Bài 1. Chọn lọc giống vi sinh vật Tóm tắt lý thuyết Vi sinh vật được sử dụng rộng rãi trong các quá trình công nghệ để tạo ra các sản phẩm hoặc cung cấp các chất trung gian tạo sản phẩm. Ngày nay, để thu nhận được chủng vi sinh vật sản xuất, có thể mua từ ngân hàng chủng hoặc sàng lọc chủng từ môi trường. Chủng có được từ ngân hàng chủng tuy nhanh, ít tốn kém song lại không có tính cạnh tranh. Cách phân lập từ tự nhiên với hai chiến lược “săn lùng” (shotgun) và có định hướng ( objective) tạo ưu thế độc quyền về chủng sản xuất và đóng góp cho sự phong phú, đa dạng về giống vi sinh vật. Chọn lọc giống vi sinh vật là phương pháp phân lập và phát hiện chủng vi sinh vật có đặc tính mong muốn từ các mẫu vi sinh vật hỗn hợp, sau đó cải tạo chủng vi sinh đó và bảo quản chúng trong môi trường thích hợp. Công việc này bao gồm các bước: phân lập từ tự nhiên, gây đột biến, phát hiện chủng vi sinh vật có đặc tính mong muốn và bảo quản giống Để phát hiện dòng vi sinh vật có đặc tính mong muốn có thể dựa vào: • Chất chuyển hóa tạo ra như: kháng sinh, sắc tố,… • Enzym ngoại bào tác động lên cơ chất trong môi trường như: amylase tinh bột, protease gelatin. • Sự thay đổi đặc tính sinh trưởng của vi sinh vật. • Sự thay đổi hình thái của vi sinh vật. Bảo quản giống có nhiều cách: giữ giống trên thạch, giữ giống dưới lớp dầu khoáng, giữ giống trong cát, đông lạnh và đông khô. Việc lựa chọn cách bảo quản đối với mỗi vi sinh vật thường dựa vào kinh nghiệm. Trong bài thực hành này, ta tiến hành: • Phân lập và phát hiện chủng vi sinh vật trong mẫu đất, có khả năng tiết amylase ngoại bào.
ĐẠI HỌC Y DƯỢC THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH KHOA DƯỢC Bộ môn Vi sinh – Ký sinh LỚP DCQ2014 BÁO CÁO THỰC TẬP CƠNG NGHỆ SINH HỌC DƯỢC Nhóm (sáng thứ 5)- Tiểu nhóm Nguyễn Thị Thu Hiền Võ Minh Hiếu Nguyễn Minh Hiếu Hồ Nguyễn Nguyên Hồ Bài Chọn lọc giống vi sinh vật 1.1 Tóm tắt lý thuyết - Vi sinh vật sử dụng rộng rãi q trình cơng nghệ để tạo sản phẩm cung cấp chất trung gian tạo sản phẩm Ngày nay, để thu nhận chủng vi sinh vật sản xuất, mua từ ngân hàng chủng sàng lọc chủng từ môi trường Chủng có từ ngân hàng chủng nhanh, tốn song lại khơng có tính cạnh tranh Cách phân lập từ tự nhiên với hai chiến lược “săn lùng” (shotgun) có định hướng ( objective) tạo ưu độc quyền chủng sản xuất đóng góp cho phong phú, đa dạng giống vi sinh vật - Chọn lọc giống vi sinh vật phương pháp phân lập phát chủng vi sinh vật có đặc tính mong muốn từ mẫu vi sinh vật hỗn hợp, sau cải tạo chủng vi sinh bảo quản chúng mơi trường thích hợp Công việc bao gồm bước: phân lập từ tự nhiên, gây đột biến, phát chủng vi sinh vật có đặc tính mong muốn bảo quản