Công nghệ enzym Đặng Thị Thu và cộng sự Enzym là chất xúc tác sinh học, tức là chất xúc tác được sản xuất ra do tế bào và vi tế bào. Là tác phẩm của tự nhiên, enzym có bản chất protein có cấu trúc phân tử phức tạp và tinh vi, do đó enzym có iực xúc tác cực kỳ mạnh mẽ và có tính chọn lọc rất cao. Song khi chiết xuất ra ngoài, hoạt tính xúc tác của nó có thể giảm hoặc mất đi khi điều kiện môi trường phản ứng không được duy trì như ở trong tế bào.
GS.TS ĐẶNG THỊ THU (Chủ biên) PGS LÊ NGỌC TU PGS.TS TÔ KIM ANH PGS.TS PHẠM THU THỦY PGS.TS NGUYỄN XUÂN SÂM Công nghệ TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA HÀ NỘI GS.TS ĐẶNG THỊ THU (CHỦ BỈÊN) PGS LÊ NGỌC TÚ, PGS.TS TÔ KIM ANH PGS.TS PHẠM THU THỦY, PGS.TS NGUYỄN XUÂN SÂM CÔNG NGH€ €NZYM NHÀ XUẤT BẢN KHOA HỌC VÀ KỸ THUẬT HÀ NỘI CỈS.TS ĐẶNG THỊ THU (CHỦ BIỂN) PGS LÊ NGỌC TÚ, PGS.TS TỔ KIM ANH PtỉS.TS PHẠM THU THỦY, PGS.TS NGUN XN SÂM CƠNG NGHỆ« ENZYM Chịu trách nhiệm xuất bản: Biên tập: Trình bày bìa: ĐồNG KHẮC SỬNG TS NGUYẼN h u y TlẾN NGỌC TUAN NHÀ XUẤT BẢN KHOA HỌC VÀ KỸ THUẬT 70 Trẩn Hưng Đ ạo “ Hà Nội In 400 khổ 16 X 24cm, Xí nghiệp In NXB Văn hóa Dân tộc Số đăng ký kế hoạch XB: 235 - 2012/CXB/253 ■- 13/KHKT, cấp ngày 06/3/2012 Quyết định XB số: 43/QĐXB - NX8KHKT, cấp ngày 15/5/2012 In xong nộp lưu chiểu Quý III năm 2012 ời nối đẩu Enzym chất xúc tác sinh học, tức chất xúc tác sản xuất tế bào vi tế bào Là tác phẩm tự nhiên, enzym có chất protein có cấu trúc phân tử phức tạp tinh vi, enzym có iực xúc tác mạnh mẽ có tính chọn lọc cao Song chiết xuất ngoài, hoạt tính xúc tác giảm m ất điều kiện môi trường phản ứng khơng trì tế bào Bằng cách trích ly enzym thu chế phẩm enzym có độ tinh khiết cao? Bằng phương pháp chế tác chế phẩm enzym đạng khơng hòa tan để sử dụng lâu bền Enzym hòa tan enzym cố định khác động học nhu nào? Đặc điểm thiết bị phản ứng enzym nguyên tắc làm việc điện cực enzym nào? Phạm vi hiệu sử dụng enzym kinh tế quốc dân th ế nào? Các vấn đề nêu ưên trình bày chương sau sách “Công nghệ enzym Chương ỉ Công nghệ thu chế phẩm enzym - GS Đặng Thị Thu, PGS Lê Ngọc Tú Chương Enzym cố định (enzym khơng hòa tan) - GS Đặng Thị Thu Chương Động học phản ứng enzym - PGS Lê Ngọc Tú Chương Điện cực sinh học (cảm biến sính học) - GS Đặng Thị Thu Chương Thiết bí phản ứng enzym - PGS Tô Kim Anh Chương úng dụng chế phẩm enzym triển vọng công nghệ enzym: - úng đụng chế phẩm cồng nghệ thực phẩm - PGS Phạm Thu Thủy - ứng dụng chế phẩm enzym số ngành công nghiệp khác - PGS Nguyễn Xuân Sâm - Triển vọng công nghệ enzym - PGS Tô Kim Anh Cuốn sách giáo trình học tập cho sinh viên học viên cao học ngành Công nghệ sinh học, Công nghệ thực phẩm đại học Bách Khoa Hà Nội sô' trường đại học khác Cũng làm tài liệu tham khảo cho sinh viên ngành Cơng nghệ hóa học, Cơng nghệ môi trường, Dược, Thủy sản, Nông nghiộp, cho cán nghiên cứu, quản lý viện nghiên cứu có ỉiẽn quan Các tác giả xin cảm ơn mong nhận ý kiến đóng góp bạn đọc để sách bổ sung hoàn thiện lẩn in sau H Nội ngày 01 tháng năm 2012 TM CÁC TÁC GIÀ Chủ biên Đặng Thị Thu i v i u9 c LUC • Lời nói đ ầ u C hương CÔNG NGHỆ THU CHẾ PHAM ENZYM 1.1 Khái quát enzym .7 1.2 Các đơn vị hoạt độ enzym 1.3 Nguồn nguyẽn liệu thu enzym 1.4 Phương pháp thu chế phẩm enzym vi sinh vật 14 C hương ENZYM c ố ĐỊNH (Immobilized enzymes) 2.1 Khái niệm enzym cố định 67 2.2 Các phương pháp điều chế enzym cố định .68 2.3 Một số đặc tính enzym cơ' đ ịn h 82 2.4 Úng dụng enzym cố định 85 Chương ĐỘNG HỌC PHẢN ÚNG ENZYM 3.1 Động học Enzym m onom e .92 3.2 Động học enzym dị không gian điều hòa enzym