài cấp Bộ mã số CS-CB11-CNTY-05 do TS Võ Thị Trà An làm chủ nhiệm Những số liệu trong luận văn được phép công bố với sự đồng ý của chủ nhiệm đề tài

Nguyễn Thị Kim Yến

L Ờ I C Ả M Ơ N

Chân thành cám ơn TS Võ Thị Trà An đã giảng dạy, hướng dẫn và giúp đỡ

tôi trong việc thực hiện và hoàn thành luận văn tốt nghiệp

Cảm ơn tất cả các thầy cô trong Khoa Chăn Nuôi Thú Y, Phòng Đào Tạo Sau Đại Học, Ban Giám Hiệu đã giúp đỡ và tạo điều kiện thuận lợi cho tôi học tập

và hoàn thành đề tài nghiên cứu

Đặc biệt cảm ơn anh Hồ Hoàng Dũng đã nhiệt tình giúp đỡ, cung cấp tài liệu

và đóng góp nhiều ý kiến chuyên môn hữu ích

Chân thành cảm ơn Ban lãnh đạo và anh em bộ phận chăn nuôi thú y Trung tâm Nông nghiệp Di Linh, Trung tâm Nông nghiệp Đức Trọng, Trung tâm Nông nghiệp Bảo Lộc và đặc biệt anh Dương Củi, Nguyễn Văn Sinh và các em Nguyễn Thế Nam, Nguyễn Minh Khánh, K’ Xuân và Trần Thị Ngọc Hân đã nhiệt tình hỗ trợ và tạo điều kiện thuận lợi cho tôi hoàn thành đề tài nghiên cứu này

Cảm ơn và chia sẻ những thành quả đạt được với cha mẹ, các anh chị, các bạn lớp cao học thú y, chăn nuôi 09 và đặc biệt chồng, các con đã tạo nguồn động viên to lớn cho tôi hoàn thành quá trình học tập và đề tài nghiên cứu này

TÓM T Ắ T

Đề tài “Phân lâp, định serotype virus gây bệnh viêm phế quản truyền nhiễm

và phòng bệnh bằng vaccine” được tiến hành từ tháng 10/2010 đến 10/2011 Mục tiêu nghiên cứu là xác định serotype của virus gây bệnh viêm phế quản truyền nhiễm (Infectious Bronchitis, IB) ở các trại gà thịt của Lâm Đồng và đánh giá khả năng phòng bệnh bằng vaccine Kết quả được ghi nhận như sau:

(1) Thông tin khi thu thập 100 mẫu bệnh phẩm là khí quản từ 100 trại gà (tại tỉnh Lâm Đồng) có triệu chứng như là chảy nước mắt, nước mũi, sưng mặt, ngáp, khó thở, hắt hơi, âm rale khí quản và tiêu chảy phân trắng, loãng nghi ngờ bệnh do virus IB Bệnh tích phổ biến là khí quản xuất huyết và thận sưng, tích urate

(2) Phân lập virus từ 100 mẫu bệnh phẩm bằng phương pháp tiêm xoang niệu

mô phôi gà 9 ngày tuổi cho thấy có 54% mẫu có bệnh tích phôi còi cọc, phôi uốn cong và 33% mẫu phôi tích urate trong thận Xác định sự hiện diện virus IB bằng

kỹ thuật RT –PCR cho kết quả 9 mẫu dương tính Xác định serotype bằng phương pháp giải trình tự gene của 8 mẫu cho thấy có 1 chủng thuộc serotype Massachusett (chủng H120) và 4 chủng thuộc serotype 793B (chủng 4/91)

(3) Chương trình vaccine cho 4080 gà thịt được chủng ngừa vaccine IB H120 lúc 1 ngày tuổi cho 3 lô Chỉ lô 1 và lô 2 được tái chủng với IB 4/91 và IB 88 lúc

14 ngày tuổi Hiệu giá kháng thể lúc 35 ngày tuổi xác định bằng ELISA của lô 1, 2

và 3 lần lượt là 663, 1184 và 1125 Tỉ lệ chết có sự khác biệt giữa lô 1 (2,5%) và lô

2 (2,4%) so với lô 3 (9,6%) Trọng lượng cuối kỳ lô 1, 2 và 3 lần lượt là 3,4 kg, 3,5

kg và 2,9 kg Kết quả là chương trình vaccine lô 1 và 2 đã khống chế được bệnh IB

và mang lại hiệu quả kinh tế cao hơn lô 3

SUMMARY

The thesis “Isolation and serotype determination of the avian infectious bronchitis (IB) virus and prevention for broiler flocks by vaccine” was conducted from Oct 2010 to Oct 2011 The objectives were to determine serotype among field isolates of infectious bronchitis virus from broiler in Lam Dong and to evaluate the efficacy of vaccine program for broilers to prevent and control IB disease The results showed that:

(1) Information from 100 samples from 100 poultry farms (in Lam Dong province) suspected IB includes respiratory signs such as sneezing, tracheal rale sound and wet dropping increased water intake Common gross lesions were tracheal hemorrhage and swollen urated kidneys

(2) Virus isolation from 100 specimens by injection into allantoic of IB negative-embryonated eggs (9 day old) showed that 54% sample having embryotic dwarfing and curling lesion and 33% sample having embryotic urated kidney Determination on the presence of IB virus by RT – PCR technique resulted with nine positive samples Identification of IB serotype by nucleotide sequencing for 8 samples showed that there are one isolate belonging to serotype Massachusetts (strain H120) and four isolates belonging to serotype 793B (strain 4/91)

(3) Vaccine programs using 4080 broilers inoculated the IB H120 vaccine at day old divided into three groups Only group 1 and group 2 were boosteed with IB 4/91 and IB 88 vaccine, respectively, at 14 day old The antibody titre at 35 day old examinated by ELISA in group 1, 2 and 3 were 663, 1184 and 1125, respectively Incidences of death were different between group 1 (2.5%) and 2 (2.4%) compared

to group 3 (9,6%) The similar figure is for growth performance The final weights

of group 1, 2 and 3 were 3.4 kg, 3.5 kg and 2.9 kg, respectively The results showed that vaccine programs of group 1 and 2 were more effective and more economically for controlling IB than that of group 3

MỤC LỤC

TRANG CHUẨN Y i

LÝ LỊCH CÁ NHÂNN ii

LỜI CAM ĐOANN iii

LỜI CẢM ƠN iv N TÓM TẮTT v

SUMMARYY vi

MỤC LỤC vii

DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT x

DANH SÁCH CÁC BẢNG xi

DANH SÁCH CÁC HÌNH xii

MỞ ĐẦU 1

Chương 1 TỔNG QUAN 3

1.1 Bệnh viêm phế quản truyền nhiễm 3

1.1.1 Lịch sử bệnh 3

1.1.2 Căn bệnh 4

1.1.3 Biến đổi cấu trúc kháng nguyên và các phương pháp định type 6

1.1.4 Cơ chế sinh bệnh 7

1.1.5 Phương thức truyền lây 9

1.1.6 Triệu chứng 10

1.1.7 Bệnh tích 12

1.1.8 Chẩn đoán bệnh 13

1.1.9 Miễn dịch 17

1.1.10 Phòng bệnh 18

1.1.11 Vaccine và đánh giá hiệu quả vaccine 18

1.2 Kỹ thuật reverse transcriptase - polymerase chain reaction (RT - PCR) 20

1.2.1 Nguyên tắc 20

1.2.2 Các yếu tố ảnh hưởng 22

1.2.3 Ứng dụng 23

1.3 Tình hình chăn nuôi gia cầm tại Lâm Đồng 28

1.4 Sơ lược một số nghiên cứu tại trước tại Việt Nam liên quan đến đề tài 29

Chương 2 NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 30

2.1 Thời gian và địa điểm nghiên cứu 30

2.2 Đối tượng nghiên cứu 30

2.3 Nội dung và phương pháp thực hiện 30

2.3.1 Nội dung 30

2.3.2 Phương pháp thực hiện 31

2.3.2.1 Thông tin liên quan đến trại gà và triệu chứng, bệnh tích đại thể vi thể gà bệnh hô hấp nghi ngờ bệnh do virus IB 31

2.3.2.2 Phân lập mẫu gà bệnh hô hấp nghi ngờ bệnh do virus IB, xác định sự hiện diện và định serotype virus gây bệnh IB 33

