Kỹ thuật nhân giống vô tính cây Lan Hồ Điệp

KĨ THUẬT NHÂN GIỐNG VƠ TÍNH CÂY TRỒNG BÀI BÁO CÁO CHỦ ĐỀ: NHÂN GIỐNG VƠ TÍNH LAN HỒ ĐIỆP( PHALAENOPSIS) GV: TS.Dương Cơng Kiên THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH Ngày tháng 10 năm 2015 MỤC LỤC: Đặt vấn đề I II III IV Nguồn gốc phân bố Phân loại 10 Đặc điểm sinh thái 10 Cơ quan sinh dưỡng a Rễ b Thân c Lá Cơ quan sinh sản a Hoa b Quả c Keiki Trồng trọt chăm sóc 15 Nhiệt độ độ ẩm Nhu cầu nước tưới Ánh sáng Độ thông thoáng Dinh dưỡng Sâu bệnh vấn đề khác A Sâu hại lan hồ điệp Rệp son( Scale insects) hút nhựa lan Bọ trĩ( Thrips) hút nhựa lan Ốc sên, nhớt ăn lan hồ điệp Nhện đỏ( red spider mites) làm hồ điệp héo rụng B Bệnh nấm xuất lan hồ điệp Bệnh thối đen( black rot) Bệnh đốm vòng( Anthracnose) Bệnh khơ lá( Leaf blight) Bệnh héo rễ( Wilt) C Bệnh vi khuẩn lan hồ điệp Bệnh thối mềm Bệnh thối nâu D Bệnh virus lan hồ điệp Botrytis Petal Blight/ Bệnh tàn cánh hoa Chậu, giá thể cách trồng Các phương pháp nhân giống lan hồ điệp 31 Nhân giống truyền thống 1.1 Nhân giống hữu tính hạt 1.2 Nhân giống vơ tính cách tách chiết a Phương pháp cho Hồ điệp sinh ky(keiki) mắt ngồng hoa b Phương pháp ép cho Hồ điêph “đẻ” Vi nhân giống lan hồ điệp( Phalaenopsis) 2.1 Nhân giống vơ tính sử dụng chồi đỉnh 2.2 Tái sinh chồi từ phát hoa Phalaenopsis 2.3 Tạo mô sẹo 2.4 Tái sinh PLB từ mô Phalaenopsis 2.5 Tái sin PLB Phalaenopsis từ nhiều nguồn mơ Quy trình nhân giống hoa lan Hồ Điệp kỹ thuật nuôi cấy mô tế bào a Chọn mẫu khử trùng mẫu cấy b Nhân giống c Tái sinh hoàn chỉnh in-vitro d Chuyển vườn ươm VI Tình hình sản xuất giá trị kinh tế 44 Nước Trong nước VII Kết luận 46 VIII Tài liệu tham khảo 47 V Giới thiệu lan hồ điệp: Lan hồ điệp(Phalaenopsis spp.) loài lan quý ưa chuộng đóng vai trò quan trọng ngành công nghiệp hoa cắt cành cảnh giới Tuy nhiên, số lượng giống sản xuất đáp ứng nhu cầu ngày tăng thị trường Nguyên nhân lan hồ điệp loài sinh trưởng chậm lồi lan khó nhân giống, thường cho hệ số nhân thấp điều kiện vườn ươm Để có số lượng lớn giống chất lượng tốt cung cấp cho thị trường sản xuất gặp nhiều khó khăn Trong năm gần đây, công nghệ lai tạo giống kết hợp gieo hạt ống nghiệm cho tỉ lệ nảy mầm cao, tạo nên đa dạng màu sắc, cấu trúc, kích thước hoa sau tế hệ Tuy nhiên nhân giống phương pháp gieo hạt mang tính biến dị cao, tốn nhiều thời gian, khơng thể có cho hoa mẹ Để khắc phục điều nhà khoa học dùng nhiều phương pháp nuôi cấy mô để tạo đồng loạt ổn định mặt di truyền Phương pháp có ưu điểm tạo nên quần thể đồng tính trạng, có tăng trưởng chất lượng hoa đồng Hiện phương pháp nuôi cấy đỉnh sinh trưởng lan hồ điệp nhằm tạo giống bệnh quan tâm Việc nhân giống kỹ thuật nuôi cấy mô in-vitro tạo hàng loạt ổn định mặt di truyền đáp ứng giá hữu ích I NGUỒN GỐC VÀ PHÂN BỐ Lan Hồ Điệp khám phá vào năm 1750, ông Rumphius xác định tên Angraecum album Đến năm 1753, Linne đổi lại Epidenndrum amabilis Vào năm 1825, Blume nhà thực vật Hà Lan định danh lần Phalaenopsis amabilis Bl tên dùng ngày Lan Hồ Điệp có tên khoa học Phalaenopsis sp, loại lan có hoa lớn, đẹp, bền Lan Hồ Điệp có màu sắc phong phú, không thua giống lan khác từ trắng, hồng, đỏ, vàng, tím đến loại lan Hồ Điệp có sọc nằm ngang thẳng đứng có đốm to hay nhỏ GiốngPhalaenopsis có khoảng 70 lồi có 44 chủng loại, mọc từ dãy Hymalaya đến châu Á Có 20 lồi lan ưa nóng có nước Đơng Nam Á bán đảo Mã Lai, Indonesia, Philippine, đông Ấn Độ, (Nguyễn Công Nghiệp, 