PHÂN TÍCH MỐI QUAN HỆ DI TRUYỀN VÀ NHẬN DIỆN 10 DÒNG VÔ TÍNH CAO SU BẰNG KỸ THUẬT ISSR (INTERSIMPLE SEQUENCE REPEATS)

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP HCM ***************** HỒNG THỊ LIỄU PHÂN TÍCH MỐI QUAN HỆ DI TRUYỀN VÀ NHẬN DIỆN 10 DỊNG VƠ TÍNH CAO SU BẰNG KỸ THUẬT ISSR (INTER-SIMPLE SEQUENCE REPEATS) Chuyên ngành: Trồng trọt Mã số : 60.62.01 LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC NÔNG NGHIỆP Hướng dẫn Khoa học: TS BÙI MINH TRÍ Thành phố Hồ Chí Minh, Tháng 06/2011 PHÂN TÍCH MỐI QUAN HỆ DI TRUYỀN VÀ NHẬN DIỆN 10 DỊNG VƠ TÍNH CAO SU BẰNG KỸ THUẬT ISSR (INTER-SIMPLE SEQUENCE REPEATS) HOÀNG THỊ LIỄU Hội đồng chấm luận văn: Chủ tịch: TS ĐỖ NGỌC DIỆP Công ty Cổ phần Đường Biên Hòa Thư ký: PGS.TS TRẦN VĂN MINH Viện Sinh học Nhiệt đới TP HCM Phản biện 1: TS NGUYỄN HỮU HỔ Viện Sinh học Nhiệt đới TP HCM Phản biện 2: TS VÕ THÁI DÂN Đại học Nông Lâm TP HCM Ủy viên: PGS TS PHAN THANH KIẾM Đại học Nông Lâm TP HCM i LÝ LỊCH CÁ NHÂN Tôi tên Hoàng Thị Liễu, sinh ngày 14 tháng 03 năm 1981, xã Vĩnh Trung, huyện Vĩnh Linh, tỉnh Quảng Trị Tốt nghiệp PTTH Trường Trung học Phổ thông Hùng Vương, thành phố Pleiku, tỉnh Gia Lai năm 1999 Tốt nghiệp Đại học ngành Nơng học, hệ qui Trường Đại học Nơng Lâm, thành phố Hồ Chí Minh năm 2004 Q trình cơng tác: Từ 2004 - 2009, cán nghiên cứu phụ trách cơng trình “Nhân giống cao su” tham gia cơng trình thuộc đề tài “Lưu giữ nguồn gen cao su” Bộ môn Giống, Viện Nghiên cứu Cao su Việt Nam Tháng năm 2009, theo học Cao học ngành Trồng trọt Trường Đại học Nông Lâm, Thủ Đức, thành phố Hồ Chí Minh Địa liên lạc: 1543 Đại lộ Bình Dương, phường Hiệp An, thị xã Thủ Dầu Một, tỉnh Bình Dương Điện thoại: Cơ quan: 06503.564596; Di động: 0907499262 Email: rrivhoanglieu@gmail.com ii LỜI CAM ĐOAN Tơi cam đoan cơng trình nghiên cứu Các số liệu, kết nêu luận văn trung thực chưa công bố cơng trình khác Hồng Thị Liễu iii LỜI CẢM TẠ Lòng biết ơn sâu sắc đến cha mẹ sinh thành nuôi dạy trưởng thành Lời cảm ơn chân thành đến chồng, trai gia đình bên chồng giúp đỡ động viên tạo điều kiện trình học tập Lời tri ân sâu sắc xin gởi đến Thầy - TS Bùi Minh Trí, dìu dắt, giúp đỡ cho tơi nhiều q trình học tập từ Đại học đến Cao học, người hướng dẫn khoa học cho thực đề tài Xin chân thành cảm tạ đến: - ThS Lại Văn Lâm - Viện trưởng Viện Nghiên cứu Cao su Việt Nam (VCS) Ban lãnh đạo Viện tạo điều kiện nghiên cứu cấp kinh phí đào tạo - ThS Lê Mậu Túy - Trưởng Bộ mơn Giống tồn thể cán công nhân viên Bộ Môn Giống - VCS giúp đỡ, tạo điều kiện tốt cho tơi hồn thành khóa học luận văn tốt nghiệp - ThS Lê Thị Thùy Trang - Phụ trách Phòng thí nghiệm CNSH, VCS giúp tơi xây dựng đề cương, dự tốn kinh phí thiết lập thí nghiệm đề tài - Ban Giám hiệu, Phòng đào tạo Sau Đại học, quý thầy cô khoa Nông học - Trường Đại học Nơng Lâm Tp Hồ Chí Minh tận tình giảng dạy, hướng dẫn tạo điều kiện để tơi hồn thành khóa học thuận lợi Cuối xin chân thành cảm ơn giúp đỡ động viên anh, chị, em, bạn bè, đồng nghiệp toàn thể thành viên lớp CHTT - 09 HỒNG THỊ LIỄU iv TĨM TẮT Đề tài "Phân tích mối quan hệ di truyền nhận diện 10 dòng vơ tính cao su kỹ thuật ISSR (Inter-simple Sequence Repeats)” thực Viện Nghiên cứu Cao su Việt Nam, Lai Hưng, Bến Cát, Bình Dương, thời gian từ tháng 06/2010 đến tháng 2/2011 Mục tiêu đề tài phân tích mối quan hệ di truyền