2.3.2.3 Khả năng phòng bệnh IB bằng vaccine 38

2.4 Xử lý số liệu 40

Chương 3 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 41

3.1 Thông tin liên quan đến trại gà và triệu chứng, bệnh tích đại thể vi thể gà bệnh hô hấp nghi ngờ bệnh do virus IB 41

3.1.1 Thông tin liên quan đến trại gà nghi ngờ bệnh do virus IB 41

3.1.2 Triệu chứng, bệnh tích đại thể vi thể gà nghi ngờ bệnh do virus IB 42

3.2 Phân lập, xác định sự hiện diện và định serotype của virus gây bệnh IB 45

3.2.1 Phân lập trên môi trường phôi trứng 45

3.2.2 Xác định sự hiện diện virus IB phân lập được 46

3.2.2.1 Xác định sự hiện hiện virus IB phân lập được 46

3.2.2.2 So sánh giữa kết quả RT - PCR dương tính và kết quả khảo sát ở nội dung1 47

3.2.3 Định serotype IB phân lập được bằng phương pháp giải trình tự gene 52

3.3 Khả năng phòng bệnh IB bằng vaccine 53

3.3.1 Hiệu giá kháng thể 54

3.3.2 Một số chỉ tiêu lâm sàng 56

3.3.2.1 Tỉ lệ nuôi sống và mức độ hô hấp của gà thí nghiệm 56

3.3.2.2 Một số chỉ tiêu bệnh tích 57

3.3.2.3 Trọng lượng bình quân hàng tuần 59

3 3 2 4 Hệ số tiêu tốn thức ăn 60

3.3 Hiệu quả kinh tế giữa các lô 61

KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 63

1 Kết luận 63

2 Đề nghị 63

TÀI LIỆU THAM KHẢO 63

PH Ụ L Ụ C 69 C

DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT

IB: Infectious bronchitis (Viêm phế quản truyền nhiễm)

PCR: Polymerase chain reaction (Kỹ thuật khuếch đại gene)

RT-PCR: Reverse transcriptase - polymerase chain

reaction IFA: Immunofluorescence assay (Miễn dịch huỳnh quang)

IDA: Immunodiffusion assay (Miễn dịch khuếch tán)

AGP: Agar gel precipitation (Kết tủa khuếch tán trên thạch)

VN: Virus neutralization (Trung hòa virus)

HI: Haemagglutination inhibition (Ngăn trở ngưng kết hồng cầu)

MDA: Maternally-derived antibody (Kháng thể từ mẹ)

RFLP: Restriction enzyme fragment length polymorphism (Cắt phân đoạn đa hình)

DANH SÁCH CÁC BẢNG

B ảng 1.1 Trình tự các đoạn mồi xác định IB 24

Bảng 1.2 Bảng IUPAC cho suy biến 25

Bảng 1.3 Trình tự đoạn mồi định serotype IB 26

B ảng 2.1 Trình tự đoạn mồi xác định IB 34

Bảng 2.2 Sơ đồ bố trí thí nghiệm 38

Bảng 3.1 Một số thông tin liên quan đến trại gà nghi ngờ bệnh do virus IB 41

Bảng 3.2 Tỉ lệ triệu trứng và bệnh tích trên đàn gà nghi ngờ bệnh do virus IB (%) 43

Bảng 3.3 Tỉ lệ bệnh tích phôi (%) 45

Bảng 3.4 So sánh giữa kết quả RT-PCR dương tính và kết quả khảo sát nội dung 1 49

Bảng 3 5 Mức độ tương đồng của virus IB thực địa so với serotype chuẩn 52

B ảng 3.6 Hiệu giá kháng thể 54

Bảng 3.7 Tỉ lệ nuôi sống và mức độ hô hấp 56

Bảng 3.8 Tỉ lệ các bệnh tích của gà được mổ khám (%) 57

B ảng 3.9 Trọng lượng bình quân hàng tuần (đơn vị tính: kg) 59

Bảng 3.10 Hệ số tiêu tốn thức ăn (đơn vị tính: KgTA/ KgTT) 60

B ảng 3.11 Hiệu quả kinh tế giữa các lô (đơn vị tính: nghìn đồng) 61

DANH SÁCH CÁC HÌNH

Hình 1.1 Cấu trúc Coronavirus 5

Hình 1.2 Quá trình nhân lên của Coronavirus 8

Hình 1.3 Gà thở khò khè, vươn cổ thở khi bệnh IB 11

Hình 1.4 Lòng trắng trứng loãng gà bệnh IB (trên) và bình thường (dưới) 11

Hình 1.5 Thận sưng tích urate 12

Hình 1.6 Khí quản xuất huyết 12

Hình 1.7 Phôi gà 16 ngày bình thường (trái), phôi cuộn tròn bệnh IB (phải) 14

Hình 1.8 Sơ đồ phản ứng RT – PCR 22

Hình 1.9 Sơ đồ khuếch đại một phần đoạn gene S1 27

Hình 2.2 Phương pháp điện di và đọc kết quả 36

Hình 2.3 Sơ đồ qui trình phân lập và định serotype IB 38

Hình 3.1 Một số bệnh tích gà bệnh nghi ngờ bệnh do virus IB 43

Hình 3.2 Bệnh tích vi thể gà bệnh nghi ngờ bệnh do virus IB 44

Hình 3.3 Bệnh tích phôi 45

Hình 3.4 Kết quả chạy RT - PCR 46

Hình 3.5 Cây sinh dòng virus gây bệnh IB thực địa 52

Hình 3.6 Lấy máu tĩnh mạch cánh 54

Hình 3.7 Một số bệnh tích của gà thí nghiệm ở lô 3 57

Hình 3.8 Khí quản tăng sinh mô dưới niêm (mũi tên cách quãng), thấm nhập nhiều lymphocyte, mất lớp biểu bì (mũi tên đen) (bên trái) (100 x); Phóng to hình bên trái (bên phải) (400 x) 58

MỞ ĐẦU

Đặt vấn đề

Chăn nuôi gia cầm ngày càng phát triển theo hướng công nghiệp với qui mô lớn, mật độ nuôi cao Gắn liền với phương thức chăn nuôi như hiện nay là việc phát

sinh một số bệnh Trong đó, viêm phế quản truyền nhiễm (Infectious bronchitis, IB)

là một trong những bệnh gây thiệt hại kinh tế lớn cho người chăn nuôi Đây là bệnh truyền nhiễm cấp tính, tốc độ lây lan cao, xảy ra hầu hết các nước có chăn nuôi gia cầm theo hướng công nghiệp trên thế giới Tỷ lệ bệnh có thể lên đến 80% tổng đàn mặc dù tỷ lệ chết thấp 20% (Gelb và ctv, 1991) Trên gà thịt, bệnh không những làm giảm tăng trọng, tăng hệ số tiêu tốn thức ăn và chi phí thuốc thú y mà còn tạo điều kiện cho các bệnh khác phát triển Hơn nữa, nếu bệnh xảy ra trên gà đẻ sản lượng trứng cũng như chất lượng trứng sẽ giảm Tỷ lệ đẻ giảm có thể lên tới 50%

và sau đó khả năng phục hồi không hoàn toàn chỉ đạt 70 - 80% so với ban đầu (Nguyễn Thị Phước Ninh, 2008) Vì vậy, bệnh ảnh hưởng rất lớn hiệu quả trong chăn nuôi gia cầm

Năm 1996, Việt Nam phát hiện bệnh viêm phế quản truyền nhiễm đầu tiên khi nhập đàn gia cầm và sau đó bệnh xảy ra phổ biến và lan rộng (Trần Thanh Phong, 1996) Theo nghiên cứu của Trần Thanh Vân (2000), có sự hiện diện của hai biến chủng 4/91 và CR 88 mới trên đàn gà giống Tuy nhiên, việc phòng bệnh chỉ dựa vào một số loại vaccine nhập vào nước ta với qui trình phòng bệnh do các nhà sản xuất khuyến cáo Hơn nữa, virus gây bệnh này có nhiều serotype, biến đổi liên tục và một số serotype không tạo miễn dịch chéo với nhau (Roussan và ctv, 2008) gây khó khăn cho công tác kiểm soát bệnh Do đó, phân lập và định danh serotype virus gây bệnh IB từ gà không chỉ là bước đầu tiên trong việc xác định sự lưu

hành serotype gây bệnh mà còn làm cơ sở cho các nghiên cứu dịch tễ, sự biến đổi của virus để tìm ra giải pháp tốt cho chiến lược phòng và khống chế căn bệnh này

Xuất phát từ thực tế trên, chúng tôi tiến hành thực hiện đề tài: “Phân lập, định serotype virus gây bệnh viêm phế quản truyền nhiễm và phòng bệnh cho gà thịt bằng vaccine” dưới sự hướng dẫn của TS Võ Thị Trà An

Chương 1 TỔNG QUAN

1.1 Bệnh viêm phế quản truyền nhiễm

Bệnh viêm phế quản (Infectious bronchitis, IB) trên gia cầm là bệnh truyền nhiễm cấp tính, nguyên nhân do virus thuộc Coronavirus Bệnh có tốc độ lây lan

nhanh trên hầu hết các loại gà và ở mọi lứa tuổi Hơn nữa, bệnh gây rối loạn nghiêm trọng đường hô hấp làm gà chậm lớn, giảm đẻ, viêm thận, tăng urê huyết

1.1.1 Lịch sử bệnh

Năm 1930, bệnh viêm phế quản truyền nhiễm phát hiện đầu tiên chủ yếu trên đàn gà con ở Mỹ với biểu hiện điển hình là rối loạn đường hô hấp Năm 1936, Beach và Schalm đã phát hiện ra virus gây bệnh, đến năm 1937 người đầu tiên nuôi cấy thành công virus trên phôi trứng gà là Beaudette và Hudson Sau đó, bệnh được báo cáo phổ biến trên cả đàn gà thịt với triệu chứng hô hấp và gà đẻ làm giảm sản xuất trứng (Cavanagh và Gelb, 2008)