2004) Lan Hồ Điệp sống độ cao 200- 400 m (William kramer, 1983) nên vừa chịu khí hậu nóng ẩm vừa chịu khí hậu mát, nhiệt độ trung bình từ 20°C – 30°C, khí hậu lý tưởng cho việc nuôi trồng loại lan 22°C – 27°C Ở Việt Nam, bắt gặp số loài lan hồ điệp khu rừng : Phalaenopsis gibbosa Phalaenopsis mannii(hồ điệp ấn): mảnh, dạng bầu thn, cong, màu xanh bóng Phát hoa dài, thường bng thòng xuống, hoa tập trung đỉnh, cánh màu vàng nghệ với vân màu đỏ Mơi nhỏ màu trắng có vạch tím, hai thùy bên thuôn Cây mọc Trung Bộ, Đà Lạt Hoa nở vào mùa hè Phalaenopsis braceana Phalaenopsis fuscata Phalaenopsis lobbii Phalaenopsis coenu(hồ điệp dẹt): Cây sống phụ, rễ lớn, khơng có thân, thn dài hình bầu dục Phát hoa dài 30cm, thẳng đứng, cánh hoa màu xanh vàng, 6-12 chiếc, nở lâu tàn có hương thơm, cột nhụy màu vàng Cây mọc miền Trung, có dáng đẹp, trồng Đà Lạt Hoa nở vào đầu mùa thu Phalaenopsis parishii(hồ điệp trung): Cây nhỏ hình trái xoan, màu xanh bóng, rụng vào mùa khô Phát hoa mọc thẳng đứng, mang 3-9 hoa đỉnh, màu vàng nhạt, mơi hồng tươi, có hai vạch nâu Cây mọc đẹp, hoa đứng, màu sắc sặc sỡ nên gây trồng làm cảnh, trang trí phòng Hoa nở vào mùa xuân Phalaenopsis pulcherrima(hồ điệp nhài): Cây nhỏ, sống đất cát rừng chồi, rễ khoẻ mập, hình trái xoan Phát hoa nhỏ dài mang chùm hoa đỉnh, nở dần, có nhiều loại như: màu trắng, màu hồng, tím Cây mọc miền Trung, Đồng Nai, Bình Châu… trồng tốt TP.Hồ Chí Minh Ra hoa vào mùa mưa Phalaenopsis chibae Hầu hết có hoa nhỏ màu sắc sặc sỡ, hương thơm độc đáo II PHÂN LOẠI Ngành: Magnoliophyta (thực vật hạt kín) Lớp: Monocotyledoneae (lớp mầm liliopsida) Bộ: Orchidaceae Họ: Orchidaceae Giống: Phalaenopsis Loài: Phalaenops is spp Tên khoa học: Phalaenopsis wedding promenade III ĐẶC ĐIỂM HÌNH THÁI Cơ quan sinh dưỡng a Rễ 10 Các keiki mọc từ ngồng hoa hồ điệp Những vị trí mọc keiki ngồng hoa Thời điểm tiến hành nhân giống hồ điệp từ keiki: - Trong suốt năm, miễn lan hồ điệp gần tàn hoa tiến hành nhân giống Nhưng thời gian tốt từ tháng đến tháng lí do: Đây giai đoạn đa số lan hồ điệp có hoa (để chơi tết) 33 Tháng đến tháng giai đoạn tăng trưởng hầu hết loại lan, thuận lợi cho Khi thấy hoa tàn độ 2/3 ngồng hoa thời điểm thích hợp để xử lý tạo keiki (nếu để muộn ngồng hoa khô, không kịp cho việc mọc ky nữa) Khi lan hồ điệp vài bơng đỉnh nên cắt chúng - Hãy cắt ngồng hoa, bỏ từ khúc có phân nhánh có hoa trở lên Thường để lại 3-4 khúc ngồng hoa (tính từ gốc lên) Vết cắt nên cách mắt độ 1-3cm Bôi Daconil thuốc chống bệnh vào vết cắt, để khô vết cắt 2-3 ngày Chăm sóc cho mẹ phân bón 20-20-20 độ 3-4 tuần, để hồi sức sau đợt nuôi hoa Lấy vải mềm quấn nhẹ, xốp, quanh mắt ngồng(thường thành công mắt thứ 3-4-5, tính từ gốc lên), rộng độ 5-7mm, dày độ 2-4mm Rồi cách nhật, theo trình tự này, nhỏ thuốc kích thích vào chổ bơng đó, sau: +Từ bắt đầu mắt sưng lên (xung dịch), nhú đầu rễ chồi ky (Khoảng 2-4 tuần): Antonic 1/500 (độ giọt/100cc nước) Hoặc thay B1 Thái Thường mọc chồi trước, rễ sau Nhưng ngược lại +Khi mắt sưng, nhú chồi rễ tháo băng ra, đổi phun thuốc (nếu tiếp tục thuốc đó, làm "cháy" chồi rễ non.) +Chuyển sang: Rootplex (hoặc Kelpak) 1/1000, cộng thêm B1 Thái 34 Antơnic Phun bón +Chỉ 2-3 tuần sau, ky nhú từ mắt ngồng hoa cũ Tiếp theo, chăm bón bình thường, đợi có nhiều rễ ky dài độ 4-6cm trở lên cắt trồng riêng, cho an toàn Nên xếp thêm than cho cao lên đón rễ, cho rễ bám vào than, ky phát triển nhanh, cắt ky trồng xuống, phát triển tiếp