TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1/ PROTEIN NGỌT VÀ PROTEIN TẠO CẢM GIÁC NGỌT 2/ MIRACULIN PROTEIN NGỌT VÀ PROTEIN TẠO CẢM GIÁC NGỌT Hiện nay, nghiên cứu giới xác định loại protein protein tạo cảm giác từ tự nhiên Theo đặc tính chia thành nhóm: Nhóm 1: protein (thaumatin, monellin, mabinlin, pentadin brazzein), nhóm 2: protein cảm ứng độ (miraculin) nhóm 3: protein có đủ đặc tính hai nhóm (neoculin) Các thuộc tính tính chất chất protein trình bày bảng 1.1 Bảng 1.1 Một số đặc tính protein tạo cảm giác (Kant 2005) Đặc tính Thaumatin Monellin Mabilin Pentadin Brazzein Curculin Miraculin Nguồn gốc T danielli Benth D cumminsii Diels C masaikai P Baillon P Baillon C latifolia R dulcifica Phân bố Tây Phi Tây Phi Trung Quốc Tây Phi Tây Phi Malaysia Tây Phi Biến thể I, II, a, b, c - I, II-a, III, IV - - - - Độ (*) 3000 3000 100 500 2000 550 - KLPT (kDa) 22,2 10,7 12,4 12,0 6,5 24,9 24,6 Acid amin 207 45 (chuỗi A) 50 (Chuỗi B) 33 (chuỗi A) 72 (Chuỗi B) - 54 114 191 Dạng hoạt tính Monomer (A+B) (A+B)(1) - Monomer (A+A) (2) (A+A), (A+A+A+A) (3) (*) độ tính dựa theo khối lượng phân tử, (1) : heterodimer, (2): homodimer, (3): tetramer Trong số protein kể trên, monellin có độ 100.000 lần, sau brazzein thaumatin khoảng 500 lần 3000 lần so với sucrose (dựa theo nồng độ mol/lít) Tất protein phân lập từ sống rừng mưa nhiệt đới Các protein có tiềm ứng dụng công nghiệp để thay chất làm nhân tạo mà sinh lượng an tồn cho người sử dụng Brazzein Brazzein protein nhỏ thuộc nhóm protein tạo vị ngọt, protein chứa 54 acid amin Brazzein bền với nhiệt độ độ pH, có độ vào khoảng 500-2000 lần so với sucrose (dựa theo khối lượng phân tử) có tiềm sử dụng chất làm với lượng thấp Brazzein phân lập từ Pentadiplandra brazzeana Baillon, loại sống Châu Phi Với đặc tính bền nhiệt bền với pH brazzein giúp nhà khoa học sử dụng brazzein để nghiên cứu ảnh hưởng nhiệt độ độ pH đến hoạt tính tạo cảm giác protein nói chung (Izawa et al., 1996) Thaumatim Thaumatin thuộc nhóm protein tạo vị phân lập từ vùng nhiệt đới Thaumatococcus danielli Thaumatin có 207 acid amin với cầu liên kết disulfide không chứa cystein tự Khi nhiệt độ 70oC pH 7,0 thaumatin có xu hướng kết dính lại hoạt tính tạo vị (Kaneko, Kitabatake 1999) Thaumatin có độ khoảng 10.000 lần so với sucrose (dựa theo nồng độ mol/lít), protein sử dụng nhiều quốc gia theo hướng tạo cảm giác tăng cường độ (Zemanek, Wasserman 1995) Monellin Monellin protein chứa chuỗi peptide, chuỗi A có 44 acid amin chuỗi B chứa 50 acid amin (Ota et al., 1999) Protein tinh từ Dioscoreophyllum cumminsii sống Tây Phi Độ monellin khoảng 100.000 lần so với đường sucrose khoảng vài trăm lần dựa theo nồng độ mol/lít khối lượng Chuỗi đơn monellin có 94 acid amin chứng minh có độ tương tự hai chuỗi monellin tự nhiên, dạng chuỗi đơn bền với nhiệt độ độ acid so với monellin tự nhiên (Lee et al., 1999) Các nghiên cứu gần xác định vị trí liên kết monellin với thụ thể vị giác