Trước năm 1956, người ta tưởng bệnh viêm phế quản truyền nhiễm chỉ có một serotype kháng nguyên đơn nhất Sau đó, người ta phân lập ra từ các ổ dịch nhiều serotype có tính kháng nguyên khác với serotype gốc Massachusetts (Nguyễn Lương, 1997).Nhiều serotype đã được phân lập ở Mỹ khác Massachuset ban đầu và sau đó hàng chục serotype phân lập ở châu Âu, châu Á, châu Phi, châu Úc Một số serotype sinh ra những triệu chứng bệnh giống nhau nhưng không có bảo hộ chéo hay trung hòa chéo với nhau Năm 1960, bệnh có thêm triệu chứng ở đường tiết niệu gây tổn thương thận do serotype mới hướng thận gây ra, ở thể này bệnh gây tỉ

lệ chết rất cao (Cavanagh và Gelb, 2008)

Bệnh phân bố trên toàn thế giới, những nước có nền chăn nuôi gia cầm công nghiệp bệnh xảy ra càng nhiều, ảnh hưởng đến lợi nhuận chăn nuôi Vì vậy, các nước nỗ lực đưa ra những chiến lược để ngăn chăn bệnh trên gà đẻ bằng cách kiểm soát sự tiếp xúc mầm bệnh ở giai đoạn đầu trước khi khởi phát hiện tượng giảm sản lượng trứng Đây là bước đầu tiên hướng tới việc sản xuất vaccine và các chương trình phòng bệnh sau này Hiện nay, dịch bệnh viêm phế quản vẫn thường xuyên xảy ra nhất là ở những nước có chăn nuôi gà công nghiệp và ngay cả những đàn đã chủng ngừa vaccine trước đó (Cavanagh và Gelb, 2008)

1.1.2 Căn bệnh

Theo Cavanagh và Gelb (2008), bệnh viêm phế quản truyền nhiễm do virus

thuộc họ Coronaviridae, giống Coronavirus, nhóm ba của chi Coronavirus Thuật

ngữ corona dùng chỉ những pelomer dạng dùi cui thưa, tạo thành tua nhọn có ánh

hào quang, tủa ra từ vỏ ngoài của virus giống như vương miện Coronavirus có vỏ

bọc, đa hình dạng nhưng chủ yếu có hình tròn , kích thước trung bình khoảng 120

nm (75 – 160 nm), trên bề mặt có những gai hình dạng cong dài 20 nm, bên trong

đa số các nucleoprotein được nhìn thấy ở dạng sợi, đường kính 1 - 2 nm nhưng vùng cấu trúc cuộn kích thước lớn hơn (10 - 15 nm) Hạt virus đầy đủ các gai có mật độ 1,18 g/ml, hạt ít gai có thể thấp hơn 1,15 g/ml, nên tránh ly tâm với lực quá mạnh hoặc nuôi cấy ở nhiệt độ 37 0 C sẽ làm mất gai bề mặt, ảnh hưởng khả năng gây bệnh của virus

Bộ gene virus có cấu trúc RNA sợi đơn, dương bản bao quanh bởi protein của nucleocapside có đối xứng xoắn Cấu tạo của lớp vỏ từ trong ra ngoài gồm lớp matrix protein liên kết với phần capside bên trong, lớp lipid và pelomer Bên trong lớp vỏ có những nucleotide hình ống, đối xứng xoắn và mang thông tin di truyền Tùy đặc điểm từng serotype khác nhau mà hạt virion có chiều dài khoảng 27,6 kb

mã hóa 3 - 4 protein cấu trúc đặc hiệu của virus là glycoprotein của gai (S - spike), glycoprotein của màng (M - membrane), protein nucleocapside bên trong (N) và protein nhỏ của màng (E) (Zou và ctv, 2010)

(Nguồn: The UK clinical virology network, 2001)

Hình 1.1 Cấu trúc Coronavirus

Sức đề kháng của virus đối với ngoại cảnh rất yếu, virus nhanh chóng mất hoạt lực khi gà bị bệnh chết Hầu hết các serotype bất hoạt ở 56°C trong 15 phút, ở 45°C trong 90 phút, ở nhiệt độ phòng có thể sống sót sau 1 - 2 ngày Ngoài trời, vào mùa xuân, virus sống được 12 ngày và mùa đông 56 ngày nên tránh lưu trữ virus ở -20°C trong thời gian dài Tuy nhiên, trong dung dịch túi niệu phôi gà cảm nhiễm virus có thể sống 30 năm khi bảo quản -30°C Mô bị nhiễm virus có thể bảo quản bằng glycerol 50% khi chuyển đến phòng thí nghiệm để chẩn đoán bệnh mà không cần làm lạnh (Cavanagh và Gelb, 2008) Virus bền vững ở pH 3 - 8 nên có thể đi qua đường tiêu hóa một cách an toàn (Trần Thị Bích Liên và Lê Anh Phụng , 2001) nhưng trong môi trường tế bào, virus bền vững ở pH 6-6,5 hơn là ở pH 7-8 Một số serotype có thể sống sót ở ether 20% tại 4°C trong 18 giờ, mất tính gây nhiễm đối với chloroform 50% tại nhiệt độ phòng trong 10 phút và sodium deoxycholate 0,1% tại 4°C trong 18 giờ, dễ nhạy cảm với các thuốc sát trùng như β-propiolactone 0,05

- 0,1%, formalin 0,1%…(Cavanagh và Gelb, 2008)

1.1.3 Biến đổi cấu trúc kháng nguyên và các phương pháp định type

Gai S có chiều dài khoảng 3,5 kb (Keeler và ctv, 2010), cấu tạo là glycoprotein, phần lớn nằm bên ngoài màng tạo thành các gai (spike) quan sát được trên bề mặt virus bằng kính hiển vi điện tử và phần nằm bên trong tạo thành chiếc đuôi ngắn gắn với capside Loại glycoprotein này là thành phần kháng nguyên chính của lớp vỏ virus gồm hai đoạn S1 và S2 khoảng 520 và 625 aminno acid tương ứng Tiểu đơn vị S1 có chiều dài 1,6 kb không những mang nhân tố quyết định kháng nguyên (epitope) tác động sản xuất kháng thể ngăn trở ngưng kết hồng cầu và phản ứng trung hòa mà còn đóng vai trò quan trọng tính kích thích hướng mô giúp virus kết bám vào màng tế bào vật chủ và quyết định độc tính virus (Zou và ctv, 2010) Mặt khác, S1 là phần dễ biến đổi đặc biệt là vùng acid amin thứ 53 đến 148 (Bayry

và ctv, 2005) Hiện tượng đột biến hoặc tái tổ hợp làm cho virus có khả năng biến đổi một phần cấu trúc của chuỗi polypeptid S1 dẫn đến sự thay đổi trình tự amino acid, epitope và glycoprotein tạo nhiều serotype khác nhau (Hussain và ctv, 2005)

Sự khác nhau giữa chuỗi S1nhiều hay ít là tiêu chuẩn xác định mối quan hệ họ hàng của chúng gần hay xa và liên tục phát sinh serotype mới Trước đây, phản ứng trung hòa chéo virus là một trong những phương pháp phổ biến để xác định mức độ quan

hệ giữa các serotype nhưng hiện nay phương pháp khuếch đại gene (Reverse transcriptase - polymerase chain reaction, RT - PCR), giải trình tự gene có nhiều ưu điểm hơn, chính xác hơn khi xác định mối quan hệ này và dễ dàng phát hiện serotype mới

Trên thế giới, các nhà khoa học ngày càng tìm ra rất nhiều serotype ở mỗi vùng địa lý khác nhau Ở Mỹ, serotype gây bệnh chủ yếu là Massachusetts kế đến là Connecticut 46, Arkansas 99, Iowa 97, Holte và Gray Châu Âu phân lập serotype D274 và D1466 (Hà Lan), 793/B (Anh), B1648 (Bỉ) và châu Úc là serotype T (Nguyễn Thị Phước Ninh, 2008) Sau này, các nghiên cứu sử dụng kỹ thuật RT - PCR và giải trình tự gene với đoạn mồi thiết kế từ các vùng gene S1 của virus viêm phế quản được phân lập từ các đàn gà ở Bắc Mỹ, châu Âu và châu Úc xác định có lưu hành sáu serotype bệnh viêm phế quản là Massachusetts, Connecticut,

Arkansas, JMK, Delaware (DE/072/92) và Califormia (CA/633/850) (Keeler và ctv, 1998) Ở Thụy Điển, bệnh IB cùng dòng với M41, H120 và D274 (Farsang và ctv (2002) Tại Ấn độ có sự lưu hành dòng PDRC/Pune/Ind/1/00 tương đồng 68% với

dòng 6/82 và 34,4% với dòng Mex/1765/99 (Bayry và ctv, 2005) Các nhà khoa học của Hà Lan cũng chứng minh có lưu hành hai serotype 793/B và QX (Blicharz và

ctv, 2007) Trong khi đó, Hàn Quốc cho biết có sự lưu hành các serotype KM91,

Ark và một nhóm mới chưa được báo cáo trước đó (Jang và ctv, 2007) Đàn gà thịt tại Jordan được xác định hiện diện ba serotype Mass, 4/91 và D274 (Roussan và

ctv, 2008) Đàn gà ở tỉnh Tứ Xuyên Trung Quốc được xác định serotye lưu hành chủ yếu là LX4 (Zou và ctv, 2010) Brazil có ba serotype Mass, 793B (4/91) và một

serotype mới Brazil (Villarreal và ctv, 2010) Như vậy, serotype gây bệnh viêm phế

quản hiện diện nhiều trên thế giới là Massachusetts (dòng M41, H120, H52), 793B (dòng 4/91, CR88), Ark một số serotype mới như QX, LX4 và trong tương lai chắc chắc nhiều seroptype mới sẽ được phân lập Điều này gây khó khăn cho việc sản xuất vaccine cũng như chiến lược khống chế bệnh bằng biện pháp tiêm phòng