ngay, khơng bị chột lại Phải để chậu thấp nơi mát ẩm, tuyệt đối tránh ánh nắng gắt (chỉ cần 20-40% ánh sáng, tức âm u) giai đoạn kích thích (Nắng nhiều héo keyki mọc nhánh hoa tiếp) Thuốc pha không nên để lâu biến chất, hiệu lực, nên đong thuốc giọt, với tiêu chuẩn tính 20 giọt = 1cc b Phương pháp ép cho Hồ điệp "đẻ" con: Để Hồ Điệp đẻ có khó tạo ky chút: Để tạo ky cần có ngồng hoa làm được, dù non, bói hoa Để Hồ Điệp đẻ khó thành cơng non, thường tiến hành lớn năm tuổi, thân phải đủ cao để tiến hành thủ thuật: Cây thường sinh phần thấp gốc, chí phần có rễ Nên chọn thời điểm mùa Xuân, sau cắt ngồng hoa sớm, bồi bổ cho sung mãn trước tiến hành thủ thuật độ tháng Bằng phân 30-10-10 20-20-20, gia thêm chút thuốc kích thích sinh trưởng Các bước tiến hành thủ thuật ép đẻ sau: 1- Bón kích hạn chế tưới: Dùng phân 20-20-20 gia thêm Antonic 1/1000 Rootplex 1/2000 (hoặc Kelpak) phun mặt tưới gốc ngày/lần x lần Hạn chế tưới nước để mẹ ngót nước 2- Thắt thân mẹ: Lấy dây điện nhỏ có lõi đồng mềm (như dây nhỏ bọc dây điện thoại), quấn vào thân mẹ vòng xoắn thít dần, lún vào thân độ mm vừa Điểm thắt nên khoảng gần gốc, 1-2 Sau thời gian, 35 chổ thít thường bị héo dần rụng Nếu gốc cao thắt thứ Ở giai đoạn cần tưới đủ, tiếp tục thúc phân kích Cứ 12 tháng, thấy nhú chồi thơi Trong trình này, nên bới giá thể sát gốc chút, chồi lại mọc sâu, vùng có rễ Nếu thấy dây thắt lỏng xoắn chặt lại cũ Do ứ nhựa lại phần cây, nên phần mẹ bị dừng phát triển Nếu bạn thắt mức làm phần héo đi, tốt theo dõi mà thắt chặt dần sau ngày 3- Dưỡng chồi non: Đây giai đoạn phải bảo vệ chăm sóc chồi cẩn thận Chồi non dễ bị thối bị ướt lâu, cần tưới xung quanh gốc, tránh tưới vào chồi non Thuốc ngừa nấm dùng 1/2 liều Phân bón thơi gia Antonic, thay vào B1 Thái, tuần/lần X 3-4 lần Chủ yếu dùng 30-10-10 20-20-20 Khi chồi cao độ cm nhú chòm lá, non dễ bị thối chạm vào giá thể, cần bới tránh Và tháo bỏ dây thắt mẹ Nếu già, thân dài, chồi mọc cao nhàn nhiều Khi chồi 2cm, nâng lên khỏi mặt giá thể chăm sóc bình thường mẹ, chờ rễ Để rễ ky phát triển nhanh, khoẻ, bạn nên xếp than cao lên, đón cho rễ bám vào Khi chùm rễ khỏe cắt tách chậu khác, khéo léo đem viên than mà rễ bám vào sang chậu Nhớ bôi thuốc phòng bệnh vào vết cắt Trong suốt q trình tiến hành, cần để nơi ẩm mát, tránh nắng, mưa Vi nhân giống Phalaenopsis: 36 Hầu hết giống lan dễ xảy biến dị, việc nuôi cấy hạt tạo đồng nhất( Arditti, 1992) Vì vậy, đế sản xuất đồng loạt cần áp dụng phương pháp Hiện phương pháp áp dụng phổ biến là: nhân giống vơ tính Khó khăn lớn nhân giống vơ tính Phalaenopsis nguồn mẫu hạn chế hồ điệp lan đơn thân, sử dụng chồi đỉnh để ni cấy nhiều lồi lan khác làm tổn thương mẹ (Intuwong Sagawa, 1974) Hơn nữa, Phalanopsis thường tiết nhiều hợp chất phenol từ bề mặt cắt môi trường nuôi cấy, gây độc cho mẫu mô( Fast,1979) Một số phương pháp nhân giống vơ tính Phalaenopsis thành cơng trình bày sau đây: 2.1 Nhân giống vơ tính sử dụng chồi đỉnh: Chồi đỉnh lan Phalaenopsis bị tổn thương già cỗi có khả tạo nhiều chồi từ chồi ngủ gốc Từ quan sát này, nhà làm vườn mạnh dạn cắt phần đỉnh phía rễ khí nuôi cấy riêng lẻ chúng để nhân thành theo ý muốn Phương pháp xem phổ biến Chồi phát triển từ phần gốc nuôi cấy 270C( Tran Thanh Van, 1974) Từ phương pháp này, chồi ban đầu tạo đến chồi khác 10( Tran Thanh Van, 1974) Các chồi sinh dưỡng phát triển từ chồi ngủ trục Phalaenopsis, từ nách chồi tạo hai chồi mới(Koch, 1974; Holers, 1983) Phương