giống - Để phát dòng vi sinh vật có đặc tính mong muốn dựa vào: • Chất chuyển hóa tạo như: kháng sinh, sắc tố,… • Enzym ngoại bào tác động lên chất môi trường như: amylase- tinh bột, protease- gelatin • Sự thay đổi đặc tính sinh trưởng vi sinh vật • Sự thay đổi hình thái vi sinh vật - Bảo quản giống có nhiều cách: giữ giống thạch, giữ giống lớp dầu khoáng, giữ giống cát, đông lạnh đông khô Việc lựa chọn cách bảo quản vi sinh vật thường dựa vào kinh nghiệm - Trong thực hành này, ta tiến hành: • Phân lập phát chủng vi sinh vật mẫu đất, có khả tiết amylase ngoại bào Môi trường phân lập: thạch tinh bột Thuốc thử: Lugol Vi sinh vật có khả tiết amylase tạo vòng sáng quanh chỗ mọc (do tinh bột bị phân giải thành glucose nên khơng có phản ứng màu với iod) • Phân lập phát chủng vi sinh vật mẫu đất có khả tiết protease ngoại bào Môi trường phân lập: thạch gelatin Thuốc thử: TCA (acid tricloroacetic) Vi sinh vật có khả tiết protease tạo vòng sán quanh chỗ mọc (do gelatin bị phân giải nên không tạo kết tủa với TCA) • Phát vi sinh vật có khả tiết kháng sinh dựa vào khả ức chế sinh trưởng với vi sinh vật khác 1.2 Kết bàn luận 1.2.1 Phát vi sinh vật sinh enzym amylase protease a Hình ảnh đĩa phân lập phát khả sinh enzyme Báo cáo TT CNSH Dược Page b Kết phân lập phát khả sinh enzym ngoại bào Bảng Kết phân lập phát khả sinh enzym ngoại bào Chủng Mô tả khuẩn lạc* Amylase** Protease** Kháng sinh** Khóm tròn nhỏ, mm mm trắng đục, có chỏm Khóm tròn, trắng 15mm mm đục, bìa cưa Báo cáo TT CNSH Dược Page 1.2.2 Phát khả sinh kháng sinh Bảng Kết phát khả sinh kháng sinh Chủng Bacillus Bacillus Bacillus Bacillus E coli** mm mm mm mm S aureus** 28 mm 10 mm 30 mm 28 mm 1.2.3 Bàn luận - Đối với việc phân lập phát vi sinh vật có khả tiết amylase ngoại bào: chủng vi sinh vật mẫu đất sau phân lập môi trường thạch tinh bột ủ 37 oC 24h có khả tiết amylase ngoại bào - Đối với việc phân lập phát vi sinh vật có khả tiết protease ngoại bào: chủng vi sinh vật mẫu đất sau phân lập môi trường thạch gelatin ủ 37 o C 24h có khả tiết protease ngoại bào - Đối với phương pháp phát khả sinh kháng sinh kháng sinh E.coli tiết khơng có khả ức chế chủng Bacillus kháng sinh S aureus tiết có khả ức chế chủng Bacillus với mức độ khác Báo cáo TT CNSH Dược Page Bài Đánh giá số đặc điểm có lợi của vi khuẩn probiotic 2.1 Tóm tắt lý thuyết - Probiotic vi khuẩn sống đưa vào thể với số lượng đầy đủ có lợi cho sức khỏe vật chủ - Ngày nay, chế phẩm sinh học từ vi sinh vật probiotic sử dụng rộng rãi đặc biệt chế phẩm từ vi khuẩn Bacillus subtilis (trị chứng viêm đại tràng viêm đường ruột….) - Một số tiêu chuẩn lựa chọn vi sinh vật làm probiotic bao gồm: Tính an tồn: khơng