1.1.4 Cơ chế sinh bệnh

Sự nhạy cảm với bệnh còn tùy thuộc vào nhiều yếu tố như lượng virus nhiều hay ít, tùy độc tính serotype gây bệnh mà tác động đến hệ thống hô hấp, tiết niệu hay sinh dục, trạng thái miễn dịch của cơ thể đã mắc phải hay được chủng ngừa bệnh trước đó, chế độ chăm sóc và dinh dưỡng, tuổi gia cầm bị bệnh Gia cầm nhỏ thường mắc thể hô hấp, gà lớn thể thận còn gà đẻ bị ảnh hưởng đến buồng trứng, ống dẫn trứng (Cavanagh và Gelb, 2008)

Virus nhân lên trong tế bào biểu mô của đường hô hấp, tiêu hóa, ống dẫn trứng hay tiết niệu từ 1 - 8 ngày sau cảm nhiễm Khi tiếp xúc với tế bào vật chủ enzyme neuraminidase của virus sẽ làm giảm khả năng phòng vệ của lớp niêm dịch

tế bào, cho phép chúng đi vào bên trong bào tương Đầu tiên vỏ ngoài của virus dung hợp màng tế bào, sau đó mRNA của virus cùng với lớp protein bao bọc xung quanh đi vào tế bào chất, kế đến mRNA sẽ thoát ra khỏi vỏ protein để tiến hành tổng hợp RNA và protein cho virus mới Cơ chế sinh bệnh chủ yếu là do virus tiết

ra các enzyme phân hủy thành phần tế bào và sử dụng các vật chất trong tế bào làm nguồn tổng hợp virus mới (Trần Thanh Vân, 2000) Virus mới bắt đầu xuất hiện sau

3 - 4 h cảm nhiễm (Hình 1.2) Gà nhiễm virus viêm phế quản có thể làm tăng cường

một số bệnh nhất là bệnh Mycoplasma hay kích hoạt bệnh này tiềm ẩn trong khí

quản (Cavanagh và Gelb, 2008)

(Nguồn: Wikipedia, 2010) Hình 1.2 Quá trình nhân lên của Coronavirus

Nếu virus nhân lên ở đường hô hấp, niêm mạc khí quản viêm dày lên nhiều lần, có thể hoại tử lớp biểu mô này Thêm vào đó sự bong tróc của tế bào vảy, sự tiết dịch nhày quá mức, tế bào lông rung hô hấp bị phá hủy không đẩy được dịch nhầy ra ngoài dẫn đến lòng khí quản hẹp lại gây khó thở, âm rale, hắt hơi, chảy nước mũi… (Trần Thanh Phong, 1996) Sau đó, virus theo máu xâm nhập vào các

cơ quan khác, đặc biệt là đường sinh dục và thận, khả năng gây bệnh phụ thuộc rất lớn các tác nhân khác Nếu có nhiễm trùng trước đó hay có sự hiện diện đồng thời

một số tác nhân khác như virus gây bệnh Newcastle, Mycoplasma gallisepticum, M

synoviae, E coli, Pasteurella multocida… làm giảm đáp ứng miễn dịch cơ thể, bệnh càng nặng hơn và gây rối loạn hô hấp phức tạp Ngoài ra, virus có thể phát triển trên nhiều tế bào đường tiêu hóa như thực quản, tá tràng, ruột, trực tràng, lỗ huyệt, một

số chủng châu Á có thể gây tổn thương trong dạ dày tuyến

Gà đẻ sau vài ngày nhiễm bệnh, virus theo máu đến cơ quan sinh sản và tiết niệu Gà sẽ có biểu hiện ăn uống ít, năng suất đẻ giảm nhất là vào tuần thứ hai sau khi nhiễm Sau đó khoảng 8 tuần, sản lượng trứng hồi phục nhưng không hoàn toàn

so với khi chưa mắc bệnh Virus gây tổn hại ống dẫn trứng nhất là chỗ phình lớn của ống dẫn trứng, nơi tạo vỏ trứng dẫn đến thay đổi màu vỏ, vỏ mỏng, trứng méo

mó cũng như chất lượng trứng giảm, lòng trắng có nhiều nước Khi gây bệnh viêm phế quản thực nghiệm, các nhà khoa học quan sát được hiện tượng biến đổi ống dẫn trứng gà con ba tuần tuổi như chiều dài ngắn hơn, đường kính lòng bị hẹp gây hiện tượng tắt nghẽn cũng như buồng trứng có những u nang hoặc virus trú ẩn thì không phát triển (Cavanagh và Gelb, 2008)

Một số serotype như Gray, Holte, Clark, Hollan, T… tác động lên những tế bào ở thận cùng với một số yếu tố quản lý như chế độ ăn giàu protein, canxi, chuồng nuôi có gió lạnh… dẫn đến khả năng loại thải, tái hấp thu của thận kém, gây hậu quả đến những nơi thận, niệu quản, gan hay cơ quan nội tạng khác tích nhiều urate, tăng tỉ lệ tử vong

1.1.5 Phương thức truyền lây

Trong tự nhiên bệnh chủ yếu xảy ra trên gà, mọi lứa tuổi đều mắc nhưng bệnh nặng và tỷ lệ chết cao trên gà con Tùy theo độ tuổi xảy ra thể bệnh khác nhau như hô hấp, thận hay sinh dục Gà con biểu hiện hô hấp trầm trọng hơn, tăng dần độ tuổi gà bị ảnh hưởng thêm thể thận và tổn thương nang noãn (nhất trên gà đẻ) Ngoài ra, bệnh có thể xảy ra trên một số gia cầm khác như trĩ, gà lôi…

Virus được phân lập từ khí quản, phổi, thận và tuyến Bursa từ ngày thứ 1 đến thứ 8, từ hạch ruột tại 14 tuần và phân lúc 20 tuần sau cảm nhiễm Ngoài ra, nguồn phân lập virus có thể từ một số cơ quan khác như nang noãn và dạ dày tuyến Nếu đàn gà bị nhiễm bệnh viêm phế quản cấp tính, nồng độ virus cao nhất trong khí

quản ở 3 - 5 ngày đầu và giảm dần theo thời gian Vì vậy, khi phân lập virus ta phải chọn mẫu bệnh phẩm là khí quản Ngược lại, khi lấy mẫu gà bệnh mãn tính nên chọn mẫu bệnh phẩm là đường ruột thì khả năng phát hiện virus cao hơn (De Wit,

2000) Như vậy, virus có nhiều trong bộ máy hô hấp nên chất tiết của đường hô hấp thông qua hắt hơi đều chứa virus Virus tồn tại trong không khí hoặc lắng xuống nhiễm vào thức ăn nước uống hay dụng cụ chăn nuôi Mặt khác, virus cũng có trong phân và được phân lập từ khí quản hay lỗ huyệt sau 49 ngày lành bệnh (Nguyễn Lương, 1997) Đây là nguồn gây nhiễm trùng dai dẳng của những cá thể trong đàn

Bệnh IB truyền lây chủ yếu qua đường hô hấp (bụi, không khí có chứa virus…) từ con này truyền sang con khác, từ đàn này sang đàn khác Vì vậy, bệnh

có khả năng lây lan trong đàn rất lớn chỉ trong vòng một ngày có thể lây lan toàn đàn Ngoài ra, bệnh có thể lây qua đường tiêu hóa, phân, dụng cụ chăn nuôi và người chăn nuôi đã tiếp xúc mầm bệnh Bệnh này không có động vật trung gian đóng vai trò truyền bệnh Hiện tượng lây qua trứng đến nay vẫn chưa xác định có hay không mặc dù trứng phân lập có virus sau 43 ngày lành bệnh (Nguyễn Lương, 1997)

có nhiều nước màu trắng, mào xanh tím, uống nước nhiều rồi nhả nước từ miệng ra nền chuồng làm ướt nền chuồng Ngoài ra, gà còn biểu hiện khó thở (vươn cổ lên thở), chảy nước mắt, nước mũi, ho (Hình 1.3)… sau 6 - 7 ngày, gà kiệt sức và chết,

tỉ lệ chết tới 30% nhất là những đàn không có kháng thể mẹ truyền (Cavanagh và Gelb, 2008) Ở gà đẻ trứng thường có biểu hiện ho, hắt hơi, chảy nước mắt nước

mũi, đặc biệt sản lượng trứng giảm tới khoảng 50% và kéo dài trong 6 - 8 tuần mới phục hồi nhưng không hoàn toàn, trứng méo mó, vỏ mỏng hay nhăn gợn sóng, lòng trắng trứng mất tính nhớt (Hình 1.4), lòng đỏ trôi nổi tự do, viêm màng bụng do tế bào trứng rơi vào xoang bụng (Nguyễn Thị Phước Ninh, 2008)

