Sự kháng lạnh và nóng sự tích tụ của hợp chất phenol trong cà chua và dưa hấu

Sự kháng lạnh nóng: tích tụ hợp chất Phenol cà chua dưa hấu Rosa M Rivero*, Juan M Ruiz, Pablo C García, Luis R LópezLefebre, Esteban Sánchez, Luis Romero Bộ Sinh Học Thực Vật, Khoa Khoa Học Tự Nhiên, Đại Học Grânda, E18071, thành phố Granada, Tây Ban Nha Công bố 16,tháng 3, năm 2000 Chờ xét duyệt 18, tháng 9, năm 2000 Công nhận 18, tháng 9, năm 2000 TĨM TẮT: Trong thí nghiệm,cây cà chua dưa hấu trồng khoảng thời gian 30 ngày nhiệt độ khác ,cụ thể mức nhiệt độ :150C,250C 350C.Chúng tơi tiến hành phân tích hòa tan phenol hoạt động enzyme(Có loại enzym khảo sát phenylalanine ammonia–lyase(PAL), polyphenol oxidase(PPO) peroxidase(POD)), trọng lượng khô.Kết cho thấy ảnh hưởng khác mức nhiệt độ cà chua dưa hấu.Kết stress nóng cà chua xảy mức nhiệt 350C, stress lạnh xảy dưa hấu mức 15 0C.Nguyên nhân stress nhiệt giảm khối lượng chồi mầm, tích tụ phenolic hòa tan,enzym phenylalanine ammonia- lyase hoạt động mạnh enzym peroxidase polyphenol oxidase hoạt động thấp Kết : stress nhiệt đem lại tích tụ hợp chất phenol thực vật cách kích hoạt q trình tổng hợp chúng ức chế trình oxi hóa chúng Điều coi chế thích nghi thực vật chống lại stress nhiệt I/ Giới thiệu: Trong suốt trình tăng trưởng phát triển, thực vật chịu ảnh hưởng nhiều loại stress khác Ví dụ như: hạn hán, nhiệt, tia cực tím, nhiễm khơng khí, tác nhân gây bệnh….Đa số thực vật chịu ảnh hưởng sinh lý sinh hóa tiếp xúc với nhiệt độ cao thấp so với ngưỡng tối ưu cho phát triển chúng Kết tổn thương biểu hầu hết trình trao đổi chất làm giảm khả tăng trưởng trồng , mà làm thấp sản lượng thương mại Điều chứng minh stress nhiệt gây việc sản xuất hợp chất phenolic, flavonoids phenyl propanoid Phenylalanine ammonia-lyase (PAL) xem enzyme chủ yếu đường phenyl-propanoid,xúc tác chuyển đổi việc khử amin L-Phenyalanine axit transcinnamic, phương tiện quan trọng q trình tổng hợp phenolic Đây enzyme làm tăng hoạt động việc đáp ứng với stress nhiệt xem dòng tế bào chống lại stress thực vật Phenol bị oxi hóa peroxidase (POD) chủ yếu polyphenol oxidase (PPO), sau enzyme xúc tác q trình oxy hóa o-diphenols đến o-diquinones, hydroxyl hóa monophenol.Hoạt động enzyme tăng cao để đáp ứng với loại stress khác nhau, sinh học phi sinh học.Cụ thể hơn, enzym liên quan đến xuất tổn thương sinh lý gây thực vật stress nhiệt.Mặc dù có nhiều cơng trình nghiên cứu liên quan đến trao đổi phenol (quá trình tổng hợp q trình oxi hóa),cũng hàm lượng hợp chất này, cảm ứng số loại stress thực vật lại có cơng trình liên quan đến tăng phenol với stress