LATS Y HỌC Nghiên cứu tác dụng kháng ung thư đại tràng người của virus vaccine sởi và quai bị trên thực nghiệm (FULL TEXT)

ĐẶT VẤN ĐỀ Ung thư đại trực tràng (colorectal cancer-CRC) là quá trình bệnh lý phát sinh từ đại trực tràng, gây nên bởi sự tăng bất thường các tế bào có khả năng xâm lấn hay lan rộng vào các bộ phận khác của cơ thể. Là quá trình bệnh lý phát triển qua nhiều giai đoạn, hậu quả từ sự tích lũy tăng dần của đột biến gen, đột biến ngoài gen và kết quả bất thường trong con đường tín hiệu nội bào Wnt. Số bệnh nhân bị CRC và số ca tử vong do CRC vẫn tăng theo thời gian. Những năm gần đây, đã có nhiều phương pháp mới, tiến bộ áp dụng điều trị CRC như: liệu pháp miễn dịch, gen trị liệu, điều trị đích, liệu pháp sử dụng các hạt nano, …. Mặc dù có các phương pháp điều trị mới với nhiều hứa hẹn, nhưng kết quả vẫn chỉ là kéo dài thời gian sống cho bệnh nhân, tiên lượng bệnh nhân CRC đã di căn sống trên 5 năm chỉ dưới 20%. Sự phát triển của sinh học phân tử đã cho chúng ta hiểu biết hơn về cơ chế bệnh ung thư và virus. Các nhà khoa học đã tạo ra các chủng virus có khả năng lây nhiễm và ly giải chọn lọc các tế bào ung thư, kích thích đáp ứng miễn dịch đặc hiệu kháng ung thư. Sử dụng virus ly giải tế bào u (OV) điều trị ung thư là một phương thức biến sự sao chép của virus thành vũ khí tiêu diệt các tế bào ung thư và hầu như không ảnh hưởng đến các tế bào lành. OV có nhiều lợi thế hơn so với các phương pháp điều trị ung thư truyền thống như: giảm độc tính tác dụng phụ, có khả năng áp dụng rộng rãi cho nhiều loại ung thư, là một phương thức tự khuếch đại các hoạt động kháng u bằng cách virus tự nhân lên ly giải tế bào u lan rộng. Hiện nay, với sự phát triển về sinh học phân tử, các nhà khoa học có thể thiết kế bộ gen của virus nhằm tăng khả năng lây nhiễm và ly giải tế bào ung thư đặc hiệu cũng như kiểm soát được mức độ virus nhân lên trong cơ thể. Liệu pháp sử dụng các chủng virus vaccine sởi (MeV) và virus vaccine quai bị (MuV) sống, giảm độc lực điều trị ung thư người đã được chứng minh có hiệu quả. Nhiều thử nghiệm lâm sàng sử dụng các virus này bằng các con đường khác nhau: tiêm nội u, tiêm tĩnh mạch, tiêm phúc mạc… điều trị nhiều loại ung thư như: u lympho tế bào T ở da, ung thư đại trực tràng, ung thư buồng trứng, u nguyên bào đệm đa dạng… đã được báo cáo là có kết quả khả quan (bảng 1.1). Trong nhiều năm qua, các chương trình tiêm chủng mở rộng với quy mô toàn cầu bằng MeV và MuV sống, giảm độc lực cũng đã rất thành công, thiết lập 1 hồ sơ an toàn rộng khắp thế giới. Các chủng MeV và MuV rất khó gây bệnh trở lại vì hầu hết mọi người đều đã được chủng ngừa. Bên cạch đó, hầu hết các nghiên cứu lâm sàng và tiền lâm sàng cũng đã chứng minh sử dụng MeV, MuV điều trị ung thư là an toàn và rất ít tác dụng phụ. Sử dụng MeV và MuV điều trị ung thư là liệu pháp có tiềm năng đang được quan tâm nghiên cứu ở nhiều nước phát triển. Nhưng cho đến nay vẫn chưa có nghiên cứu nào đi sâu đánh giá hiệu quả sử dụng phối hợp MeV và MuV điều trị ung thư đại tràng người. Nghiên cứu phối hợp MeV với MuV kháng ung thư đại tràng người trên thực nghệm sẽ mở đầu cho việc đi sâu nghiên cứu, áp dụng một phương pháp mới điều trị ung thư đại tràng người. Vì vậy, chúng tôi tiến hành đề tài “Nghiên cứu tác dụng kháng ung thư đại tràng người của virus vaccine sởi và quai bị trên thực nghiệm” với mục tiêu sau: 1. Đánh giá khả năng gây độc tế bào và chết tế bào theo chương trình (apoptosis) của phối hợp virus vaccine sởi và quai bị trên dòng tế bào ung thư đại tràng người HT-29 in vitro. 2. Đánh giá hiệu quả kháng u của phối hợp virus vaccine sởi và quai bị trên mô hình chuột thiếu hụt miễn dịch (chuột nude) mang khối u dòng tế bào ung thư đại trực tràng người HT-29.

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ QUỐC PHÒNG

HỌC VIỆN QUÂN Y

LÊ DUY CƯƠNG

NGHIÊN CỨU TÁC DỤNG KHÁNG UNG THƯ ĐẠI TRÀNG NGƯỜI CỦA VIRUS VACCINE SỞI

VÀ QUAI BỊ TRÊN THỰC NGHIỆM

LUẬN ÁN TIẾN SỸ Y HỌC

HÀ NỘI, NĂM 2019

ĐẶT VẤN ĐỀ

Ung thư đại trực tràng (colorectal cancer-CRC) là quá trình bệnh lýphát sinh từ đại trực tràng, gây nên bởi sự tăng bất thường các tế bào có khả năngxâm lấn hay lan rộng vào các bộ phận khác của cơ thể Là quá trình bệnh lýphát triển qua nhiều giai đoạn, hậu quả từ sự tích lũy tăng dần của đột biến gen,đột biến ngoài gen và kết quả bất thường trong con đường tín hiệu nội bào Wnt

Số bệnh nhân bị CRC và số ca tử vong do CRC vẫn tăng theo thời gian Nhữngnăm gần đây, đã có nhiều phương pháp mới, tiến bộ áp dụng điều trị CRC như:liệu pháp miễn dịch, gen trị liệu, điều trị đích, liệu pháp sử dụng các hạt nano, ….Mặc dù có các phương pháp điều trị mới với nhiều hứa hẹn, nhưng kết quả vẫnchỉ là kéo dài thời gian sống cho bệnh nhân, tiên lượng bệnh nhân CRC đã dicăn sống trên 5 năm chỉ dưới 20%

Sự phát triển của sinh học phân tử đã cho chúng ta hiểu biết hơn về cơ chếbệnh ung thư và virus Các nhà khoa học đã tạo ra các chủng virus có khả nănglây nhiễm và ly giải chọn lọc các tế bào ung thư, kích thích đáp ứng miễn

dịch đặc hiệu kháng ung thư Sử dụng virus ly giải tế bào u (OV) điều trị ung thư

là một phương thức biến sự sao chép của virus thành vũ khí tiêu diệt các tế bàoung thư và hầu như không ảnh hưởng đến các tế bào lành OV có nhiều lợi thếhơn so với các phương pháp điều trị ung thư truyền thống như: giảm độc tính tácdụng phụ, có khả năng áp dụng rộng rãi cho nhiều loại ung thư, là một phươngthức tự khuếch đại các hoạt động kháng u bằng cách virus tự nhân lên ly giải tếbào u lan rộng Hiện nay, với sự phát triển về sinh học phân tử, các nhà khoahọc có thể thiết kế bộ gen của virus nhằm tăng khả năng lây nhiễm và ly giải

tế bào ung thư đặc hiệu cũng như kiểm soát được mức độ virus nhân lên trong cơthể Liệu pháp sử dụng các chủng virus vaccine sởi (MeV) và virus vaccine quai

bị (MuV) sống, giảm độc lực điều trị ung thư người đã được chứng minh có hiệuquả

2

Nhiều thử nghiệm lâm sàng sử dụng các virus này bằng các con đường khácnhau: tiêm nội u, tiêm tĩnh mạch, tiêm phúc mạc… điều trị nhiều loại ung thưnhư: u lympho tế bào T ở da, ung thư đại trực tràng, ung thư buồng trứng, unguyên bào đệm đa dạng… đã được báo cáo là có kết quả khả quan (bảng 1.1).Trong nhiều năm qua, các chương trình tiêm chủng mở rộng với quy mô toàncầu bằng MeV và MuV sống, giảm độc lực cũng đã rất thành công, thiết lập 1 hồ

sơ an toàn rộng khắp thế giới Các chủng MeV và MuV rất khó gây bệnh trở lại

vì hầu hết mọi người đều đã được chủng ngừa Bên cạch đó, hầu hết các nghiêncứu lâm sàng và tiền lâm sàng cũng đã chứng minh sử dụng MeV, MuV điềutrị ung thư là an toàn và rất ít tác dụng phụ

Sử dụng MeV và MuV điều trị ung thư là liệu pháp có tiềm năng đangđược quan tâm nghiên cứu ở nhiều nước phát triển Nhưng cho đến nay vẫn chưa

có nghiên cứu nào đi sâu đánh giá hiệu quả sử dụng phối hợp MeV và MuV điềutrị ung thư đại tràng người Nghiên cứu phối hợp MeV với MuV kháng ung thưđại tràng người trên thực nghệm sẽ mở đầu cho việc đi sâu nghiên cứu, áp dụngmột phương pháp mới điều trị ung thư đại tràng người

Vì vậy, chúng tôi tiến hành đề tài “Nghiên cứu tác dụng kháng ung thư đại

tràng người của virus vaccine sởi và quai bị trên thực nghiệm” với mục tiêu

sau:

1 Đánh giá khả năng gây độc tế bào và chết tế bào theo chương trình (apoptosis) của phối hợp virus vaccine sởi và quai bị trên dòng tế bào ung thư đại tràng người HT-29 in vitro.

2 Đánh giá hiệu quả kháng u của phối hợp virus vaccine sởi và quai bị trên mô hình chuột thiếu hụt miễn dịch (chuột nude) mang khối u dòng tế bào ung thư đại trực tràng người HT-29.

3

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1 Giới thiệu chung

OV gần đây đã được công nhận là một phương pháp điều trị ung thư cónhiều hứa hẹn OV có thể là virus tự nhiên hoặc là virus đã biến đổi gen, cókhả năng nhân lên và giết chết các tế bào ung thư một cách chọn lọc mà hầunhư không làm tổn hại các tế bào bình thường xung quanh Khác với liệupháp gen, OV không đơn thuần là một chất mang gen trị liệu, nó là tác nhânthuốc điều trị ung thư Giả thuyết nhiễm virus có thể kháng ung thư bắt đầubằng phát hiện khối u bị thoái triển trong và sau khi nhiễm virus [1] Năm

1949, có 22 bệnh nhân bị bệnh Hodgkin được điều trị bằng chế phẩm chiếtxuất từ huyết thanh hoặc mô có chứa virus viêm gan, kết quả cho thấy viruslàm thoái triển các khối [2] Từ năm 1950 đến 1980, các thử nghiệm lâm sàngđiều trị ung thư được thực hiện bằng các chủng virus hoang dã hoặc các virus

tự nhiên, giảm độc lực, bao gồm cả virus viêm gan, virus West Nile, virusdengue và các adenovirus… [3] Tuy nhiên, những loại virus này chưa thực sựchứng minh được hiệu quả điều trị, cũng như chưa kiểm soát được độc tínhvới cơ thể cũng như mức độ virus nhân lên trong tế bào ung thư