(Nguồn: Nguyễn Thị Phước Ninh, 2008)

Hình 1.3 Gà thở khò khè, vươn cổ thở khi bệnh IB

(Nguồn: Cavanagh và Gelb, 2008)

Hình 1.4 Lòng trắng trứng loãng gà bệnh IB (trên) và bình thường (dưới) Những gà bố mẹ đã bị nhiễm bệnh hoặc đã được tiêm phòng vaccine thì gà con nhận được miễn dịch từ mẹ truyền qua, chống được bệnh ở hai tuần tuổi Do vậy từ tuần tuổi thứ ba trở đi mới thấy phát bệnh với các triệu chứng điển hình như

gà hắt hơi, kêu toóc toóc, thở khò khè, vươn cổ lên thở, ăn kém, chậm lớn, xù lông

Nếu ghép với Mycoplasma bệnh sẽ nặng và kéo dài Một số đàn có thể nhiễm kế phát cả thương hàn, E.coli nên tiêu chảy phân trắng xanh và loãng

1.1.7 Bệnh tích

Cơ quan hô hấp có biểu hiện viêm phế quản, khí quản, phổi và chất nhày tiết

ra quá nhiều Dịch rỉ viêm do viêm cata sẽ trở thành casein, đặc biệt là trên gà con Túi khí có thể bị viêm, dày và đục Trên cơ quan sinh sản, ống dẫn trứng bị giảm kích thước, giãn nở các tuyến nhày, ống dẫn trứng còn bị phù, xơ hóa, những nang trứng chưa chín cũng bị u nang, tế bào trứng rơi vào xoang bụng gây viêm màng bụng, trứng bị méo mó Ở cơ quan tiết niệu, viêm thận kẽ, sưng và sung huyết thận, thận nhạt màu, ống dẫn tiểu chứa đầy urate, ống thận bị họai tử (Hình 1.5)

(Nguồn: Cavanagh và Gelb, 2008) (Nguồn: Uttara Krisht Prabha, 2008)

Hình 1.5 Thận sưng tích urate Hình 1.6 Khí quản xuất huyết

Khí quản xuất huyết (Hình 1.6) và phế quản mất lông rung, tế bào biểu mô tăng sản và thoái triển Lớp dưới biểu mô dày lên với phù và thấm nhập một lớp mỏng monocyte, lymphocyte và sự mất những tuyến nhày Ở cơ quan sinh sản, tế bào biểu mô thoái triển, giảm kích thước, thấm nhập tế bào lympho, dãn tuyến nhày Vì thế, chức năng của ống dẫn trứng bị ảnh hưởng dẫn đến trứng bị dị hình,

vỏ nhám, mềm và lòng trắng loãng có nhiều nước Cơ quan tiết niệu biểu hiện viêm

thận với sự thấm nhập lymphocyte vào mô kẽ, biểu mô ống thận hoại tử và sự tích urate trong ống thận Gà con bị nhiễm bệnh lúc một ngày tuổi sẽ phát triển bất thường ống dẫn trứng hoặc chỉ phát triển một phần, bị tắt nghẽn, có chiều dài ngắn hơn Nang noãn của gà có u nang, giảm trọng lượng mặc dù buồng trứng vẫn phát triển bình thường khi ống dẫn trứng bị tắt nghẽn, trứng sẽ rụng vào xoang bụng làm viêm màng bụng Đây là nguyên nhân gây hiện tượng gà đẻ giảm, ở đàn bị bệnh viêm phế quản khi tới thời kỳ đẻ trứng sản lượng trứng giảm so với đàn bình thường

1.1.8 Chẩn đoán bệnh

Chẩn đoán phân biệt bệnh viêm phế quản với bệnh Newcastle và viêm thanh

khí quản truyền nhiễm, cả ba bệnh đều biểu hiện rối loạn hô hấp như thở khó, viêm kết mạc mắt, chảy nước mắt, mũi Tuy nhiên, bệnh viêm phế quản có thể tiêu chảy phân trắng có nhiều nước, trên gà đẻ gây hư hại cả bên trong lẫn bên ngoài quả

trứng Bệnh Newcastle tiêu chảy phân xanh và có dấu hiệu thần kinh Bệnh viêm

thanh khí quản truyền nhiễm gà có biểu hiện khó thở trầm trọng hơn, chất tiết đường hô hấp nhuộm máu

Chẩn đoán bệnh viêm phế quản ngoài việc dựa vào các triệu chứng lâm sàng

và mổ khám bệnh tích nên dùng thêm một số phương pháp khác như xét nghiệm tìm kháng nguyên hay kháng thể, nuôi cấy phân lập virus, khuếch đại gene (Polymerase chain reaction, PCR), giải trình tự nucleotide … thì kết luận sẽ chính xác hơn

Phân lập virus có thể dùng bệnh phẩm là khí quản, phổi, thận, ống dẫn trứng Nếu mục đích phân lập chủng thực địa gây bệnh, tránh những chủng từ vaccin thì thời điểm lấy mẫu được khuyến cáo là gà sau ba tuần tiêm vaccin sống Hầu hết serotype của virus viêm phế quản được nuôi cấy trên phôi gà 09 - 11 ngày tuổi, qua đường tiêm xoang niệu mô (allantois) và lượng virus trong xoang niệu mô cao nhất

ở 1 - 2 ngày sau khi tiêm (De Wit, 2000) Virus rất dễ mọc ở môi trường này , gây cảm nhiễm ở trứng là phôi lùn, còi xương, cơ thể uốn cong hình cầu, hai chân ép lên đầu (Hình 1.7) và tổn thương bên trong, phôi tích urate trong thận Tỉ lệ chết phôi ngày càng tăng thường 90% phôi sống sót đến ngày thứ 19 (Cavanagh và Gelb ,

2008) Nuôi cấy trên môi trường tế bào như thận phôi gà (CEK), thận gà hay tế bào vòng sụn khí quản được chuẩn bị từ phôi gà 20 ngày tuổi sẽ gây bệnh tích tế bào đặc hiệu tạo các plaque và hợp bào (syncytium) là những thể hình cầu Ngoài ra, hiện tượng mất lông rung xuất hiện sau 3 - 4 ngày nhiễm được quan sát dễ dàng dưới kính hiển vi Nuôi cấy phôi gà và cơ quan khí quản được sử dụng rộng rãi để chuẩn độ hoặc phân lập virus

(Nguồn: Cavanagh và Gelb, 2008)

Hình 1.7 Phôi gà 16 ngày bình thường (trái), phôi cuộn tròn bệnh IB (phải)

Kỹ thuật phát hiện kháng nguyên thường dùng những đoạn khí quản hay những mô khác được thu thập từ những gà có triệu chứng bệnh hô hấp bằng phản ứng miễn dịch huỳnh quang (Immunofluorescence assay, IFA) hay phản ứng kết tủa khuếch tán trên thạch (Agar gel precipitation, AGP) là những phản ứng dựa trên nguyên tắc kết hợp kháng nguyên kháng thể khi sử dụng huyết thanh nhiều dòng hoặc kháng thể đơn dòng đặc hiệu cho bệnh viêm phế quản truyền nhiễm Mặt khác, phản ứng AGP còn dùng để khẳng định sự hiện diện của virus khi tiêm truyền vào trong phôi trứng (De Wit, 2000) d

Theo De Wit (2000), kháng thể bệnh IB trong huyết thanh gà được phát hiện bằng các phản ứng ELISA (Enzyme linked immunosorbent assay), miễn dịch huỳnh quang, miễn dịch khuếch tán (Immunodiffusion assay, IDA), trung hoà virus (Virus neutralization, VN), ngăn trở ngưng kết hồng cầu (Haemaglutination inhibition, HI)

Tuy nhiên, ba phản ứng ELISA, IFA và IDA có sự kết hợp kháng thể với kháng nguyên đặc hiệu nhóm Mặt khác, kháng thể chống lại một serotype nhất định không nhất thiết có sự hiện diện của serotype đó, điều này đồng nghĩa với việc thận trọng khi dùng các phản ứng này để kết luận serotype mới xuất hiện Do đó, ba phản ứng trên không phân biệt các serotype chính xác của bệnh Ngược lại, phần lớn serotype được xác định qua phản ứng HI và VN trừ một số nhỏ gây phản ứng chéo gây khó khăn cho phân loại (Cavanagh và Gelb, 2008) Tóm lại, phương pháp dùng kháng thể phát hiện bệnh sớm nhất bởi phản ứng ELISA, tiếp theo HI và cuối cùng là VN

Một số kỹ thuật sinh học phân tử như khuếch đại gene (PCR) là một kỹ thuật tiên tiến nhằm phát hiện virus nhanh và đặc biệt là khi chúng hiện diện với một lượng rất thấp, áp dụng trực tiếp đối với mô từ những con gà bị nhiễm bệnh hoặc sau khi virus được nhân lên trong trứng Đây là kỹ thuật mới thay thế phản ứng HI, VN và tỏ ra hiệu quả hơn trong việc phân biệt các serotype Hệ gene của