pháp nuôi cấy chồi đỉnh tạo PLB thành công biết đến trường Đại học Hawai thực hiện( Intuwong Sagawa, 1974) Vật liệu chồi đỉnh mang 6-7 non P Amabilis, P x Star Santa Cruz, P x Surfrider, P x Ituby Lips, P.x Arcadia P cochlearis Phương pháp sử dụng thành công chồi dỉnh ứng dụng thành cơng cao cho nhiều lồi lan Tuy nhiên, loài lan đơn thân Phalaenopsis, sử dụng phương pháp nuôi cấy chồi đỉnh làm tổn thương mẹ, đó, phương pháp nhân giống dùng phát hoa từ mẹ sử dụng phổ biến 2.2 Tái sinh chồi từ phát hoa Phalaenopsis: Gavino Rotor người thành công việc nhân giống vơ tính in vitro lan hồ điệp nghiên cứu sinh Lawrence McDaniels Đại học Cornell( Rotor, 1949) Ông sử dụng phát hoa bỏ bắc mang đến chồi ngủ, cắt phát hoa thành đoạn mang chồi nằm cách hai đầu cắt 7-8cm Sau khử trùng bề mặt cắt vô trùng thành đoạn mang chồi cách hai đầu 1-2cm Cấy đoạn phát hoa vào môi trường Knudson C làm rắn với agar, đoạn phát hoa cắm thẳng cho chồi hướng lên Phương pháp Rotor ý đến tỷ lệ nhiễm cao hệ số nhân thấp Nhưng 10 năm sau nghiên cứu khác tạo nhiều quy trình dựa phương pháp này( Sagawa Niimoto, 1960; Sagawa, 1961; Kotomori Murashige, 1965; Scully, 1966; Tse cộng sự, 1976; Arditti cộng sự, 1977a; 1977b; Tanaka Sakanishi, 1977, 1978; Valmayor, 1977; Fast, 1979; Johnson cộng sự, 1982) Intuwong cộng sự(1972a,b) cho lợi ích phương pháp mẹ không bị tổn thương nguy hiểm 37 Tanaka Sakanishi(1978) sử dụng phát hoa P amabilis lai khoảng tuổi nuôi cấy môi trường Vacin-Went bổ sung 2,5ppm BAP.Các phát hoa nuôi cấy 280C, nốt vị trí cho tỉ lệ tăng trưởng tốt nhất, có khơng có chồi ngủ, nhiều chồi nốt chưa thoát khỏi ngủ Khi nuôi cấy nhiệt độ thấp hơn(28-300C) yếu tố quan trọng để kích thích ngủ chồi bên Nghiên cứu nhóm Ernst( 1984) cho thấy nồng độ cytokinin môi trường tăng lên( 25 đến 125ppm BAP môi trường Knudson C môi trường REM) cảm ứng tạo cụm chồi hình thành từ nốt phát hoa Cuống hoa non( hoa chưa nở) khử trùng, cắt đoạn cấy vào môi trường REM bổ sung 25mg/l BAP cho chồi hướng lên Sau 2-3 tháng, chồi phát triển, cấy truyền sang môi trường REM chứa 10% nước chuối xay khơng có chất điều hòa sinh trưởng để rễ sau 1-2 tháng Phương pháp nhân giống từ phát hoa phương pháp đặc trưng Phalaenopsis Ưu điểm phương pháp tạo bệnh đồng di truyền, điều mà phương pháp gieo hạt truyền thống khơng thể đạt Ngồi ra, việc nhân giống in vitro từ phát hoa có ưu điểm lớn không làm tổn thương mẹ, so với việc nhân giống từ chồi trưởng thành mẹ Tuy nhiên, phương pháp có khuyết điểm hệ số nhân thấp, vậy, phương pháp nhân giống vơ tính từ phát hoa thường sử dụng để tạo nguồn nguyên liệu mô in vitro cho phương pháp hiệu sau Một số phương pháp phát sinh PLB trực tiếp từ mô in vitro, tạo mô sẹo phát sinh phôi vô tính đe lại hệ số nhân cao dựa vào nguồn mẫu in vitro tạo thành nhờ nuôi cấy phát hoa( Tanaka cộng sự, 1997; Park cộng sự, 2000; 2002a) 2.3 Tạo mơ sẹo: Sự hình thành mơ sẹo từ nhiều loại mô khác nghiên cứu Phalaenopsis Tuy nhiên, có báo cáo cơng bố q trình Mơ sẹo Phalaenopsis thu nhận từ chồi ngủ phát hoa phương pháp gây vết thương, chồi ngủ khơng có khả hình thành chồi tạo mô sẹo( Tse cộng sự, 1971; Hackett cộng sự, 1973) Có phương pháp gây vết thương sau: - Bỏ 2/3 chồi cách cắt xéo theo trục hoa, song song trục thân - Cắt đôi chồi cách cắt dọc trục cuống - Đâm thủng chồi theo chiều dọc trục kim nhọn vô trùng - Phương pháp cho kết hình thành mơ sẹo cao mơi trường Knudson C MS( Murshige Skoog, 