oligom e 127 3.3 Động học enzym cố đ ịn h 136 C hương ĐIỆN c ụ c SINH HỌC (Cảm Biến Sinh Học) 4.1 Sơ lược lịch sử phát triển ĐIỆN c ụ c SINH H Ọ C 160 4.2 Khái niệm điện cực sinh h ọ c 161 4.3 Một số loại điện cực sinh h ọ c 169 4.4 úh g dụng điện cực sinh h ọ c 195 C hương THIÊT BỊ PHẢN ÚNG ENZYM 5.1 Thiết bị phản ứng gián đ o n 218 5.2 Thiết bị phản ứng liên tụ c 220 5.3 Thiết bị phản ứng enzym dạng m àng 226 5.4 Thiết bị phản ứng dạng c ộ t 227 5.5 Thiết bị phản ứng tầng sôi 230 5.6 Lựa chọn thiết bị phản ứng enzym 231 Chương ỨNG DỤNG CHẾ PHAM ENZYM VÀ TRIEN v ọ n g c ủ a CÔNG NGHỆ ENZYM 6.1 Úng dụng enzym công nghiệp thực p h ẩ m „ 233 6.2 ứng đụng enzym Số ngành công nghiệp k h c 6.3 Triển vọng công nghệ EN ZY M 300 TÀI LIỆU THAM K H Ả O 319 CỈỈƯƠNG CÔNG NGHỆ THU CHẾ PHAM ENZYM 1.1 KHÁI QUÁT VỂ ENZYM - Enzym chất xúc tác sinh học, có chất protein, hồ tan nước dung dịch muối lỗng Enzym có phân tử lượng lớn từ 201.000 KDa nên không qua màng bán thấm - Tất yếu tố làm biến tính protein axit đặc, kiềm đặc, muối kim loại nặng, làm enzym bị biến tính hoạt tính xúc tác - Enzym có nhiều tính chất ưu việt hẳn chất xúc tác hố học Enzym có cường lực xúc tác lớn: điểu kiện thích hợp, hầu hết phản ứng có xúc tác enzym xảy với tốc độ nhanh gấp lo ’1-10“ lần so với phản ứng khòng có chất xúc tác - lg pepsin phân giải đuợc 5kg protein trứng - ỉg renin làm đông tụ 72 sữa sản xuất mát - lm ol catalase phân huỷ l0 6mol H20 ?/phút Crong mol Fe+1chỉ phân huỷ 10‘6mol H20 2/phút, Enzym có tính đặc hiệu cao: Mỗi enzym xúc tác làm chuyển hoá chất định theo kiểu liên kết hoá học nhât định, kiểu phản ứng định Sự tác dụng có tính chất lựa chọn gọi tính đặc hiệu enzym,hay gọi tính chun mơn hóa cao Enzym có tính đặc hiệu cao nên khơng tạo sản phẩm phụ Enzym tác dụrig điều kiện “êm dịu Enzym thường tác dụng thích hợp nhiệt độ 30-50()C, pH trung tính ấp suất thường, không cần nồng độ axit hay nồng độ kiềm mạnh, áp suất cao, khơng đòi hỏi thiết bị chịu axit, kiềm chịu áp suất cao đắt tiền Tất cá enzym có nguồn gốc tự nhiên khơng độc Điều có ý nghĩa quan trọng còng nghiệp thực phẩm y học Các chế phẩm enzym sán xuất từ nsuón nsuyẽn liệu dễ kiếm, rẻ tiền: - Enzym prolease động vậỉ thường thu nhận lừ phụ phẩm lò mổ : tụy tạng, dày - Enzym protease thực vật thu từ vỏ, dứa, lá, thân, nhựa sung, vả, nhựa đu đủ xanh - Enzym vi sinh vật thu nhận phương pháp nuôi cấy bề mặt bề sâu 1.2 CÁC ĐƠN VỊ HOẠT ĐỘ CỦA ENZYM Đơn vị hoạt độ enzym coi lượng enzym có khả xúc tác làm chuyển hố m ột lượng chất định, đcm vị thòi gian định, điều kiện tiêu chuẩn Theo quy ước quốc tế có m ột số đơn vị hoạt độ sau: Đơn vị w ịđơn vị quốc tê) Là lượng enzym có khả nãng xúc tác chuyển hoá micromol chất sau thời gian phút điều kiện tiêu chuẩn: II u = n M chất (lO^M/phút) Đơn vị katal (kat) Là lượng enzym có khả nâng xúc tác chuyển hoá mol chất sau thời gian giây điều kiện tiêu chuẩn: lk at = ỈM ol chất / giây II u = 1/60 x l0 6kat =16,67 nkat Hoạt lực enzym hoạt lực xúc tác biểu diễn số đơn vị hoạt độ enzym Hoạt độ riêng Hoạt độ riêng ch ế phẩm enzym biểu diễn sô đơn vị hoạt độ enzym đơn vị khối lượng protein: I u kat / mg (ml) protein Hoạt độ phản tử (hoặc hoạt độ rièng phản tử) Được biểu diễn số phân tử châì chuyển hố phan tử enzym sau đơn vị thời gian (thường phút) Ilo t độ tám Xi1C tác Là số phân tử chất bị chuyển hoá trung tâm hoạt động sau mội phút Hoạt độ kcat (hoạt độ xúc tác) Là lượng phân tử chất lớn dược chuyển hoá phân tử enzym đơn vị thời gian (giây) điều kiện enzym bão hoà chất Tỷ lệ kcat/km Là hiệu xúc tác