gây bệnh, gây độc Chức năng: có chức cân hệ vi khuẩn đường ruột, chống rối loạn tiêu hóa Các u cầu cơng nghệ: sản xuất với quy mô lớn, ổn định lúc bảo quản Khả sống sót đến đường tiêu hóa: chịu dịch vị muối mật Tính đề kháng kháng sinh: có mang gen đề kháng hay khơng, có có khả lây nhiễm sang vi sinh vật khác không - Ở thực hành ta khảo sát tỉ lệ sống sót vi sinh vật probiotic (tế bào sinh dưỡng bào tử vi khuẩn Bacillus subtilis PY79) dịch vị nhân tạo ( pH 3) dịch mật nhân tạo ( nông độ muối mật 0.3 0.5%) 2.2 Kết bàn luận 2.2.1 Đánh giá đặc điểm có lợi của vi khuẩn probiotic a Hình ảnh thử nghiệm khả chịu acid dịch vị dịch mật nhân tạo - Acid dịch vị Pha loãng cấp (1/100) Pha loãng cấp (1/1000) * Tế bào sinh dưỡng: - Đối chứng: Báo cáo TT CNSH Dược Page - pH 2: + 60 phút: + 90 phút: - pH 3: + 60 phút: + 90 phút: Báo cáo TT CNSH Dược Page * Bào tử - Đối chứng - pH 2: - 60 phút: - 90 phút: -pH 3: + 60 phút: Báo cáo TT CNSH Dược Page + 90 phút - Dịch mật nhân tạo: Báo cáo TT CNSH Dược Page b Kết khả chịu acid dịch vị dịch mật nhân tạo Bảng Kết đánh giá khả chịu dịch vị nhân tạo* Thời (phút) gian pH MT pH Đối ch ng TBSD 70.10 Bào tử 215.10 MT pH Bào tử TBSD Bào tử TBSD 60 13.10 90 10 138.10 42.10 Bảng Kết ph n trăm tế bào sống sót Thời gian 6.10 88.10 ∞ pH dịch vị khác ( )** pH pH TBSD Bào tử TBSD Bào tử 60 18,57 64,18 8,57 40,93 90 1,43 19,53 ≈ 100 ** Tỉ lệ sống sót = Số tế bào thời điểm pH khảo sát/ Số tế bào mật đối chứng tương ứng x100 Bảng Kết đánh giá khả chịu dịch mật nhân tạo* Nồng độ muối mật (%) Thời gian (giờ) Đối ch ng TBSD 156.103 Bào tử 0,3 TBSD 0,5 Bào tử TBSD Bào tử 138.104 81.103 66.104 2.103 57.104 103 52.104 48.104 Báo cáo TT CNSH Dược Page Bảng Kết ph n trăm tế bào sống sót Thời gian nồng độ muối mật khác ( )** 0,3 0,5 TBSD Bào tử TBSD Bào tử 60 51,92 47,83 1,28 41,30 90 6,41 37,68 34,78 ** Tỉ lệ sống sót = Số tế bào thời điểm pH khảo sát/ Số tế bào mật đối chứng tương ứng x100 c So sánh khả chịu acid dịch vị muối mật dịch mật nồng độ khác - Acid dịch vị: • Khả sống sót vi sinh vật (VSV) dạng bào tử cao nhiều so với tế bào sinh dưỡng pH dịch vị khảo sát • Thời gian tiếp xúc với dịch vị nhân tạo lâu, số lượng tế bào sinh dưỡng bào tử giảm - Muối mật: • Khả sống sót vi sinh vật (VSV) dạng bào tử cao nhiều so với tế bào sinh dưỡng nồng độ muối mật khảo sát • Thời gian tiếp xúc với dịch vị nhân tạo lâu, số lượng tế bào sinh dưỡng bào tử giảm 2.2.2 Bàn luận -3 Số lượng vi khuẩn ban đầu sử dụng là: 0.4x10 x50x10 = 2.10 A Muối mật - Ở nồng độ muối mật 0,5%, tỷ lệ sống sót tế bào sinh dưỡng thấp nhiều so với nồng độ 0,3% bào tử thấp khơng đáng kể - Bào tử có khả chịu dịch mật tốt tế bào sinh dưỡng sau