1962) thay đổi Các chồi bất định hình thành mơ sẹo bề mặt, sau mơ sẹo tiếp tục phát triển thành chồi Khoảng 12 hình thành tháng nốt, sau khác tạo Từ phương pháp này, tác giả tiếp tục phát triển phương pháp nhân giống thông qua mô sẹo 38 Tanaka( 1976) ni cấy chóp rễ từ gieo hạt in vitro thu nhận dạng mô sẹo màu vàng, mô sẹo tiếp tục phát triển thành PLB tái sinh Lin(1986) tạo mô sẹo màu vàng sáng ni cấy lóng phát hoa non, tỷ lệ mô sẹo tạo thành môi trường chứa 1mg/l BAP 26% 53% môi trường mg/l BAP Sagawa(1990) tạo mô sẹo Phalaenopsis đề nghị quy trình nhân giống Kim cộng sự(1994) thu dạng mô sẹo tơi xốp màu vàng sáng nuôi cấy lát cắt mỏng phát hoa Phalaenopsis Các mô sẹo tiếp tục biệt hóa thành phơi, hình thành PLB tái sinh Kobayashi cộng sự(1993) nuôi cấy mô sẹo tách thành công protoplast Ichihashi Hiraiwa( 1996) nghiên cứu phát triển mô sẹo cho môi trường làm rắn với gelatin phù hợp cho mô sẹo tăng sinh Mơ sẹo Phalaenopsis thu nhận thành cơng từ nuôi cấy mô in vitro 2cm từ PLB(Ishii cộng sự, 1997), nhiên việc tạo mô sẹo từ PLB dễ dàng từ mô nuôi cấy môi trường VW bổ sung 40g/l sucrose, 20%(v/v) nước dừa làm đông với gellan gum Mô sẹo sau chuyển sang môi trường không chứa sucrose dễ dàng chuyển thành PLB, sau tiếp tục tái sinh mơi trường thích hợp Các nghiên cứu cho PLB dạng phôi vô tính Phalaenopsis mơ sẹo tơi xốp màu vàng có khả sinh tạo phơi( mơ sẹo tạo phôi- embrygenic callus)(Kim, 1994; Ichihashi Hiraiwa, 1996; Tanaka cộng sự, 1997) 2.4 Tái sinh PLB từ mô Phalaenopsis 39 M Tanaka cộng tiến hành nghiên cứu việc nhân giống vơ tính Phalaenopsis từ mô trường đại học Osaka, Nhật Bản (Tanaka cộng sự, 1975; Tannaka Sakanishi, 1977, 1980, 1985) Nguyên liệu cho thí nghiệm ban đầu cảu nhóm mơ lấy từ trưởng thành từ in vitro tạo thành nhờ gieo hạt Tuy nhiên trưởng thành khơng có khả tạo PLB, nảy mầm lai tạo PLB Như vậy, khả tạo PLB giảm xuống tuổi cấy giống tang lên (Tanaka công sự, 1975) Theo phương pháp này, PLB tạo từ ni cấy mẫu in vitro môi trường MS, mẫu tạo rat rung bình khoảng 3,8 PLB (từ đến PLB) mặt cắt mẫu Các PLB biệt hóa tiếp tục mơi trường lỏng Vacin-Went bổ sung 20% nước dừa tiếp túc tái sinh môi trường gieo hạt Phalaenopsis Sau chuyển sang vườn ươm tiếp tục phát triển bình thường nở hoa Quy trình tạo số lượng lớn giống đông mặt di truyền Phương pháp tạo PLB từ nốt phát hoa cắt nhỏ Phalaenopsis nhuwtuwf mẫu tạo thành từ phát hoa Hấ-von Schmude (1983,1985) thực Các mẫu phát hoa – 1.5 cm mang chồi bên lai phalaenopsis Munsyerland Stẻn “Alpha”, Babette “ Symphony”, Windspiel “Dussedort”, Barbara Moler “Firecracker” sử dụng sau khử trùng với dung dịch sodium hypochlorite 0,6%, mẫu ni cấy mơi trường MS lỏng lắc 100 vòng/phút vài tuần môi trường rắn Chồi nuôi môi trường lỏng tạo PLB mẫu mơi trường rắn taọ Các PLB tạo thành dọc theo mặt cắt, đỉnh đáy mẫu Các nhà khoa học tìm thấy nhiểu tế bào nhỏ với nhân to tương tự phôi.Các mô cắt nuôi cấy lỏng lắc môi trường MS mô tả Phương pháp có 40 thể tạo 30000 từ phát hoa Phalaenopsis Babette “Symphony” ban đầu năm, Phalaenopsis Munsterland Stern „Alpha‟ tạo 10000 năm, phalaenopsis Barbara Moler „ Firecracker‟ taoj 3000 18 tháng (Haas-von Schmude, 1984) Cả lai từ P.lueddemanniana P.fasciata, lồi có khả ình thành keiki dễ tang sinh lai P.amabilis loài có hoa lớn khác Từ phương pháp Haas-von Schmude (1983,1985), tương tự nghiên cứu Reuter (1983), thấy kiểu di truyền Phalaenopsis có đáp ứng khác nuôi cấy điều