Hiện nay, OV đã được công nhận là một phương pháp điều trị ung thư

Để tăng cường cho virus nhân lên và ly giải đặc hiệu tế bào ung thư, các nhànghiên cứu đã lựa chọn loại virus không gây bệnh cho người nhưng lại có khảnăng nhằm đích các tế bào ung thư, hoặc biến đổi bộ gen virus để tăng cườngkhả năng nhằm đích tế bào ung thư Đại diện cho chiến lược này là viruschủng reolysin, một biến thể của reovirus, có thuộc tính ly giải tế bào u thôngqua hoạt hóa tín hiệu RAS, do đó hạn chế được mức độ gây độc cho các tếbào bình thường Vào năm 1994, Mineta T và cộng sự đã chúng minh chủng

virus herpes simplex là hrR3 đột biến mang gen lacZ của Esckerichia coli, có

4

khả năng điều trị khối u não in vivo hiệu quả hơn nhiều so với các chủng

hoang dã [4] Tác giả có thể theo dõi được chủng virus này nhân lên rất tốttrong các tế bào ung thư não và hầu như không có độc tính với tế bào lành.Phát hiện này đã mở ra một lĩnh vực mới về thiết kế và biến đổi bộ gen của

OV làm tăng hiệu quả ly giải tế bào u

OV phát triển mạnh mẽ trong suốt ba thập kỷ qua, phát hiện quan trọngnhất trong quá trình hoạt động ly giải tế bào ung thư là OV có khả năng tạo ramiễn dịch đặc hiệu chống khối u [5] Hiện nay, vấn đề này đã được công nhậnđây là tính năng quan trọng của liệu pháp OV Có hai chủng virus biến đổigen đã được chấp thuận để tiếp thị dưới dạng thuốc: một là Oncorine (H101)

hay ONYX-015, một Adenovirus bị mất đoạn gen E1B, đã được các cơ quan

có thẩm quyền phê duyệt cho điều trị ung thư đầu, cổ và ung thư thực quản ởTrung Quốc năm 2005 [6] Cho đến nay, việc sử dụng Oncorine trên lâm sàngvẫn còn hạn chế Hai là T-Vec, 1 chủng virus herpes biến đổi gen, được cụcquản lý thực phẩm và dược phẩm Mỹ chấp thuận cho điều trị u tế bào hắc tốvào tháng 10 năm 2015, sau đó được phê duyệt ở Châu Âu vào tháng 1 năm

2016 và tại Úc vào tháng 5 năm 2016 [7] Nhiều thử nghiệm T-Vec trên lâmsàng hiện đang được các công ty dược phẩm thực hiện trên toàn thế giới nhằm

mở rộng ứng dụng và thị trường

Trong số các chủng virus ly giải tế bào ung thư, chủng MeV và MuVcho thấy có nhiều tiềm năng chống ung thư Đến nay, MeV và MuV đã đượcchứng minh là có khả năng kháng nhiều loại tế bào ung thư trong đó có cả

CRC in vitro, in vivo và cả trên lâm sàng ở các giai đoạn khác nhau Ngoài

tính lựa chọn đặc hiệu tế bào ung thư, MeV và MuV còn kích hoạt mạnh đápứng miễn dịch của vật chủ góp phần rất quan trọng vào hiệu quả ly giải tế bàoung thư [8], [9]

5

1.2 Ung thư đại trực tràng

1.2.1 Tình hình ung thư đại trực tràng

CRC vẫn là một gánh nặng sức khỏe rất lớn cho cộng đồng Trên thếgiới, nó là loại ung thư phổ biến thứ ba ở nam giới và phổ biến thứ hai ở nữgiới, là nguyên nhân đứng thứ ba gây tử vong liên quan đến ung thư Trongnăm 2017, ước tính có khoảng 95.520 trường hợp ung thư đại tràng và 39.910trường hợp ung thư trực tràng mới được chẩn đoán tại Mỹ Trong khi số liệucho thấy ung thư đại tràng ở nam giới (47.700 trường hợp) và nữ giới (47.820trường hợp) là khá bằng nhau, nhưng ung thư trực tràng ở nam giới (23.720trường hợp) lại cao hơn nữ giới (16.190 trường hợp) Tỷ lệ mắc bệnh cao nhất

ở thổ dân Alaska (91/100.000 người), người Mỹ gốc Phi (49/100.000 người),thấp nhất ở người Mỹ gốc Á và người dân đảo Thái Bình Dương (32/100.000người) Ước tính có 27.150 bệnh nhân nam giới và 23.110 nữ giới sẽ chết vìCRC vào năm 2017 [10]

Tỉ lệ mắc CRC rất đa dạng về tuổi, chủng tộc, sắc tộc và kiểu mắc Ởcác nước thu nhập cao, tỉ lệ ung thư đại tràng cao hơn ung thư trực tràng vàtăng khởi phát sau tuổi 50 là đặc trưng của ung thư trực tràng Tỷ lệ mắc CRCđang có xu hướng trẻ hóa người mắc Tỉ lệ mắc CRC tiếp tục giảm ở nhữngngười từ 50 tuổi trở lên (giảm 32% kể từ năm 2000) Có được xu hướng này

là do sàng lọc CRC có hiệu quả, có thể ngăn ngừa CRC sớm bằng cách pháthiện và loại bỏ polyp tiền ung thư Tỷ lệ mắc CRC giảm nhanh nhất ở nhữngngười từ 65 tuổi trở lên và đối với các khối u nằm ở đại tràng xa Trong khi

đó tỷ lệ giảm chậm nhất ở những người từ 50-64 tuổi và đối với các khối utrực tràng (giảm 9% tỷ lệ mắc khối u trực tràng ở nam giới từ 50-64 tuổi vàgiảm không đáng kể ở phụ nữ trong độ tuổi này; giảm 38% ở nam giới và41% nữ giới ở độ tuổi từ 65 tuổi trở lên) Tỷ lệ mắc CRC ở những người từ 50tuổi trở lên đang giảm ở hầu hết các tiểu bang của Mỹ, với mức giảm hơn 5%hàng năm từ năm 2009-2013 tại bảy tiểu bang (Nebraska, Maine, Rhode

6

Island, Delaware, Massachusetts, South Dakota và California) Đáng chú ý,các bang có tỷ lệ mắc cao nhất như: bang Kentucky, Mississippi và Louisiana.Trái ngược hoàn toàn với xu hướng tỷ lệ mắc CRC ở những người từ 50 tuổitrở lên, tỷ lệ mới mắc ở những người dưới 50 tuổi tiếp tục tăng, tăng 22% từnăm 2000-2013 Tương tự như mô hình tỷ lệ mắc, tỷ lệ tử vong của CRCgiảm 34% ở những người từ 50 tuổi trở lên trong giai đoạn 2000-2014, nhưnglại tăng 13% ở những người dưới 50 tuổi [10].

Năm 2012, dữ liệu từ GLO B O C A N cho thấy tỉ lệ mắc CRC cao nhất ởAustralia, New Zealand, Europe, Bắc Mỹ, tỉ lệ mắc thấp nhất được tìm thấy ởChâu Phi và Trung Nam Châu Á Tỉ lệ mắc CRC ở các khu vực khác nhau vềđịa lý có thể là do thay đổi ở chế độ ăn uống, môi trường tiếp xúc kết hợp với

sự nhạy cảm về di truyền đã có từ trước ở từng khu vực [11]

Tình trạng kinh tế xã hội thấp cũng liên quan với việc gia tăng nguy cơphát triển CRC, nguy cơ CRC tăng lên ở nơi tình trạng kinh tế xã hội thấp.Các nguy cơ có khả năng thay đổi được như: không hoạt động thể chất, chế

độ ăn uống không khoa học, hút thuốc lá, và béo phì… chiếm một tỉ lệ đáng

kể [12] Các yếu tố khác, đặc biệt là mạng lưới y tế dự phòng CRC kém ở cácnước điều kiện kinh tế thấp cũng góp phần đáng kể làm tăng tỉ lệ bị CRC

1.2.2 Nguyên nhân ung thư đại trực tràng

Ung thư đã được xác định là do biến đổi DNA trong tế bào gây ra.DNA là một chất trong nhân tế bào chứa đựng các gen điều khiển chức năng

tế bào Hiện nay, hiểu biết về các biến đổi DNA làm cho tế bào bình thườngchuyển thành ung thư đã rõ ràng hơn Trong DNA có những gen với chứcnăng điều khiển tăng trưởng tế bào, chia tách, chết tế bào, có các gen gây ungthư và gen ức chế khối u… Đáng chú ý, quá trình hình thành ung thư là docác đột biến DNA làm cho gen gây ung thư hoạt động hoặc làm bất hoạt gen

ức chế khối u Ngoài ra, sự thay đổi trong một số gen khác cũng có vai trò gây

ra CRC

7

1.2.2.1 Đột biến gen di truyền

Bệnh đa polyp tuyến và hội chứng Gardner: là do các đột biến di

chuyền ở gen coli gây polyp tuyến (APC), đây là một gen ức chế khối u, bìnhthường nó duy trì tế bào tăng trưởng trong giới hạn kiểm soát Những người

bị đột biến ở gen này, sự kìm hãm phát triển khối u trong tế bào bị “tắt”, do

đó, hình thành hàng trăm polyp ở đại tràng Theo thời gian, các đột biến genmới tiếp theo sẽ xảy ra ở tế bào trong các polyp này và hình thành ung thư

Hội chứng Lynch: là do những biến đổi ở các gen hỗ trợ sửa chữa

DNA Đột biến một trong các gen mã hóa các enzyme sửa chữa DNA làm choDNA bắt cặp sai, dẫn đến phát triển ung thư

Hội chứng Peutz-Jeghers: là do những biến đổi di truyền ở gen ức chế

khối u, làm chúng không hoạt động và kết quả là hình thánh các khối u

1.2.2.2 Các đột biến gen mắc phải

Một số đột biến gen xảy ra trong thời gian sống và không truyền quacác thế hệ, chúng chỉ có ở các tế bào sinh ra từ tế bào gốc bị đột biến Tronghầu hết các trường hợp bị CRC, đột biến gen mắc phải gây ra ung thư nhiềuhơn so với các đột biến gen di truyền Các yếu tố nguy cơ CRC đóng một vaitrò quan trọng trong việc tạo ra các đột biến mắc phải Không có đột biến genđơn gây ra CRC, hầu hết đột biến đầu tiên xảy ra ở gen ức chế khối u hay gengây ung thư, dẫn đến tế bào đại trực tràng tăng sinh không kiểm soát, các độtbiến tiếp theo có thể xảy ra sau đó ở các gen khác và gây ra CRC

1.2.3 Cơ chế bệnh sinh của ung thư đại trực tràng

1.2.3.1 Gen, vi môi trường và di truyền ngoại gen (epigenetic)

Các cơ chế bệnh sinh cơ bản của CRC là những vấn đề ở phạm vi rộngtrong lĩnh vực sinh học ung thư CRC là hậu quả từ tích lũy về cả biến đổi gen

và di truyền ngoại gen làm biến đổi tế bào biểu mô tuyến bình thường thànhung thư tuyến Các tế bào biểu mô tuyến có thể bị thay đổi cả cấu hình gen vàngoại gen để có được khả năng xâm lấn, di căn cơ quan xa, chủ yếu là đến