Coronavirus là một chuỗi RNA đơn nên cần tổng hợp một DNA bổ sung (cDNA) trước khi được nhân lên Vì vậy, sử dụng phản ứng RT - PCR là thích hợp nhất Tuy nhiên, độ nhạy của phản ứng thường thấp nếu sử dụng mẫu trực tiếp từ các cơ quan

gà bệnh Do đó, mẫu phải được nhân lên trong phôi trứng hoặc tế bào khí quản trước khi thực hiện kỹ thuật này (Meir và ctv, 2010) Kế đến, khi nghiên cứu dịch tễ

và muốn phân biệt chính xác serotype gây bệnh viêm phế quản phải sử dụng kỹ thuật cắt phân đoạn đa hình (Restriction enzyme fragment length polymorphism, RFLP), giải trình tự nucleotide…

Phương pháp RT - PCR tương đối nhạy cảm khi thực hiện trực tiếp trên bệnh phẩm khí quản và càng nhạy cảm hơn khi mẫu được khuếch đại qua phôi trứng Việc lựa chọn đoạn mồi thích hợp khi sử dụng kỹ thuật RT - PCR là điều cần thiết nhằm tăng độ đặc hiệu của phản ứng Với mục đích xác định sự hiện hiện virus, đoạn mồi được chọn là vùng bảo tồn hiện diện trong tất cả các serotype của bệnh viêm phế quản truyền nhiễm Ngoài ra, giải trình tự gene rất quan trọng trong việc xác định vị trí bảo tồn cần thiết cho cấu trúc và chức năng gây bệnh của virus Giải

trình tự có thể thực hiện trên bất cứ đoạn nào của bộ gene, tuy nhiên đối với virus gây bệnh phế quản phần được chọn thường là gene mã hóa vùng glycoprotein của gai (S) hoặc nucleocapside bên trong (N) Gene N bảo tồn cao giữa các serotype và

có nhiều trong các tế bào bị nhiễm nên có thể phát hiện với mẫu là các cơ quan gà bệnh mà không cần khuếch đại qua phôi trứng Vì vậy, khuếch đại hay giải trình tự gene N khi chỉ xác định sự hiện diện sự của virus và thời gian chẩn đoán nhanh mà

không cho phép xác định sự khác biệt giữa các serotype Ngược lại, Coronavirus có

bộ gene RNA với tần số đột biến cao, phần chính bộ gene không thay đổi chỉ thay đổi hoặc đột biến amino acid của gai S từ đó hình thành những serotype mới (De Wit, 2000) Do đó, các nhà khoa học nghiên cứu liên tục tình hình biến đổi các serotype và thường sử dụng gene S để phân biệt và phát hiện các serotype (Meir và ctv, 2010) Giải trình tự gene S1 thường xuyên nhất vì S1 là protein xác định serotype và kích thích cơ thể tạo bảo vệ miễn dịch Hơn nữa, sự thay đổi thứ tự amino acid của S1 (nhất là đột biến điểm trong những epitope) tạo serotype mới gây bệnh Một số serotype có thể tạo miễn dịch chéo nhưng các thí nghiệm cho thấy mức độ bảo vệ chéo giữa các serotype giảm đi khi sự khác biệt amino acid giữa các

S1 tăng Vì thế phân tích trình tự gene rất hữu ích cho việc mô tả chi tiết đặc điểm

phân tử các serotype làm cơ sở xây dựng chương trình kiểm soát bệnh tốt hơn Mặt khác, một số lớn trình tự gene hay biến đổi của tiểu đơn vị S1 (nhiều serotype) đã được công bố trong ngân hàng dữ liệu, tạo điều kiện thuận lợi cho nghiên cứu, so sánh và phát hiện serotype mới (Cavanagh và Gelb, 2008) Nhờ nhiều ưu điểm kể trên, kỹ thuật sinh học phân tử ngày nay được sử dụng phổ biến trong nghiên cứu dịch tễ và sự tiến hóa của virus gây bệnh IB

Mondal và Naqi (2001) đã chứng minh rằng gà mới nở có kháng thể từ mẹ ở mức độ cao sẽ được bảo hộ cao (>95%) chống lại việc công cường độc vào lúc một ngày tuổi nhưng thấp hơn lúc bảy ngày (<30%) Điều đáng chú ý là sự bảo hộ này liên quan tới mức độ kháng thể cục bộ trên đường hô hấp mà không liên quan tới kháng thể có trong huyết thanh Những gà con có kháng thể từ mẹ sẽ có kháng thể trung hoà virus đáp ứng lại sự tiêm phòng vaccine lần hai yếu hơn những gà con không có kháng thể từ mẹ Sau khi tiêm vaccine vào lúc một ngày tuổi, kháng thể từ

mẹ giảm xuống nhanh chóng hơn so với không tiêm vaccine nhưng tiêm chủng vẫn thành công khi đối mặt với kháng thể mẹ truyền (Davelaar và Kouwenhoven, 1977)

Khi công cường độc một serotype nào đó của bệnh viêm phế quản, nếu gà làm thí nghiệm vừa khỏi bệnh do nhiễm tự nhiên cùng serotype trước đó thì có khả năng đề kháng bệnh cao (bảo hộ đồng chủng), nhưng nếu gà nhiễm khác serotype thì mức độ bảo hộ thấp hơn (bảo hộ dị chủng) và không giống nhau tuỳ thuộc vào độc lực các serotypes khác nhau (Cavanagh và Naqi, 2003)

Sau tiêm vaccine nhược độc khoảng 3 - 4 tuần, gia cầm tạo miễn dịch chủ động cụ thể tiết IgA trong khí quản (bắt nguồn từ tuyến Harder) ngăn trở sự kết bám của virus trên bề mặt tế bào và bảo vệ đường hô hấp từ đó giảm tỉ lệ mắc bệnh (Trần Thanh Vân, 2000) Tuy nhiên, miễn dịch dịch thể không phải là nguồn bảo hộ duy nhất mà vai trò của miễn dịch trung gian qua tế bào đã được chứng minh qua phản ứng chuyển dạng lympho bào (Lymphocyte transformation assay) khi tiêm vaccine sống, hoạt động của tế bào lympho, quá trình quá mẫn muộn, hoạt động của

tế bào diệt tự nhiên và bằng chứng mô học đáng chú ý là sự xâm nhập từng tốp của

tế bào T (đặc biệt là CD4+) vào trong mô hô hấp và thận khi nhiễm bệnh viêm phế quản truyền nhiễm (Cavanagh và Gelb, 2008)

1.1.10 Phòng bệnh

Bệnh này không có thuốc điều trị, do đó chủ yếu là phòng bệnh bằng vaccine

và sử dụng một số kháng sinh có phổ rộng như tiamulin, spiramycin, tylosin, lincomycin, erythromycin, chlotetracycline … pha vào nước uống hoặc trộn thức ăn

liên tục 3 - 5 ngày để điều trị các vi khuẩn kế phát ở đường hô hấp do Mycoplasma, E.coli, Pasteurella, Staphylococcus…Tuy nhiên, trong trường hợp gia cầm bệnh IB

thể thận phải hạn chế dùng kháng sinh (nhất là các kháng sinh bài thải qua thận) mà

sử dụng các biện pháp khác như tăng nhiệt độ sưởi ấm trong chuồng nuôi, đồng thời giảm lượng protein động vật (bột cá) trong thức ăn, đưa các chất điện giải hoà vào nước cho gà uống liên tục 5 - 7 ngày, mục đích bổ sung thêm Na và K để giảm urê huyết, tăng khả năng hồi phục cơ thể Mặt khác, biện pháp an toàn sinh học rất hiệu quả trong việc phòng bệnh như sát trùng chuồng trại, chất độn chuồng, máng ăn, máng uống định kỳ Chăm sóc quản lý đàn đúng qui trình kỹ thuật, thực hiện biện pháp cùng vào cùng ra Đặc biệt, những lúc giao mùa hay chuyển chuồng hoặc tiêm phòng phải chăm sóc gia cầm tốt nhằm hạn chế hiện tượng stress xảy ra Chuồng trại phải thiết kế thông thoáng đảm bảo nhiệt độ và độ ẩm thích hợp Ngoài ra, nước uống phải sạch và thức ăn phối trộn đủ nhu cầu Khi phát hiện gà bị bệnh phải cách

ly, đối với gà mái đẻ bị bệnh thì tốt nhất là nên loại thải chúng, sau đó tiến hành sát trùng chuồng trại, dụng cụ chăn nuôi