enzym (catalytic efficency) biểu tính đặc hiệu enzym với chất khác 1.3 NGUỔN NGUYÊN LIỆU THU ENZYM Enzym chất điều chế phương pháp tổng hợp hoá học, mà người ta thường thu nhận chúng từ nguồn tế bào động vật, thực vật vi sinh vật Trong hàng trăm enzym sử dụng công nghiệp nửa sản xuất từ nấm mốc nấm men, phần ba từ vi khuẩn, lại từ 8% nguồn động vật 4% nguồn thực vật 1.3.1 Enzym động vật Một số mô động vật chứa nhiều enzym: Dạ dày, tụy tạng, tim, gan, Lá lách Tụy tạng: quan chứa nhiều enzym amylase, mantase, lipase, cholesterol esterase, excitinase, nuclease, trypsin, kimotrypsin, cacbocylpeptidase A, B, elastase Tất enzym tiết tế bào với dịch tụy D dày: Màng nhầy dày lợn, chó, gà, thỏ, chứa pepsin A,B,C,D (dạ dày lợn nhiều nhất) riêng dày lợn có gastrinsin (enzym thuỷ phân protein) Khi thể tích pha hữu đủ lớn, Khai pha tiến tới Khe trường hợp phản ứng đơn phân Tuy nhiên, Khai pha phụ thuộc bậc vào a, vậy, giá trị trung gian ạ, K h a i pha nhận giá ưị cực đại cực tiểu khác với Kn vả Khc Như vậy, K hai pha có giá trị lớn hom phản ứng tương tự xảy hệ pha hữu nước Trong trường hợp này, vận tốc phản ứng hệ hai pha lớn hem nhiều so với phản ứng hệ pha Một trường hợp đặc biệt phản ứng nhị phân hệ hai pha cấu tử phản ứng nuớc Khi ấy, ưình (6.16) trờ thành: Kn Pha nước Pha hữu Cơ A + B _ iĩ f F ' A + B „ — c í + HjO _ //C I6 -2™ c + H:0 (6 21) r p n = IHjO h,J / í H ,0 „] Thông thường hệ dung môi nước, phản ứng thủy phân xảy ra, nghĩa theo chiều từ phải sang ừái Tuy nhiên hệ hai pha, hàng sổ cân phản ứng thay đổi mô tả trên, cho phép enzym thủy phân hoạt động theo chiều từ ứái qua phải Điều có ý nghĩa phản ứng tổng hợp khó xảy phản ứng hỏa học hữu thơng thường đo đòi hỏi vùng đặc hiệu lựa chọn nhóm phản ứng Có hai yếu tổ ảnh hưởng tới suất thu nhận sản phẩm c , là: 1) thay đồi Khai pha, 2) nồng (Jộ ([H20]t) Nồng độ nước tổng cộng tính theo phương trình cân vật liệu: [H20 ]t (Vn + Ỵhc) = [H20]n.vn + [H20 ]hc.vhc (6.22) [H2 Ơ]n nồng độ phần mol nước tinh khiết, [H2 Ơ]n = 1000/18 = 55,5M r u m _ 55,5(1 +aPn) [H 20 ] , = 1+ a Với 306 K"haipha = i M Ề i I (6.23) Và (6.19), thay Pn cho P [), được: r c i = K q + « P j.( l + q ).[A l3.[BJ (6.24) " 55f5.(l + a P A).(l + aP B) Nếu c phân cực han A B, hiệu suất phản ứng tăng lên nồng độ pha hừu Ví dụ hình 6.14 tổng hợp este từ axit rượu hệ hai pha cho thấy nồng độ pha hữu tâng lên, hiệu suất phản ứng tăng từ 0% lên 100% Để đạt hiệu suất chuyển hóa cao, cần loại bỏ lượng nước tạo thành hệ hai pha để tránh giảm DL Tuy nhiên loại bỏ nước hệ hai pha khơng đễ đạt Có thể bổ sung đặn enzym thể tích định pha hữu để giữ cho số cân bẳng pha hệ khơng thay đổi Hình 6.13 Tổng họp etyỉ este -benzoyl-L-phenyialanin từ N-benzoyl-Lphenyỉaỉanitì vứ rượu etylic hệ hai pha cloroform ■nước - Động học enzym hệ hai pha hữu - nước Trong hệ hai phai ln có lượng định chất phản ứng tan lớp nước bao quanh enzym Thường thi iớp nước không bị khuấy trộn cho dù pha hữu khuấy đặn suốt trình phản ứng, Nếu chịều dảy lớp nước ỉà lớn, vận tốc phản ứng enzym bị kiểm soát vận tốc khuếch tán chất qua lớp nước độ hòa tan thấp cùa chất pha nước Trong trường hợp enzym hòa tan tốt nước, lớp nưóc thường mỏng, vận tốc phản ứng phụ thuộc vào vận tốc 307 khuếch tán chất nồng độ cao pha hữu qua lớp phân chia bề mặt tới vi mơi trường bao quanh enzym có nồng độ chất thấp Trong trường hợp enzym cố định, vận tốc dòng chất tới bề mặt xúc tác hiệu suất phản ứng phụ thuộc vào bề mặt riêng hạt enzym Trong trường hợp hệ pha, bề mặt riêng bề mặt hạt enzym tiếp xúc với môi trường phản ứng Trong