Kháng sinh là những chất có khả năng tiêu diệt vi khuẩn hay kìm hãm sự phát triển của vi khuẩn một cách đặc hiệu. Nó có tác dụng lên vi khuẩn ở cấp độ phân tử, thường là một vị trí quan trọng của vi khuẩn hay một phản ứng trong quá trình phát triển của vi khuẩn. Cefuroxime acetyl là một kháng sinh thế hệ 2 của nhóm cephalosporin nằm trong danh mục các kháng sinh có chứa vòng Beta_lactam. Cefuroxime acetyl có tác dụng trị bệnh nhiễm trùng do vi khuẩn gây ra về các đường hô hấp, taimũihọng và các bệnh về đường tiêu hóa, đường sinh dục. Cefuroxime là loại thuốc có hoạt tính kháng khuẩn hữu hiệu và có khả năng phân bố rộng khắp cơ thể, kể cả dịch màng phổi, hoạt dịch và thủy dịch. Cefuroxime thường có 2 dạng muối: Cefuroxime natri dễ tan trong nước, thường được dùng ở dạng bột pha tiêm, cefuroxime acetyl ít tan trong nước thường được dùng dưới dạng viên nén
BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN- ĐHQG HÀ NỘI KHOA HÓA HỌC NGHIÊN CỨU ĐỊNH LƯỢNG CEFUROXIME ACETYL TRONG THUỐC KHÁNG SINH DẠNG VIÊN BẰNG PHƯƠNG PHÁP HPLC KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC HỆ CHÍNH QUY CHUN NGÀNH HĨA PHÂN TÍCH Giảng viên hướng dẫn: Sinh viên : Nguyễn Quốc Cường Lớp : K53a hóa học HÀ NỘI – 2012 LỜI CẢM ƠN Với lòng kính trọng biết ơn sâu sắc, em xin cảm ơn đến TS Từ Bình Minh, ThS Lê Thị Hường Hoa người giáo đề tài tận tình hướng dẫn em trình nghiên cứu để em hồn thành luận văn Em xin chân thành cảm ơn ThS Hoàng Thanh Tâm anh chị khoa Mĩ Phẩm nhiệt tình bảo, giúp đỡ em trình em thực tập khoa Mĩ Phẩm -Viện kiểm nghiệm thuốc TW Em xin chân thành cảm ơn thầy, cô giáo Bộ mơn Hóa Phân Tích thầy, cô giáo Trường Đại Học Khoa Học Tự Nhiên giảng dạy trang bị cho em kiến thức sở năm qua, kỹ thuật viên phòng thí nghiệm Bộ mơn Hóa Phân Tích tận tình giúp đỡ trình nghiên cứu Cuối cùng, em muốn nói lời cảm ơn đến gia đình, bạn bè, người tận tình giúp đỡ động viên khích lệ để em hồn thành khóa luận Hà Nội, Ngày 20, Tháng 5, Năm 2012 Sinh viên: MỤC LỤC ĐẶT VẤN ĐỀ Chương TỔNG QUAN 1.1.Kháng sinh ß-lactame 1.1.1.Penicillin 1.1.2.Kháng sinh cephalosporin 1.1.2.1 Các hệ cephalosporin chế phẩm đại diện 1.2 Cefuroxime 1.2.1 Cefuroxime natri 1.2.2 Cefuroxim acetyl 1.3 Tình hình sử dụng kháng sinh Beta-lactame cefuroxime Việt Nam 1.4 Các phương pháp áp dụng để định lượng Cefuroxime 1.4.1 Phương pháp quang phổ tử ngoại 1.4.2 Phương pháp LCMS 1.4.3 Phương pháp HPLC định lượng viên nén Cefuroxime 1.5 Phương pháp sắc ký lỏng hiệu cao HPLC 1.5.1 Khái niệm sắc ký 1.5.2 Khái niệm sắc ký lỏng hiệu cao 1.5.3 Nguyên tắc trình sắc ký 1.5.4 Nguyên tắc cấu tạo máy sắc ký lỏng hiệu cao 1.5.4.1 Hệ thống cấp pha động 