1.1.11 Vaccine và đánh giá hiệu quả vaccine

Vaccine phòng bệnh IB có hai loại vaccine sống và vô hoạt Đối với vaccine sống thường phòng bệnh cho gà con, gà thịt bằng phương pháp nhỏ mắt, mũi hoặc

cho uống hoặc khí dung và phòng cùng lúc với vaccine Newcastle lần một lúc 1

ngày tuổi và lần hai khoảng 2 - 3 tuần tuổi Khi sử dụng vaccine nhược độc phải theo sự hướng dẫn của nơi sản xuất, đồng thời phải cách ly tuyệt đối gà khoẻ tiếp xúc với đàn gà bệnh IB Nếu không đàn gà bị nhiễm virus độc lực cao sẽ làm tăng khả năng phát bệnh IB ngay sau khi chủng ngừa vaccine nhược độc Đối với

vaccine vô hoạt thường dùng cho gà đẻ bằng phương pháp tiêm bắp hay tiêm dưới

da lúc 14 tuần tuổi

Ở Việt Nam, vaccine phòng bệnh viêm phế quản truyền nhiễm thường được

sử dụng ở hai dạng vaccine đơn và vaccine ghép (phối hợp từ 2 đến 4 bệnh) Một số vaccine đơn phải kể đến là Nobilis IB H120 (dòng H120 type Mass), Nobilis IB 4/91 (dòng 4/91), Galivac IB 88 (dòng CR 88), Gavilac Poulvac IBMM (dòng 1263 type Mass), Poulvac IBMM + ARK (type Mass và Ark DPI) Poulvac IB primer (dòng H120 và D274), Poulvac IB H120 (dòng H120 type Mass) đây là những vaccine sống dùng chủng cho gà con từ 1 ngày tuổi trở lên Vaccine ghép phối hợp

hai bệnh viêm phế quản và Newcastle được lưu hành là Nobilis MA5 + clone 30 (IB dòng MA5 type Mass, Newcastle dòng clone 30) và Polybron N63 (IB type Mass và Conn, Newcastle type B1, dòng lasota) đều là vaccine sống chủng cho gà từ 1 ngày

và 4 tuần tuổi trở lên Vaccine ghép phối hợp ba bệnh viêm phế quản, Newcastle và hội chứng giảm đẻ (IB dòng M41 type Mass, Newcastle dòng clone 30, EDS dòng BC14) hoặc phối hợp bốn bệnh viêm phế quản, Newcastle, viêm khớp và Gumboro

(IB type Mass, Reo dòng 1733 và 2408) là những vaccine vô hoạt dùng chủng cho

gà đẻ từ 16 -20 tuần tuổi Vaccine phối hợp phòng bốn bệnh viêm phế quản,

Newcastle, sổ mũi truyền nhiễm và hội chứng giảm đẻ (IB dòng M41 type Mass,

Newcastle dòng clone 30, COR4 dòng 083, Spross, H - 18 và 48, EDS dòng BC14)

vaccine vô hoạt dùng chủng cho gà đẻ từ 14 - 20 tuần tuổi và không nên dùng cho

gà đang đẻ trứng

Theo De Wit (2000), các yếu tố ảnh hưởng đến hiệu quả vaccine là tuổi gà con, sự hiện diện kháng thể mẹ truyền, đường đưa vaccine, phản ứng chéo giữa các serotype, hiện tượng ức chế miễn dịch, sự xuất hiện các serotype mới không tương đồng với vaccine sử dụng và yếu tố quan trọng là miễn dịch có nguồn gốc từ tiêm phòng hoặc nhiễm bệnh trước đó Cook và ctv (1999); Terregino và ctv (2008), chứng minh rằng qui trình chủng vaccine Ma5 lúc 1 ngày tuổi và IB 4/91 lúc 2 tuần tuổi có thể bảo vệ tốt đàn gà chống lại một số serotye và biến thể QX gây bệnh IB mặc dù không chống lại tất cả các serotype mới xuất hiện

Khả năng phòng bệnh bằng vaccine IB được đánh giá dựa vào hiệu giá kháng thể trước và sau tiêm phòng, triệu chứng, bệnh tích lâm sàng, tăng trọng bình quân, hệ số tiêu tốn thức ăn và hiệu quả kinh tế của đàn gà thí nghiệm Các phương pháp này không đánh giá được hiệu lực bảo vệ của vaccine IB Khi đánh giá khả năng phòng bệnh bằng vaccine IB bằng phương pháp công cường độc (xác định tỷ

lệ gia cầm đã được tiêm chủng sống sót sau khi thử thách bằng virus IB) thì cho biết hiệu lực bảo vệ của vaccine IB Tuy nhiên, đối với phương pháp này cần phải có một số điều kiện nhất định như gà dùng công cường độc phải là gà SPF, phải có phòng thí nghiệm riêng biệt và khu biệt lập để nuôi gà thí nghiệm nhằm hạn chế lây lan virus IB ra môi trường xung quanh Đối với phương pháp này, theo tiêu chuẩn thử nghiệm dược lý châu Âu khi đánh giá sự bảo vệ của vaccine IB được coi là hợp

lệ nếu virus công cường độc được phân lập trên 80% nhóm gia cầm thử nghiệm không sử dụng vaccine IB và vaccine IB coi là hiệu quả nếu virus công cường độc được phân lập ít hơn 20% nhóm gia cầm thí nghiệm có sử dụng vaccine IB (Terregino và ctv, 2008)

1.2 Kỹ thuật reverse transcriptase - polymerase chain reaction (RT - PCR) 1.2.1 Nguyên tắc

Theo Phạm Hùng Vân (2009), PCR là phương pháp khuếch đại một đoạn DNA chọn lọc dựa trên nguyên tắc của phản ứng sinh hóa nhờ hoạt động của enzyme polymerase và các chu kỳ nhiệt trong thời gian ngắn, tạo ra sản phẩm vô số bản sao DNA Khuếch đại được thực hiện trong một ống nghiệm nhỏ chứa dung dịch phản ứng (gọi là PCR mix) có thể tích vào khoảng 10-50 µl với thành phần chủ yếu là enzyme polymerase chịu nhiệt (Taq polymerase) có hoạt tính tối đa ở 720

C

và bền với nhiệt độ Bốn loại desoxyribonucleotide (dNTP) là adenine, thymine, guanine, cytosine (dATP, dTTP, dGTP và dCTP) DNA (deoxyribonucleic acid) chứa các đoạn DNA đích sẽ được nhân bản trong ống phản ứng Các đoạn mồi (primer) xuôi và ngược là các đoạn oligonucleotide có chiều dài khoảng 20 - 30 nucleotide có trình tự bổ sung một cách đặc hiệu với trình tự của hai đầu đoạn DNA

sẽ được nhân bản Ion Mg++ trong muối MgCl2ở nồng độ thích hợp Dung dịch đệm

Tris-KCl để làm dung môi phù hợp cho phản ứng Khi ống phản ứng này được cho vào buồng ủ chu kỳ nhiệt của máy luân nhiệt (thermal cycler) mà chúng ta thường gọi là máy PCR, chương trình nhiệt độ trong máy sẽ làm cho nhiệt độ trong buồng ủ nhiệt của máy thay đổi theo chu kỳ, nhờ vậy mà phản ứng nhân bản DNA sẽ xảy ra Phản ứng PCR là một chuỗi gồm nhiều chu kỳ nối tiếp nhau, một chu kỳ nhiệt gồm ba giai đoạn là (i) Giai đoạn biến tính: nhiệt độ sẽ được đưa lên 940

C, lúc này các liên kết hydro của mạch đôi DNA sẽ bị mất đi, nhờ vậy DNA đích bị biến tính thành các mạch đơn (ii) Giai đoạn bắt cặp: nhiệt độ sẽ được hạ xuống 55 - 650

C là nhiệt độ thích hợp để các đoạn mồi tìm đến bắt cặp bổ sung vào hai đầu của đoạn DNA đích nhờ enzyme polymerase chịu nhiệt (iii) Giai đoạn kéo dài: nhiệt độ được đưa lên 720C là nhiệt độ thích hợp cho hoạt tính của enzyme Taq polymerase hoạt động tối ưu để kéo các dNTP lại đầu 3’ của đoạn mồi đang bắt cặp trên đầu 5’ của sợi DNA đích bắt nguồn cho sự tổng hợp nên mạch bổ sung Bước này sẽ hoàn tất một chu kỳ và chu kỳ tiếp theo lại tiếp tục với ba giai đoạn như trên và lặp đi lặp lại cho hết số chu kỳ đã định (30 - 40 chu kỳ) Như vậy, một DNA đích đã nhân bản được thành 230 đến 240 bản sao, tức là đến hàng tỷ bản sao (Phạm Hùng Vân, 2009)