người, vị trí gồm AsnA16, AsnA22, GlnA25 AsnA26 có hoạt tính tạo cảm giác 7500, 750, 2500 5500 lần so với sucrose (dựa theo khối lượng phân tử) (Kohmura et al., 1992) Curculin Curculin thu nhận từ Curculigo latifolia, curculin có hoạt tính chất làm sinh lượng Độ tối đa curculin tương đương với dung dịch sucrose 0,35 M Nó có khả tạo vị nước chất chua sau sử dụng curculin Hoạt tính tạo vị curculin không thay đổi sau xử lý nhiệt độ 50oC với pH từ 3-9 Mabinlin Mabinlin protein bền với nhiệt độ, bắt nguồn từ Capparis masaikai, có độ khoảng 400 lần so với sucrose (dựa theo khối lượng phân tử) Protein có chứa hai chuỗi, chuỗi A có 33 acid amin chuỗi B có 72 acid amin, chuỗi B có chứa hai liên kết disulfide chuỗi B liên kết với chuỗi A thông qua ba liên kết disulfide (Kohmura et al., 1992) Độ mabinlin-2 không thay đổi sau xử lý 48 điểm sôi, mabinlin-3 mabinlin-4 giữ hoạt tính sau xử lý 80oC (Nirasawa et al.,1994) Pentadin Pentadin loại protein tách chiết từ Pentadiplandra brazzeana, loại bụi phát rừng nhiệt đới số quốc gia Châu Phi Độ khoảng 500 lần so với sucrose (dựa theo khối lượng phân tử), phân tử chứa hai tiểu phần liên kết với qua cầu disulfide Đến chưa có nhiều thơng tin protein (van der Wel et al., 1989) Đặc điểm sinh học thần kỳ miraculin 2.1 Đặc điểm sinh học thần kỳ Cây thần kỳ (Richadella dulcifica) thuộc họ Hồng xiêm (Sapotaceae) (Matsuyama et al., 2009) Đây loại bụi sống vùng nhiệt đới Tây Phi Trong điều kiện tự nhiên, cao khoảng m điều kiện nhân tạo chiều cao khoảng m Loại sinh trưởng tốt đất có pH từ 4,5-5,8, điều kiện lạnh, chịu bóng nơi có độ ẩm tương đối cao Cây thần kỳ có màu đỏ, kích thước nhỏ (hình 1.1), nhai phần thịt thần kỳ sau ăn vị chua chẳng hạn chanh, lúc chanh có cảm giác mà khơng cịn vị chua Do vậy, gọi tên “thần kỳ”, có người dân Châu Phi dùng cách hàng trăm năm (Kurihara, Beidler 1968) Hình 1.1 Cây thần kỳ (Richadella dulcifica) cắt dọc Tính chất tạo cảm giác sử dụng thần kỳ miraculin chứa tạo mà thân miraculin không Ưu điểm việc sử dụng miraculin vừa tạo cảm giác vừa có lượng hấp thụ thấp, tốt cho cải thiện bữa ăn bệnh nhân tiểu đường béo phì (Sun et al., 2006a) Trong tự nhiên, miraculin tích lũy thần kỳ tuần tuổi chuyển từ màu xanh sang màu cam miraculin tích lũy nhiều trạng thái đỏ hồn tồn, miraculin tiết tích lũy lớp gian bào thần kỳ (Hirai et al., 2010b) (hình 1.2) Hình 1.2 Miraculin tự nhiên tích lũy phần thịt thần kỳ (A) Hàm lượng miraculin tích lũy thịt quả; (B) Miraculin thịt phân tích Western blot; (C) Các giai đoạn phát triển thần kỳ (Hirai et al., 2010a, Hiraiet al., 2011a, Kim et al., 2010b) Tại Việt Nam, Trần Danh Thế et al (2009) bước đầu trồng thử nghiệm thần kỳ Thành phố Hồ Chí Minh, theo dõi đặc điểm sinh học phân tích thành phần từ thịt thần kỳ giai đoạn chín đỏ, kết phân tích cho thấy ,dịch chiết gồm: nước (68,9%), đường tan tổng số (2,38%), đường khử (0,40%), protein (0,10%), đạm tổng số (1,91%) khống tổng số (0,99%) Ngồi định tính số