nhận diện 10 dvt cao su bảng cấu giống khuyến cáo giai đoạn 2006 - 2010 Đề tài sử dụng kỹ thuật ISSR dựa quy trình Weising ctv (2005), thành phần phản ứng PCR điều chỉnh phù hợp với vật liệu điều kiện thí nghiệm Kết thu thành phần phản ứng PCR điều chỉnh phù hợp với nồng độ Taq 1,25 U nồng độ mồi M Hai mươi mồi ISSR qua sàng lọc thu mồi gồm T28, T30, T31, T33, T34 T38 cho sản phẩm đa hình ổn định 10 dvt cao su nghiên cứu Phân tích PCR với mồi 10 dvt tạo 53 băng DNA dao động khoảng 180 - 2600 bp, có 26 băng đa hình, chiếm tỷ lệ 49,1 % Hệ số tương đồng di truyền dvt dao động khoảng 0,810 đến 0,937, trung bình 0,873 Kết phân tích mối quan hệ di truyền dựa hệ số DICE phần mềm NTSYSpc 2.1 cho thấy, mức tương đồng truyền 0,876, dvt chia làm nhóm: nhóm I gồm dvt có phổ hệ gần gũi: LH 88/236, LH 88/72 RRIC 121; nhóm II gồm dvt có phổ hệ LH 90/952 LH 90/1094; nhóm III gồm dvt LH 83/85, LH 83/87, RRIM 600 PB 260 Bên cạnh đó, dvt IAN 45/873 tách khỏi nhóm mức tương đồng 0,848 Kết cho thấy phân bố dvt nhóm có liên quan đến phổ hệ, nguồn gen xuất xứ chúng Các dvt cao su nghiên cứu có mối quan hệ di truyền gần gũi, nhiên chúng có khác biệt, điều thể rõ qua kết phân tích 3D - PCA Sự khác biệt dựa sở hình ảnh kích thước vị trí băng DNA 10 dvt cao su với mồi ISSR sở để nhận diện 10 dvt cao su nghiên cứu Qua đó, quy trình nhận diện 10 dvt cao su kỹ thuật ISSR xây dựng v ABSTRACT The study “Genetic relationships and clonal identification among 10 rubber clones using ISSR (Inter-simple Sequence Repeats)” was carried out at Rubber Research Intitute of Vietnam, from June, 2010 to February, 2011 The objectives of this study were to evaluate the genetic relationships among 10 elite clones, selected from breeding recomendation classes of the period 2006 - 2010 and to identify them The ISSR technique based on an earlier published ISSR protocol by Weising et al., 2005 was applied to the study The contents of PCR were optimized with levels 1.25 U of Taq and M of primer Twenty ISSR primers were screened and primers including T30, T31, T34, T33, T28 and T38 produced clear, stable and polymorphic fragments of all samples A total of 53 amplified fragments ranging from 180 - 1600 bp were detected on 10 clones, of which 26 were polymorphic (49.1 %) The Dice similarity coefficient values ranged from 0.810 - 0.937; the mean of values was 0.873 UPGMA cluster analysis based on Dice genetic similarity segregated the studied clones into clusters at the value 0.876 The cluster I is formed from clones having close relatives: LH 88/236, LH 88/72 and RRIC 121 The cluster II consist of two clones having the same parents: LH 90/952 and LH 90/1094 The cluster III is formed by the others Besides, the clone IAN 45/873 separated from all the three above-mentioned clusters at 0.848 The dendrogram indicated that the distribution of clones in groups related to genetic resources, genealogy and locations of all clones Although the studied clones had close relative, genetic difference among them (as expressed by size and number of DNA bands) indicated by the results of 3D - PCA analysis was quite clearly Based on data of bands DNA with primers that would be trusted evident for identification of the 10 clones, the identification protocol of rubber clones by ISSR was built vi MỤC LỤC TRANG Trang