1.5.4.2 Hệ thống bơm 1.5.4.3 Hệ tiêm mẫu 1.5.4.4 Cột sắc ký 1.5.4.5 Detector 1.5.4.6 Hệ thu nhận xử lý số liệu 1.5.5 Pha tĩnh sắc ký lỏng hiệu cao 1.5.6 Pha động sắc ký lỏng hiệu cao 1.5.7 Ứng dụng sắc ký lỏng hiệu cao 1.5.7.1 Định tính 1.5.7.2 Định lượng 1.5.7.3 Thử tạp chất Chương ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU (NGUYÊN LIỆU, THIẾT BỊ, DUNG MÔI VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU) 2.1 Nguyên vật liệu thiết bị 2.1.1 Dung mơi hóa chất 2.1.2 Thiết bị dụng cụ 2.2 Đối tượng nghiên cứu, nội dung, phương pháp nghiên cứu 2.2.1 Đối tượng nghiên cứu 2.2.3 Phương pháp nghiên cứu 2.2.4 Một số công thức sử dụng thống kê Chương 3: THỰC NGHIỆM, KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 3.1 Khảo sát lựa chọn qui trình xử lý mẫu 3.1.1 Lựa chọn dung môi pha mẫu 3.1.2 Quy trình xử lý mẫu 3.2 Khảo sát lựa chọn điều kiện sắc ký 3.3 Đánh giá tính thích hợp hệ thống sắc ký 3.4 Khảo sát khoảng tuyến tính diện tích pic nồng độ 3.5 Khảo sát độ lặp lại q trình phân tích 3.6 Khảo sát độ phương pháp 3.7 Xác định giới hạn định lượng giới hạn phát Cefuroxime 3.8 Ứng dụng định lượng Cefuroxime acetyl mẫu thực tế Bàn luận KẾT LUẬN KIẾN NGH CÁC CHỮ VIẾT TẮT HPLC : Hight performace liquid chromatography ( sắc ký lỏng hiệu cao) LC-MS-MS : Sắc ký lỏng ghép nối khối phổ UV : Tử ngoại DUV-VIS : Detector tử ngoại khả kiến DĐVN : Dược điển Việt Nam KS : Kháng sinh ĐẶT VẤN ĐỀ Ngày nay, kinh tế nước ta phát triển đời sống nhân dân ngày cải thiện nguy bệnh tật ngày tăng Từ lâu, người ta tìm kháng sinh có tác dụng diệt khuẩn Kháng sinh chất có khả tiêu diệt vi khuẩn hay kìm hãm phát triển vi khuẩn cách đặc hiệu Nó có tác dụng lên vi khuẩn cấp độ phân tử, thường vị trí quan trọng vi khuẩn hay phản ứng trình phát triển vi khuẩn Cefuroxime acetyl kháng sinh hệ nhóm cephalosporin nằm danh mục kháng sinh có chứa vòng Beta_lactam Cefuroxime acetyl có tác dụng trị bệnh nhiễm trùng vi khuẩn gây đường hô hấp, tai-mũi-họng bệnh đường tiêu hóa, đường sinh dục Cefuroxime loại thuốc có hoạt tính kháng khuẩn hữu hiệu có khả phân bố rộng khắp thể, kể dịch màng phổi, hoạt dịch thủy dịch Cefuroxime thường có dạng muối: Cefuroxime natri dễ tan nước, thường dùng dạng bột pha tiêm, cefuroxime acetyl tan nước thường dùng dạng viên nén Để góp phần vào cơng tác kiểm tra chất lượng thuốc nói chung nghiên cứu phương pháp định lượng Cefuroxime nói riêng, chúng tơi thực đề tài: “Nghiên cứu định lượng cefuroxime acetyl thuốc viên nén phương pháp sắc ký lỏng hiệu cao” Mục tiêu đề tài: Khảo sát chọn quy trình xử lý mẫu, điều kiện sắc ký phù hợp để phân tích cefuroxime acetyl chế phẩm phương pháp HPLC Ứng dụng