8

gan và phổi Tuy nhiên, cơ chế phân tử của CRC chưa được hiểu biết đầy đủ.Nhiều mô hình phân tử khác nhau đã được đề xuất cho cơ chế bệnh sinh CRC.Đầu tiên, mô hình Loeb khẳng định quá trình phát triển khối u được kíchthích bởi sự bất ổn định về gen, tạo ra số lượng lớn đột biến ngẫu nhiên và sựchọn lọc các đột biến này Kế tiếp ngay sau đó, công trình của Nowell về vaitrò sai lệch nhiễm sắc thể tạo ra khối u đã dẫn đến giả thuyết về từng kiểu genriêng lẻ của ung thư là do các vòng chọn lọc vô tính Cả 2 giả thuyết này cùngphù hợp với giả thuyết tạo khối u nhiều bước của Fould Trong 2 thập kỷ qua,các nghiên cứu mô hình Darwin Vogelstein về sự tiến triển của u tuyến thànhung thư biểu mô tuyến, cùng với các công trình nghiên cứu về gen ung thư đạitrực tràng di truyền không do polyp ở người đã cung cấp nhiều hiểu biết về cơchế bệnh sinh CRC Những nghiên cứu này đã đưa ra bằng chứng polyp ốngnhỏ và polyp tuyến hỗn hợp là các dạng tiền ung thư, chúng có thể tiến triểnthành ung thư biểu mô tuyến xâm lấn Tiến bộ hơn trong lĩnh vực nghiên cứuCRC, các nhà khoa học đã chứng minh được những phân nhóm nhỏ của polyptiền ác tính như polyp có răng cưa, rất dễ biến đổi thành CRC [13], [14] Tuynhiên, kết quả thu được từ các mô hình biến đổi gen gây CRC chỉ đưa ra đượcrất ít gen bị đột biến hình thành CRC, khó khăn cho việc chứng minh sự tíchlũy đột biến gen ở các trường hợp CRC lẻ tẻ Rất ít dữ liệu về giả thuyết biếnđổi gen trong các mô lão hóa để giải thích cho sự gia tăng theo cấp số nhân tỷ

lệ mắc CRC tương xứng với tuổi cao Hiện nay, có nhiều giả thuyết về cơ chếphân tử gây ra CRC, những cơ chế này liên quan đến cả đột biến di truyền vàbiến đổi ngoại gen Ví dụ, polyp có răng cưa liên quan đến sự bất ổn trình tựlặp ngắn (MSI) trong DNA và sự gia tăng quá trình methyl hóa làm bấtthường ngoại gen, cytosine và adenosine trong DNA Trong khi polyp ốngnhỏ thường gặp hơn do các biến đổi ở gen ức chế khối u đồng thời với bất ổnnhiễm sắc thể khác gây ra Hơn nữa, những tiến bộ về công nghệ sinh học,giải trình tự gen đã cho thấy có hàng ngàn thay đổi phân tử trong hệ gen CRC,

9

nhưng chỉ có một tập hợp nhỏ những thay đổi trong số này gây ra CRC Mặc

dù tồn tại các phân nhóm cơ chế phân tử gây CRC, nhưng cho đến nay vẫnchưa thể xác định được chính xác các phân nhóm này theo kiểu mô học hay

về lâm sàng Ngược lại, các thay đổi ngoài gen, kiểu hình methyl hóa đảoCpG có nhiều đóng góp về cơ chế bệnh sinh CRC [14] Ngoài sự kiện tăngmethyl hóa DNA thường xảy ra ở vùng khởi động của các gen ức chế khối u,điều tiết ngoại gen trong CRC bao gồm các biến đổi histone sau dịch mã, chủyếu là sự acetyl hóa, methyl hóa histone, chúng đóng vai trò quan trọng trongviệc điều hòa biểu hiện gen gây ung thư và gen ức chế khối u

Đột biến gen gây ra CRC: Giống như các loại bệnh ung thư khác, quan

điểm trước đây cho rằng CRC phát sinh từ hậu quả tích lũy các đột biến ở gen

ức chế khối u hoặc gen gây ung thư, mất chức năng cân bằng nội tại gây ra sựbiến đổi tế bào bình thường thành tế bào ung thư Phân tích trình tự bộ genCRC, người ta đã xác định có khoảng 13.000 gen đột biến trong hệ gen CRC,chỉ có khoảng 69 đột biến gen điều khiển được đề xuất là các đột biến có vaitrò hình thành CRC [15] Bộ gen ung thư chứa hàng ngàn đột biến, nhưng đếnnay, các nhà khoa học vẫn chưa xác định được đột biết nào có vai trò quyếtđịnh hình thành ung thư (đột biến điều khiển) và đột biến nào là những hậuquả của quá trình này (đột biến kéo theo) Một số nghiên cứu phạm vi rộng vềCRC đã chứng minh được phần lớn các đột biến kéo theo đều vô hại, không

có lợi thế chọn lọc Chỉ có một số đột biến điều khiển là yếu tố quan trọng gâyCRC và được chọn lọc Những đột biến điều khiển này ảnh hưởng đến mộtloạt các chức năng tế bào từ sự tăng sinh, di cư, sự biệt hóa, độ bám dính, chết

tế bào, ổn định và sửa chữa DNA CRC có thể được phân chia theo nhóm, tùythuộc vào loại hình bất ổn định của bộ gen mà chúng hiển thị Bất ổn nhiễmsắc thể được đặc trưng bởi tính bội không chỉnh, tăng số lượng nhiễm sắc thểhoặc mất nhiễm sắc thể Trong khi đó mất ổn định vùng vi vệ tinh của DNAđược xác định bởi sự hiện diện của đột biến chèn và đột biến đứt đoạn hay

10

xảy ra trong các trình tự lặp lại của DNA Loạn sản các cụm ống tuyến có thể

là do đột biến gen APC, dẫn đến hoạt hóa con đường tín hiệu Wnt, đó là một

cơ chế chung cho khởi phát polyp tiến triển thành ung thư Các đột biến gen

APC kéo theo là đột biến xảy ra ở gen KRAS hoặc TP53, thúc đẩy sự phát

triển các tế bào polyp tuyến chuyển thành ung thư Quá trình thành ung thưcũng có liên quan đến các đột biến trong con đường tín hiệu yếu tố tăngtrưởng chuyển dạng beta (TGFβ) Ở CRC, đột biến gen chịu trách nhiệm thụcảm thể TGFβ loại II xảy ra khoảng 30% Ngoài ra, các đột biến gen khác

trong con đường tín hiệu TGFβ, bao gồm cả gen SMAD2, SMAD4, RUNX3 và

TSP1 cũng có vai trò hình thành CRC Đột biến gen kích hoạt các gen gây

ung thư và bất hoạt gen ức chế khối u, làm thay đổi các con đường phát tín

hiệu tế bào đều góp phần hình thành CRC Ví dụ, gen KRAS là một gen gây

ung thư, nó phát tín hiệu thông qua protein B-Raf kích hoạt con đường tínhiệu protein kinase hoạt hoá phân bào Khoảng 55-60% CRC có các đột biến

trong gen KRAS hoặc gen B-RAF, kích hoạt con đường tín hiệu protein kinase

hoạt hoá phân bào gây tăng sinh tế bào và ức chế con đường chết tế bào theochương trình [16]

Ít gặp hơn là đột biến các gen MSH2, MSH6, MLH1 và PMS2 có vai trò

sửa chữa ghép đôi không xứng DNA ở dòng tế bào gốc, tạo ra đột biến dịchkhung và thay thế cặp base trong chuỗi lặp lại song song ngắn của DNA, gây

ra bất ổn trình tự lặp ngắn của DNA, gặp trong hội chứng ung thư đại tràng ditruyền không polyp /hội chứng Lynch Ngoại trừ đột biến điểm, gần 85%

CRC được đặc trưng bởi mất đoạn nhiễm sắc thể (8p21-pter, 15q11-Q21,

17p12-13, 18q12-21) và mất dị hợp tử Do đó, những bằng chứng này gần

như đã khẳng định vai trò của đột biến gen trong tế bào CRC, đặc biệt là độtbiến gen có chức năng điều tiết sự tăng sinh, di cư, biệt hóa, độ bám dính,chết tế bào và ổn định tế bào cũng như các gen sửa chữa DNA

11

Biến đổi di truyền ngoại gen gây CRC: Trong hai thập kỷ qua, chúng ta

đã chứng kiến sự bùng nổ về thông tin liên quan đến những thay đổi di truyềnngoại gen trong hệ gen ở nhiều tế bào ung thư bao gồm cả CRC Một sốnghiên cứu phạm vi rộng đã tập trung vào miêu tả “bối cảnh di truyền ngoạigen” Năm 1980, lần đầu tiên bất thường về di truyền ngoại gen trong CRCđược xác định Các cơ chế thay đổi di truyền ngoại gen có vai trò quan trọngtrong hình thành ung thư bao gồm sự methyl hóa bazơ cytosine của DNAtrong các dinucleotide ở CpG, những biến đổi sau dịch mã của các proteinhistone trung gian cho quá trình DNA cuộn vào trong nhiễm sắc thể, một quátrình điều tiết biểu hiện gen qua hình thể nhiễm sắc thể

microRNA là phân tử điều hòa di truyền ngoại gen của CRC: có một số

microRNA tăng lên trong tế bào CRC, đáng chú ý là: microRNA-31,microRNA-183, microRNA-17-5, microRNA-18a, microRNA-20a vàmicroRNA-92 cao hơn đáng kể so với tế bào đại trực tràng bình thường.Nhưng bên cạnh đó, microRNA-143 và microRNA-145 ở tế bào CRC lại thấphơn nhiều so với tế bào đại trực tràng bình thường, củng cố thêm giả thuyết tếbào CRC biểu hiện microRNA-18a cao thường có tiên lượng xấu microRNA-18a được chứng minh là một chất gây ung thư, nó kích hoạt gen gây ung

KRAS [17].

Các microRNA ức chế khối u và microRNA gây ung thư: Đánh giá về

vai trò của microRNA, các nhà khoa học đã chứng minh microRNA-135a vàmicroRNA-135b ảnh hưởng trực tiếp vào vùng 3' chưa được dịch mã của gen

ức chế khối u APC, trấn áp các biểu hiện của gen này và kích hoạt tín hiệu

con đường Wnt tạo ra CRC Ngược lại, microRNA-122a lại là một

microRNA ức chế khối u, nó làm tăng biểu hiện gen APC trong các dòng tế

bào ống tiêu hóa và ở các mô khác Những dữ liệu này chứng minh một cơ

chế kiểm soát hoạt động của gen APC qua trung gian microRNA và kích hoạt

con đường tín hiệu Wnt

12

Polyp tuyến thường là tiền thân của CRC, polyp tuyến tiến triển thànhCRC là một quá trình biến đổi gen và di truyền ngoại gen qua nhiều giai đoạn.Biểu hiện microRNA-21 tăng trong tế bào CRC có liên quan đến tiên lượngxấu và giảm thời gian sống ở bệnh nhân CRC, vì vậy, microRNA-21 có chứcnăng như một chất gây ung thư Hơn nữa, các báo cáo gần đây cho thấy biểuhiện microRNA-21 trong các u tuyến đại trực tràng cao hơn nhiều so với các

mô bình thường Như vậy, biểu hiện microRNA-21 tăng trong tế bào ở giaiđoạn sớm CRC Người ta đã chứng minh rằng microRNA-21 thúc đẩy tế bàoung thư di căn và xâm lấn bằng cách làm giảm protein 4, bất hoạt con đường

chết tế bào theo chương trình và gen ức chế khối u (tensin homolog) [18].