thành phần dịch chiết thịt gồm tinh dầu, carotenoid, phytosterol, acid béo, flavonoid, polyphenol, acid hữu cơ, saponin steroid, đường khử, hợp chất uronic (Trần Danh Thế et al., 2009) 2.2 Cấu trúc miraculin Miraculin glycoprotein, chuỗi polypeptide chứa 220 acid amin có 29 acid amin trình tự tín hiệu (Masuda et al., 1995) Khối lượng phân tử chuỗi đơn peptide tính tốn dựa trình tự acid amin khoảng 24,6 kDa, hàm lượng hydrocacbon chiếm khoảng 13,9% (Theerasilp et al., 1989) Miraculin tự nhiên tinh khiết tetramer, dịch chiết thơ chưa khử chưa biến tính miraculin dimer Cả hai dạng tetramer dimer tự nhiên miraculin có tác dụng tạo cảm giác (Igeta et al., 1991), dạng monomer lại khơng có tính chất (Ito et al., 2007) Vì vậy, q trình dimer hóa từ hai monomer miraculin thông qua việc tạo liên kết cộng hóa trị vị trí Cys138-Cys138 (Cysteine) cần thiết để tạo miraculin dimer có hoạt tính (hình 1.3) Hình 1.3 Mơ hình cấu trúc 3D protein miraculin dạng homodimer Mũi tên màu xanh: liên kết disulfide (Cys138-Cys138) hai monomer Phân tử miraculin có hai vị trí glycosyl hoá Asn42 Asn186 tạo thành ,oligosarcharide (Hiwasa-Tanase et al., 2011) Miraculin có bảy phân tử Cys, hình thành ba chuỗi tương tác qua cầu disulfide Cys47-Cys92, Cys148-Cys159 Cys152- Cys155 chuỗi tương tác qua cầu disulfide Cys138 (Igeta et al., 1991) 2.3 Cơ chế tạo cảm giác miraculin Miraculin có chất không ngọt, sau sử dụng miraculin từ thần kỳ vị chua chanh có vị cam Miraculin có khả tạo cảm giác từ loại acid khác HCl, acid oxalic, acid lactic, acid formic, acid axetic acid citric Tác dụng tạo cảm giác miraculin phụ thuộc vào độ chua độ pH acid (Kurihara, Beidler 1969) Hoạt tính tạo cảm giác dung dịch miraculin đạt mức tối đa sau ngậm dung dịch miệng khoảng phút (Kurihara, Beidler 1969) Để tạo cảm giác tối đa, nồng độ miraculin từ 4.10-7 M độ đạt tương đương với độ dung dịch sucrose 0,4 M Tác dụng tạo cảm giác kéo dài khoảng sau sử dụng, tùy thuộc vào nồng độ dung dịch miraculin Ở người, vị cảm nhận nhờ vào tế bào thụ thể chồi vị giác Có loại vị giác bản: mặn, chua, ngọt, đắng umami, cảm giác vị umami vị ngon người Thụ thể vị giác động vật có vú có chất phức hệ G protein, phức hệ thụ thể cảm giác T1R2+T1R3 (Zhao et al., 2003) Hình 1.4 Mơ hình thụ thể T1R2+T1R3 liên kết với protein cảm giác (A) Mơ hình mơ tương tác protein với thụ thể; (B) Mơ hình phân tử thể tương tác miraculin với thụ thể T1R2+T1R3 (Kant 2005, Koizumi et al., 2011) Miraculin làm thay đổi cấu hình chồi vị giác lưỡi sau sử dụng Điều kết hoạt hoá thụ quan cảm giác lưỡi miraculin: protein cảm giác (ký hiệu màu đỏ, hình 1.4A) liên kết với thụ thể T1R2+T1R3 dạng I, liên kết làm thay đổi cấu hình thụ thể, trở thành dạng II ổn định (Kant 2005, Koizumi et al., 2011) Cơ chế chi tiết hoạt động thuộc tính cảm ứng lưỡi miraculin đến chưa rõ ràng, có quan niệm cho chồi vị giác khác cho cảm giác vị khác chẳng hạn chồi vị giác nhận vị mặn truyền tín hiệu lên não để hoạt