tựa Trang chuẩn y i Lý lịch cá nhân ii Lời cam đoan iii Cảm tạ iv Tóm tắt v Abstract vi Mục lục vii Danh sách chữ viết tắt x Danh sách hình sơ đồ .xii Danh sách bảng xiii Chương MỞ ĐẦU 1.1 Đặt vấn đề 1.2 Mục tiêu nghiên cứu 1.3 Yêu cầu 1.4 Phạm vi đề tài Chương TỔNG QUAN 2.1 Giới thiệu tổng quát cao su 2.1.1 Nguồn gốc, phân loại 2.1.2 Đặc điểm hình thái 2.1.3 Điều kiện sinh thái 2.1.4 Đặc điểm di truyền cao su 2.1.5 Nguồn gen cao su giới 2.1.5.1 Nguồn gen cao su Đông Nam Á (Wickham) 2.1.5.2 Nguồn gen cao su Amazon 2.1.6 Tình hình sản xuất cao su giới vii 2.1.7 Tình hình sản xuất cao su Việt Nam 2.2 Giới thiệu loại thị di truyền 10 2.2.1 Chỉ thị hình thái 10 2.2.2 Chỉ thị phân tử 10 2.3 Một số kỹ thuật sử dụng thị phân tử nghiên cứu quan hệ di truyền nhận diện giống trồng 11 2.3.1 Kỹ thuật điện di Isozyme 11 2.3.2 Kỹ thuật RFLP (Restriction Fragment Length Polymorphism) 12 2.3.3 Kỹ thuật AFLP (Amplified Fragment Length Polymorphism) 13 2.3.4 Kỹ thuật RAPD (Random Amplified Polymorphic DNA) 13 2.3.5 Kỹ thuật PCR 14 2.3.6 Kỹ thuật SSR (Simple Sequence Repeats) 16 2.3.7 Kỹ thuật ISSR (Inter-simple Sequence Repeats) 17 2.3.8 So sánh giá trị số loại thị DNA 20 2.4 Các nghiên cứu mối quan hệ di truyền nhận diện giống cao su 22 2.4.1 Nghiên cứu quan hệ di truyền cao su nước 22 2.4.2 Nghiên cứu nhận diện giống cao su nước 25 2.4.2.1 Nghiên cứu nhận diện giống cao su thị hình thái 25 2.4.2.2 Nghiên cứu nhận diện giống cao su thị isozyme 26 2.4.2.3 Nghiên cứu nhận diện giống cao su thị DNA 27 2.4.3 Nghiên cứu nhận diện giống cao su nước 28 Chương NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 30 3.1 Thời gian địa điểm 30 3.2 Vật liệu nghiên cứu 30 3.2.1 Các dòng vơ tính cao su nghiên cứu 30 3.2.2 Mồi hóa chất thí nghiệm 31 3.2.3 Trang thiết bị thí nghiệm 32 3.3 Phương pháp nghiên cứu 32 3.3.1 Phương pháp lấy mẫu 32 viii 3.3.2 Phương pháp ly trích, định tính định lượng DNA 34 3.3.3 Thành phần hóa chất chương trình nhiệt cho phản ứng PCR - ISSR 34 3.3.4 Phương pháp phân tích kết 37 3.3.4.1 Sàng lọc mồi cho đa hình 37 3.3.4.2 Đánh giá tính ổn định kỹ thuật PCR - ISSR 37 3.3.4.3 Phân tích mối quan hệ di truyền 10 dvt cao su nghiên cứu 37 3.3.4.4 Nhận diện 10 dvt cao su nghiên cứu 38 Chương KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 39 4.1 Ly trích DNA dvt cao su nghiên cứu 39 4.2 Điều chỉnh thành phần phản ứng PCR - ISSR 41 4.3 Kết phân tích ISSR 43 4.3.1 Đánh giá tính đa hình mồi ISSR nghiên cứu 43 4.3.2 Đánh giá khả lặp lại kỹ thuật ISSR 44 4.3.3 Mối quan hệ di truyền 10 dvt cao su nghiên cứu 46 4.3.4 Nhận diện 10 dvt cao su nghiên cứu 52 4.3.4.1 Cơ sở liệu 52 4.3.4.2 Tiến trình nhận diện 10 dvt cao su nghiên cứu 53 Chương KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 55 5.1 Kết luận 55 5.2 Đề nghị 56 TÀI LIỆU THAM KHẢO 57 PHỤ LỤC 63 ix TÀI LIỆU THAM KHẢO Andy Vierstraete, 1999 Principle of the PCR Homepage of Andy Vierstraete < http://users.ugent.be/~avierstr/index.html> Akagi H., Yokozeki Y., Inagaki A., Nakamura A and Fujimura T., 1996 A codominant DNA marker closely linked to the rice nuclear restorer gene, Rf-1, identified with inter - SSR fingerprinting Genome 39: 1205-1209 Arnau G., Lallemand J and Bourgoin M., 2003 Fast and reliable strawberry cultivar identification using inter simple sequence repeat (ISSR) amplification