Nhiều nghiên cứu cũng cho thấy microRNA-143 và microRNA-145giảm đáng kể trong CRC, các locus mã hóa cho những microRNA này đều

nằm trên đoạn gen 5q23 [19] Cả microRNA-143 và microRNA-145 đóng

một vai trò quan trọng trong hoạt động ức chế khối u Gần đây người ta cũng

đã phát hiện ra vai trò ức chế khối u của microRNA-143 thông qua cơ chế tácđộng vào gen DNA methyltransferase 3a [20]

Điều hòa biểu hiện microRNA ở cấp độ phân tử trong tế bào CRC: Các

cơ chế phân tử chịu trách nhiệm cho việc điều tiết biểu hiện microRNA trong

tế bào ung thư người chưa rõ ràng Một nhóm các nhà nghiên cứu Nhật Bản

đã chứng minh gen ức chế khối u P53 làm tăng hoạt hóa một số microRNA,

bao gồm microRNA-16-1, microRNA-143 và microRNA-145 có vai trò ứcchế sau phiên mã của gen ung thư [21] Ngoài ra, có nghiên cứu cho thấy biểuhiện của microRNA ức chế khối u cũng có thể bị bất hoạt do bị methyl hóa

Về vấn đề này, các nhà khoa học đã được chứng minh microRNA-34b,microRNA-34c, microRNA-9-1, microRNA-129-2 và microRNA-137 gắnvào trong các đảo CpG, đây là mục tiêu của sự methyl hóa quá mức ở cácdòng tế bào CRC [22]

13

1.2.3.2 Tăng methyl hóa DNA trong ung thư đại trực tràng

Methyl hóa DNA là phản ứng cộng thêm một nhóm methyl vào vị trí 5'của cytosine dưới xúc tác của enzyme DNA methyltransferase để tạo thành 5-methyl cytosine Bình thường, hệ gen có hơn 70% cặp base cytosine củadinucleotide ở CpG bị methyl hóa, các đảo CpG nằm xung quanh vùng khởiđộng của gen thường không bị methyl hóa Methyl hóa DNA là điều cần thiếtcho sự phát triển ở động vật có vú và có nhiệm vụ quan trọng trong quá trìnhkhử hoạt tính nhiễm sắc thể X và ghi nhớ di truyền Ngược lại trong tế bàoung thư, chúng ta thường quan sát thấy giảm methyl hóa gen trong các vùngngoài vùng khởi động và tăng methyl hóa gen ở vùng khởi động, đặc biệt làcác gen ức chế khối u và gen sửa chữa DNA Tăng methyl hóa góp phần làmbất hoạt gen, làm bất ổn định bộ gen, giảm quá trình tế bào chết theo chươngtrình, sửa chữa DNA và kiểm soát chu trình tế bào

Tăng mức biểu hiện các enzyme DNA methyltransferase ở tế bào ungthư người, bao gồm cả CRC so với tế bào bình thường đã được đề cập trongmột số nghiên cứu Năm 1971, Knudson A.G là người đầu tiên phát hiện tăngmethyl hóa các alen ở gen ức chế khối u nguyên bào võng mạc tạo ra đột biếngen và mất dị hợp tử (LOH) và đề xuất “giả thuyết cú hích thứ 2”, một cáchthức bất hoạt gen do tăng methyl hóa các gen ở vùng khởi động [23]

Trong CRC, hầu hết việc thay đổi ngoại gen có tính chất đặc trưng, phổbiến là tăng methyl ở vùng khởi động của các gen, xảy ra trong các đảo CpG,thường xuất hiện khoảng 60% ở khu vực 5' của gen Người ta đã quan sát thấytăng methyl hóa ở vùng khởi động của nhiều gen ức chế khối u và các genchịu trách nhiệm sửa chữa vùng đột biến và đứt đoạn của DNA Tăng hoạtđộng enzyme DNA methyltransferase là một đặc tính của hầu hết các tế bàoung thư Ba enzyme DNA methyltransferase đã được chứng minh là chất xúctác cho sự methyl hóa DNA trong các tế bào động vật có vú đó là: enzymeDNA methyltransferase 3a, 3b và enzyme DNA methyltransferase 1 [24]

14

Ở giai đoạn từ năm 1980 đến đầu năm 1990, các nhà nghiên cứu đã tìm

ra các protein gắn với nhóm methyl của CpG gây ra methyl hóa DNA và làmthay đổi biểu hiện gen Các protein này gọi là protein gắn với miền methylCpG, có liên kết ái lực cao với methyl của CpG Protein gắn với miền methylCpG có ba nhánh: (1) các protein có chứa vùng gắn với methyl của CpG, (2)protein ngón tay kẽm gắn với methyl-CpG, (3) các protein có miền ngón taynhẫn (RNF) [25] Các protein có chứa vùng gắn với methyl của CpG là nhómlớn với 11 thành viên (MeCP2, MBD1, MBD2, MBD3, MBD4, MBD5,MBD6, SETDB1, SETDB2, BAZ2A và BAZ2B) Nhóm protein ngón taykẽm bao gồm Kaiso, ZBTB4, ZBTB38 Nhóm protein có chứa miền ngón taynhẫn gồm UHRF1 và UHRF2 Protein chứa vùng gắn với methyl của CpG tạo

ra methyl hóa DNA có thể ngăn chặn việc gắn yếu tố phiên mã vào các vùngkhởi động của gen, ức chế khởi phát phiên mã Quá trình gắn này cũng có thểlàm tăng các chất ức chế vùng khởi động của gen, ức chế hoạt động các yếu tốphiên mã, từ đó ngăn chặn xâm nhập các yếu tố phiên mã đến vùng khởiđộng Trong số các protein chứa vùng gắn với methyl của CpG đã biết thìMeCP2, MBD1, MBD2, và MBD4 có vai trò nhiều nhất gây ra CRC

Tăng methyl hóa các gen sửa chữa DNA ghép đôi không xứng trong tếbào ung thư có thể làm cho đột biến gen nhiều hơn 100 lần so với tế bào bìnhthường, hậu quả trực tiếp là tế bào không có khả năng tái tạo chính xác bộgen, thường là sai lệch vị trí trong quá trình sao chép DNA, tạo ra đột biếnchèn/mất đoạn, nếu duy trì biến đổi này sẽ sinh ra MSI của DNA một dấuhiệu của kiểu hình có lỗi sao chép Các khiếm khuyết đầu tiên trong sửa chữa

ghép đôi không xứng là các đột biến gen MutL và Muts ở tế bào mần tương đồng với các đột biến gen MHL1 và MSH2, hiếm hơn là các gen MSH6,

PMS1 và PMS2 tiến triển thành polyp tuyến Năm 2006, lần đầu tiên người ta

đã mô tả methyl hóa ở vùng khởi động của gen MSH2 do di truyền cũng có

thể gây ra hội chứng Lynch [26] Sau đó, Ligtenberg M.J và cộng sự (2009)

15

thấy rằng việc đứt đoạn Alu ở bộ ba nucleotic kết thúc của gen mã hóa phân

tử kết dính tế bào biểu mô (EpCAM), gây ra methyl hóa trong các tế bào mầm

và bất hoạt gen MSH2 mã hóa phân tử kết dính tế bào biểu mô [27].

Bên cạnh đó, cũng không thấy tăng methyl hóa gen MHL1 tại vùng

khởi động ở hơn một nửa số CRC có kiểu hình methyl hóa đảo CpG và ở 25%những người bị CRC có bất ổn trình tự lặp ngắn Hiện nay, tăng methyl hóa

gen MHL1 có thể chiếm đến 75% các trường hợp CRC lẻ tẻ Một vài gen ức chế khối u, cụ thể là gen TGFβ loại II và BAX là các mục tiêu của MSI trong CRC Hơn nữa, có nhiều báo cáo gen MHL1 biểu hiện quá mức đã trực tiếp kích hoạt tế bào chết theo chương trình [28] Như vậy, methyl hóa gen MHL1

ở vị trí 5' có thể ảnh hưởng đến sự tăng trưởng tế bào Shen L và cộng sự(2007) dựa vào phân tích bằng cách đánh dấu methyl hóa đã chứng minh kiểuhình methyl hóa đảo CpG trong tế bào CRC có thể được chia thành hai nhómriêng biệt là kiểu hình methyl hóa đảo CpG1 và kiểu hình methyl hóa đảoCpG2 [29] Một nghiên cứu 97 trường hợp bị CRC nguyên phát đã chỉ ra khối

u có kiểu hình methyl hóa đảo CpG1 thường có MSI cao (80%) và có những

đột biến gen BRAF cao (53%), trong khi các khối u kiểu hình methyl hóa đảo CpG2 có những đột biến gen KRAS rất cao (92%), nhưng hiếm khi có MSI, gen BRAF hay đột biến gen TP53 [29] Những khối u không có kiểu hình methyl hóa đảo CpG có một tần số đột biến gen TP53 cao (71%) và một tần

số các đột biến gen KRAS trung bình (33%) [29] Sử dụng các phân tích cụm

dựa trên mô hình methyl hóa gen của ADN ở 125 bệnh nhân CRC, đã xácđịnh được các phân nhóm methyl hóa DNA như kiểu hình methyl hóa đảoCpG cao, kiểu hình methyl hóa đảo CpG thấp và không có kiểu hình methylhóa đảo CpG Các khối u nhóm kiểu hình methyl hóa đảo CpG cao biểu hiện

tăng methyl hóa DNA đặc hiệu với ung thư và có tỷ lệ đột biến gen BRAF cao

(61%), kiểu hình methyl hóa đảo CpG cao có nhiều gen bị methyl hóa ở đảo

16

CpG trong khi nhóm kiểu hình methyl hóa đảo CpG thấp có liên quan với đột

biến KRAS cao hơn (45%).

Nhìn chung, tăng methyl hóa DNA đã tác động đến con đường tín hiệu

Wnt, thụ thể tyrosine kinase, chất đồng đẳng locus thần kinh notch, gen TP53,

p h o sp h oi n o s it i d e 3 - k in a se , acid retinoic và tín hiệu yếu tố tăng trưởng giốnginsulin (IGF), cũng như con đường tín hiệu khác điều chỉnh chu trình tế bào,sao chép, sửa chữa, ổn định DNA, chết tế bào theo chương trình, độ bámdính, hình thành mạch, xâm lấn và di căn Vì vậy, giống như các đột biến gen,bất hoạt gen qua trung gian methyl hóa DNA cũng nhắm đến nhiều conđường truyền tín hiệu trực tiếp ở tế bào tham gia hình thành CRC [30]

1.2.3.3 Giảm methyl hóa DNA trong tế bào CRC

Như đã thảo luận ở trên, tăng methyl hóa DNA thường kết hợp với bấthoạt phiên mã các gen ức chế khối u trong CRC Tuy nhiên, giảm methyl hóaDNA cũng đóng một vai trò quan trọng trong cơ chế phân tử hình thành CRC,

có thể giảm methyl làm mất ổn định hệ gen Một ví dụ cổ điển của giảmmethyl hóa hình thành CRC là yếu tố nhân kích thước dài rải rác 1 (LINE-1).Các yếu tố này chiếm khoảng 17% bộ gen người, do đó, tình trạng methyl hóacủa chúng là một chỉ số quan trọng về mức độ methyl hóa toàn bộ DNA Tuynhiên, trong các tế bào bình thường, yếu tố LINE-1 thường được methyl hóamột cách khó khăn, điều này quan trọng cho việc ức chế hoạt động gen nhảy

và để duy trì sự ổn định của bộ gen Trong mối liên quan với các gen gây ungthư, các vị trí CpG trong những phần lặp lại của DNA có xu hướng bịdemethyl hóa, dẫn đến sự giảm methyl hóa gen theo kiểu khuếch tán Mặc dù

có ý kiến cho rằng CRC khởi phát sớm là do yếu tố di truyền, nhưng chỉ đạidiện cho 15-20% trường hợp CRC, vẫn còn 75-80% trường hợp CRC khởiphát sớm có liên quan đến giảm methyl hóa yếu tố LINE-1 Mức độ methylhóa yếu tố LINE-1 là rất khác nhau giữa các loại ung thư đại trực tràng và cóliên quan với tiên lượng xấu

17

Một trong những thay đổi di truyền ngoại gen được công nhận đầu tiêngây ra CRC là giảm từ từ đến toàn bộ 5-methyl cytosine (giảm methyl hóatoàn bộ DNA) Quá trình này phụ thuộc vào tuổi và là giai đoạn sớm trongquá trình hình thành CRC đã được chứng minh bằng thực nghiệm Giảmmethyl hóa tạo ra các tế bào ung thư với bắt đầu là một kiểu hình gây đột biếnbằng cách làm mất ổn định kiểu nhân và thúc đẩy mất dị hợp tử (LOH) Giảmmethyl hóa toàn bộ DNA xảy ra chủ yếu ở các dinucleotide tại CpG trong cáctrình tự lặp lại (trình tự lặp lại satellite và yếu tố LINE-1, các bản sao đoạnDNA và các yếu tố retrovirus nội sinh), trình tự đơn nhất bao gồm cả gen gâyung thư và loci ghi nhớ, ít gặp hơn là ở trình tự bảo tồn cao xung quanh cácđảo CpG, được gọi là các trụ đảo CpG Ngoài ra, giảm methyl hóa có thể làmkích hoạt gen gây ung thư, giảm methyl hóa DNA gây ra bất ổn định nhiễmsắc thể.