hóa thụ quan vị mặn cho có cảm giác vị mặn Trong trường hợp miraculin, tế bào thụ quan cảm giác chồi vị giác khơng nhận vị miraculin mà hoạt hố thụ quan cảm giác não Vì miraculin đã“đánh lừa” não 2.4 Tình hình nghiên cứu miraculin tái tổ hợp Cây thần kỳ loại sống vùng nhiệt đới, sống nhiệt độ môi trường thấp 70C, thêm vào đó, cần đến 3-4 năm tuổi để hoa phần nhỏ số hoa thụ phấn Ngoài ra, hoạt động tạo cảm giác miraculin thần kỳ bị hoạt tính sau khoảng 2-3 thu hoạch bảo quản nhiệt độ phòng (Kurihara, Nirasawa 1997) Vì vậy, nguồn miraculin tự nhiên bị hạn chế Từ tính chất ưu việt miraculin nên việc sản xuất sinh khối miraculin cần thiết Hiện nay, với phát triển mạnh mẽ công nghệ sinh học, đặc biệt công nghệ gen giúp nghiên cứu sản xuất thử nghiệm miraculin tái tổ hợp nhiều đối tượng biểu khác E.coli, nấm men, nấm mốc (Aspergillus oryzae) thực vật Miraculin tái tổ hợp tạo E.coli khơng có hoạt tính tạo cảm giác có biểu protein (Kurihara 1992) Gần đây, miraculin tái tổ hợp biểu lại E.coli với số cải tiến nhóm nghiên cứu Matsuyama et al (2009), nhóm thành cơng việc sản xuất miraculin dimer có hoạt tính Tuy nhiên, hoạt tính khoảng 1/6 so với miraculin tự nhiên Kết cho thấy q trình glycosyl hóa cần thiết cho trình cuộn gấp ổn định protein (Matsuyama et al., 2009) Miraculin tái tổ hợp có hoạt tính sản xuất nấm mốc (có q trình glycosyl hóa) (Ito et al., 2007) Một hệ thống vi sinh vật khác sử dụng để biểu miraculin tái tổ hợp tế bào nấm men có mã di truyền tối ưu bổ sung them trình tự tín hiệu, kết miraculin tái tổ hợp tạo có hoạt tính (Ito et al., 2010) Hoạt tính miraculin tái tổ hợp hệ thống nấm mốc nấm men đánh giá khoảng 1/5 so với hoạt tính miraculin tự nhiên, kết giải thích khơng q trình glycosyl hóa quan trọng mà phụ thuộc vào chất chuỗi đường liên kết, sự ổn định miraculin tổng hợp Các nghiên cứu gần xác định thực vật hệ thống thích hợp để sản xuất miraculin có hoạt tính sinh học, thực vật nói chung có q trình glycosyl hóa tương tự thần kỳ Cây xà lách (Lactuca sativa) thực vật sử dụng để biểu miraculin tái tổ hợp, hoạt động gen điều khiển promoter 35S NOS terminator, kết miraculin tái tổ hợp tạo có đầy đủ hoạt tính tạo cảm giác với độ tương đương với miraculin tự nhiên (Sun et al., 2006a) Tuy nhiên, “câm lặng” gen chuyển xảy dòng chuyển gen hệ cháu (Sun et al., 2007) Tiếp theo, miraculin biểu dâu tây chuyển gen, loại có ưu sinh sản vơ tính, nhiên miraculin tái tổ hợp tích lũy có hàm lượng thấp, khoảng 2,0 µg/g khối lượng tươi, mức độ tích lũy ổn định qua hệ nhờ sinh sản vơ tính (Sugaya et al., 2008) Miraculin tái tổ hợp biểu cà chua, xem loại thích hợp số loài thực vật sử dụng để biểu miraculin tái tổ hợp (Kurokawa et al., 2013) Cây cà chua có nhiều ưu điểm khác chuyển gen dễ dàng thông qua Agrobacterium, hiệu suất biến nạp lên đến 40% (Sun et al., 2006b) Các thể biến nạp thu khoảng tháng sau hạt nảy mầm Hơn nữa, cà chua chuyển gen tạo miraculin tái tổ hợp có hàm lượng khoảng 