kiện 2.5 Tái sinh PLB Phalaenopsis từ nhiều nguồn mô Nhiều quy trình nhân giống sử dụng phần mơ tạo từ phát hoa làm vật liệu nuôi cấy (Fu, 1979; Kushnir, 1980) Zimmer cộng tiến hành ni cấy tồn từ chồi in vitro để thu nhận PLB, nhiên cứu thực trường Đại học kỸ thuật Hannover ( Đức) thu kết khả quan (Zimmer Pieper, 1976, 1979) Phát hoa cấy Phalaenopsis lai màu hồng Zada x Zada, Lipperose, Zauberrose nhân giống in vitro để tạo Các tách rời thành mô lá, mô rễ, mô cuống nuôi cấy môi trường Knudson C thay đổi có chứa BA KNA ( potassium napthalenecetate) giúp cảm ứng hình thành PLB Sau đó, PLB ni cấy trê mơi trường Knudson C để biệt hóa thành Để thay cho nước dừa( giá thành nước dừa Châu Âu cao), sử dụng 10% nhựa bulo them vào môi trường Knudson C để giúp PLB phát triển ( Zimmer vaf Pieper, 1978; Holters, 1983) Tuy nhiên, nhựa cụa bulô không phổ biến nên phương pháp khó áp dụng rộng rãi nhiều nơi khác Năm 1976, Tanaka phát triển qui trình nhân giống Phalaenopsis từ chops rễ lai P amabilis gieo hạt in vitro Sau đó, cắt đầu rễ dài 3mm tạo thành đặt vào môi trường MS bổ sung auxin vaf cytokinin Khoảng 40% mẫu 349 ngày tuổ tạo PLB sau 120 đến 272 ngày môi trường MS Môi trường O (Ojima vaf Fujiwara, 1962) tạo PLB sau 260 ngày Sau tháng, PLB tạo hình cầu đỉnh mặt sau mẫu chop rễ khối cầu biệt hóa thành mơ sẹo sau phát triển dẩn thành PLB Chỉ 10% mẫu 194 ngày tuổi hình thành sinh khối mơ sẹo màu sang mơi trường MS cải biến mô sẹo tách rời cấy chuyển sang môi trườn thu 12 PLB Các PLB tăng trưởng thành môi trường gieo hạt Một số chóp rễ khơng tạo PLB kéo dài phát triển chồi 41 Các mẫu rễ từ thường khơng có giá trị nhiều chúng khơng sử dụng để nhân sinh khối Tuy nhiên mẫu mô rễ sau cắt rời có khả tạo PLB tái sinh (Zimmer Pieper, 1978) Vì chất lượng hoa ổn định, quy trình ứng dụng rộng rãi Năm 1986, Lin nhân giống Phalaenopsis cách cắt phiến mô mỏng mẫu long phát hoa.Long phát hoa Phalaenopsis lai năm tuổi trồng vườm ươm sử dụng làm vật liệu nuôi cấy Các PLB thường tạo phát hoa 60 – 75 ngày tuổi suất PLB cao dung phát hoa 35 – 45 ngày tuổi Các phát hoa từ 180 ngày tuổi trở lên không tạo PLB.Các phát hoa già thường tạo PLB phần nốt gần đỉnh Đối với mẫu phát hoa bắt đầu nở hoa khơng có khả tạo dược 22,5 đến 44,7% PLB Tần số cảm ứng PLB cao ( 62,9% đến 77,1%) thu dung mẫu phát hoa non chưa tạo hoc Phát hoa Phalaenopsis có khả tái sinh PLB ( 4,8 ĐẾN 6,5%) vị trí gần đỉnh dù phát hoa cho hoa nở xong Năng suất PLB cao thu môi trường chưa 1mg/l BAP không bổ sung auxin, sau mơi trường mg/l BAP khơng auxin Một số PLB hình thành bổ sung mg/l NÂ vào mơi trường có BAP, PLB khơng tròn Trên mơi trường có kinetin, kinetin NAA, hay BAP khơng có sụ hình thành PLB Các PLB cấy chuyền sang môi trường chưa BAP 1mg/l, không bổ sung auxin để tái sinh Phương pháp nhân sinh khối PLB bioreactor phát triển Park cộng (2000).Các PLB hình thành từ mơ in vitro ngun liệu để ni cấy bioreactor Ni cấy chìm chu kỳ lít mơi trường Hyponex bổ sung than hoạt tính, độ tong khí bioreactor 0.5 2.0 ppm vòng tuan62 tạo 18000 PLB từ 1000 PLB ban đầu Qua đây, vai trò kích thích tăng sinh PLB than hoạt tính chứng minh Ngồi ra, số mơi trường sử dụng để tái sinh cấy từ PLB MS, VW, KC, Lindemann Hyponex mơi trường Hyponex thích hợp (Park cộng 2000; Ishii cộng sự, 1997) Quy trình nhân giống hoa lan Hồ điệp kỹ thuật nuôi cấy mô tế bào Quy trình tiến hành qua giai đoạn sau: a Chọn mẫu khử trùng mẫu cấy: Tách vảy hành