Với tiến bộ về công nghệ sinh học (giải trình tự gen), cho phép các nhàkhoa học phát hiện được những khác biệt rất nhỏ các mức methyl hóa ở yếu tốLINE giữa các phân nhóm CRC khác nhau Dữ liệu thống kê về thời giansống của bệnh nhân CRC cho thấy mức độ methyl hóa yếu tố LINE (được xácđịnh bởi kỹ thuật giải trình tự pyrosequencing) ảnh hưởng đến kết quả lâmsàng và tiên lượng bệnh nhân [31] Cả hai kiểu hình methyl hóa đảo CpG cao

và bất ổn trình tự lặp ngắn cao của DNA ở CRC có tương quan nghịch đảovới methyl hóa yếu tố LINE-1, trong khi ở các khối u có bất ổn trình tự lặpngắn của DNA không cao có tương quan thuận với sự giảm methyl hóa yếu tốLINE-1 Các nhà khoa học đã tìm thấy trong các tế bào CRC có kiểu hìnhmethyl hóa yếu tố LINE-1 thấp thì càng tăng tính chất ác tính [32] Hơn nữa,Ogino và cộng sự (2013) đã chỉ ra những người có tiền sử gia đình bị CRC thì

có nguy cơ bị CRC cao với methyl hóa mức thấp yếu tố LINE-1 [33] Nhữngnghiên cứu này đã thiết lập một mối liên quan vững chắc giữa sự giảm methylhóa DNA và phát triển CRC

18

1.2.3.3 Thay đổi Histone trong tế bào CRC

Ngoài sự bất hoạt phiên mã các gen do methyl hóa DNA, những thayđổi liên kết cộng hóa trị ở đuôi histone sau dịch mã cũng là một cơ chế biếnđổi ngoại gen quan trọng khác điều tiết cấu trúc nhiễm sắc thể và biểu hiệngen ung thư người

Thể nhân là đơn vị cơ bản của nhiễm sắc thể, nó bao gồm một octamertạo bởi bốn histone lõi (H3, H4, H2A, H2B) xung quanh có 147 cặp base củaDNA phủ bên ngoài, lõi histone chủ yếu là hình cầu ngoại trừ “các đuôi” N-tận của chúng Đuôi N-tận của histone có sự khác nhau về cấu hình Có ít nhấttám loại thay đổi histone, bao gồm acetyl hóa, methyl hóa, phosphoryl hóa,ubiquityl hóa, sumoyl hóa, ADP-ribosyl hóa, đồng phân proline hóa vàcitrulline hóa [34] Có giả thuyết cho là sự kết hợp của những thay đổi này tạothành cái gọi là "mã hóa histone" để xác định hình thái nhiễm sắc thể và cácmức độ biểu hiện gen Trong 8 thay đổi histone này, acetyl hóa và methyl hóa

là loại phổ biến nhất và liên quan đến cơ chế bệnh sinh CRC

Acetyl hóa histone là những thay đổi thuận nghịch trong các phần củalysine tại "đuôi" histone và được kiểm soát bởi các enzym histoneacetyltransferase và histone deacetylase, chúng hoạt động lần lượt như nhữngchất đồng hoạt hóa phiên mã hoặc đồng ức chế phiên mã Trong các thay đổihistone đã biết, acetyl hóa histone là thay đổi làm biểu hiện nhiễm sắc thể tiềmnăng nhất vì nó trung hòa điện tích cơ bản của lysine Histoneacetyltransferase được chia thành ba họ chính: một là general controlnonderepressible-5-related N-acetyltransferase (GNAT); hai là họ MYST gồmbốn thành viên M O Z , Ybf2 (Sas3), Sas2, và Ti p 60 ; ba là họ p300 và cAMPgắn với protein (CBP) Hầu hết các vị trí acetyl hóa đặc trưng bởi thay đổitrong đuôi N- tận của histone Gần đây, người ta đã tìm thấy một lysine tronglõi H3 là K56 bị acetyl hóa Phần còn lại của K56 hướng về phía rãnh chínhcủa DNA trong thể nhân, vì vậy nó là ở một vị trí đặc biệt cho acetyl hóa

19

histone Protein SPT10 của nấm men có thể làm trung gian acetyl hóa vị tríK56 của lõi H3 tại các các vùng khởi động của histone mà histone RTT109acetyltransferase xúc tác cho quá trình này, điều chỉnh biểu hiện gen [34].

Có ba họ enzyme histone deacetylase khác nhau là: lớp I, lớp II và lớpIII [34] Chúng tham gia vào nhiều con đường tín hiệu và có mặt trong rấtnhiều phức chất ức chế nhiễm sắc thể Nói chung, những enzyme này khôngđặc hiệu cho một nhóm acetyl cụ thể Histone deacetylase là những enzymephổ biến nhất trong số các enzyme thay đổi histone, chúng có vai trò quantrọng hình thành CRC Một nghiên cứu cho thấy Histone deacetylase tăng với36,4% histone deacetylase lớp I, 57,9% histone deacetylase lớp II và 72,9%histone deacetylase lớp III ở các mẫu xét nghiệm của CRC, biểu hiện histonedeacetylase cao đã được chứng minh làm giảm thời gian sống của bệnh nhânCRC [35] Biểu hiện histone deacetylase lớp II ở nhân lần lượt được quan sátthấy ở 81,9% ung thư biểu mô đại trực tràng, 63,1% u tuyến đại trực tràng và53,1% của các mô bình thường Biểu hiện histone deacetylase lớp II quá mức

đi kèm với giảm acetyl hóa histone tại H4K12 và H3K18 thấy trong u tuyếntiến triển thành ung thư biểu mô [36] Trong một nghiên cứu 485 trường hợpCRC cho thấy histone deacetylase lớp III, sirtuina 1 (SIRT1) được biểu hiệnquá mức trong 37% CRC kết hợp với các khối u có kiểu hình methyl hóa đảoCpG cao và bất ổn trình tự lặp ngắn của DNA Ức chế sirtuina 1 có thể phụchồi hoạt động các gen bị bất hoạt phiên mã, đó một phương pháp trị liệu cóthể thực hiện được nhằm đảo ngược thay đổi ngoại gen do quá trình bất hoạtcủa nhiều gen [37]

Methyl hóa histone là một thay đổi quan trọng ở các histone sau dịch

mã, hiện tượng này xảy ra cả ở phần lysine và arginine còn lại ở đuôi N- tậncủa histone Giống như acetyl hóa histone, methyl hóa histone cũng được đánhgiá là một quá trình thuận nghịch Cân bằng nội tại của nó nhờ hai nhómenzyme đối kháng là histone methyltransferase và histone demethylase, chúng

20

lần lượt lắp ráp hoặc gỡ bỏ các vị trí methyl hóa đặc hiệu ở histone Đến nay,

đã xác định được hơn hai mươi enzyme lysine và arginine histonemethyltransferase Các enzyme histone methyltransferase có thể hoạt động mộtmình hoặc phối hợp với nhau xúc tác cho phản ứng methyl hóa histone ở các vịtrí đặc hiệu Ví dụ, methyl hóa vị trí lysine 4 ở histone H3 (H3K4) là doenzyme su(var) 3-9, enhancer-of-zeste, trithorax 1 (SET1) và mixed-lineageleukemia (MLL) [38] Đối với histone H3, người ta đã quan sát thấy methylhóa ở nhiều vị trí lysine, bao gồm H3K4, K9, K27, K36, K79, R2, K20, K5,R3, H2A.Z, có thể methyl hóa một đến 3 lysine cùng lúc và tạo ra bốn trạngthái methyl hóa: không methyl hóa, mono methyl hóa, dimethyl hóa vàtrimethyl hóa Các trạng thái methyl hóa histone là một mô hình sắp xếp riêngbiệt trong hệ gen ở động vật có vú [38] Trimethyl hóa lysine 4 ở histone H3(H3K4me3) liên quan với hoạt hóa phiên mã, người ta quan sát thấy các vị trícủa gen bắt đầu phiên mã được bộc lộ ở mức cao nhất Hai vị trí methyl hóakhác trên histones H3 là H3K36 và H3K79 cũng có liên quan đến sự hoạt hóaphiên mã Ngược lại, trimethyl hóa histone H3 ở vị trí H3K27 thường làm bấthoạt gen, đặc biệt là ức chế không mong muốn các chương trình biệt hóa xácđịnh nòi giống Hai vị trí methyl hóa lysine khác cũng ức chế phiên mã làH3K9 và H4K20 [38]

Có được cấu hình methyl hóa histone phù hợp không chỉ quan trọng đốivới sự phát triển và sự biệt hóa bình thường ở tế bào, mà còn liên quan mậtthiết với việc hình thành và phát triển của khối u Ví dụ, histone 3 lysine 79(H3K79) methyltransferase (DOT1L) là một chất hoạt hóa phiên mã phụthuộc vào con đường tín hiệu Wnt trong tế bào CRC Các protein tăng cường

cho gen homolog 2 (EZH2) thuộc nhóm protein polycomb cũng có chức năng

như histone methyltransferase, chúng thường xuyên được biểu hiện quá mứctrong các khối u rắn khác nhau, bao gồm cả CRC [39] Protein này bất hoạt

gen ức chế khối u, bao gồm INK4B-ARF-INK4a, E-cadherin, P57 KIP2, p2,

21

BRCA1 và β2 adrenergic làm cho tế bào biến đổi thành ung thư [39] lineage leukemia 2 là một gen đột biến được tìm thấy đầu tiên trong tế bào u

Mixed-lympho B lớn, nó mã hóa cho protein mixed-lineage leukemia 2, tăng mức

biểu hiện gen mixed-lineage leukemia 2 thường thấy trong các dòng tế bào

ung thư biểu mô đại tràng biệt hóa kém và dòng tế bào ung thư biểu mô đạitràng xâm lấn so với biểu mô đại tràng bình thường bên cạnh Protein mixed-lineage leukemia 2 là một protein nhân có vai trò chủ yếu để định vị nhân Ởcác dòng tế bào u đại tràng có khả năng xâm lấn cao, sự thay đổi phân bổ cáccấu trúc dưới tế bào và quá trình thủy phân protein mixed-lineage leukemia 2nhiều hơn các dòng tế bào bình thường hay tế bào khối u ít xâm lấn Như vậy,thay đổi bất thường về sắp xếp cũng như quá trình thủy phân protein mixed-lineage leukemia 2 có thể liên quan đến các gen tạo ra khối u ở đại tràng,

mixed-lineage leukemia 2 qua trung gian các hoạt động methyl hóa histone

làm gián đoạn lần lượt tín hiệu gen ở phần cuối DNA, liên quan đến chu trình

tế bào hoặc các hoạt động tăng sinh tế bào Chất ức chế gen homolog 1 khảm

3-9 (SUV39H1) là một enzyme histone methyltransferase xúc tác phản ứng

methyl hóa histone 3 ở vị trí H3K9 quanh thể trung tâm của dị nhiễm sắc chất.Các nhà nghiên cứu đã tìm thấy tăng mức độ biểu hiện của chất ức chế gen

homolog 1 dạng khảm 3-9 có trong 54/219 mẫu xét nghiệm ở bệnh nhân CRC.