RT - PCR cũng giống như PCR thông thường nhưng nhằm mục đích khuếch đại đoạn khuôn từ gene RNA thay vì DNA Trong kỹ thuật này có hai giai đoạn khuếch đại được thực hiện là (i) Giai đoạn tổng hợp cDNA: RNA đích phải được phiên mã ngược nhờ enzyme reverse transcriptase thành cDNA Tổng hợp cDNA

có hai phương pháp Phương pháp thứ nhất đối với các loại virus có đuôi poly (A) thì sự tổng hợp cDNA có thể được thực hiện dựa vào các loại cặp mồi oligo (dT), cặp mồi đặc hiệu (chuyên biệt) hoặc cặp mồi ngẫu nhiên (đoạn gồm 6 nucleotide) Phương pháp thứ hai đối với các loại virus không có đuôi poly (A) thì sự tổng hợp cDNA chỉ dựa vào các cặp mồi đặc hiệu hoặc cặp mồi ngẫu nhiên (Hình 1.8) (ii) Giai đoạn tổng hợp DNA: dùng cDNA vừa được tổng hợp để khuyếch đại DNA với enzyme DNA polymerase, quá trình này cũng thực hiện qua ba giai đoạn như PCR thông thường Tuy nhiên, enzyme reverse transcriptase chịu nhiệt kém nên quá trình phiên mã ngược để tạo thành cDNA phải thực hiện ở nhiệt độ thấp (42 - 45°C) tạo

các sản phẩm không mong muốn khi các cặp mồi bắt cặp không đặc hiệu và giảm hiệu quả kéo dài chuỗi gene do sự hình thành RNA cấu trúc bậc hai Trong những điều kiện nhất định, sử dụng enzyme DNA polymerase chịu nhiệt (chiết xuất từ vi

khuẩn Thermus thermophilus) có thể thực hiện cùng lúc hai chức năng của enzyme

reverse transcriptase và enzyme DNA polymerase thì những trở ngại trên được giải quyết (Nguyễn Ngọc Hải, 2007)

Kỹ thuật RT - PCR có hai phương pháp thực hiện RT - PCR hai bước thực hiện giai đoạn tổng hợp cDNA trong một ống nghiệm, sau đó lấy sản phẩm cDNA cho vào ống nghiệm PCR để khuếch đại DNA đích muốn tìm, phương pháp này cần dùng dUTP và UNG để chống ngoại nhiễm RT - PCR một bước thực hiện cả hai giai đoạn tổng hợp cDNA và khuếch đại DNA trong cùng một ống phản ứng nhờ enzyme DNA polymerase chịu nhiệt

(Nguồn: Phạm Hùng Vân, 2009) (Hình a: mồi đặc hiệu; Hình b: mồi ngẫu nhiên)

Hình 1.8 Sơ đồ phản ứng RT – PCR

1.2.2 Các yếu tố ảnh hưởng

Kết quả RT - PCR phụ thuộc rất nhiều yếu tố như điều kiện khi lấy mẫu, quá trình thu nhận trữ mẫu, qui trình tách chiết RNA từ huyễn dịch chứa virus là một trong những yếu tố ảnh hưởng lớn đến kết quả RT - PCR đặc biệt là những huyễn dịch chứa virus thấp Bên cạnh đó, phân tử RNA không bền dễ bị phân hủy bởi các enzyme như là ribonuclease Vì vậy, khi tách chiết RNA phải thực hiện ba giai đoạn

cơ bản là phá màng tế bào, loại bỏ protein và tủa acid nucleic sao cho thu nhận lượng acid nucleic đủ lớn, đủ tinh sạch và ở trạng thái nguyên vẹn tối đa thì mới

thành công Mẫu dùng trong phản ứng RT - PCR phải có ít nhất một chuỗi RNA nguyên vẹn có chứa vùng gene cần xác định và đủ lượng mới không kìm hãm sự tổng hợp DNA, mẫu tinh sạch thì phản ứng xảy ra tối ưu Đoạn mồi là yếu tố quyết định độ đặc hiệu (chuyên biệt) của phản ứng và đóng vai trò khởi động hoạt động enzyme DNA polymerase khi đã ở trạng thái bắt cặp ở đầu 3’ DNA polymerase có tác dụng kéo dài đoạn bổ sung, nếu nồng độ quá cao sẽ tạo sản phẩm không chuyên biệt, nếu nồng độ quá thấp thì không đủ enzyme tạo ra sản phẩm PCR mong muốn Kết quả phản ứng đặc hiệu phải sử dụng enzyme phiên mã ngược (enzyme reverse transcriptase) chịu nhiệt 42 - 65°C Nồng độ desoxynucleotid triphosphate (dNTP) tùy thuộc từng phản ứng nhưng phải giữ bốn loại bằng nhau vì mất cân bằng sẽ xảy

ra lỗi sao chép của DNA polymerase Ion magnesium (Mg2+) tăng hoạt động của DNA polymerase, thời gian nóng chảy DNA Nồng độ Mg2+thường từ 1,2 – 2 mM

là tối ưu Khi sử dụng nồng độ quá cao tạo ra phản ứng không đặc hiệu do bắt cặp sai Ngược lại, khi nồng độ thấp sẽ ức chế hoạt động của enzyme giảm giai đoạn kéo dài chuỗi Nhiệt độ bắt cặp tùy thuộc từng phản ứng nhưng nhiệt độ cao sẽ không thực hiện được giai đoạn bắt cặp và khi nhiệt độ bắt cặp giảm thấp lại gia tăng hiện tượng bắt cặp gây phản ứng không đặc hiệu Thời gian kéo dài và nhiệt độ cũng tùy từng phản ứng chuyên biệt nhưng thời gian dài sẽ tăng hiệu suất các kỳ sau Dung dịch đệm có tác dụng cung cấp lực ion cần thiết cho phản ứng, pH tùy thuộc enzyme DNA polymerase được dùng và dung dịch đệm điển hình thường dùng gồm HCl, gelatin Ngoài ra, kết quả RT - PCR phụ thuộc vào trang thiết bị phòng thí nghiệm, biện pháp vệ sinh phòng ngừa nhiễm từ bên ngoài và giữa các mẫu, kỹ năng thao tác kỹ thuật cũng như kinh nghiệm người thực hiện…

1.2.3 Ứng dụng

RT - PCR thường được sử dụng trong các nghiên cứu gene của virus có bộ gene được cấu tạo RNA, chẩn đoán các bệnh di truyền, xác định sự phong phú các phân tử RNA trong tế bào hoặc hữu ích trong việc chèn các gene vi sinh vật nhân chuẩn vào vi sinh vật nhân sơ, nghiên cứu dịch tễ học phân tử, tạo thư viện DNA Đặc biệt, RT - PCR là kỹ thuật có độ nhạy và đặc hiệu cao để phát hiện RNA của

virus, chẩn đoán nhanh chính xác nguyên nhân gây bệnh, truy tìm nguồn gốc của căn bệnh, nghiên cứu kiểm soát sự biến chủng, sự xuất hiện các serotype mới, dự đoán sự tiến hóa của virus, xác định trình tự gene giúp phân biệt được các dòng virus, xác định khả năng sản xuất và kiểm tra hiệu quả bảo hộ của vaccine từ đó xây dựng các chiến lược và giải pháp kỹ thuật phòng chống bệnh một cách hiệu quả

Kỹ thuật RT - PCR có thể xác định bệnh viêm phế quản truyền nhiễm đã được phân lập được từ nước trứng hoặc mẫu trực tiếp từ các cơ quan gà bệnh theo qui trình của Keeler và ctv (1998), Roussan và ctv (2008) hay Meir và ctv (2010) với đoạn mồi được thiết kế là đoạn bảo tồn trong tiểu phần S1lần lượt là cặp CK4 và CK2, cặp CXE + và CXE -, cặp New S1OLIGO5 và Degenerate3 (Bảng 1.1)

CRA

Bộ gene virus viêm phế quản truyền nhiễm chỉ thay đổi hoặc đột biến amino acid của gai S, đặt biệt tiểu phần S1 từ đó hình thành những serotype mới (De Wit, 2000) Do tiểu phần S1 biến đổi liên tục, PCR suy biến thường được sử dụng khuếch đại đoạn gene này nhằm khuếch đại một hỗn hợp các chuỗi có liên quan trong một phản ứng Phương pháp PCR suy biến thường dùng các cặp mồi suy biến (cặp CK4 và CK2, cặp New S1OLIGO5 và Degenerate3), đây là những cặp mồi không giống hệt nhau được thiết kế dựa trên chuỗi protein S1 và bảng IUPAC (Bảng 1.2), thường ở dưới dạng hỗn hợp tương ứng với các hoán vị Vì vậy, đoạn mồi Degenerate3 có “ R” theo bảng IUPA có nghĩa là tương ứng với A hoặc G Tuy nhiên, khi sử dụng mồi suy biến trong kỹ thuật PCR sẽ làm giảm tính đặc hiệu

của phản ứng

Bảng 1.2 Bảng IUPAC cho suy biến

Ngoài ra, theo Jia và ctv (1996), Keeler và ctv (1998), Roussan và ctv (2008)

có thể dùng kỹ thuật RT-PCR định serotype viêm phế quản truyền nhiễm giống như xác định hiện diện virus này nhưng với cặp mồi đặc hiệu cho từng serotype trong tiểu phần S1 (Bảng 1.3) Tuy nhiên, điều hạn chế khi sử dụng kỹ thuật PCR định serotype là chỉ phát hiện serotype tương ứng cặp mồi mà không phát hiện serotype

mới phát sinh như kỹ thuật giải trình tự gene

Bảng 1.3 Trình tự đoạn mồi định serotype IB Tên

serotype

với

Kích thước

Tác giả

(1996) Ngược AAAGCAACGCCAGTTGTA

GA

De/072/92 Ngược TATGCCATAACAGGTGTA CK4 492

Ca/633/58 Xuôi CAGAAACAGGTTCTGCTAAC CK2 555

D274 Xuôi TTCCAATTATATCAAACCAGC CXE3- 217 Roussan

và ctv (2008)

CXE3- Ngược CAGATTGCTTACAACCACC