từ cây, bóc lần già 42 xuất mầm chồi bên mang đỉnh sinh trưởng Cắt bỏ gốc mầm, sau khử trùng cách ngâm cồn 70° 30 giây, rửa nước cất vô trùng ngâm dung dịch Ca(OCl)2 2% 25 phút, việc khử trùng tiến hành tủ cấy Mô rửa lại với nước cất vô trùng - lần Mỗi mầm đặt đĩa petri vô trùng cẩn thận tách non Sau lần tách, nhúng mầm vào cồn 70° giây rửa với nước cất vô trùng Chuyển sang đĩa petri vô trùng khác, tách mầm dao nhọn vơ trùng Dùng kìm nhọn tách lớp lá, cắt đỉnh sinh trưởng khỏi mô cấy vào môi trường nhân giống ban đầu b Nhân giống: Môi trường nhân giống thường môi trường MS (Murashige Skoog, 1962) có bổ sung chất điều hồ tăng trưởng (auxin, cytokinin,…) với tỷ lệ phù hợp tùy loài nhằm tạo điều kiện cho trình nhân chồi Nồng độ chất điều hoà sinh trưởng nên giảm dần lần cấy chuyền sau Các chất chiết trái đề nghị dùng nước cốt cà chua, nước dừa, nước chuối, nước khoai tây chúng có hiệu lần cấy chuyền thể tích khơng q 10% thể tích môi trường Nhiệt độ lý tưởng để nhân giống Lan 22°C - 26°C tuỳ vào loài Sau 4-8 tuần, đỉnh sinh trưởng chuyển sang màu xanh lục tạo khối tròn gọi thể chồi Thể chồi lấy khỏi môi trường cấy ban đầu, dùng dao nhọn cắt làm 4-6 miếng tuỳ kích thước chồi Lát cắt chuyển vào môi trường trì (mơi trường phát triển chồi) Mỗi đỉnh sinh trưởng phát triển thể chồi sau khoảng tuần, cắt tiếp cấy chuyền sang mơi trường c Tái sinh hồn chỉnh in-vitro: 43 Khi đạt đến số giống cần thiết, ta chuyển thể chồi sang môi trường tạo rễ (môi trường có lượng auxin tăng lên để kích thích rễ) Sau -5 tháng, thể chồi phát triển thành d Chuyển vườn ươm: Cây cao 5-7 cm có từ 3-4 chuyển sang cấy vào bầu đất mùn vơ trùng có bổ sung chất dinh dưỡng Sau thời gian phát triển ổn định ta đem chuyển vào chậu Sau chuyển chậu khoảng tuần bón phân, lúc có đủ sức chống chọi với bệnh tật Như vậy, từ mô hoa Lan chọn nuôi cấy có 3-4 chuyển vườn trồng thời gian khoảng từ đến 11 tháng Với phương pháp nhân giống vơ tính đảm bảo tạo mang đặc tính giống hồn tồn với cha mẹ (cây ổn định mặt di truyền), không nhiễm bệnh tạo số lượng lớn thời gian ngắn Tuy nhiên, việc cấy mô phải thực thật nghiêm túc tỉ mỉ theo quy trình, phải có điều kiện trang thiết bị đầy đủ, môi trường nhân tạo thích hợp, đặc biệt điều kiện vơ trùng phải đảm bảo nghiêm ngặt Cần ý thêm, lồi khơng phải địa, phải hoá vùng chọn mẫu đem ni cấy, có đảm bảo hiệu từ khâu ni cấy phòng thí nghiệm đến trồng ngồi vườn ươm VI Tình hình sản xuất giá trị kinh tế: Nước ngồi: Hiện tình hình sản xuất hoa giới phát triển cách mạnh mẽ trở thành ngành thương mại có lợi cho kinh tế nước trồng xuất hoa Diện tích trồng hoa giới ngày mở rộng không ngừng tăng lên, nhiều tạp chí hoa lan xuất bán, nhiều hội thảo lan tổ chức Trước việc nuôi trồng xuất chủ yếu lan rừng nên nguy khảng 13 loài tuyệt chủng, ngày việc trồng lan dần theo quy mô công nghiệp, việc xuất lan đạt tới số lượng hàng trăm ngàn giỏ, hàng vạn cành lan 44 năm nhằm đap ứng nhu cầu ngày cao thị trường Nhiều nước trở thành cường quốc xuất hoa lan Thái Lan, Đài Loan… Hiện nay, Thái Lan nước đứng đầu giới xuất hoa lan đạt 110 triệu USD năm 2003; Đài Loan có khí hậu ấm áp, mưa nhiều gần giống với khí hậu Việt Nam nên sản xuất hoa tươi quanh năm, Đài Loan tăng nhanh sản xuất Phalaenopsis chọn tạo nhiều giống mới, tạo số giống lan quý có khả cắt hoa trồng chậu( Segrback, LB 1983); Malaysia: với quan tâm phủ phát triển nhanh chóng nghề trồng hoa, đến có đủ khả cạnh tranh với giới