nhiệt Vì vậy, mục đích cơng trình nghiên cứu để phân tích vai trò trao đổi phenol để đáp ứng với nhiệt độ khác nhau( 25 0C, 250C 35oC) cà chua dưa hấu Nhiệt độ sử dụng phòng thí nghiệm chúng tơi (150C, 250C 35oC) cho phép thực phản ứng trao đổi phenol từ stress nóng cà chua, nhiệt độ tăng trưởng tối ưu giống sử dụng từ 15-20oC Ngồi ra, chúng tơi thực phản ứng stress lạnh dưa hấu, nhiệt độ phát triển tối ưu khoảng khoảng 35oC II Vật liệu phương pháp 1/Thiết kế trồng: Cà chua (Lycopersicon esculentum L cv.Tmnkvf 2) dưa hấu (Citrullus lanatus) nảy mầm phát triển khoảng thời gian 30 ngày phòng tăng trưởng nhiệt độ tăng trưởng tối ưu loài :22-26oC cà chua 33-37oC dưa hấu.Sau 12 lồi chuyển vào phòng ni trồng nhiệt độ 15oC (ngày, đêm), thêm 12 đặt phòng nhiệt độ 25oC (ngày, đêm), 12 lại để phòng thứ nhiệt độ 35oC (ngày, đêm) Mỗi thí nghiệm stress nhiệt thực thời gian 30 ngày, (từ 30 ngày sau gieo hạt đến 60 ngày sau gieo hạt) Phòng tăng trưởng trường hợp phải trì độ ẩm tương đối khoảng 60-80% 16 chiếu sáng PPFD(Photosynthetic Photon Flux Density) 350 mmol m-2s-1, đo đỉnh sinh trưởng với cảm biến lượng tử 190 Sb.Trong tất thí nghiệm, trồng chậu riêng (đường kính 25cm, đường kính 17cm, chiều cao 25cm) đầy chất khống bón cây.Các nhận chất dinh dưỡng hòa tan: mM KNO 3,4mM (NO3) 2Ca, 1.5 mM NaH2PO4, mM CaCl2,3mM K2SO4, 1.25 mM MgSO4,5mM FeEDTA, 2mM MnSO4,1mM ZnSO4, 0.25 mM CuSO4, 0.05 mM (NH4)6Mo7O24 2.5mMH3BO3 Dung dịch dinh dưỡng (pH 6-6,1) thay ngày lần 2/Lấy mẫu thực vật: Cây lấy mẫu vào ngày 60 sau gieo, tất lấy mẫu trạng thái trưởng thành Vật liệu rửa ba lần H 2O sau khử trùng với 1% chất tẩy rửa không ion (Decon 90), sau thấm khơ giấy lọc Một mẫu sử dụng tươi để phân tích giá trị PAL, POD, PPO tổng số phenol, thực thí nghiệm ba lần cho dòng giống.Một mẫu chồi non sấy khô lò sấy 70oC 24 giờ.Trọng lượng khơ ghi nhận biểu thị mg khối lượng khô chồi 3/ Phân tích mẫu: 3.1/ Rút nguyên tắc khảo nghiệm PAL: Việc khảo sát thực theo phương pháp đề xuất Lister cộng Nguyên liệu tươi nghiền oC đệm gồm 5ml Na2HPO4/KH2PO4 50mM, pH 7.0, 5% polyvinylpyrrolidone (PVP) (Mr 44 000), 50 mM Na ascorbate, 18 mM mercaptoethanol, 0.1% (v/v) Triton X-100 Các đồng chất lọc qua lớp vải li tâm 20000 vòng 10 phút, (NH4)2SO4 thêm vào phần dịch để đạt 35% độ bão hòa, sau li tâm 20000 vòng 20 phút loại bỏ PVP Sau đó,(NH4)2SO4 thêm vào để đạt độ bão hòa cuối 80% Phần li tâm 20000 vòng 20 phút phần dịch đệm ( khơng có PVP Triton) Giải pháp sử dụng cho thử nghiệm PAL Protein ước tính phương pháp Brandford theo tiêu chuẩn BSA Hoạt động PAL phân tích phương pháp Zucker, McCallum