Phương pháp đo các gốc oxi hóa tự do

Trương đai hoc sư pham ky thuât tp.hcm Khoa điên – điên tư Bô môn : SINH HỌC ĐẠI CƯƠNG PHƯƠNG PHÁP ĐO CÁC GỐC OXI HÓA TỰ DO TRONG HỆ THỐNG SINH HỌC Nguyễn Lê Gia Bách Pham Thị Diễm My 16129008 16129039 Phan Thị My Loan 16129034 Dương Thanh Toàn 16129073 Dương Thị Kiêu Oanh 16129050 I Gốc tự I.1 Định nghĩa Gốc tự nguyên tử, phân tử ion có điện tử lẻ đơi vòng ngồi nên mang điện tích âm có khả ơxy hóa tế bào, phân tử, nguyên tử khác Do bị điện tử nên gốc tự do rất khơng ổn định ln có xu hướng chiếm đoạt điện tử từ cấu trúc lân cận, tạo hàng loạt gốc tự do mới Hậu xuất biến đổi làm tổn hại, rối loạn chức năng, chí gây chết tế bào I.2 Nguyên nhân Nội sinh Ngoại sinh (phát: sinh tác động từ môi trường sống): - Từ chuỗi chuyền điện trongsinh ty thể (cáctựphản ứng hóa mitochondria): superoxide anion Các yếu tố môi trường táctửđộng gốc do: có rấtphosphoryl nhiều oxy tia tử ngoại (UV), loại bụi kim loại, khói (O2●), peroxynitrate (ONO-), hydrogen peroxide (H2O2), gốcđường hydroxyl Các gốcnghiệp tự ln hình thành nhiều nhau,phụ thực phẩm, thuốc lá, bụi, khói cơng (khóiđược thải từ nhà máy,từ xe,…), thuốc trừ sâu,khác các(●OH) chất gia,chia chấtthành bảo quản Từ hoạt động hơ hấp leucocyte, gốc tự docác hình thành để giết vi khuẩn thức ăn -nước uống cónội chứa nấm mốc, độc tố vi khuẩn, chất phóng xạ, hành vi, thói quen cá nhân hút loại: sinh vàcủa ngoại sinh   Từrượu, trình tự chết củaloại tế bào (apoptosis): in vitro, người ta thấy chất oxy hóa nội sinh AXO thuốc,  uống ăn uống nhiều đồ ăn sinh axit, v.v… ngăn trở apoptosis I.3 Cấu trúc Phân tử gồm số nguyên tử dính với tác dụng cặp đôi điện tử (electron) Vì lý đó, điện tử bị tách rời khỏi nhóm nên phân tử có số điện tử lẻ coi gốc tự I.4 Đặc điểm • Tính bất ổn: bị thiếu điện tử (electron) nên gốc tự thường bất ổn, dễ dàng tạo phản ứng hóa học • Tính dễ chiếm đoạt: xu hướng ln tìm cách để “chiếm đoạt” điện tử từ phân tử khác để bù đắp vào thiếu hụt • Có xu hướng đạt tới ổn định: ln có khuynh hướng đạt tới ổn định có thời gian tồn ngắn, hoạt tính mạnh Gốc tự tồn ngắn độc tính cao I.5 Tác hại Lượng tế bào thể phải hứng chịu khoảng 10.000 gốc tự công ngày Trải qua 70 năm đời, thể hình thành ước chừng đến 17 gốc tự Các chất cấu tạo quan thể bị ảnh hưởng gốc tự : • • • Màng tế bào, protein mỡ Mô mỡ Các acid nucleic (adenine, thymine, guanine cytosine) I.6.1 ROS ngoại sinh ROS ngoại sinh tạo từ chất nhiễm, thuốc lá, khói bụi, chất độc hóa học phóng xạ Các phóng xạ ion hóa phản ứng với nước gây nên tổn thương cho sinh vật, q trình gọi phân ly phóng xạ Vì nước chiếm tới 55-60% thể nên khả xảy phân ly phóng xạ cao trường hợp có diện phóng xạ ion hóa Trong q trình này, nước bị electron trở nên hoạt động III.1.7 Phát hiên hydrogen peroxid (H2O2) Phương pháp sử dụng phổ biến sử dụng oxy hóa phụ thuộc spocolectin horseradish peroxidase tạo thành sản phẩm không phát huỳnh quang Đo huỳnh quang scopeletin 460nm Đôi sử dụng chất khác peroxidase ( ví dụ biến đổi guaicol thành chất có màu nâu) Superoxide làm giảm hoạt tính peroxidase ảnh hưởng đến phép đo H2O2 hộ sinh O2 Điều tránh cách thêm vSOD III.2 Các phương pháp dấu vân tay ROS RNS phản ứng theo cách riêng với ADN, protein, lipid số chất chống oxy hoá khối lượng phần tử thấp( ví dụ ascorbic, urat) Do sản phẩm tạo thành coi ‘dấu vân tay’ cơng oxy hố.Các phương pháp không dạng hoạt động ROS/RNS mà sản phẩm tổn thương oxy hoá gây ROS/RNS sảnphẩm phải chất đánh dấu đặc trưng tổn thương oxy hoá Và phải đảm bảo chắn sản phẩm xác định công oxy hố khơng phải tạo q trình sinh học thơng thường III.2 Các phương pháp dấu vân tay 3.2.1 Đo q trình peroxyd hóa lipid (POL) Q trình peroxyd hố lipid màng, lipoprotein acid béo chưa no công gốc tự tạo sản phẩm cuối Mỗi kỹ thuật đo sản phẩm q trình POL khơng kỹ thuật đo xác tồn q trình POL Dưới số phương pháp đo sản phẩm trình POL III.2 Các phương pháp dấu vân tay 3.2.1.1Đo acid béo chưa no