khoảng thời gian tiếp xúc với muối mật B Dịch vị nhân tạo - Khả sống sót dạng bào tử cao nhiều so với tế bào sinh dưỡng pH dịch vị khảo sát - Thời gian tiếp xúc với dịch vị nhân tạo lâu, số lượng tế bào sinh dưỡng bào tử giảm - Dạng bào tử sống sót tốt acid dịch vị, bào tử mọc nhanh giảm so với tế bào sinh dưỡng Bởi bào tử vi khuẩn có cấu trúc vỏ dày, chịu điều kiện khắc nghiệt môi trường * Các khó khăn q trình thực tập - Số lượng tế bào sinh dưỡng bào tử cần phải điều chỉnh cho OD600=0.5 - Các yếu tố ngoại nhiễm đặc biệt vi khuẩn từ khơng khí xâm nhập trình trải thạch dẫn đến đếm nhầm yếu tố ngoại lai Báo cáo TT CNSH Dược Page - Các yếu tố khác ảnh hưởng đến khả tồn phát triển Bacillus subtilis môi trường dịch vị nhân tạo dịch mật nhân tạo Báo cáo TT CNSH Dược Page 10 Bài Tinh chế enzyme amylase alginat 3.1 Tóm tắt lý thuyết - Enzym amylase enzym thủy phân tinh bột tìm thấy nhiều nguồn khác động vật, thực vật vi sinh vật Amylase có ý nghĩa mặt sinh lý, thương mại, cơng nghiệp, thực phẩm, dược phẩm - Trong ngành dược, amylase sử dụng để sản xuất glucose dịch tiêm truyền chuyển hóa tinh bột thành dextrin, tinh bột tan tá dược số thuốc - Tinh chế enzym bước quan trọng trình sản xuất enzym Có nhiều phương pháp tinh chế enzym amylase có phương pháp cố định lên aginate - Khi cho CaCl2 vào hỗn hợp enzym sodium alginat tạo thành hạt có cấu trúc bền vững (khoảng 0.54 mm) chứa enzym bên Enzym bao bọc màng không thẩm thấu enzym chất có trọng lượng phân tử cao, lại cho chất sản phẩm thẩm thấu qua cách dễ dàng Điều cho phép giữ enzym dung dịch gần giống tự nhiên tái sử dụng nhiều lần - Gel alginate có khả nhốt lượng lớn enzyme, hiệu suất nhốt enzym cao, thao tác kỹ thuật tiến hành đơn giản Hạt gel có cấu trúc bền vững Để ổn định hạt gel cho vào dung dịch glutaraldehyd khâu mạch khác Tuy nhiên gel lại khơng bền mơi trường có phosphate 3.2 Kết bàn luận 3.2.1 Hàm lượng protein Bảng Hàm lượng protein của enzym thô tinh chế Mẫu Thể tích (ml) OD280 Hàm lượng protein (mg) Enzym thô 0.9807 Vthô =10 196.14 Enzym tinh chế 0.5284 Vtinh chế = 22 11.6248 3.2.2 Hoạt tính enzym a Đường chuẩn hoạt tính enzym OD560 Bảng Thông số đường chuẩn tinh bột Ống U/ml OD Báo cáo TT CNSH Dược 0,2 0,4 0,6 0,8 0.1432 0.2922 0.4030 0.5398 0.6192 Page 11 Đường chuẩn: b Hoạt tính enzym Bảng Hoạt tính enzym thơ tinh chế Mẫu OD560 chứng Enzym thô 0,63385 0,21115 100 7707,6 39,2964 tinh 0,61595 0,5467 50 543,73 46,7732 Enzym chế OD560 thử Độ loãng pha Hoạt tính enzym (U) tổng Hoạt tính riêng (U/protein) Tính: Hiệu suất tinh chế Mức tinh chế Hiệu suất tinh chế: M c tinh chế: c Nhận xét hiệu suất tinh chế mức tinh chế -Hiệu suất tinh chế 7,054% thấp -Mức tinh