Euphytica 129: 69-79 Baulkwill W J., 1989 The history of natural rubber production Longman Singapore Publishers (Eds Webster C C and Baulkwill W J.): 11-14 Besse P., Seguin M., Lebrun P., Chevallier M.H., Nicolas D and Lanaud C., 1994 Genetic diversity among wild and cultivated populations of Hevea brasiliensis assessed by nuclear RFLP analysis Theor Appl Genet 88: 199207 Besse P., Lebrun P., Seguin M., and Lanaud C., 1993 DNA fingerprints in Hevea brasiliensis (rubber tree) using human minisatellite probes Heredity 70: 237–244 Bornet and Branchard, 2001 Nonanchored Inter simple sequence repeat (ISSR) markers: reproducible and specific tools for genome fingerprinting Plant molecular bilogy reporter 19: 209-215 Botstein D., White R.L., Skolnick M and Davis R.W.,1980 Construction of a genetic linkage map in human using restriction fragment length polymorphism American Journal of Human Genetics 32: 314-331 Chevallier M.H, 1988 Genetic variability of Hevea brasiliensis germplasm using isozymes marker Journal of Natural Rubber Research 3: 42-53 10 Clement-Demange A., Legnateù H., Seguin M., Carron M P., Le Guen V., Chapuset T and Nicolas D., 2001 Rubber tree In: Tropical Plant Breeding CIRAD and Science Publishers, Inc., pp 455-480 11 Dice L.R 1945 Measures of the amount of ecologic association between species Ecology, 26: 297-302 12 Doyle J.J and Doyle J.L., 1987 A rapid DNA isolation procedure for small quantities of fresh leaf tissue Phytochemistry Bulletin 9: 11-15 13 Goulao L and Oliveira C.M., 2001 Molecular characterization of cultivars of apple (Malusdomestica Borkh.) using microsatellite (SSR and ISSR) markers Euphytica, 122: 81-89 57 14 Gupta M., Chyi Y-S., Romero-Severson J and Owen J.L., 1994 Amplification of DNA markers from evolutionarily diverse genomes using single primers of simple - sequence repeats Theor Appl Genet 89: 998-1006 15 Gupta P.K and Varshney R.K., 1999 The development and use of microstaellite marker for genetic analysis and plant breeding with emphasis on bread wheat Department of Agricultural Botany, Ch Charan Singh University, India, pp 163-185 16 Kitijuntaropas Y Wansomnuk P.P., 2007 Genetic diversity of thirteen cultivars of para rubber tree (Hevea brasiliensis Muell Arg.) in Thailand Agricultural Sci J 38 (6) (Suppl.): 19-24 17 Lại văn Lâm, Lê Mậu Túy, Lê Thị Thùy Trang, Huỳnh Đức Định, Huỳnh Thị Minh Tâm Hoàng Thị Liễu, 2010 Ứng dụng kỹ thuật RAPD nghiên cứu biến lượng di truyền nguồn gen Amazon lai cao su Wickham x Amazon Báo cáo tổng kết đề tài năm 2010 Viện Nghiên cứu cao su Việt Nam, trang 11-38 18 Lại Văn Lâm, Trần Thanh, Vũ Thị Quỳnh Chi Lê Mậu Túy 2009 Nghiên cứu đa dạng di truyền sưu tập IRRDB’81 thị RAPD Thông tin khoa học – công nghệ cao su thiên nhiên Bản tin 4, số 2/2009, trang 3-7 19 Lại Văn Lâm, Trần Thanh Lê Mậu Túy, 2005 Ứng dụng điện di isozyme nghiên cứu đa dạng di truyền quỹ gen cao su Tạp chí Nơng nghiệp Phát triển Nông thôn (số 2/2005): 25-31 Nhà xuất LĐXH 20 Lại Văn Lâm, Huỳnh Bảo Lam Trần Thanh, 2002 Ứng dụng kỹ thuật điện di isozyme công tác định danh giống cao su vườn nhân tược ghép Trong Báo cáo tham luận Hội nghị KH-CN tỉnh Nam Trung Bộ Tây Nguyên lần thứ Bộ Khoa học Công nghệ 21 Lebrun P and Chevallier M.H., 1988 Starch and polyacrylamide gel electrophoresis of Hevea