hệ hai pha, bể mặt riêng bề mặt phân chia hai pha Trong trường hợp thông thường, bề mặt phân chia pha phụ thuộc vảo thể tích giọt nước bao quanh hạt enzym Nếu thể tích pha hữu tăng lên, thể tích giọt nước giảm đi, làm giảm suất thể tích phản ứng Khi phản ứng tạo thành nước, cần tách nước hàm lượng nước tích tụ khơng làm chuyển dịch cân bàng hệ thống mà làm giàm vận tốc phàn ứng Các nguyên tắc cho phép tối ưu hỏa phản ứng enzym hệ hai pha chủ yếu phụ thuộc vào logP: - Giảm tối đa khác biệt logP chất bề mặt phân chia pha LogP dung môi hữu cần lớn logP chất nhiều để đảm bảo nồng độ chất cao khu vực phân chia pha nhờ đạt vận tốc khuếch tán cao cùa chất từ pha hừu vào pha nước - Sự khác biệt logP sản phẩm pha hữu cần phải nhỏ, đồng thời logP sản phẩm phải lớn logP bề mặt phân chia pha Nhờ đạt vận tốc chuyển dịch lớn sản phẩm sau phản ứng từ pha nước qua bề mặt phân chia vào pha hữu - Có thể thay đổi logP bề mặt phân chia pha độc lập với pha hữu nhờ bổ sung chất hoạt động bề mặt chất hiệp trợ thích hợp Tuy nhiên thục tế, việc sử dụng lựa chọn chất hoạt động bề mặt phức tạp nhiều Đặc biệt phản ứng tạo nước, chất hoạt động bề mặt tạo lớp màng kép chất hoạt động bề mặt bao quanh giọt nước Có thể hạn ehế nồng độ nước xung quanh hạt enzym bàng cách sử dụng màng lọc phân từ (K-A]-silicagel) để hẩp thụ nirớc ứong pha hữu Nếu dung mơi hừu có nhiệt độ sơi cao, tách nước bàng chưng cât chân khơng (ví dụ, phản ứng este hóa axit béo rượu kỵ nước nhờ lypase công nghệ sản xuất loại sáp) 308 6.3.1.2 Phản ứng enzyrn hệ hai pha lỏng tan lẫn: pha ntrớc - nước Hệ hai pha nước cho phép chuyển dịch cân phản ứọg phía tạo sản phẩm băng cách đảm bào chất enzym phân bổ chủ yếu vào pha, sản phẩm phân bố chủ yếu pha lại Lý thuyết hệ hai pha hữu - nước hồn tồn áp dụng trường hợp hai pha nước Có thể minh họa hệ thống thơng qua ví dụ thủy phân tinh bột nhờ ctamylase gluco-amylase hệ haí pha nước tạo nước (pha trên) vá nước - propyenglycol (PFG 20000) (pha dưới) Tinh bột phàn lớn enzym phân bố pha dưới, glucose phân bố chủ yếu pha Một lượng nhỏ glucoamylase phân bố pha giúp chuyển hóa ologosaccarit pha thành glucose nâng nồng độ sản phẩm tới 140 g/1.trong pha Hệ thống cho phép enzym chất tồn pha, ưánh hạn chế cùa tượng chụyển khối qua bề mặt phân chia pha trường hợp hệ hai pha không tan lẫn Ngồi ra, khơng cần tách sản phẩm khỏi chất chưa đư ợ c chuyển hóa giảm m ấ t mát enzym - Phàn ứng tỏng hợp enzym xúc tác Các phản ứng tổng hợp nhờ enzym mối quan tâm nhà công nghệ sinh học việc tổng hợp chất nhờ đường hóa học khó khăn, tạo nhiều sàn phẩm phụ giá thành sản phẩm cao Việc sử dụng enzym với tính đặc hiệu nhỏm, đặc hiệu mạch bên đặc hiệu quang học cao điều kiện cân phản ứng chuyển dịch theo chiều từ phải sang trái (tổĩig hợp) có thả thu sản phẩm với giá thảnh thấp nhiều sơ với phương phảp hóa học Chúng ta xem xét ví dụ sử dụng protease phản ứng plastein, glycozidase tròng phản, ứng tổng hợp cảc oligosaccarit lipase phản ứng chuyển vị estq Phản ứng pỉastéiri Sử dụng protease dung dịch protein, axit amin pepỉit có nồng độ cao tổng hợp ngẫu nhiên polyme Phản ửng thường sử dụng để cải biến chất dinh dưỡng, cảm quan không hấp đẫn protein, ví dụ tạo rá protein có mùi, vị hoặc'màu sắc hấp dẫn so với protein nguyên thủy Phàn ứng sứ dụng để gắn thêm 309 vào protein thành phần axit amin nhảm nâng cao giá trị dinh dưỡng biến đổi cấu trúc bậc protein nhàm cải biến tính chất chức protein Hầu protease phân cắt protein liên kết đặc hiệu, sử dụng enzym theo chiều phàn ứng tổng hợp để tổng hợp liên kết peptit định