Hơn nữa, cũng có tương quan đáng kể giữa biểu hiện mRNA mã hóa proteinnày và mức mRNA mã hóa DNA methyltransferase 1 ở những bệnh nhânCRC, cho thấy mối liên quan giữa methyl hóa histone H3 ở vị trí H3K9 vàhình thành tế bào CRC Nhìn chung, các nghiên cứu đã chứng minh rằng thayđổi biểu hiện và chức năng của enzyme histone methyltransferase là đặc trưngcủa bệnh ung thư, bao gồm cả CRC [40]

22

1.3 Liệu pháp virus vaccine sởi và quai bị điều trị ung thư đại trực tràng người

1.3.1 Sinh học virus sởi và quai bị

Virus sởi và quai bị là các virus thuộc thành viên của họParamyxoviridae (hình 1.1), có đường kính khoảng 100-300 nm, với một lõinucleocapsid xoắn chứa sợi RNA đơn (-) Hai protein màng của virus: proteinfusion (F) chịu trách nhiệm cho sự hợp nhất màng của virus với màng tế bàochủ, tạo điều kiện cho virus xâm nhập vào bên trong tế bào và huyết tán;protein hemagglutinin (H) hay hemagglutinin neuraminidase (HN) chịu tráchnhiệm việc virus xâm nhập vào tế bào Kháng thể kháng các protein này có thểlàm giảm nhiễm trùng virus Protein khác bao gồm các protein mitrix (M) liênkết các vỏ với lõi plasmid ribonucleo cùng với protein hợp nhất fusion vàprotein hemagglutinin hay hemagglutinin neuraminidase tạo nên cấu trúccủa vỏ virus Nucleoprotein (N) cùng với Phosphoprotein (P) và protein Large(L) tạo nên ribonucleocapsid chứa đựng genome ARN của virus (hình 1.1)[41]

Virus sởi và quai bị xâm nhập vào tế bào bằng cách gắn protein bámdính của chúng (protein H, HN) vào thụ cảm thể đặc hiệu trên bề mặt tế bào

Vỏ của chúng có thể hòa hợp trực tiếp với màng tế bào dưới sự hỗ trợ củaprotein F, quá trình này được kích hoạt bởi glycoprotein bề mặt tế bào cóchứa acid sialic, hoặc virus có thể xâm nhập vào các tế bào thông qua các conđường nội nhập bào cùng với sự hợp nhất màng xảy ra trong điều kiện toanhóa bên trong endosome Kết quả là các nucleocapsid chứa gen của virusđược giải phóng vào bào tương nơi mà diễn ra quá trình virus nhân lên [41]

Nhờ có enzyme RNA polymerase, các virus này sao chép sợi RNAthành mRNA, sau đó được dịch mã thành các protein cấu trúc và phi cấu trúc

Sự phiên mã bắt đầu từ vùng khởi động đơn nằm ở đầu 3' của bộ gen và sau

đó có thể chấm dứt trong các khu vực đã được định rõ giữa các gen của virushoặc theo xuôi chiều bộ gen Phương thức phiên mã này chịu trách nhiệm về

23

sự phân cực các sản phẩm, trong đó các gen gần với đầu 3' của bộ gen nhấtđược thể hiện nhiều hơn so với các bản sao ở vị trí xa Cơ chế này là một cáchđơn giản và hiệu quả để điều chỉnh mức độ phiên mã, tạo ra sự cân bằng cầnthiết cho sản phẩm virus Nồng độ sản phẩm nucleoprotein quyết định thờigian mà tại đó RNA polymerase chuyển từ phiên mã gen sang sao chép gen.

Sự nhân lên của virus liên quan đến việc tổng hợp các sợi RNA (+) có độ dàiđầy đủ, sau đó được sao chép thành các sợi RNA (-) thế hệ con cháu (hình1.1) Các hạt virus trưởng thành lồi ra ngoài màng tế bào rồi sau đó thoát rangoài Chúng có thể lây nhiễm sang các tế bào khác và bắt đầu chu kỳ sốngmới Một con đường khác đối với lây truyền virus là sự hợp nhất các tế bào bịnhiễm virus với các tế bào lân cận và hình thành các hợp bào Hợp bào tạođiều kiện cho virus có khả năng lây nhiễm và giết chết hàng chục tế bào màkhông cần phải thoát ra bên ngoài tế bào [41]

Gia đình paramyxoviridea Cấu trúc hạt virus

* Nguồn: theo Matveeva O.V và cộng sự (2015) [41]

24

1.3.2 Virus vaccine sởi và quai bị lây nhiễm đặc hiệu tế bào ung thư đại trực tràng

virus vaccine sởi và quai bị

MuV chủng Urabe sử dụng các sialoglycoprotein có chứa acid sialictrên bề mặt tế bào ung thư như là thụ cảm thể đặc hiệu MuV lây nhiễm chọnlọc vào tế bào CRC có nhiều sialoglycoprotein trên bề mặt và hầu như khônglây nhiễm các tế bào bình thường Do đó, MuV ly giải có tính chọn lọc các tếbào u CRC nguyên phát và cả u CRC di căn [42]

MeV chủng Edmonston sử dụng các thụ cảm thể đặc hiệu CD46, đó làmột yếu tố điều hòa hoạt hóa bổ thể có ở bề mặt tất cả các tế bào có nhân củangười, nhưng thường biểu hiện quá mức ở một số dòng tế bào ung thư baogồm cả CRC MeV lây nhiễm và giết chết các tế bào ung thư biểu hiện nhiềuthụ cảm thể này nhưng lại ít ảnh hưởng đối với tế bào bình thường Gần đây,Nectin-4 cũng được xác định là thụ cảm thể đặc hiệu của MeV [43] Đây làmột thành viên các thụ cảm thể bám dính của liên họ globulin miễn dịch nằm

ở vị trí mà các tế bào biểu mô dính với nhau trong đó có cả tế bào CRC.Nectin-4 có thể được coi là một marker của tế bào khối u vú, ung thư phổi,ung thư buồng trứng và CRC

1.3.2.2 Virus vaccine sởi và quai bị ly giải tế bào ung thư đại trực tràng thông qua protease đặc hiệu

Tính đặc hiệu của các MeV, MuV đối với tế bào CRC còn thông quacác protease có ở tế bào CRC Chu trình nhân lên của MuV, MeV đòi hỏi phải

có các protease phân cắt glycoprotein của virus, tạo điều kiện để virus xâmnhập có hiệu quả vào tế bào (hình 1.2) Các protease này được biểu hiện nhiều

ở các tế bào ung thư, đại diện là các matrix metalloproteinase, những phân tửnày là các endopeptidase, được biểu hiện quá mức ở hầu hết các tế bào ungthư người bao gồm cả CRC [44], [45] Người ta vẫn chưa rõ liệu những

protease này có thể hoạt hóa virus chủng hoang dại của MeV và MuV haykhông Tuy nhiên, MeV chủng Edmonston và MuV chủng Urabe đã biến đổigen đều có tính chọn lọc với các tế bào ung thư người mà biểu hiện nhiềumatrix metalloproteinase.

Hình 1.2 MeV, MuV lây nhiễm đặc hiệu tế bào CRC

* Nguồn: theo Matveeva O.V và cộng sự (2015) [45]

1.3.2.3 Virus vaccine sởi và quai bị tận dụng các khiếm khuyết gen ở tế bào ung thư đại trực tràng

Tính đặc hiệu của MeV, MuV còn có liên quan đến biến đổi di truyềnđặc biệt trong tế bào ung thư Các khiếm khuyết di truyền này làm cho các tếbào ung thư dễ bị nhiễm virus và tạo điều kiện cho virus nhân lên tốt hơn màhầu như không có ở tế bào bình thường (hình 1.2)

Do có biến đổi di truyền đặc biệt, các tế bào khối u phát triển nhiềuchiến lược để tránh sự phát hiện và tiêu diệt của hệ thống miễn dịch Trong số

đó, đáng chú ý là khả năng thu hút các tế bào ức chế miễn dịch như tế bàolympho T điều hòa (tế bào Treg) và đại thực bào M2 Các tế bào này làm giảm

sự xâm nhập của các tế bào lympho T gây độc tế bào khối u, do đó, giảm cácđáp ứng miễn dịch kháng u Ngoài ra, các khối u còn có khả năng biến đổi vimôi trường để hạn chết sự xâm nhập các tế bào miễn dịch như: các tế bàobạch cầu dòng tủy, tế bào tua (tế bào DC), tế vào giết tự nhiên (tế bào NK),đây là các tế bào rất quan trọng cho cả miễn dịch tự nhiên và miễn dịch thíchứng Vi môi trường khối u còn có khả năng che dấu kháng nguyên khối u,trung hòa các kháng thể kháng tế bào u tạo điều kiện cho khối u thoát khỏikiểm soát của hệ miễn dịch Tất các các cơ chế làm cho khối u thoát khỏi hệmiễn dịch cũng là điều kiện thuận lợi quan trọng để OV thoát khỏi kiểm soátcủa hệ miễn dịch và lây nhiễm bên trong khối u.

Cuddington B.P và cộng sự (2014) đã phát hiện ra OV có khả năng lây

nhiễm tốt hơn ở các tế bào tăng mức độ biểu hiện gen KRAS (tế bào khối u) [46] Một gen khác được tìm thấy trong các tế bào khối u là VEGF, có thể ảnh

hưởng đến liệu pháp điều trị ung thư bằng OV Người ta đã chứng minh gen

VEGF-A làm tăng mức độ xâm nhập và sau đó nhân lên của OV trong tế bào

u Do đó, OV có thể tận dụng sự đột biến gen làm tăng biểu hiện gen VEGF

để tăng khả năng lây nhiễm và ly giải tế bào u Ngoài ra, Arulanandam R và

cộng sự (2015) nhận thấy rằng sự gia tăng biểu hiện gen VEGF dẫn đến tăng

sự điều hòa của PRD1-BF1 (một chất ức chế phiên mã) làm tăng độ nhạy cảmcủa các tế bào nội mô mạch máu khối u với nhiễm trùng OV thông qua việc

ức chế tín hiệu chống virus loại 1 Sự gia tăng ái lực của virus với tế bào ucho phép OV lây lan trong khối u hiệu quả hơn và do đó làm tăng hiệu quảcủa liệu pháp OV [47] Các nhà khoa học cũng đã tìm thấy con đường đápứng interferon là một yếu tố quan trọng trong nhiễm trùng virus sởi vào tế bào

u ác tính trung biểu mô màng phổi Có mối tương quan nghịch giữa khả năngvirus sởi lây nhiễm tế bào với mức độ tạo ra phản ứng interferon Tế bào ungthư biến đổi di truyền, mất khả năng cảm ứng interferon nên rất dễ bị lây

nhiễm OV Ức chế con đường cảm ứng interferon đã được chứng minh làmtăng hiệu quả ly giải tế bào u của OV.

1.3.3 Các cơ chế virus vaccine sởi và quai bị ly giải tế bào ung thư đại trực tràng

1.3.3.1 Hình thành hợp bào (tế bào khổng lồ nhiều nhân)

MeV và MuV có các protein F và protein HN hay H gắn vào thụ thểtham gia quá trình hợp màng Khi gắn vào thụ thể, protein HN hay H thay đổicấu hình, sự thay đổi này kích hoạt protein hợp màng gây ra quá trình thay đổitrong protein F Sự thay đổi này làm cho màng virus và tế bào sát lại rồi hợpnhất với nhau Cơ chế chính xác mà protein HN hay H kích hoạt protein F làchưa rõ ràng Các protein F của MeV và MuV còn tham gia quá trình hợpnhất màng tế bào nhiễm virus với màng tế bào bình thường xung quanh,giống như sự hợp nhất giữa màng virus và tế bào (quá trình nhiễm trùng) Sựhợp nhất giữa tế bào nhiễm virus và tế bào bình thường lân cận tạo thành hợpbào (một khối tế bào khổng lồ có nhiều nhân) Một tế bào bị nhiễm virus cóthể hợp nhất 50-100 tế bào lân cận với nhau tạo thành một hợp bào (hình1.3a) [45] Đây là một cơ chế lây lan virus mà không cần giải phóng các hạtvirus trưởng thành ra khỏi tế bào ung thư Quá trình hợp nhất tế bào làm chovirus giảm tiếp xúc với kháng thể trung hòa của cơ thể vật chủ, chúng lẩntránh được sự kiểm soát của hệ miễn dịch dễ dàng lây lan và phát triển Thôngthường, các hợp bào tồn tại không quá 4-5 ngày

Hợp bào chết là do hợp nhất hạt nhân, ngưng tụ nhiễm sắc thể sớm,thoái hóa autophagy, kèm theo giải phóng các túi syncytiosome giống nhưexosome nhưng biểu hiện kháng nguyên tế bào u cao Hợp bào chết tạo ra cácsyncytiosome nhiều hơn đáng kể so với các tế bào chết do các nguyên nhânkhác Syncytiosome là yếu tố làm cho các tế bào DC trưởng thành và trìnhdiện kháng nguyên hiệu quả hơn so với các exosome từ tế bào chết do cácnguyên nhân khác [48]

Các virus sử dụng protein hợp màng để hình thành hợp bào góp phầntăng hiệu quả ly giải tế bào u Vì vậy, MeV và MuV có khả năng trực tiếp giếtchết các tế bào ung thư thông qua hình thành các hợp bào, đây là một thuộctính ly giải tế bào u quan trọng (hình 1.3a), khả năng virus tạo hợp bào tươngquan với tiềm năng ly giải tế bào ung thư của chúng.