phương pháp vừa xây dựng để định lượng Cefuroxime acetyl chế phẩm viên nén Cezirnate 500mg thị trường Chương – TỔNG QUAN 1.1.Kháng sinh ß-lactame [5, 8] Câú trúc : Là kháng sinh mà phân tử chứa vòng ß-lactam Hai nhóm lớn kháng sinh Penicillin Cephalosporin 1.1.1 Penicilin [5, 8, 9] Công thức chung : Các penicillin khác gốc R, cacbon bất đối có cấu hình theo vị trí 2S, 5S, 6R enicillin acyl amid A6AP ( acid 6- amino nicillanic) Cơ chế tác dụng: Ngăn cản xây dựng giảm độ bền màng tế bào vi khuẩn nên chủ yếu kìm hãm tồn phát triển vi khuẩn 1.1.2 Kháng sinh Cephalosporin [5,8,9] Cấu tạo : Năm 1948, Abraham cộng phân lập từ môi trường nuôi cấy nấm cephalosporium aeremonium cephalosporin C dẫn chất acyl acid 7-aminocephalosporanic(A7AC) Các kháng sinh cephalosporin dùng kháng sinh bán tổng hợp, chúng dẫn chất acyl hóa A7AC mang cấu trúc ∆ 3cephem; ∆3 đủ liên hợp điện tử với vòng B-lactam để hợp chất có tác dụng sinh học Cơ chế tác dụng: Ngăn cản xây dựng giảm độ bền màng tế bào vi khuẩn nên chủ yếu kìm hãm tồn phát triển vi khuẩn 1.1.2.1 Các hệ cephalosporin chế phẩm đại diện [5,8,9,11] Cephalosporin hệ I: có chế phẩm đại diện cephalexin, cephradin, cefradoxil Cephalosporin hệ II: có chế phẩm đại diện cefuroxim natri; cefuroxim acetyl Cephalosporin hệ III: có chế phẩm đại diện cefotaximnatri; cefixim; ceftriaxonnatri Cephalosporin hệ IV: có chế phẩm đại diện cefepim 1.2 Cefuroxime Là kháng sinh bán tổ hợp phổ rộng, thuộc nhóm caphalosporin hệ Cefuroxime có hoạt tính kháng khuẩn ức chế tổng hợp vách tế bào vi khuẩn cách gắn vào protein đích thiết yếu 1.2.1 Cefuroxime natri [5,8,9,11] Công thức cấu tạo: C16H15N4NaO8S Tên khoa học: Là muối natri acid (6R,7R)-3[(carbamoyloxy)methyl]-7-[[(Z)(furan-2-yl)(methoxyimino)acetyl]amino]-8-oxo-5-thia-1zabicyclo[4.2.0]oct-2-en-2-carboxylic, phải chứa từ 96% đến 102% C16H15N4NaO8S Tính chất: + Bột trắng trắng ngà, dễ tan nước, ethanol tan + pH Từ 5,5 đến 8, + Độ tan: không 3.5% nước không 0.5% acid-2-ethyl hexanoic + Cefuroxime natri hấp thụ ánh sáng mạnh bước sóng: 278nm Cơng dụng: Có phổ kháng khuẩn điển hình cephalosporin hệ II Và hệ này, chất đạt nồng độ tác dụng dịch não tủy Chỉ định: cho trường hợp : + viêm màng não, bệnh lậu + viêm đường hô hấp dưới, viêm phổi, viêm phế quản + viêm đường tiết niệu, có hạn chế số trường hợp dùng so với chất hệ II + nhiễm trùng máu, viêm xương ( vi khuẩn nhạy cảm) + phòng nhiễm trùng phẫu thuật Dạng thuốc: Lọ bột pha tiêm 1.2.2 Cefuroxim acetyl [5,8,9,11] Công thức cấu tạo: C20H22N4O10S Tên khoa học: Là hỗn hợp đồng phân không đối quang (diastereo-isomer A diastereo-isomer