trước Yếu tố tăng cường q trình tổng hợp bao gồm pH, nhóm cacboxyl nhóm amin lựa chọn để bảo vệ, khà kết tủa sản phẩm, phản ứng hệ hai pha lỏng Các yếu tố đạt cách kiểm soát cân bàng phản ứng Một cách khác để tổng hợp peptit dựa vào trình kiểm sốt động thái q trình tổng hợp có vận tốc tạo sản phẩm (kp) cao trình thùy phân (A h) Q trình mơ tả sau (X cỏ thề este, amit cacboxyl): Ọ H II t R - c —X + enzym ọ H Ọ r II I t _ _ — Ị^R—c —X : enzymj— ► R - c —X -enzym + HX Vận tổc tạo thành sản phẩm phụ thuộc vào tỷ số kp / kh, km nồng độ nước hợp chất amin Hiệu suất trình nâng cao giảm hoạt độ nước mơi trường phản ứng Có thể kéo dài peptit bàng cách thêm vào peptit axit amin cách ngưng tụ peptit Phản ứng ngưng tụ peptit thực trình kiểm sốt động thái, phản ứng kéo dài peptit thực tốt nhẩt hệ hai pha rắn - lỏng (thông qua việc kết tủa) trinh kiểm soát động thái hệ hai pha lỏng - ỉỏng Để kiểm soát động thái phàn ứng, cần có enzym hoạt độ cao, giá thành sản phẩm cao Để giảm chi phí, sử dụng enzym cố định Tổng hợp chất thay aspartam ví dụ đơn giản phản ứng plastein Aspartam dipeptit ữ-L-asparty-L-phenylalanyl-Ometyl-este tạo bời L-aspartic metyl este phenylamin Trong phương pháp tông hợp asparỉam băng đường hóa họe, cần bảo vệ cà hai nhóm j8- 310 cacboxyl ữ-amin L-aspartic Nếu nhóm /3-cacboxyl khơng bảo vệ, phản ímg tạo dạng /3-izome mà để loại bỏ nó, giá thành sản phâm tăng lên 30% Hiệu suất tổng hợp theo đường thấp, giá thành sản phẩm cao Nếu sử dụng protease thermolysin, cần bảo vệ nhóm a -am in cùa L-aspartic nhờ phản ứng với benzyl chloroformat để tạo thành đẫn xuất benzyloxy-cacbonyl-BOC (BOC-L-aspartic), ưánh tạo thành poly L-aspartic Có thể sừ dụng hỗn hợp racemic L-aspartic để tổng hợp aspartam tính đậc hiệu quang học enzym Việc tổng hợp isulin nguời từ isulin lợn đòi hỏi thay alanin đầu cacbon mạch peptit lợn threonin Có thể thực phản ứng nhờ phản ứng chuyển peptit trypsin xúc tác vói tham gia threonin có nhóm cacboxyl bảo vệ Phản ứng xảy pha nước với dung môi hữu tan nước Sản phẩm tạo thành thủy phân nhẹ để tách nhóm cacboxyl threonin để tạo insulin người - Phản ứng tổng hợp sử dụng glycozidase Bên cạnh việc sử đụng protease ừong phàn ứng plastein, glycozidase sử dụng rộng rãi để tổng hợp oligosaccarit khử không khử từ đường khử quen thuộc glucose, fructose việc phát triển thực phẩm chức /3galactosidase sử dụng ừong phản ứng tổng hợp N-acetyllactosamin từ lactose N-acetylglucosamin để loại bỏ lactose sữa sản xuất chế phẩm sữa chọ người tiểu đường bệnh nhân mẫn cảm vói lactose Phản ứng chuyển vị este Vị trí chất gốc cacboxyl cấu tạơ lipít tạo nên lipit có tính chất vật lý cảm quan hồn tồn khác Một số lipit có giả trị thường mại lớn, vỉ dụ bơ cacao Bơ cacao có giá trị caơ nhiệt độ nóng chảy đặc biệt (nằm nhiệt độ môi trường nhiệt độ thể người) Trong thành phần cấu tạo bơ cacáo, 80% triglycerit có thành phần axit palmitic stearic vị trí 3, axit oleic vị trí Cố thể sản xuất lipìt có giá trị cáo từ lipit thông thường rẻ nhờ phàn ứng chuyển vị este thay gốc cacboxyl gốc rượu lipit tác dụng lipase 311 Để sản xuất bơ cacao từ dầu cọ, gốc axit dầu cọ cần thay gốc strearic Phản ứng thực hexan chứa lượng vừa đủ nước cho hoạt hóa lipạse Cũng nâng cao chat lượng dầu oliu bàng cách thay gốc oleic vị trí 1,3 bàng gốc palmitic, chất lượng dầu cọ dầu hướng dương cách tâng tỳ lệ gốc oleic đàu Ngồi ra, lipase sử đụng ưong phản ứng tong hợp chất thơm tự nhiên hệ hai pha (ví dụ tổng hợp isoamyl acetat rượu isoamyỉic) Các phản ứng tổng hợp cỏ thể thực chì khí sử dụng lipase có tính