brasiliensis: a laboratory manual IRCA - CIRAD publ, Montpellier, France 22 Leconte A, Le Guen V., Rodier-Goud M and Seguin M., 1997 Germplasm characterization and clonal identification through leaves zymogram analysis In Seminar: The Biochemical and Molecular Tools for Exploitation Diagnostic and Rubber Tree Improvement, 20-22 Oct Faculty of Science, Mahidol Univ, Bangkok, Thailand 23 Leconte A., Lebrun P., Nicolas D and Seguin M., 1994 Electrophoresis: Application to Hevea clone identification Plantations, research and development 1: 28-36 24 Lefebvre V and Chèvre A M., 1995 Tools for marking plant disease and pest resistance genes: a review Agronomic 15: 3-19 58 25 Lekawipat N., Teerawatanasuk K., Rodier-Goud M., Seguin M., Vanavichit A., Toojinda T and Tragoonrung S., 2003 Genetic diversity analysis of wild germplasm and cultivated clones of Hevea brasiliensis Muell Arg by using microsatellite markers Journal of rubber research 6: 36-47 26 Leonardi S., 2000 Evoluzione e genetica di popolazioni Italia, 27 Lê mậu Túy Trần Thị Thúy Hoa, 2003 Nhận diện kiểm định giống cao su vườn nhân Viện nghiên cứu cao su Việt Nam, 34 trang 28 Mercycutty V.C., Joshep G., Saraswathyamma C.K and Meenakumari T., 2002 Identification of Hevea clone Kottayam, Kerala, Indian, 103 pages 29 Meyer W., Michell T.G., Freedman E.Z and Vylgalis, 1993 Hybridization probes for conventional DNA fingerpringting used as single mồis in the polymerase chain reaction to distinguish trains of Cryptococcus neoformans Jour Clinical Boil 31: 2274-2280 30 Nagaoka, T and Y Ogihara 1997 Applicability of inter-simple sequence repeat polymorphisms in wheat for use as DNA markers in comparison to RFLP and RAPD markers Theor Appl.Genet., 94: 597-602 31 Nakkanong K., Nualsri C And Sdoodee S., 2008 Analysis of genetic diversity in early introduced clones of rubber tree (Hevea brasiliensis) using RAPD snd microsatellite markers Songklanakarin J Sci Technol 30 (5): 553-560 32 Newton C R and Graham A., 1997 PCR second edition Bio scientific publishers, Springer, Verlag, pp.18 - 23 33 Nguyễn Thị Huệ, 2006 Cây cao su Nhà xuất Tổng hợp TP Hồ Chí Minh, 476 trang 34 Ong S.H and Ramli O (1992) Status report of the 1981 Hevea germplasm centre at RRIES, Sungei Buloh, Malaysia, 1992 IRRDB’s symposium 1992, Indonesia, pp 22-52 35 Ong S.H and Tan H., 1987 Utilization of Hevea genetic resources in the RRIM Malay Appl Biol 16 (1): 145 – 155 36 Ong S.H., Mohn Noor A.G., Tan A.M and Tan H., 1983 New Hevea germplasm Its introduction and potential Proc RRIM Pltrs’ Conf 1983: 317 37 Page R D M., 1996 TREEVIEW: An application to display phylogenetic trees on personal computers Computer Applications in the Biosciences 12: 357358 38 Pavlicek A., Hrda S., Flegr J., 1999 FreeTree - Freeware program for construction of phylogenetic trees on the basis of distance data and 59 bootstrap/jackknife analysis of the tree robustness Application in the RAPD analysis of the genus Frenkelia Folia Biologica (Praha) 45: 97-99 39 Phamawati M., Yan G and Finnegan P., 2005 Molecular variation and fingerpringting of Leucadendron cultivar (Proteaceae) by ISSR marker Annals of Botany 95: 1163-1170 40 Prevost A and Wilkinson M.J., 1999 A new system of comparing PCR primers applied to ISSR fingerprinting of potato cultivars Theor Appl