B) (1RS)-1-(acetyloxy)ethyl(6R,7R)-3((cacbamoyloxy)methyl)-7((Z)-2-(furan-2-(furan-2-yl)-2-(methoxyimino)acetyl)amino)-8-oxo-5-thia-1-a-azabicyclo-(4.2.1)oct-2-en2-carboxylat Tính chất: + Bột trắng trắng ngà, tan nước, tan aceton ethyl acetate methanol, tan ethanol + Độ tan: nước 25oC không 1.5% + Cefuroxime acetyl hấp thụ ánh sang mạnh bước sóng 278nm + Là tiền chất cefuroxime, có hoạt tính kháng khuẩn chưa bị thủy phân thành cefuroxim thể Chỉ định: Cho nhiễm khuẩn nhẹ hơn, trường hợp viêm tai giữa, viêm phổi, viêm đường tiết liệu Dạng thuốc: thuốc viên 1.3 Tình hình sử dụng thuốc kháng sinh Beta-lactame Cefuroxime Việt Nam Bệnh nhiễm khuẩn chiếm 60% số bệnh có tỷ lệ mắc cao Việt Nam, kháng sinh loại thuốc dung phần lớn Tuy nhiên việc sử dụng kháng sinh bước ta chưa hợp lý Trước tiên việc chuẩn đoán bệnh chưa bác sĩ chưa ý, chưa xác định xác vi khuẩn gây bệnh; chưa ý hiệu chỉnh liều kháng sinh nhóm aminoglycozid, beta lactam…đối với nhóm bệnh nhân đặc biệt (người cao tuổi, trẻ em, phụ nữ mang 10 KIẾN NGHỊ Cefuroxime hoạt chất hữu hiệu ứng dụng y học năm gần để điều trị bệnh nhiễm khuẩn cần phải xây dựng phương pháp chuẩn để định lượng định tính chế phẩm cách thống Trên thị trường chế phẩm chứa hoạt chất phổ biến với hai loại thuốc nội thuốc ngoại, song thuốc ngoại thường đắt( gấp nhiều lần thuôc nội) Với tác dụng ưu việt nó, lại phù hợp với mơ hình bệnh tật nước ta mong sở sản xuất thuốc nước nghiên cứu để sản xuất sản phẩm có chứa Cefuroxime đạt chất lượng cao với hy vọng giá thành rẻ hơn, phải dùng thuốc ngoại mà đáp ứng nhu cầu điều trị người bệnh TÀI LIỆU THAM KHẢO (Tài liệu tiếng Việt ) 38 1.Phạm Luận(2005), Giáo trình xử lý mẫu phân tích, Đại học Khoa học tự nhiên, ĐHQG Hà Nội 2.Trần Tứ Hiếu- Từ Vọng Nhi- Nguyễn Văn Di- Nguyễn Xn Trung(2007), Giáo trình Hóa học phân tích , phần 2: Các phương pháp phân tích cơng cụ Đại học Khoa học tự nhiên, ĐHQG Hà Nội 3.Phạm Luận (1989), sổ tay pha chế dung dịch Đại học Khoa học tự nhiên, ĐHQG Hà nội 4.Nguyễn Văn Di(2009),Các phương pháp tách Đại học Khoa học tự nhiên, ĐHQG Hà Nội 5.Trần Đức Hậu- Nguyễn Đình Hiển- Thái Duy Thìn- Nguyễn Văn Thục(2006),Đại học dược Hà Nội 6.Đinh Viết Chiến- k52-hóa phân tích, Đại học Khoa học tự nhiên, ĐHQG Hà Nội, xác định hàm lượng số đường glucid phương pháp sắc ký lỏng hiệu cao 7.Bùi Thị Ngát k52-hóa phân tích, Đại học Khoa học tự nhiên, ĐHQG Hà Nội, tách định lượng số kháng sinh họ beeta-lactam phương pháp đo phổ hấp thụ nguyên tử (UV-VIS) 8.Dược điển Việt Nam(2009), 1:148 Viện kiểm nghiệm dược phẩm TW 9.Dược điển Mĩ (2009), :1863 Viện kiểm nghiệm dược phẩm TW 10.Nghiêm Thị Ánh Minh.