đặc hiệu phù hợp điều kiện phản ứng thích ứng cho q trình hợp ưu q trình thủy phân Đối với lipase cơng nghiệp, thơng thường hoạt tính thủy phân cao hoạt tính tổng hợp - lần Có thể hạn chế phản ứng thủy phân cách làm giàm hàm lượng nước hệ thống phản ứng sử dụng phản ứng ừong hệ hai pha hữu -n c 6.3.2 Triển vọng tương lai cơng nghệ enzym Hiện tai, có số enzym sản xuất quy mơ lớn thích ứng với sản xuất công nghiệp Ngành công nghiệp enzym phát triển dựa hưởng sau: kiểm tìm nguồn enzym mới; thiết lập sử dụng đa hóa enzym cơng nghiệp; sử đụng cơng cụ kỹ thuật di truyền để thiết kế sản xuất chất xúc tác hữu tương tự enzym sử dụng hệ enzym phức tạp Để đáp ứng yêu cầu phát triển cơng nghiệp enzym, cẩn có phối hợp cùa nhà enzym học, nhà di truyền nhà hóa học 63.2.1 Cơ c h ứ phi tự nhiên Rất nhiều enzym tính đặc hiệu với chất tự nhiên đơi điều kiện phản ứng thay đổi enzym thể hoạt tính hồn tồn khác với hoạt tính biết tnrớc chúng Nhở phản ửng này, thực phản ứng enzym với vận tốc cao nhiều lần so với sử dụng chất thơng thường chúng tạo cách thức để sản suất sản phẩm Có thể minh họa khả enzym trường hợp sau: Enzym glucooxydase đặc hiệu phản ứng oxy hóa đưcmg khừ với chất đặc hiệu D-glucose không đặc hiệu với chất nhận electron cùa phản ứng oxy hỏa Thông thưcmg, oxy đóng vai trò chất nhận electron phản ứng oxy hóa D-glucose enzym glucooxydase Benzoquinon đóng vai trò chất nhận điện tử thay cho oxy, phản ứng diễn sau: o D -G lu co se B enzoquinon D-Glucono-1,5-lacion Ồ Hydroquinon Hydroquinon hợp chất hữu quý sử dụng nhiều kỹ thuật nhiếp ảnh Phản úng xảy với hiệu suất gần 100%, enzym không bị vô hoạt peroxyt ưong phản ứng với oxy Vận tốc phản ứng glucooxydase với benzoquinon cao vận tốc phản ứng enzym với oxy tỉnh tan benzoquinon pha nước cao oxy Acetylcholinesterase enzym xúc tác thủy phán acetylcholin, chất dẫn truyền thần kinh động vật có xương sống, tạo thành cholin acetic Enzym xúc tác đặc hiệu việc thủy phân acetyl-Dcamitin khơng có hoạt tính acetyl-L-camitin L-camitin có hoạt tính vitamin sử dụng hữu ích điều trị, đó, dạng D-camitin lại khơng có giá trị Vì thế, enzym acetylcholinesterase sử đụng để phân tách hỗn hợp racemic hai hợp chất Người ta tổng hợp hỗn hợp racemic L,D-camitin đường hóa học, sau acetylat hỏa hỗn hợp bàng acetyl clorua để tạo acetyl-L,D-camitin Cho hỗn hợp qua cột phản ứng với acetylcholinesteraza, thu acetyl-L-camitin D-camitin Tách hỗn hợp bàng sắc ký trao đổi ion, thu acetyl-Lcamitin, chất có tác dụng tương tự L-camitin 6.3.2.2 Biến đổi cấu trúc enzym Một xu hướng phát triển năm vừa qua lĩnh vực enzym áp dụng kỹ thuật di truyền làm biến đổi có định hướng cấu trúc 313 enzym, làm thay đổi hoạt tính, hiệu suẩt phản ứng động học enzym, làm cho trình thu hồi enzym trờ nên thực Một khía cạnh sản xuất enzym tính đến gắn gen chịu trách nhiệm tổng hợp enzym có nguồn gốc từ nguồn khơng an tồn vào thể chủ an toàn tổng hợp chúng với suất cao nhờ việc chứa nhiều gen Trong tương lai, enzym thao tác cho dễ dàng phù hợp với điều kiện sản xuất điều kiện nhiệt độ, ion, kiềm pH Một xu hướng hứa hẹn công nghệ enzym sừ dụng công nghệ protein cài biến trung tâm hoạt động enzym, nhờ thu enzym có hoạt tính cao có hoạt tính Một kỹ thuật xem triển vọng đột biến điểm cho protein enzym Điểm mấu chốt kỹ thuật thay đổi vài axit amin cấu tạo protein enzym, dẫn tới thay đổi lớn cấu hình protein, hoạt tính tính chất enzym thay đổi theo Để kỹ thuật phát triển được, cần cớ hệ liệu đủ chi tiết phần mềm hỗ trợ, cộng thêm kỹ thuật đột biến điểm bẳng phương pháp truyền thống, hóa học