chế có kết 1,19 lần Tuy đạt yêu cầu song thấp 3.2.3 Bàn luận - Sau tinh chế, hoạt tính riêng enzym tăng lên - Hiệu suất tinh chế thấp, lượng amylase bị thất q trình thao tác lớn Có thể thao tác chưa xác khơng cẩn thận Báo cáo TT CNSH Dược Page 12 trình thơi enzyme (do thơi enzyme chưa hết hay enzyme sót tủa gel, ) hay sai sót trình đo quang - Để đánh giá hiệu q trình tinh chế ta dựa vào mức tinh chế amylase Theo lý thuyết, mức tinh chế nên lớn (tốt 4) Kết 1,19 lần, đạt yêu cầu song q thấp Có thể thao tác chưa cẩn thận nên làm giảm hoạt tính amylase Quy trình tinh chế enzyme: Báo cáo TT CNSH Dược Page 13 Bài Cố định CGTase lên alginat 4.1 Tóm tắt lý thuyết - Cyclodextrin glucanotransferase (CGTase, EC 2.4.1.19) enzym vi khuẩn có vai trò chuyển hóa tinh bột chất tương tự khác amylopectin, glycogen, để tạo thành hỗn hợp cyclodextrin (CD) chất có mạch ngắn với 6, đơn vị glucose tương ứng α-CD, β-CD, γ-CD - Việc cố định enzym giúp thu hồi, bảo quản tái sử dụng enzym CGTase đắt tiền trước thay đổi môi trường pH, nhiệt độ,… mà hoạt tính enzym ổn định so với enzym tự - Sự cố định enzym gắn enzym hòa tan lên chất mang nhiều kỹ thuật khác nhau, enzym từ trạng thái hòa tan chuyển sang trạng thái khơng hòa tan Hiện có phương pháp: • Phương pháp vật lý: hấp phụ, liên kết ion, liên kết hydro, tương tác kỵ nước, lực Vander Waals,… • Phương pháp liên kết cộng hóa trị: cố định enzyme liên kết cộng hóa trị với chất mang hoạt hóa để tạo phức enzym – chất mang • Phương pháp bắt giữ enzym vào khn gel: enzym nhốt cấu trúc mạng gel có màng không thẩm thấu, chất sản phẩm không bị giữ lại qua được, phương pháp đơn giản enzym bị biến đổi q trình cố định • Phương pháp tạo vi nang: enzym giữ bao vi thể có màng bán thấm dày 200Å (cellulose, polysaccharid), hoạt động mơi trường dung dịch khả tiếp xúc enzym với chất lớn so với phương pháp giữ enzym vào khuôn gel - Trong thực tập tiến hành cố định enzym hai phương pháp: hấp phụ bắt giữ • Phương pháp bắt giữ dựa nguyên tắc enzym bị giữ mạng lưới gel Caalginat • Phương pháp hấp phụ dựa nguyên tắc enzym bị giữ bề mặt hạt gel 4.2 Kết bàn luận 4.2.1 Hàm lượng protein a Đường chuẩn BSA Bảng Thông số đường chuẩn BSA Ống nghiệm Nồng độ BSA (mg/ml) 0,2 0,4 0,6 0,8 1,0 OD595 nm 0,0952 0,1495 0,2343 0,3040 0,3493 0,4185 Báo cáo TT CNSH Dược Page 14 Đường chuẩn BSA theo nồng độ protein chuẩn b Hàm lượng protein Bảng Hàm lượng protein của enzym thô tinh chế Mẫu OD595 Thể tích (ml) Enzym ban đầu 0,2691 Vban đầu = 5,326 Vgộp = 44 1,675 Enzym không CĐ 0,3065 theo bắt giữ Hàm lượng protein (mg) Enzym CĐ theo bắt giữ 3,651 Enzym không CĐ 0,4585 theo hấp phụ Enzym CĐ hấp phụ Vgộp = 40 2,618 theo 2,708 4.2.2 