(2008), Đại học dược Hà Nội, Xây dựng phương pháp kiểm tra chất màu Metanil yellow bị cấm son mơi sơn móng tay phương pháp HPLC 11.http://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1002/rcm.1396/abstract 12.http://www.springerlink.com/content/1fptyqyn8km99y2p/ 13.http://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1002/rcm.1396/full (Tài liệu tiếng anh) 39 Dr.MichaelO’Keefe (2000),“Confirmatory assay for the simultaneousdetection of penicillins and cephalosporins in milk using liquid chromatography/tandemmassspectrometry”.The National Food Centre, Dublin, Ireland Tu Binh Minh , Ho Wing Leung , I Ha Loia, Wing Hei Chan , Man Ka So( 2009) ‚’’ Antibiotics in the Hong Kong metropolitan area: Ubiquitous distribution and fate in Victoria Harbour” Department of Biology and Chemistry, City University of Hong Kong, 83 Tat Chee Avenue, Kowloon, Hong Kong SAR, China Ito Y, Ikai Y, Oka H (2001) “Application of ion-exchange cartridge clean-up in food analysis Confirmatory assay of benzylpenicillin, phenoxymethylpenicillin, oxacillin, cloxacillin, nafcillin and dicloxacillin in bovine tissues by liquid chromatography-electrospray ionization tandem mass spectrometry.” Croucher Laboratory for Environmental Hydraulics, Civil Engineering Department, Tokyo, Japan 40 Phụ lục 1.Sắc ký đồ dung dịch chuẩn nồng độ 0.25mg/ml (1.1) 75 mAU 50 Cefuroxim acetil B 15.563 Cefuroxim acetil A 13.195 100 11.851 9.845 10.656 2.325 3.072 3.424 3.701 4.011 4.171 1.237 1.344 1.504 25 0 10 15 Minutes 1: 278 nm, nm Name Cefuroxim acetil A Cefuroxim acetil B Retention Time 13.195 15.563 Area 1704049 1569715 Height 37563 32483 3273764 70046 Totals 41 2.Sắc ký đồ dung dịch chuẩn nồng độ 0.25mg/ml (1.2) 75 mAU 50 Cefuroxim acetil B 15.531 Cefuroxim acetil A 13.163 100 18.400 17.312 11.776 10.571 2.347 2.933 3.125 3.392 3.840 1.237 1.355 25 0 10 15 Minutes 1: 278 nm, nm Name Cefuroxim acetil A Cefuroxim acetil B Retention Time 13.163 15.531 Area 1711999 1566537 Height 37690 32441 3278536 70131 Totals 42 10 Minutes 1: 278 nm, nm 43 13.685 11.467 8.597 9.451 10.059 6.859 7.115 4.875 1.333 1.749 2.069 2.411 2.741 3.445 150 100 15 ce fu ro xim acetyl B 18.912 ce fu ro xim acetyl A 15.968 mAU Sắc ký đồ dung dịch chuẩn+thử.(1.1) Cefuroxim acetil 200 50 20 A 100 10 ce fu ro xim acetyl B 19.125 ce fu ro xim acetyl A 16.107 150 20.907 21.269 21.408 21.600 22.752 23.979 14.923 6.453 6.891 7.360 8.693 9.557 10.144 11.541 12.011 12.811 13.152 0.256 1.387 1.771 2.080 2.421 2.752 3.456 3.605 4.277 4.619 4.843 5.003 5.205 mAU Sắc ký đồ dung dịch chuẩn+thử.