1.3.3.2 Tạo ra miễn dịch đặc hiệu kháng tế bào u

Ngoài khả năng trực tiếp giết chết tế bào CRC qua hình thành hợp bào,các virus còn tạo ra phản ứng toàn thân góp phần mạnh mẽ vào hoạt động lygiải tế bào u Những phản ứng này bao gồm kích thích miễn dịch bẩm sinhkháng virus như: sản xuất interferon (IFN), các cytokine, hoạt hóa tế bào giết

tự nhiên (NK), đại thực bào, tế bào tua (DC) Nhiễm virus còn tạo ra phảnứng miễn dịch thích ứng không chỉ hoạt động để hạn chế sự lây nhiễm virusbằng cách nhắm vào các hạt virus được giải phóng ra và tế bào bị nhiễmvirus, mà còn làm cho tế bào ung thư tiếp xúc với các tế bào trình diện khángnguyên, kích hoạt phản ứng miễn dịch kháng ung thư đặc hiệu (hình 1.3b)

MeV, MuV tạo ra tín hiệu nguy hiểm, các tín hiệu này đóng một vai tròquan trọng trong việc loại bỏ khối u qua trung gian miễn dịch Kích hoạt miễndịch chống ung thư có thể xảy ra khi không có sự sao chép của virus trong tếbào khối u và ngay cả khi virus được tiêm dưới da hoặc nội u [49] Về bảnchất, virus hoạt động như một tín hiệu nguy hiểm, có khả năng thu hút và kíchhoạt các tế bào trình diện kháng nguyên chuyên nghiệp như các tế bào DC.Các tế bào DC hoạt động như một phần của cả miễn dịch bẩm sinh và thíchứng, chúng kích thích đáp ứng miễn dịch tế bào lympho T đặc hiệu chống lạicác kháng nguyên khối u Các protein hợp màng của MeV, MuV hình thànhhợp bào, các sản phẩm từ hợp bào bị phân hủy làm cho tế bào DC trưởngthành và trình diện kháng nguyên khối u có hiệu quả [48]

MeV và MuV tạo ra tín hiệu nguy hiểm, các tín hiệu nguy hiểm chia ralàm 2 loại là nội sinh và ngoại sinh Theo quan điểm hiện nay, các tín hiệu

nguy hiểm nội sinh là những phân tử có nguồn gốc từ các tế bào và tổ chức bịtổn thương (DAMP), các phân tử DAMP bao gồm các calreticulin, các proteinsốc nhiệt (Hsp70, HSP90) … và cả acid uric có nguồn gốc từ tế bào chết Cácchất này được giải phóng ra trong thời gian từ giữa đến cuối của quá trình tếbào chết theo chương trình, hoại tử, hoặc autophagy Các tín hiệu nguy hiểmngoại sinh là những phân tử có nguồn gốc từ tác nhân gây bệnh (PAMP) như:

vi khuẩn, virus… DAMP và PAMP kích hoạt các phản ứng miễn dịch chốnglại nhiễm trùng và quá trình bệnh lý do các mầm bệnh gây ra [50]

Tế bào ung thư còn có khả năng điều chỉnh vi môi trường của chúng đểthoái khỏi hệ miễn dịch Vi môi trường khối u có khả năng sản xuất ra cáccytokine ức chế miễn dịch và thu hút các tế bào ức chế miễn dịch, như tế bàolympho T điều hòa dòng tủy (Treg), các đại thực bào M2 duy trì dung nạpmiễn dịch trong các khối u… Sự thay đổi vi môi trường để khối u thoát khỏikiểm soát của hệ miễn dịch đã tạo điều kiện cho virus vượt qua hệ miễn dịch,

dễ dàng vượt qua vi môi trường của khối u xâm nhập vào tế bào ung thư vàbộc lộ kháng nguyên virus trên bề mặt tế bào ung thư, cùng với các sản phẩm

do các tế bào chết tạo ra tín hiệu DAMP và PAMP, kích hoạt các đáp ứngmiễn dịch đặc hiệu tiêu diệt tế bào u Quá trình này có thể giống hoại tử tếbào, chết tế bào theo chương trình, hoặc autophagy [51]

Các phân tử tín hiệu nguy hiểm chính là các tác nhân làm cho hệ miễndịch dễ dàng nhận diện tế bào ung thư DAMP và PAMP kích hoạt tế bào DCtrình diện chéo các kháng nguyên khối u cho tế bào lympho T CD4+ và TCD8+ đã biệt hóa Sau khi tế bào u bị chết do nhiễm virus, các sản phẩm từ tếbào chết được tế bào DC thực bào và tiêu hóa, hoạt động này lại làm cho tếbào DC trưởng thành, chúng sản xuất các IFN-α và trình diện chéo khángnguyên khối u ở mức cao hơn cho tế bào lympho T, tạo ra các tế bào T CD8+gây độc tế bào u đặc hiệu Như vậy, MeV và MuV có thể ly giải các tế bào uthông qua kích thích hệ miễn dịch kháng tế bào u đặc hiệu [52]

Hình 1.3 MeV, MuV ly giải tế bào CRC trực tiếp và qua trung gian

miễn dịch

* Nguồn: theo Matveeva O.V và cộng sự (2015) [45]

Vai trò của tự thực bào (autophagy): Autophagy là một quá trình tế bào

chết do tự thực bào, được kiểm soát chặt chẽ, làm trung gian cho sự thoái biến

và tái sinh các protein tế bào, các bào quan, cũng như các tác nhân gây bệnh.Autophagy đóng vai trò quan trọng trong cả miễn dịch bẩm sinh và thích ứng[53] MeV và MuV đã được chứng minh là các nhân gây ra autophagy trongcác tế bào ung thư Như đã đề cập trước đó, hợp bào bị chết là do autophagy.MeV và MuV có thể gắn với thụ thể đặc hiệu trên bề mặt tế bào u và tạo raautophagy [53], [54] Autophagy làm tăng sinh miễn dịch chống khối u khôngchỉ bằng cách giải phóng ra DAMP, PAMP mà còn làm cho tế bào DC trưởngthành và trình diện chéo các kháng nguyên tế bào ung thư, kích hoạt tế bàolympho T

MeV, MuV ức chế đáp ứng IFN ở tế bào CRC: Một trong những cơ chế

quan trọng nhất bảo vệ tế bào chống lại virus là sự cảm ứng IFN, các proteincảm ứng IFN làm ức chế sự tổng hợp protein cho virus, thiết lập một tìnhtrạng kháng virus Tuy nhiên, MeV, MuV là những virus đã phát triển các conđường khác nhau để trốn tránh hệ miễn dịch hoặc kháng lại các protein tạo rađáp ứng IFN kháng virus MeV và MuV sử dụng một số protein làm chochúng có thể thoát khỏi hàng rào bảo vệ tế bào bằng cách ngăn chặn sự sảnxuất và/hoặc tạo ra tín hiệu khích thích IFN MuV sử dụng protein V [55];MeV sử dụng protein V, C và P để ngăn chặn các con đường tạo ra IFN [56],[57], [58]

Trong quá trình hình thành tính chất ác tính, tế bào ung thư biến đổi vềgen và thoát khỏi các chức năng kiểm soát của cơ thể Cùng với các đột genthúc đẩy sự tăng sinh tế bào và xâm lấn, các tín hiệu cảm ứng IFN thường bịgiảm bởi mất đồng hợp tử của vùng nhiễm sắc thể 9p21, vùng này mã hóa cácgen IFN lớp I [59] Trong các tế bào ác tính, virus không bị ngăn chặn bởiIFN, vì con đường này đã bị phá vỡ

MeV, MuV kích thích các cytokine: MuV và MeV có khả năng kích

thích các tế bào lympho máu ngoại vi tổng hợp các interleukins (IL), đại thựcbào viêm tiết ra protein-1 α và β, các chất này có vai trò hóa ứng động bạchcầu đơn nhân Tác giả Donnelly O.G và cộng sự (2013) cũng đã chứng minhchủng MeV-Edmonston có khả năng ly giải tế bào u hắc tố qua trung gianmiễn dịch bằng cách kích thích các tế bào miễn dịch tiết ra các cytokine viêm(IL-6, IL-8 và IFN loại I) và chemokine (RANTES và HMGB1), các chất nàythu hút bạch cầu đơn nhân, đại thực bào, tế bào NK, tế bào DC và tế bàolympho T tạo ra đáp ứng miễn dịch đặc hiệu kháng u [60] Các chemokinenày cũng kích thích các tế bào lympho T bám dính vào tế bào nội mô mạchmáu và ức chế sự hình thành mạch Chemokine (motif C-C) ligand 5 vàchemokine motif C-X-C 10 có khả năng kích thích tế bào lympho T hỗ trợ

type 1 (Th1), thu hút tế bào lympho T gây độc tế bào đã được hoạt hóa vàotrong khối u để tiêu diệt tế bào ung thư MuV và MeV sử dụng protein H, HNkích thích các tế bào lympho ở máu ngoại vi bài tiết các cytokine như yếu tốhoại tử khối u ( TNF-), phân tử gây ra apoptosis làm tăng hiệu quả ly giải tếbào u qua trung gian miễn dịch [61].

MeV, MuV kích thích các tế bào NK: Các tế bào NK cũng là loại tế bào

lympho gây độc tế bào, cầu nối hệ miễn dịch bẩm sinh và thích ứng Những tếbào này tương tác với nhiều thành phần khác nhau của hệ miễn dịch, sau đó,kích hoạt đáp ứng tế bào lympho T và B đặc hiệu với kháng nguyên [62] Các

tế bào NK tham gia vào kiểm soát sớm chống nhiễm virus và trong giám sátmiễn dịch khối u Tế bào NK có vai trò phản ứng nhanh bảo vệ cơ thể, chúng

có khả năng tiêu diệt các tế bào bất thường hoặc tế bào bị stress mà thiếu thụcác kháng thể và phức hợp tương hợp mô chính (MHC) Các tế bào NK cầnđược hoạt hóa để có khả năng giết chết các tế bào mà không biểu hiện cácmarker "cùng loại" với MHC lớp I Tế bào NK có các thụ cảm thể gây độc tếbào, các thụ cảm thể này chịu trách nhiệm kích hoạt chúng Trong số các thụthể này có thụ thể protein NK 46 (NKp46) và protein NK 44 (NKp44) có vaitrò quan trọng nhất Protein HN của các virus trực tiếp tương tác với hai thụthể NKp44 và NKp46, tương tác này gây ra sự kích hoạt tế bào NK và ly giải

tế bào u qua trung gian tế bào NK [63] Đặc biệt, protein HN của MuV hoạthóa thụ thể NKp46 của tế bào NK và loại bỏ khối u qua tương tác chéo giữa

tế bào NK và DC [64]

MeV, MuV kích thích tế bào DC: Tế bào DC là những tế bào trình diện

kháng nguyên chuyên biệt, chúng có thể kích thích rất hiệu quả đáp ứng miễndịch bẩm sinh cũng như miễn dịch thích ứng chống lại tác nhân gây bệnhkhác nhau và tế bào ung thư Sau khi nhận diện được một loại virus hoặcmầm bệnh, các tế bào DC bắt đầu một quá trình trưởng thành và có khả nănghuấn luyện các tế bào lympho T non thành các tế bào lympho T trưởng thành