Walker Hợp chất khảo nghiệm bao gồm: đệm 0.06 M Na borat, pH 8.8 enzym thô Phản ứng bắt đầu việc bổ sung 11mM L-phenylalanine Ống ủ 30oC 60 phút phản ứng dừng lại bổ sung 35% (w/ v) axit trifluoroacetic (TFA) Sau li tâm phút 5000 vòng để protein bị biến tính.Hoạt động PAL xác định sản lượng acid cinnamic, ước tính hấp thụ mức A 290 có khơng có phenylalanine Để xác định xem phản ứng enzyme ta tiến hành chiết xuất mẫu đun sôi khảo nghiệm 3.2/Rút nguyên tắc khảo nghiệm PPO Phương pháp rút đề xuất Thypyapony cộng Lá nghiền thành bột mịn chiết xuất với tỉ lệ 150 mg trọng lượng tươi/ 1ml đệm thu (100 mM Tris-HCl, pH 7.0; 100 mM KCl, mM phenylmetansulphonyl florua (PMSE) 3% [w/v] PVP) có chứa SDS 0, 0.5, 1, (w/v)) Các chất đồng li tâm 12000 vòng 15 phút, phần dịch sử dụng để đo nồng độ protein theo phương pháp Bradford theo tiêu chuẩn BSA PPO phân tích.Tất phương pháp thực 0-40C Hoạt động PPO khảo nghiệm mô tả Nicoli người khác với số sửa đổi Hoạt động tối ưu đạt sử dụng SDS mức 2% (dữ liệu không hiển thị) Hỗn hợp khảo nghiệm gồm 30 mM acid caffeic 100 mM đệm (Na2HPO4/KH2PO4), pH 7.0, sục khí vào phút Enzym Catalase (420 đơn vị) từ gan bò ( EC 1.11.1.6) (Fluka) thêm vào 0,1 ml H2O để ngăn chặn oxy hóa bề mặt.Khảo nghiệm bắt đầu việc bổ sung chiết suất enzyme Hoạt động PPO đo thay đổi A 370 hỗn hợp khảo nghiệm ( 300C) dựa tiêu hao acid caffeic q trình oxy hóa enzyme Để xác định xem phản ứng enzyme matic, chiết xuất mẫu đun sôi 3.3/ Rút nguyên tắc khảo nghiệm POD: Các phương pháp sử dụng sửa đổi Kalir người khác Nguyên liệu thực vật tươi cho vào với 50 mM dung dịch đệm Tris- acetate, pH 7.5, 5mM 2-mercaptoethanol, 2mM 1,4-dithio-DL-threitol (DTT), 2mM ethylenedi-amin acid tetraacetic (EDTA), 0.5 mM PMSF 1% (w/v) PVP Các chất đồng lọc qua lớp Miracloth li tâm 37000 vòng 30 phút Các cặn bị loại bỏ phần sử dụng để xét nghiệm với peroxidase để đo nồng độ protein phương pháp Braford theo tiêu chuẩn BSA Hoạt động POD xác định sau thay đổi A 485 guaiacol oxy hóa 300C.Hỗn hợp phản ứng chứa 100 mM đệm Tris-acetate, pH 5.0, mM guaiacol 0.003 mM H2O2 Để kiểm tra xem phản ứng POD, ta sử dụng enzyme catalase từ gan bò ( EC 1.11.1.6) (Fluka) (420 đơn vị 0.1 ml H2O) Để xác định xem phản ứng enzyme,ta tiến hành chiết xuất mẫu đun sơi phân tích 3.4/Rút ngun tắc định lượng phenol: Phenol nguyên liệu thực vật chiết xuất với methanol Tổng hàm lượng phenolic khảo nghiệm định lượng A 765 với thuốc thử Folin-Ciocalteau Kết thu acid caffeic gam trọng lượng tươi (FW) 4/ Phân tích thống kê: Các liệu hiển thị giá trị trung bình ± SE Mức độ quan trọng *P < 0,05; **P