Genet., 98: 107-112 41 Raina S.N., Rani V., Kojima T., Ogihara Y., Singh K.P and Devarumath R.M., 2001 RAPD and ISSR fingerprints as useful genetic markers for analysis of genetic diversity, varietal identification and phylogenetic relationships in peanut (Arachis hypogaea) cultivars and wild species Genome, 44: 763-772 42 Ratnaparkhe M.B., Tekeoglu M and Muehlbauer F.J., 1998 Inter - simple sequence repeats (ISSR) polymorphisms are useful for finding markers associated with disease resistance gene clusters Theor Appl Genet 97: 515519 43 Reddy M P., Sarla N and Siddiq E.A., 2002 Inter simple sequence repeats (ISSR) polymorphism and its application in plant breeding Euphytica 128: 9-17 44 Rohlf F.J., 2000 NTSYS-pc, numerical taxonomy and multivariate analysis system, version 2.1 Exeter Publications, New York, USA, 2000, 38 pages 45 Sagar S Pandit, Sirsha Mitra, Ashok P Giri, Keshav H Pujari, Bhimarao P Patil, Narayan D Jambhale and Vidya S Gupta, 2007 Genetic diversity analysis of mango cultivars using inter simple sequence repeat markers Current Science, vol 93, No 8, pp 1135 – 1141 46 Sankar A.A and Moore G.A., 2001 Evaluation of inter-simple sequence repeat analysis for mapping in citrus and extension of genetic linkage map Theor Appl Genet 102: 206-214 47 Satoni S., Faivre-Rampant P., Prado E and Prat D., 2000 Marqueurs moléculaires pour l’analyse des resources génétiques et l’amélioration des plantes (Huỳnh Bảo Lam dịch) Cahiers Agricultures 9, pp 311-327 48 Seguin M., Gay C., Xiong T.C and Rodier-Goud M., 2001 Microsatellite marker for genome analysis of rubber tree (Hevea spp.) In Proceedings IRRDB Symposium 2001 - Biotechnology and Rubber Tree Montpelier, France 49 Seguin M., Besse P., Lebrun P and Chevallier M.H, 1995 Hevea germplasm characterization using isozymes and RFLP marker In Population Genetics and Genetic Conservation of Forest Trees (Eds: Baradat P., Adams W.T., 60 Müller-Starck G.) SPB Academic Publishing BV, Amsterdam, Netherlands, pp 129-134 50 Semagn K., Bjornstad A and Ndjiondjop M N., 2006 An overview of molecular marker methods for plants African Journal of Biotechnology Vol (25): 2540-2568 51 Tan H., Mukherjee T.K and Subramanian S., 1975 Estimates of genetic parameters of certain characters in Hevea brasiliensis Theor.Appl Genet 46: 181-190 52 Tanksley S., 1983 Molecular markers in plant breeding Plant molecular biology reporter 1: 3-8 53 Tổng cục thống kê Việt Nam, 2006 Niên giám thống kê 2005 NXB Thống kê, trang 268-269 54 Trần Thị Thúy Hoa, 1998 Nghiên cứu cải tiến chương trình lai hữu tính nhân tạo giống cao su Việt Nam Luận án Tiến sĩ, Đại học Nơng Lâm TP Hồ Chí Minh, Việt Nam 55 Trung tâm thông tin PT NNNT – Bộ Nông Nghiệp Phát triển Nông thôn (AGROINFO), 2008 Báo cáo thường niên ngành hàng cao su Việt Nam 2008 triển vọng 2009 Bộ Nông Nghiệp phát triển Nông Thôn, 87 trang 56 Tsumura Y., Ohba K and Strauss S.H., 1996 Diversity and inheritance of inter -simple sequence repeat polymorphisms in Douglasfir (Pseudotsuga menziesii) and sugi (Cryptomeria japonica) Theor Appl Genet 92: 40-45 57 Varghese Y.A., Knaak C., Sethuraj M.R and Ecke W., 1997 Evaluation of random amplified polymorphic DNA (RAPD) marker in Hevea brasiliensis Plant Breeding 116: 47-52 58 Venkatachalam P, Jayashree P.K., Sushmakumari S., Jayashree