Người ta đã chứng minh đưa tế bào DC trưởng thành vào cơ thể trước khi cấyghép khối u có tác dụng dự phòng ung thư nguyên bào thần kinh di căn phổi

và ung thư tuyến tiền liệt di căn phổi [65], [66] Một chức năng khác của tếbào DC là chúng có khả năng ngăn chặn vai trò ức chế miễn dịch của các tếbào lympho T điều hòa (tế bào Treg)

MeV, MuV tái tổ hợp có thể kích hoạt tế bào DC bên ngoài cơ thể sốngtạo ra các tế bào DC trưởng thành, quá trình hoạt hóa tế bào DC chỉ xảy ratrong 1 giờ Điều trị bằng tế bào DC đã được hoạt hóa chứa các biến thể khácnhau của MeV, MuV tái tổ hợp có thể cải thiện đáng kể sự sống của động vật

bị khối u ác tính như: ung thư đại tràng, ung thư biểu mô tế bào vảy, ung thư

tế bào gan, u nguyên bào thần kinh, và ung thư tuyến tiền liệt

MeV, MuV kích thích tế bào lympho T gây độc tế bào khối u đặc hiệu:

MeV, MuV kích hoạt hệ miễn dịch, hoạt hóa tế bào lympho T CD8+, tăngcường hoạt động của tế bào T CD4+ hỗ trợ, các tế bào lympho T xâm nhậpvào bên trong khối u ly giải tế bào ung thư là kết quả của hiệu ứng phức tạp,bao gồm cả giải phóng IFN tại chỗ và toàn thân cũng như các cytokine [52].Người ta đã tìm thấy hiệu ứng này qua sự hiện diện các phân tử chức nănghemagglutinin neuraminidase của virus trên bề mặt tế bào khối u, chúng có áilực với màng tế bào và do đó có thể làm trung gian bám dính mạnh mẽ củacác tế bào bị nhiễm virus với tế bào lympho T gây độc tế bào

Virus gắn lên bề mặt tế bào có thể kích thích đáp ứng tế bào lympho TCD8+ đặc hiệu và tăng cường hoạt động của tế bào lympho T CD4+ tiêu diệt

tế bào ung thư Các tế bào lympho T gây độc tế bào được kích hoạt và xâmnhập vào các vị trí khối u là kết quả của những tác động phức tạp do viruskhích thích hệ miễn dịch ngay cả khi tiêm virus tại chỗ (nội u)

sialidase: Axit sialic là axit monosaccharide có chín carbon được tìm thấy ở

vị trí cuối của chuỗi glycan Sialic hóa các phân tử glycoprotein trên bề mặt tế

bào thường xuyên bị thay đổi theo các tế loại bào ung thư Trên bề mặt các tếbào ung thư thường biểu hiện mật độ cao glycoprotein giàu axit sialic Sựbiểu hiệu quá mức axit sialic hình thành một điện tích âm trên bề mặt tế bàoung thư, tạo ra một lực đẩy giữa các tế bào với nhau, giúp các tế bào ung thư

dễ bong ra, xâm nhập vào dòng máu, tăng khả năng xâm lấn và di căn Khảnăng di căn của các tế bào ung thư tương quan với mức độ phong phú axitsialic trên bề mặt của chúng Tuy nhiên, cho đến nay, một khía cạnh quantrọng liên quan đến vai trò của axit sialic trong sinh hóa tế bào ung thư vẫnchưa rõ ràng Một nghiên cứu gần đây đã chứng minh và đề xuất mức độ axitsialic trên bề mặt tế bào như là một marker đặc trưng cho tình trạng biệt hóacủa tế bào ung thư phổi nhỏ [67]

Một nghiên cứu sâu hơn đánh giá vai trò của acid sialic trên bề mặt tếbào u, kết quả cho thấy có sự khác biệt về axit sialic trên bề mặt tế bào ungthư đại tràng so với tế bào đại tràng bình thường, mức độ axit sialic cũngtương quan với mức độ di căn và xâm lấn Axit sialic có liên kết alpha 2, 3 cónhiều ở các tế bào đại tràng người bình thường, trong khi đó các tế bào ungthư đại tràng lại có nhiều axit sialic có liên kết alpha 2, 6 Có thể thấy rằng sựtiến triển ác tính có liên quan với thay đổi của enzyme sialyl-transferasealpha, enzyme này biến đổi axit sialic có liên kết alpha 2, 3 thành axit sialic

có liên kết alpha 2, 6 Axit sialic có liên kết alpha 2, 6 tỉ lệ thuận với khả năngtiến triển bệnh ung thư đại trực tràng [42], [68]

Bên cạnh đó, axit sialic hóa bề mặt tế bào còn tạo ra một lớp phủ trên

bề mặt tế bào ung thư, che giấu các kháng nguyên tế bào ung thư và làm chocác tế bào này thoát khỏi sự giám sát của hệ thống miễn dịch Các nhà khoahọc đã chứng minh kháng nguyên ung thư tuyến giáp thể tủy lewis bị chekhuất, thoát khỏi kiểm soát của hệ miễn dịch nhờ các phân tử axit sialic cóliên kết alpha 2,3 và liên kết alpha 2,6 Loại bỏ axit sialic khỏi bề mặt tế bàoung thư bằng enzyme sialidase có thể làm cho hệ thống miễn dịch phát hiện

kháng nguyên ung thư đặc hiệu (hình 1.4) Việc loại bỏ axit sialic khỏi bề mặt

tế bào ung thư làm giảm khả năng di căn, bộc lộ kháng nguyên tế bào u, do

đó, kích hoạt các tế bào NK, giải phóng IFN-γ tiêu diệt tế bào ung thư Cácprotein H, HN của MeV và MuV sở hữu cả hoạt động ngưng kết hồng cầu vàneuraminidase (sialidase) Neuraminidase có khả năng chia tách và loại bỏaxit sialic khỏi bề mặt các tế bào u, bộc lộ kháng nguyên tế bào u, làm tăngđáp ứng của tế bào lympho T gây độc tế bào

Hình 1.4 Vai trò sialidase của MeV, MuV hoạt hóa tế bào lympho T

gây độc tế bào u

* Nguồn: theo Matveeva O.V và cộng sự (2015) [45]

1.4 Các nghiên cứu virus vaccine sởi và quai bị điều trị ung thư trên lâm sàng

Đã có nhiều thử nghiệm lâm sàng của MeV và Muv ở các giai đoạnkhác nhau Điều này cho thấy 2 OV này có tiềm năng phát triển thành liệupháp điều trị nhiều loại ung thư khác nhau Bảng dưới đây thống kê các thửnghiệm lâm sàng đã tiến hành với MeV và MuV

Bảng 1.1 Các thử nghiệm lâm sàng của MeV và MuV

N.C lâm

b

sàng, số ệnh nhân (n) Kết quả lâm sàng Năm Virus sởi (MeV)

1/5 bệnh nhân thoái triển hoàn toàn u bị tiêm, 3/5 bệnh nhân thoái triển một phần ở u tiêm

và 2/3 bệnh nhân này có thoái triển một phần các u ở xa.

Ung thư buồng trứng

Giai đoạn 1 (n = 21)

Giai đoạn 1 (n=16)

Thời gian sống trung bình của

2012 đến 2018

MeV-NIS

Tiêm

nội u

Ung thư biểu

mô tế bào vảy đầu và cổ hay ung thư vú

Giai đoạn 1

2013 đến 2018

Giai đoạn 2

2015 đến 2019 MeV-

U biểu mô buồng trứng hay màng bụng

Giai đoạn 1

2012 đến 2018 MeV-

nội u

U biểu mô buồng trứng

Giai đoạn 1

2014 đến 2021

10 –10

* Nguồn: theo Matveeva O.V và cộng sự (2015) [41]

Virus quai bị (MuV)

Giai đoạn 2 (n = 90)

79/90 bệnh nhân đáp ứng với điều trị và 37/79 bệnh nhân có thoái biến khối u đáng kể hay

Giai đoạn 2 (n=200)

26/200 bệnh nhân có thoái biến khối u; đa số bệnh nhân

Giai đoạn 2 (n = 22)

5/7 bệnh nhân đã mất hoàn toàn cổ trướng hoặc tràn dịch màng phổi; Tuy nhiên những bệnh nhân có khối u lớn không đáp ứng Bệnh nhân tràn dịch màng bụng hoặc màng phổi có đáp ứng (chưa tiêm chủng vaccine virus)

1988

CHƯƠNG 2 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 Đối tượng nghiên cứu

2.1.1 Động vật

Có 49 con chuột thiếu hụt miễn dịch (chuột nude) chủng BALB/c đượcnuôi trong phòng sạch, chăm sóc theo quy trình hướng dẫn nuôi chuột nudetại Viện nghiên cứu Y-Dược học Quân sự, Học viện Quân Y

2.1.2 Chất liệu nghiên cứu

2.1.2.1 Virus vaccine sởi và quai bị

Virus vaccine sởi chủng Edmonton và virus vaccine quai bị chủngUrabe có nguồn gốc từ vaccine Priorix (GlaxosmithKline, Anh) Các chủngvirus vaccine này được tăng sinh, bảo quản và duy trì ở phòng thí nghiệmnghiên cứu ưng thư của Bộ môn Sinh lý bệnh đặt tại Viện nghiên cứu Y-Dượchọc Quân sự, Học viện Quân y

2.1.2.2 Dòng tế bào ung thư đại tràng người HT-29 và tế bào thận khỉ xanh Châu Phi (Vero)

Dòng tế bào Vero và ung thư đại tràng người HT-29 có nguồn gốc từtrung tâm nuôi cấy các dòng tế bào Mỹ (American Type Culture Collection,Manassas, Virginia, USA) Quá trình nghiên cứu chúng tôi nuôi cấy, tăng sinhcác dòng tế bào này trong môi trường nuôi cấy đúng theo quy trình, bảo quản

và duy trì tại trung tâm nghiên cứu ưng thư của Bộ môn Sinh lý bệnh đặt tạiViện nghiên cứu Y-Dược học Quân sự, Học viện Quân y

2.1.3 Trang thiết bị sử dụng cho nghiên cứu

2.1.3.1 Thiết bị sử dụng

Sử dụng các thước kẹp đo u, máy camera, máy đo quang OD làmnghiệm pháp MTT, kính hiển vi quang học, tủ ấm 370 C và 5% CO2 (hình2.1) Các máy đo phục vụ cho nghiên cứu đều được chuẩn hóa

Hình 2.1 Các máy sử dụng cho nghiên cứu(1) Kính hiển vi điện tử truyền qua; (2) Máy phân tích tế bào theo dòng chảy;

(3) Máy ly tâm; (4) Kính hiển vi; (5) Tủ ấm 370C, 5% CO2;

(6) Máy đo quang MTT

2.1.3.2 Các dụng cụ thí nghiệm tiêu hao

Đĩa nuôi cấy tế bào các kích cỡ khác nhau, các đĩa nuôi cấy tế bào đagiếng: 6, 12, 24, 96 giếng; pipet các kích cỡ; ống falcon 15ml và 50 ml; ốngeffendort 1,5ml và 2ml; các dụng cụ tiêu hao khác

2.1.3.3 Hóa chất

Môi trường nuôi cấy DMEM có thêm 10% FBS (Foetal Bovine Serum)

và 1% kháng sinh (penicillin và streptomycin) được lọc qua màng lọc vôtrùng

Dung dịch đệm PBS, cồn 90 độ, Trypsin-EDTA 1X, dung dịch cố định

tế bào, dung dịch dimethyl sulphoxide (DMSO)…

Bộ kit MTT đánh giá tỉ lệ tế bào sống; kit FITC Annexin V ApoptosisDetection kit (BD) đáng giá tỉ lệ tế bào chết apoptosis; các kháng thể gắn chấtphát huỳnh quang phát hiện các tế bào miễn dịch ở lách chuột: kháng thể