III.2 Các phương pháp dấu vân tay 3.2.1.2 Đo hấp thụ UV cấu trúc điện liên hợp với xếp liên kết đôi- đơn- đôi III.2 Các phương pháp dấu vân tay 3.2.1.3Đo khí hydrocarbon III.2 Các phương pháp dấu vân tay 3.2.1.4- Do isoprostan (isoPs) Các mô dộng vật dịch thể (gồm nước tiểu) chứa lượng nhỏ F2- Tsopiostan III.2 Các phương pháp dấu vân tay 3.2.1.5 Đo aldehyd khác ngồi MDA Có nhiều sản phẩm cuối q trình peroxvd hóa lipid ngồi cácisoprotane, peroxyd, khí hydrocarhon MDA Các aldehyd phản ứng với dinilrophenylhydrazin cho sản phẩm dinitrophenylhydrazon, chất tách HPLC Hoặc, chúng cố thể bị biến đổi thành sản phẩm dể bay tách GC xác định bời MS Các aldehyd hoạt động bị chuyển hoá tế bào Khi sinh tế bào chúng nhanh chóng liên kết với protein mà GC-MS không tách phức hợp liên kết với protein Do đó, phương pháp dựa vào kháng thể đổ phát phức hợp III.2 Các phương pháp dấu vân tay 3.2.1.6 Đo phát xạ ánh sáng Các phương pháp đo phát xạ ánh sáng tế bào phân lập thành phần màng, đo giai đoạn sau trình pcroxyd hoá lipid.Một nguồn phát xạ ánh sáng thể q trình peroxyd hố lipid Một số ánh sáng tạo hệ thống lipid peroxyđ hoá xuất hai gốc peroxyl gặp theo chế Russcl.Hoặc, hợp chất carbonyl tạo trạng thái kích thích phát xạ ánh sáng phân rã trở lại trạng thái Các nguồn sáng khác tạo thành gốc alkoxyl tự phản ứng tạo thành ceton trạng thái kích thích III.2 Các phương pháp dấu vân tay 3.2.2 Đo tổn thương ADN 3.2.2.1 Định lượng trực tiếp 8-hydroxydeoxyguanosin AON HPLC Sự tổn thương ADN oxy hoá gây đứt mạch ADN, tổn thương đường deoxyribose gâv biến đổi base purin pyrimidin tạo nhiều sản phẩm 8- hydroxydeoxyguanosin (8-OHdG) sản phẩm coi chất thị tổn thương ADN oxy hố Do phương pháp để định lượng tổn thương ADN oxy hoá định lượng trực tiếp 8-01 IdG ADN Trước tiên giải phóng 8OHdG từ ADN cách thuỷ phân enzym, sau định lượng 8-OHdCr phương pháp HPLC kết hợp với detector điện hoá (ECD), kỹ thuật nhạy thường hay sử dụng III.2 Các phương pháp dấu vân tay 3.2.2 Đo tổn thương ADN 3.2.2.2 Phương pháp điện ly gel đơn tế bào phương pháp comet, phương pháp "sao chổi') Đánh giá tổn thương base oxy hoá Sau phân giải tế bào, cho tiếp xúc với enzym phục hồi ADN ADN bị phá vỡ vị trí base biến đổi, tạo nhiều đoạn Phương pháp kết hợp với phương pháp khác để đo lường mức độ phá vỡ ADN Gồm đánh dấu đồng vị 31 P nucleotid ADN thuỷ phân, enzym, sau tách bang sắc kỷ phát bàng cách xạ, sử dụng kháng thể trực tiếp kháng lại 8-OHdG tổn thương khác Nhuộm màu kháng thể kháng lại 8-OHdG ứng dụng cho tồn ADN kháng thể đưa vào cột để loại hết 8OHdG từ thuỷ phân ADN từ nước tiểu III.2 Các phương pháp dấu vân tay 3.2.2 Đo tổn thương ADN 3.2.2.3 Do hợp chất gốc aldehyde kết hợp với ADN Các aldehyd độc tế bào dược tạo q trình peroxvd hố lipid có nhiều mơi trường Nếu gặp ADN, aldehyd liên kết với base ADN Đo sản phẩm phương pháp GC-MS HPLC/ECD sau thuỷ phân ADN acid thử nghiệm miễn dịch III.2 Các phương pháp dấu vân tay 3.2.2 Đo tổn thương ADN 3.2.2.4 Đo tổn thương protein Một phương pháp phổ biến đánh giá tổn thương protein oxy hoá phương pháp carbonyl sử đụng rộng rãi Dựa công số ROS vào gốc amino acid protein đặc biệt histidin, arginine, lysin prolin) để tạo sản phẩm cố chứa nhóm carbonyl, sản phẩm đo sau phản ứng với 2,4- dinitrophenylhydrazine tạo sản phẩm hấp thụ bước sóng 360-390 nm Hãy chống lai gốc tự ... khác • Phương pháp thử hoạt tính ức chế gốc tự DPPH • Phương pháp thu hoạt tính ức chế gốc tự NO • Phương pháp đo MDA II Phương pháp xác định hoat tính chống oxi hóa II.1 DPPH Ngun tắc: Các chất... phức ta tính khả kháng oxy hóa chất cần nghiên cứu • Phương pháp xác định trực tiếp • Các phương pháp dấu vân tay • Đo tổn thương AND III Các phương pháp xác định gốc tự III.1.1 ESR bẫy Spin Quang... xác định theo phương pháp HPLC Máy UV-Vis II.2 Ức chế gốc tự NO Cơ sở phương pháp Natrinăng Khả nitroprussid ức chế gốc bị phân tự dohủy NO đượcánh xác sáng định sinh dựa gốcphần tự trăm NO.ức