(1.2) 200 50 Minutes 20 Pk # Name 25 ce fu ro xim acetyl A 26 ce fu ro xim acetyl B 44 30 1: 278 nm, nm Retention Time 16.107 19.125 Height 84173 78984 Totals 163157 M in u t e s 10 1: 278 nm, nm 45 1 9 0 1 3 4 45 66 21 5 4 7 6 7 46 84 7 9 45 54 9 mAU 150 100 15 c e f u r o x i m a c e1 t9y l 0B9 c e f u r o x i m a c e1 t6y l 0A6 Sắc đồ dung dịch thư 1.2 200 50 20 Sắc đồ dung dịch chuẩn tuyến tính 0,025mg/ml 15 0 10 15 20 21.291 19.733 19.925 20.011 Cefuroxim acetil B 17.867 Cefuroxim acetil A 15.072 8.149 6.304 6.443 6.987 7.168 2.464 3.360 4.011 0.192 0.288 1.227 1.344 1.461 10 25 Minutes 1: 278 nm, nm Pk # Name 14 Cefuroxim acetil A 15 Cefuroxim acetil B Retention Time 15.072 17.867 Height 15203 13051 Totals 28254 46 Sắc đồ dung dịch chuẩn tuyến tính 0,05mg/ml 30 0 10 15 20 23.936 21.707 20.085 Cefuroxim acetil B 18.165 Cefuroxim acetil A 15.339 13.333 8.256 9.109 6.496 3.349 4.032 4.651 4.896 5.387 1.237 1.355 10 2.453 20 25 Minutes 1: 278 nm, nm Pk # Name 13 Cefuroxim acetil A 14 Cefuroxim acetil B Retention Time 15.339 18.165 Height 29988 25565 Totals 55553 47 Sắc đồ dung dịch chuẩn tuyến tính 0,1mg/ml 30 10 15 20 23.936 21.707 20.085 Cefuroxim acetil B 18.165 Cefuroxim acetil A 15.339 13.333 8.256 9.109 6.496 3.349 4.032 4.651 4.896 5.387 1.237 1.355 10 2.453 20 25 Minutes 1: 278 nm, nm Pk # Name 14 Cefuroxim acetil A 16 Cefuroxim acetil B Retention Time 15.275 18.080 Height 36558 29774 Totals 66332 48 Sắc đồ dung dịch chuẩn tuyến tính 0,2mg/ml 80 60 10 15 21.824 Cefuroxim acetil B 18.304 Cefuroxim acetil A 15.467 12.299 12.416 12.811 13.355 13.867 14.016 10.443 8.427 9.045 1.355 20 3.296 3.541 4.203 4.683 5.237 5.344 5.653 6.240 6.699 7.360 2.667 40 20 25 Minutes 1: 278 nm, nm Pk # Name 22 Cefuroxim acetil A 23 Cefuroxim acetil B Retention Time 15.467 18.304 Height 76175 61681 Totals 137856 49 10 Sắc đồ dung dịch chuẩn giới hạn phát Cefuroxim acetil A 15.648 16.096 acetil B 16.384 Cefuroxim 7.5 13.291 2.5 9.675 0.907 1.483 1.749 2.187 2.901 3.296 3.435 3.691 4.043 4.320 4.779 5.0 0.0 1.237 -2.5 -5.0 10 15 20 25 Minutes 1: 278 nm, nm Pk # Name 15 Cefuroxim acetil A 17 Cefuroxim acetil B Retention Time 15.648 16.384 Height 93 28 Totals 121 50 51 52 ... hiện, giới hạn định lượng + Giới hạn phát hiện, giới hạn định lượng + Áp dụng phương pháp xây dựng để định lượng Cefuroxime acetyl chế phẩm chọn 2.2.3 Phương pháp nghiên cứu Nghiên cứu tiến hành... thường dùng dạng bột pha tiêm, cefuroxime acetyl tan nước thường dùng dạng viên nén Để góp phần vào cơng tác kiểm tra chất lượng thuốc nói chung nghiên cứu phương pháp định lượng Cefuroxime nói... chọn phương pháp HPLC với cột RP18 để nghiên cứu xây dựng quy trình định lượng cefuroxime acetyl viên nén *Hai tác giả Yuko Ito Hisao Oka đã: _Phân tích penicillin mẫu huyết phương pháp HPLC- UV