Hoạt tính enzym a Đường chuẩn CD Bảng Thơng số đường chuẩn CD Số thứ tự Nồng độ CD (mg) 10 OD550 OD550 Báo cáo TT CNSH Dược 0,9104 0,7522 0,6005 0,4974 0,3825 0,2981 0,1582 0,3099 0,4130 0,5279 0,6123 Page 15 Đường chuẩn β-CD ΔOD 0,7 0,6 0,5 0,4 0,3 y = 0,0611x + 0,0316 R² = 0,9873 0,2 0,1 Nồng độ mg/ml 0 10 12 b Hoạt tính enzym Bảng Hoạt tính enzym Mẫu OD550 chứng OD550 thử Hoạt tính chung Hoạt tính riêng (U/mg (U) protein) Enzym ban đầu 0,8533 0,6032 63,015 11,8316 Enzym CĐ theo bắt giữ 0,7187 0,2395 4,7810 1,3095 Enzym CĐ theo hấp phụ 0,7311 0,6047 1,5189 0,5609 - Hiệu suất cố định: • Phương pháp hấp phụ • Phương pháp bắt giữ - Tỉ lệ hoạt tính: • Phương pháp hấp phụ • Phương pháp bắt giữ c Nhận xét hiệu suất cố định và tỉ lệ hoạt tính riêng enzym Báo cáo TT CNSH Dược Page 16 - Hiệu suất cố định enzym phương pháp bắt giữ cao 1,35 lần phương pháp hấp phụ Vì phương pháp bắt giữ enzym bị giữ bên hạt gel khơng được, q trình cố định khơng thuận nghịch Còn phương pháp hấp phụ q trình cố định thuận nghịch, enzym bị hấp phụ lên bề mặt hạt gel - Hoạt tính enzym bị cố định theo bắt giữ cao 2,34 lần so với hấp phụ - Hoạt tính enzyme bị cố định thấp nhiều so với enzyme tự do, lúc enzyme bị gắn với chất mang nên tiếp xúc enzym với chất bị cản trở mặt không gian cấu trúc enzym bị thay đổi, khả gắn với chất bị giảm 4.2.3 Bàn luận - Các phương pháp cố định CGTase lên alginate hấp phụ bắt giữ có ưu – nhược điểm khác hiệu suất cố định khác nhau: + Với phương pháp hấp phụ: Ưu điểm: phương pháp dễ thực hiện, thường ảnh hưởng đến hoạt tính enzym Nhược điểm: • Enzyme dễ bị hòa tan trở lại q trình sử dụng lặp lại nhiều lần, phương pháp hấp phụ vật lý, liên kết enzym với chất mang lỏng lẻo, độ bền liên kết enzym phụ thuộc vào pH lực ion • Ngồi q trình làm, thao tác thí nghiệm nhỏ dung dịch alginate CaCl2 nhanh không làm cho gel tạo có kích thước khơng đồng nhất, việc lọc rửa gel không cẩn thận làm enzym bị hấp phụ tan trở lại môi trường,… dẫn đến hiệu suất cố định thấp + Với phương pháp bắt giữ: Ưu điểm: enzym bị giữ chặt hơn, enzym không liên kết trực tiếp với chất mang, mà bị nhốt bên chất mang nên cấu trúc enzym khơng thay đổi Nhược điểm: • Khơng thể áp dụng phương pháp để cố định enzym mà chất có phân tử lớn, chất phân tử lớn khơng thể qua màng gel • Kích thước mắt lưới gel không đồng nên enzym ngồi Và kích thước mắt lưới phải đủ lớn để chất sản phẩm thoát phải đủ nhỏ để giữ enzym lại • Một số gốc tự tạo q trình trùng hợp tạo gel làm kìm hãm enzym phải ý đến nhiệt độ, pH điều kiện khác để tránh tạo gel ảnh hưởng đến enzym • Ngồi q trình làm, thao tác thí nghiệm thêm enzym vào alginate không lắc kỹ, việc tạo gel nhanh không