90,7 µg/g khối lượng tươi quả, có đầy đủ hoạt tính tạo cảm giác ngọt, tương đương với miraculin tự nhiên (Sun et al., 2007) Ngoài ra, mức độ tích lũy biểu gen chuyển ổn định từ hệ T1 đến T5 (Yano et al., 2010) Tuy nhiên, tích lũy miraculin tái tổ hợp phụ thuộc vào chất giống cà chua, số lượng copy gen chuyển thời điểm chín cà chua (Hirai et al., 2011a, Hiwasa-Tanase et al., 2011, Sun et al., 2007) Một hệ thống gần đầy sử dụng để biểu miraculin tái tổ hợp cam quýt, hệ thống tiềm để sản xuất miraculin tương lai (Jin et al., 2013) Trong trình nghiên cứu sản xuất miraculin tái tổ hợp miraculin phân lập từ tự nhiên, việc xác định xác khối lượng phân tử tinh sản phẩm quan trọng, phục vụ nghiên cứu chi tiết Trước mẫu phân lập chưa hoàn toàn tinh việc xác định cấu trúc chủ yếu miraclin chưa thực Kỹ thuật tinh miraculin từ thần kỳ phát triển từ năm 1968 (Kurihara, Beidler 1968) Tuy nhiên, phương pháp loại bỏ chất tạo màu polyphenolic giảm hoạt tính tạo cảm giác Năm 1988, Theerasilp Kurihara sử dụng dung dịch NaCl để tách chiết dịch thơ từ thần kỳ, sau tiến hành sắc ký trao đổi ion sắc ký lực để tinh miraculin thu (Theerasilp, Kurihara 1988), khối lượng phân tử xác định SDS-PAGE khoảng 28 kDa thơng báo trước cho khối lượng miraculin dao động 40 kDa tới 48 kDa Miraculin glycoprotein có chứa khoảng 13,9% carbohydrate (Theerasilp, Kurihara 1988) Gần đây, hệ thống tinh bước sử dụng sắc ký lực kim loại nikel cố định phát triển (Duhita et al., 2009) Phương pháp sử dụng chuỗi histidine tiếp xúc bề mặt dimer miraculin Phương pháp đơn giản so với phương pháp trước làm giảm bước sử dụng cột lọc nên tiết kiệm thời gian, giảm chi phí cho q trình tinh Thêm vào đó, phương pháp cho phép tinh dạng miraculin hoạt tính cột IMAC liên kết với miraculin có cấu trúc không gian chiều dạng dimer (cấu trúc khơng gian có liên quan đến hoạt động tạo cảm giác ngọt) không liên kết với miraculin dạng monomer (dạng khơng có hoạt tính) Mặc dù phương pháp tinh sử dụng IMAC hiệu so với phương pháp khác, tương lai cần thiết phải phát triển phương pháp khác để ứng dụng quy mô công nghiệp Đối với miraculin tái tổ hợp, q trình tinh thực theo phương pháp Theerasilp Kurihara (1988) cách thêm sắc ký cột khối lượng phân tử (Sephacryl S-200 HR) phương pháp thời gian có mức độ thu hồi thấp liên quan đến nhiều bước tinh (Sun et al., 2007) ... al., 2 011 ) Miraculin có bảy phân tử Cys, hình thành ba chuỗi tương tác qua cầu disulfide Cys47-Cys92, Cys148-Cys159 Cys152- Cys155 chuỗi tương tác qua cầu disulfide Cys138 (Igeta et al., 19 91) 2.3... (hình 1. 3) Hình 1. 3 Mơ hình cấu trúc 3D protein miraculin dạng homodimer Mũi tên màu xanh: liên kết disulfide (Cys138-Cys138) hai monomer Phân tử miraculin có hai vị trí glycosyl hoá Asn42 Asn186... động vật có vú có chất phức hệ G protein, phức hệ thụ thể cảm giác T1R2+T1R3 (Zhao et al., 2003) Hình 1. 4 Mơ hình thụ thể T1R2+T1R3 liên kết với protein cảm giác (A) Mơ hình mơ tương tác protein