chiếm phần đáng kể Châu Á, công nghiệp lan cắt cành tăng khoảng triệu USD năm 1988 20 triệu năm 1994, thị trường xuất chủ yếu Singapore, Nhật, Úc…(Ngô Quang Vũ-Hoa cảnh T10/2002); Hà Lan: đầu tư 20 triệu USD vào Ấn Độ để lắp đặt thiết bị máy móc đầu tư cho sản xuất hoa lan xuất Tính đến năm 2003, kim ngạch xuất hoa phong lan Hà Lan đạt 1,8 tỷ USD Hoa phong lan Hà Lan trồng nhà kính với tổng diện tích 3081,75ha; Nhật Bản: đầu tư 6,6 triệu USD cho Thái Lan để mở rộng sở sản xuất với công suất 10 triệu lan năm hiên Nhật khách hàng lớn Singapore với khả tiêu thụ 60% số lan nước này( Phan Thúc Huân, 1989) Trong nước: Việt Nam nằm vùng khí hậu nhiệt đới gió mùa, nóng ẩm quanh năm thuận lợi cho việc trồng hoa, cảnh Tuy nhiên chưa đầu tư thích đáng nên ngành trồng hoa nói chung ngành trồng lan nói riêng chưa thực phát triển, sản xuất lan Việt Nam phát triển mạnh mẽ tỉnh phía nam, đặc biệt Đà Lạt thành phố Hồ Chí Minh Thành phố Hồ Chí Minh có khí hậu ấm áp quanh năm trung tâm văn óa kinh tế, trị, khoa học kỹ thuật miền Nam có tiềm lớn ni trồng kinh doanh hoa lan Từ năm 1980 Việt Nam xuất lan sang Liên Xô, Tiệp Khắc Năm 1987 thành phố Hồ Chí Minh có vườn lan quốc doanh tư nhân với đời nhiều hội lan, cảnh có nhiều sở nghiên cứu đời Theo số liệu điều tra bước đầu tính đến năm 1986 thành phố Hồ Chí Minh có khoảng 15 gia đình có vườn lan với số lượng 1000-7000 chậu đến năm 1987 thành phố Hồ Chí Minh có vườn quốc doanh tư nhân: vườn lan T78, vườn lan Hàng Không dân dụng, từ năm 1980, năm thành phố cũn tổ chức Hội Hoa Xuân 45 VII Kết Luận: Hiện lan hồ điệp nói chung loại lan nói riêng xem trồng đem lại hiệu kinh tế cao Hiệu kinh tế cao gấp 2-3 lần so với trồng khác Lan hồ điệp u thích khơng màu sắc, kiểu dáng mà mang vẻ đẹp sang trọng trang nhã Việc nhân giống vơ tính sản xuất nhiều giống ổn định việc cung cấp giống nhằm phát triển ngành trồng lan 46 VIII Tài liệu tham khảo: -Giáo trình ni cấy mơ tập III TS Dương Công Kiên Kĩ thuật nhân giống kinh doanh, Huỳnh Canh Thới,1996 - Cung Hoàng Phi Phượng, Nguyễn Văn Hiếu, Nguyễn Quốc Thiện, Dương Hoa Xơ, Nguyễn Quốc Bình (2007) ỨNG DỤNG HỆ THỐNG NI CẤY NGẬP CHÌM TẠM THỜI TRONG NHÂN GIỐNG CÂY LAN HỒ ĐIỆP LAI (Phalaenopsis hybrid) - Joseph Arditti, Robert Ernst, Micropropagation of orchids http://www.vuonhoalan.net/default.asp?tab=detailnews&zone=94&id=107&tin=392&titl e=gioi-thieu-tong-quat-ve-lan-ho-diep http://www.hoalansadec.com/2014/04/chiet-tach-lan-ho-diep-tukeiki.html#.VhMe4kaT5QQ http://www.hoalansadec.com/2014/01/chia-se-mot-so-cach-nhan-giong-lan-ho.html https://vuonhoalanhodiep.wordpress.com/2014/10/26/cach-nhan-giong-va-phong-trubenh-sau-hai-cho-lan-ho-diep/ http://favri.org.vn/vi/san-pham-khcn/san-pham-khcn/hoa-va-cay-canh/quy-trinh-kythuat/263-quy-trinh-nhan-giong-hoa-lan-ho-diep-bang-ky-thuat-nuoi-cay-mo-te-bao.htm 47 ... Chậu trồng lan hồ điệp 30 V Các phương pháp nhân giống lan hồ điệp: Nhân giống truyền thống: 1.1 Nhân giống hữu tính hạt: Trong thiên nhiên thụ phấn lan côn trùng thực Cánh mơi hoa lan có cấu... thống 1.1 Nhân giống hữu tính hạt 1.2 Nhân giống vơ tính cách tách chiết a Phương pháp cho Hồ điệp sinh ky(keiki) mắt ngồng hoa b Phương pháp ép cho Hồ điêph “đẻ” Vi nhân giống lan hồ điệp( Phalaenopsis)... Sâu hại lan hồ điệp Rệp son( Scale insects) hút nhựa lan Bọ trĩ( Thrips) hút nhựa lan Ốc sên, nhớt ăn lan hồ điệp Nhện đỏ( red spider mites) làm hồ điệp héo rụng B Bệnh nấm xuất lan hồ điệp Bệnh