R, Rekha K., Sobha S., Priya P., Kala RG and Thulaseedharan A., 2007 Current perspectives on application of biotechnology to assist the genetic improvement of rubber tree (Hevea brasiliensis Muell Arg.): An Overview Functional Plant Science and Biotechnology 1(1): 1-17 59 Venkatachalam P., Thomas S., Priya P., Thanseem I., Saraswathyamma C.K and Thulaseedharan A., 2002 Identification of DNA polymorphism among clones of Hevea brasiliensis Muell Agr Using RAPD analysis Indian Journal of Natural Rubber Research 15: 172-181 60 Venkatachlam P., Sailasree R., Priya P., Saraswathyamma C K and Thulaseedaran A., 2001 Identification of a DNA marker associated with drawf trait in Hevea brasiliensis (Muell.) Arg through random amplified polymorphic DNA analysis In Proceedings IRRDB Symposium 2001 Biotechnology and Rubber tree Montpellier, France 61 61 Vos P., Hogers R., Bleeker M., Reijans M., Van de Lee T., Hornes M., Frijters A., Pot J., Peleman J., Kuiper M and Zabeau M., 1995 AFLP: A new technique for DNA Fingerprinting Nucleic Acids Research 23: 4407-4414 62 Weising K., Nybom H., Kirsten W and Kahl G., 2005 DNA fingerprinting in plants - Principles, Method and Applications Second edition, CRC Press, pp 148-150 63 William J.G.K., Kubelik A.R., Livak K.J., Rafalski J.A and Tingey S.V, 1990 DNA polynorphisms amplified by arbitrary primers are useful as genetic marker Nucleic Acids Research 18: 6531-6535 64 Zewei A., Han C., Aihua S., Jialin F and Huasun H., 2005 Identification of rubber clones by RAPD marker In Report on the International Rubber Research and Development Board conference Cochin, India, 6-8 November 2005, pp 88-92 65 Ze-wei A., Ai-Hua S., Han C., Hua-sun H and Jia-lin F., 2005 Genetic diversity among wild and cultivated accessions of Hevea brasiliensis (rubber tree) detected by RAPDs and ISSRs Journal of Tropical and Subtropical Botany, 2005, 13 (3): 246-252 66 Zietkiewicz E., Rafalski A and Labuda D., 1994 Genome fingerprinting by simple sequence repeat (SSR) - anchored polymerase chain reaction amplification Genomics 20: 176-183 62 PHỤ LỤC Phụ lục Quy trình tách chiết DNA theo phương pháp CTAB - Bước 1: Cân 0,2 g tươi rửa sạch, cho vào cối, nghiền mẫu với 1,2 ml dịch trích DNA (2 % w/v CTAB, 1,4 M NaCl, 20 mM EDTA, 100 mM Tris-HCl, pH 8,0) - Bước 2: Lấy phần dịch nghiền cho vào eppendorf (loại ml), vortex kỹ, đem ủ 65 oC 45 phút - Bước 3: Thêm vào 600 µl phenol: chloroform: isoamyl alcohol (25:24:1), vortex 1400 vòng 10 phút, ly tâm 14000 vòng phút 10 oC - Bước 4: Chuyển lấy dịch bên Thêm vào 600 µl phenol: chloroform: isoamyl alcohol (25:24:1), vortex 1400 vòng 10 phút, ly tâm 14000 vòng phút 10 oC - Bước 5: Chuyển lấy dịch trong, thêm vào µl RNase (nồng độ: 10 mg/ml), ủ 37 oC - Bước 6: Thêm vào 500 µl dung dịch isopropanol lạnh Để tủa -20 oC qua đêm - Bước 7: Ly tâm 14000 vòng phút 10 oC Đổ bỏ dịch - Bước 8: Thêm vào 300 µl TE X, ủ 37 oC - Bước 9: Thêm vào 20 µl sodium acetate M 640 µl ethanol 96 %, trộn đặt nhiệt độ - 20 oC 30 phút - Bước 10: Ly tâm 14000 vòng 10 phút 10 oC, đổ bỏ phần dịch - Bước 11: Rửa kết tủa lần với 400 µl ethanol 70 % cách ly tâm 10000 vòng phút 10 oC, đổ bỏ phần dịch trong, để khơ kết tủa hòa tan kết tủa 100 - 300 µl TE X (tùy theo hàm lượng DNA thu được), ủ 37 o C 30 phút - Bước 12: Bảo quản mẫu DNA