nên enzym bị giữ lại không đồng hạt gel, viêc hấp phụ enzym lên bề mặt hạt gel xảy nên việc xác định thơng số có sai số - Nhìn chung, phương pháp bắt giữ ưu việt so với phương pháp hấp phụ, bên cạnh phương pháp có nhiều phương pháp có ưu điểm mà đưa vào sản xuất với quy mô lớn phương pháp cố định enzym liên kết cộng hóa trị, phương pháp tạo vi nang có nhiều ưu điểm vượt trội giữ Báo cáo TT CNSH Dược Page 17 bọc đồng thời nhiều enzym dãy phản ứng mà không làm ảnh hưởng đến cấu trúc enzym,… - Việc cố định enzym có nhiều ứng dụng quan trọng nhiều lĩnh vực nông nghiệp, công nghiệp, y học,… Chẳng hạn công nghiệp cố định enzym glucoisomerase enzym invertase để sản xuất loại siro giàu fructose hay sản xuất sữa không lactose việc cố định enzym β-Galactosidase lactase Trong y học cố định enzym penicillin amydase để sản xuất penicillin bán tổng hợp cố định enzym không tan steroid 11β-oxygenase Δ-dehydrogenase để sản xuất prednisolone điều trị bệnh thấp khớp,… Sơ đồ cố định CGTase theo phương pháp hấp phụ Nhỏ từ từ 15ml dung dịch alginate 2% vào 20ml dung dịch CaCl2 0,2M Để yên 10 phút Lọc Hạt gel Ca-alginate Cho hạt gel vào 20ml đệm Tris-HCl pH Thêm 1ml CGTase Cố định 45 phút Lọc Enzym bị hấp phụ Rửa lần với đệm Tris HCl pH Dịch lọc (giữ) Xác định V Gộp Enzym bị hấp phụ gel Dịch rửa Xác định V Dịch gộp Sơ đồ cố định CGTase theo phương pháp bắt giữ Báo cáo TT CNSH Dược Page 18 Thêm 1ml enzyme CGTase vào 10 dung dịch alginate 2% Nhỏ từ từ Dung dịch CaCl2 0,2M Để yên 10 phút Lọc Enzym bị bắt giữ Rửa lần với đệm Tris HCl pH Dịch lọc (giữ) Xác định V Gộp Enzym bị bắt giữ gel Dịch rửa Xác định V Báo cáo TT CNSH Dược Dịch gộp Page 19 Bài Tinh chế protein sắc ký trao đổi ion 5.1 Tóm tắt lý thuyết - Các phương pháp tinh chế protein dựa tinh chất hóa lý protein độ tích điện, kích thước phân tử, độ hòa tan…Đối với phương pháp tinh chế protein sắc kí trao đổi ion dựa tích điện khác trước thay đổi pH Mỗi protein có giá trị pH mà tổng điện tích âm dương nhau, hay nói cách khác điện tích 0, pH gọi pI ( điểm đẳng điện ) Khi pH dung dịch lớn pI protein tích điện âm ngược lại - Nhựa sắc ký trao đổi ion gồm chất rắn khơng tan gắn nhóm mang điện tích liên kết cộng hóa trị, nhóm mang điện tích liên kết với đối ion có điện tích trái dấu cách thuận nghịch nhờ tương tác tĩnh điện Có hai loại nhựa trao đổi ion: cationit anionit - Sắc ký trao đổi ion dựa vào trao đổi thuận nghịch điện tích protein với điện tích trái dấu pha tĩnh sắc ký, tùy theo cân ion pH dung dịch mà protein gắn vào hay bị đẩy khỏi nhựa - Nguyên tắc thực tập: dựa vào khác biệt pI lysozym(pI=10) so với protein khác lòng trắng trứng(pIpH tích điện dương bị giữ lại cột protein pI