phân tử lý thuyết thực nghiệm 6.3.23 Tổng hợp enzym nhân tạo Các chất có hoạt tính tương tự enzym (synzym) tổng hợp bằrig đuờng nhân tạo Để tổng hợp synzym, cần thiết kế tổng hợp trung tâm gán chất trung tâm xúc tác Thực tế cho thấy việc thiết kế trung tâm gẳn chất đơn giản thiết kể trung tâm xúc tác, gập nhiều khỏ khăn Nhìn chng synzym tuân thủ mô hỉnh MichaelisMenten, chế phản ứng tương tự phản ứng đo enzym xúc tác, Cho tới nay, enzym nhân tạo chưa thể thiết kể từ protein chưa có đầy đủ thơng tin nguyên tác cấu hỉnh không gian từ cấu trúc bậc protein Hơn nữa, enzym tạo nên tự prọtein gặp phải nhược điểm enzym tự nhiên dễ biến tính, d i bị oxy hóa thủy phân 314 I Một vài enzym nhân tạo đà sử dụng thành công, ví dụ trường hợp axit polyglutamic với tính chất tương tự esteraza, hoạt động pH hẹp, tối ưu pH = 5,3; Km= 2mM V m ax = 10"4 thủy phân chất 4-nitrophenyl acetat 10'5 s"1đối với phản ứng 6.23,4, Hệ thống tái tạo coenzym Đối với enzym sử dụng coenzym, việc tái tạo coenzym vô quan trọng giá thành cao coenzym khó khăn tái tạo coenzym c ỏ thể giải van đề cố định coenzym enzym chat mang thích hợp Một biện pháp hệ thống cố định tế bào Tuy nhiên hệ thống làm việc với hiệu suất thấp tính ổn nhiệt khơng cao Có thể thực phản ứng enzym thiết bị phản ứng màng với kích thước lỗ màng lọc phải nhỏ kích thước coenzym Hoặc coenzym cố định ừên chất mang Thông thường cần dẫn xuất hóa coenzym để dễ dàng cố định chúng chất mang không ảnh hường tới chức hỗ trợ xúc tác chúng Các chất phân tử lượng cao hòa tan ừong nước thường sử dụng làm chất mang coenzym đo ảnh hưởng tói khuếch tán coenzym so với chất mang không tan nước Các chất hay sử dụng dextran, propylenglycol, polyetylenimin Thường coenzym nên gắn mức độ thấp tránh làm giảm khả chuyển động khuếch tán ảnh hưởng ức chế chúng tới phản ứng enzym Động thái phản ứng enzyw nảy thay đổi theo hệ thống, nhiên chúng tn theo mơ hình Michaelis-Menten với Kmcao hom v m thấp hom trường hợp không cô định coenzym Hiện nay, có số hệ thong tái tạo coenzym dựa nguyên tẳc hồa học, điện hỏa nguyên tắc enzym Tái tạo coenzym theo nguyên tắc enzym ưu điểm tính đặc hiệu cao nó, phương phầp điện hóa lại cỏ tính cạnh tranh Dưới hai ví dự tái tạo coenzym theọ nguyên tạc enzym Đê thực nguyên tác này, chất enzym phải rẻ enzym hỗ trợ tìn h phải (dễ kiếm, sản phẩm cần tách dễ dàng, chạt sản phẩm phản ứng tái tạo coenzym không ảnh hưởng tới hệ thống 315 C ơchấi (A = ) - oxydoreduciase sán phẩm (A H O H ) polyeivlen glycol-N A D * Polyeíhylen glycol-NADH + H* CO: (khí) HCOOH form al dehydrogenase kinase Cơ chất (A O H ) dextran-A D P D e x tra n -A T P Axit acetic sàn phẩm (A O PO r ) acítat kinase acetyl phosphai 6.3.2.S S dụng enzym phân tích, chẩn đốn điều trị Một lĩnh vục phát triển quan trọng công nghệ enzyra sử dụng enzym phân tích - chẩn đoán điều ưị Trong năm gần đây, kỹ thuật enzym tiếp cận phân tích chăn nuôi, trồng trọt, nghiên cứu sinh thái học công nghiệp thực phẩm đặc biệt việc sử dụng cơng cụ enzym ừong chẩn đốn y tế vệ sinh môi trường Việc sử dụng enzym ưong y học đạt thành công hạn chế, chù yếu phân tích chẩn đốn Việc sử đụng enzym tín hiệu cảnh bảo điều trị gặp nhiều khó khăn, chủ yếu là: Các enzym polyme lớn, khỏ đưa vào tể bào thể Đây lý bàn hạn chế khả khai thác việc sử dụng enzym chẩn trị bệnh truyền Nhiều phương pháp phát triển áp dụng để giải vấn đề bàng cách sử dụng enzym hướng đích Vi dụ enzym với liên kết cộng hóa trị gắn vào gổc galactose có tác dụng hưổmg đích tế bào gan, enzym với liên kết cộng hóa trị gắn kháng thể đon dòng đặc