thu điều kiện oC 63 Phụ lục Khảo sát tính đa hình khả lặp 20 mồi ISSR dvt LH 90/952 (1), LH 90/1094 (2), LH 83/87 (3) T32 L 3 T33 M T34 L 2 3 3 L 2 3 L 3 3 L 3 T40 T29 L T38 T31 L 1 T30 64 L RV L 1 2 RV 3 1 RV4 L 1 2 1 2 3 1 1 2 2 3 L 2 3 L 2 3 L 2 3 L 28 3 1 T35 L RV1 T27 L T36 3 65 1 RV5 L 1 2 T39 3 1 RV6 1 2 2 3 L 3 T37 3 L 66 1 2 Phụ lục Kết khảo sát tính đa hình khả lặp 10 dvt với mồi ISSR (các số thứ tự từ - 10 kí hiệu cho 10 dvt nghiên cứu; kí tự: a, b, c kí hiệu cho khác dvt lấy từ vườn khác nhau) T33-PCR1 L 1a 1b 1c 2a 2b 2c 3a 3b 3c 4a 4b 4c 5a 5b 5c 6a 6b 6c 7a 7b 7c 8a 8b 8c 9a 9b 9c 10a 10b 10c L T33-PCR2 L 1a 1b 1c 2a 2b 2c 3a 3b 3c 4a 4b 4c 5a 5b 5c 6a 6b 6c 7a 7b 7c 8a 8b 8c 9a 9b 9c 10a 10b 10c L T34-PCR1 L 1a 1b 1c 2a 2b 2c 3a 3b 3c 4a 4b 4c 5a 5b 5c 6a 6b 6c 7a 7b 7c 8a 8b 8c 9a 9b 9c 10a10b 10c L T34-PCR2 L 1a 1b 1c 2a 2b 2c 3a 3b 3c 4a 4b 4c 5a 5b 5c 6a 6b 6c 7a 7b 7c 8a 8b 8c 9a 9b 9c 10a 10b10c L 67 T28-PCR1 L 1a 1b 1c 2a 2b 2c 3a 3b 3c 4a 4b 4c 5a 5b 5c 6a 6b 6c 7a 7b 7c 8a 8b 8c 9a 9b 9c 10a 10b10c L T28-PCR L 1a 1b 1c 2a 2b 2c 3a 3b 3c 4a 4b 4c 5a 5b 5c 6a 6b 6c 7a 7b 7c 8a 8b 8c 9a 9b 9c 10a10b10c L T31-PCR1 L 1a 1b 1c 2a 2b 2c 3a 3b 3c 4a 4b 4c 5a 5b 5c 6a 6b 6c 7a 7b 7c 8a 8b 8c 9a 9b 9c 10a10b10c L T31-PCR L 1a 1b 1c 2a 2b 2c 3a 3b 3c 4a 4b 4c 5a 5b 5c 6a 6b 6c 7a 7b 7c 8a 8b 8c 9a 9b 9c 10a 10b10c L 68 T38-PCR L 1a 1b 1c 2a 2b 2c 3a 3b 3c 4a 4b 4c 5a 5b 5c 6a 6b 6c 7a 7b 7c 8a 8b 8c 9a 9b 9c 10a 10b10c L T31-PCR L 1a 1b 1c 2a 2b 2c 3a 3b 3c 4a 4b 4c 5a 5b 5c 6a 6b 6c 7a 7b 7c 8a 8b 8c 9a 9b 9c 10a 10b10c L 69 LH 90/1094 LH 90/952 PB 260 RRIC 121 RRIM 712 T38 LH 88/72 T31 LH 88/236 T30 LH 83/87 T28 LH 83/85 Mồi Trọng lượng phân tử (bp) IAN 45/873 Phụ lục Kết mã hóa liệu băng DNA với mồi ISSR 10 dvt 320 380 400 510 540 650 1000 1100 1430 1600 495 530 650 180 240 250 320 400 440 540 600 700 800 1000 1300 1400 1500 330 570 960 1100 1 1 1 1 0 1 1 1 1 0 0 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 0 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 0 0 1 1 1 1 1 1 1 0 1 1 1 1 1 1 1 0 1 1 1 1 1 1 1 1 0 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 0 1 1 1 0 1 1 1 1 1 1 1 0 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 0 1 1 1 0 1 1 1 1 0 1 1 1 1 0 1 1 1 70 LH 83/87 LH 88/236 LH 88/72 LH 90/1094 LH 90/952 PB 260 RRIC 121 RRIM 712 T33 LH 83/85 T34 Trọng lượng phân tử (bp) IAN 45/873 Mồi 300 330 370 500 530 600 650 930 1070 1150 1300 1500 180 230 310 340 400 450 520 600 650 770 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 0 1 1 1 1 1 1 1 1 0 1 0 1 1 1 1 1 1 1 1 1 0 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 0 1 0 1 1 1 1 1 1 0 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 71 ... Thủ Dầu Một, tỉnh Bình Dương Điện thoại: Cơ quan: 06503.564596; Di động: 0907499262 Email: rrivhoanglieu@gmail.com ii LỜI CAM ĐOAN Tơi cam đoan cơng trình nghiên cứu Các số liệu, kết nêu luận văn... nghiên cứu sản xuất thực cần thi t Bên cạnh đó, vấn đề quản lý tập đồn giống nghiên cứu sản xuất không phần quan trọng Sự nhầm lẫn giống nghiên cứu sản xuất dẫn đến thi t hại cơng sức chi phí đầu... Với vấn đề đặt tính khả thi kỹ thuật ISSR, đề tài: “Phân tích mối quan hệ di truyền nhận diện 10 dòng vơ tính cao su kỹ thuật ISSR (Inter-Simple Sequence Repeats)” thực cần thi t phù hợp với điều