hiệu sử dụng để tránh hiệu ứng phụ tính khơng đặc hiệu gây nên 316 - Do có chất protein, enzym vào thể đóng vai trò kháng nguyên cảm ứng phản ứng miễn địch thể Điều gây nên phản úmg dị ứng đặc biệt sừ dụng thời gian đài Trong vài trường hợp giải vấn đề cách biến đồi enzym thành chất khơng chất protein nhờ liên kết cộng hóa trị Khí ấy, enzym nảy thể hoạt tính chống khối u không gây nên đáp úng miễn địch Tuy nhiên việc sử dụng enzym cần đảm bảo khơng kèm theo độc tố Chính mà enzym động vật sử dụng phổ biến enzym vi sinh vật cho dù giá thành chúng cao enzymvi sinh vật - Các enzym kéo dài thời gian bán hủy nhờ phương pháp khác nhau: tạo liên kết cộng hóa trị, bao enzym lớp vỏ nhân tạo Tuy thời gian hoạt động enzym cải thiện song gây nên phản ứng miễn dịch tạo cục máu đơng Các enzym sử dụng chẩn đốn, điều trị cần có độ tinh đặc hiệu cao Các giá trị Km phải thấp Vmax cao để đạt hiệu quà sử đụng nồng độ enzym chất thấp Gia thành chế phẩm enzym cao cạnh tr-anh với hóa trị đắt tiền 63.2.6 Bảo vệ môi trường Việc sử dụng enzym quan trọng công tác bào vệ môi trường sử dụng enzym “công nghệ cuổi đuờng ổng”- xử lý chất thải, chuyển chất thải thành sản phẩm có ích, ừong cơng nghệ tái sử dụng phế thải, chuyển phế thải thành sàn phẩm có ích Trong trường hợp này, enzym sử dụng dạng chế phẩm kỹ thuật Ngoài ra, mơi trường chứa nhiều thành phần khác nên đòi hòi enzym phải có độ đặc hiệu cao Chính yêu cầu đặt thách thức lớn cho việc sử dụng enzym ưong công tác bảo vệ môi trường Một xu hướng bào vệ mơi trường lả sừ dụng enzym mục đích phát triển công nghiệp bền vững Người ta hy vọng enzym giúp phát triển chiến lược sản xuất sử dụng nguyên liệu tái chể, thay kỹ thuật sử dụng hóa chất vật liệu q trình sinh học 317 Công nghệ enzym giai đoạn chín mùì để phát triền Lý thuyết enzym tích lũy Việc sù dụng enzym nhân rộng nghiên cứu, cơng nghiệp ngày tìm thấy ứng dụng đặc biệt thay Tuy vậy, nhiều khoảng trống kiến thức enzym phương diện lý thuyết thực nghiêm Việc phát enzym tự nhiên ừong hệ sinh thái thiết kế enzym phía trước 318 X i Liệu Tham Khảo Aehle Wolgang, 2004 Enzyme in industry, Wiley-VCH Verlag GmbH and Co.kgaA Andres Illanes, 2008, Enzyme Biocatalysis, Applications, Springer Science Publishing Anthony p Turner F, 1996, Biosensors; Past* Present and Future, Institute of Bioscience and Technology Asjhok Mulchandani, 2008, Principles o f Enzyme Biosensors, vol : Enzyme and Microbial Biosensors Byong H Lee, 1996, Fundamentaks o f Food Biotechnology, VCH Publisher Bommarius, A s, Riebel B R, 2004, Biocatalysis and Applications Wiley -V C H Verlag GmbH and Co.kgaA Campbell, c N, Gal D, Cristies N, Barditrat c , 2002, Enzyme amplified amperometric Sandwich test for RNA and DNA - Anal chem, pp158-162 Erika Kressroger, 1997, Handbook of Biosensors and Electronic Noces Medicine, Foof and the Environment CRC Press FOX P.F, 1991, Food Enzymology-Vol2-Elivier Science Publishers LTD 10 Georgres Hennen, 1998, Biochimie r r Cycle, Dunod, Paris u Gerard Coutouly, 1991, Genie Enzymaticque CO-Edition Masson- Principles and Doin 12 Graham Romsay, 1998, Commercial Biosensors-Application to Chilical Bioprocess and Environment Samples, Chem, Anal Vol 148 13 Hideaki Nakamura, Isao Karube, 2003, Current Reseach Activity in Biosensors Anal Bianal Chem 377 14 Josh Haacker, 1997, Immobilized Enzyme Weiley, Chichester 319 15 Jacquer-Henry Well, 1997, Biochimie General, Masson Paris 16 Kiyoshi Toko, 2000, University Press Biometric Sensor Technology Cambridge 17 Lehniger, A L, 2004, Principles of Biochemistry, 4