Phát hiện ADN phôi thai tự do trong huyết tương máu ngoại vi mẹ ứng dụng cho chẩn đoán trước sinh bằng biện pháp không can thiệp

PHÁT HIỆN ADN PHÔI THAI TỰ DO TRONG HUYẾT TƯƠNG MÁU NGOẠI VI MẸ: ỨNG DỤNG CHO CHẨN ĐOÁN TRƯỚC SINH BẰNG BIỆN PHÁP KHÔNG CAN THIỆP Trần Văn Khoa, Nguyễn Duy Bắc Hồ Hữu Thọ, Nguyễn Viết Trung Học viện quân y Tóm tắt ĐẶT VẤN ĐỀ: Gần đây, phát ADN phôi thai huyết mẹ mở phương pháp chẩn đoán trước sinh biện pháp khơng can thiệp Mục đích nghiên cứu tách chiết ADN phôi thai tự trong máu ngoại vi mẹ để sử dụng cho chẩn đốn trước sinh biện pháp khơng can thiệp ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU: AND phôi thai tách chiết từ huyết tương máu ngoại vi 29 phụ nữ mang thai với tuổi thai từ đến 38 tuần Gen đặc hiệu giới tính nam – SRY phân tích kỹ thuật PCR KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN: 15 số 29 thai xác định nam qua phân tích PCR với gen đặc hiệu giới tính nam Kết hoàn toàn phù hợp với kết kiểm tra giới tính qua siêu âm giới tính sau sinh KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ: ADN tự phôi thai tách chiết từ huyết máu ngoại vi mẹ có giá trị để chẩn đốn trước sinh bệnh di truyền biện pháp khơng can thiệp *Từ khố: AND phơi thai tự do, chẩn đốn trước sinh Đặt vấn đề Lo cộng sự, 1996 phát ADN phôi thai huyết máu ngoại vi mẹ [3] Điều mở triển vọng cơng tác chẩn đốn trước sinh biện pháp không can thiệp Trên giới Việt Nam chẩn đoán trước sinh biện pháp can thiệp phương pháp tiến hành chủ yếu từ trước tới Tuy mang lại nhiều lợi ích xác định sớm trường hợp thai mang bệnh di truyền để giúp cho công tác tư vấn di truyền y học, song chẩn đốn qua chọc dò xét nghiệm dịch ối, sinh thiết thai… gặp phải tỷ lệ tai biến từ 0,5-1% Chính nhiều nhà khoa học giới năm gần tập trung vào việc nghiên cứu tách chiết ADN phơi thai máu mẹ để áp dụng chẩn đốn trước sinh biện pháp khơng can thiệp qua phân tích ADN bào thai lưu hành máu mẹ [1, 2, 6] Trong thực tế có nhiều tác giả thành cơng lĩnh vực áp dụng chẩn đốn giới tính [4] hay chẩn đốn nhóm máu Rh [7], chẩn đốn bệnh di truyền [6, 9, 10] Có tác giả sử dụng ADN phơi thai tự phân tích đột biến nhận dạng cá thể thai hình pháp y [5] Đề tài thực nhằm số mục tiêu sau: - Nghiên cứu tách chiết ADN thai huyết tương máu mẹ - Xác định ADN phôi thai tự huyết tương máu mẹ kỹ thuật PCR Đối tượng, vật liệu phương pháp nghiên cứu Đối tượng: 29 phụ nữ mang thai vào khám thai phòng khám bệnh Viện quân y 103 Trung tâm nghiên cứu ứng dụng Sinh - Y - Dược học, Học viện quân y với tuổi thai từ 7-38 tuần Mẫu chứng dương lấy từ nam giới; mẫu chứng âm chọn từ phụ nữ chưa mang thai lần Thu chuẩn bị mẫu: Máu ngoại vi toàn phần lấy vào tuýp lấy máu vô khuẩn chống đông EDTA Mỗi mấu lấy 5ml máu Máu sau lấy li tâm 5000 vòng/phút 10 phút Bảo quản huyết tương thu tủ lạnh âm – 80oC tách ADN Phương pháp tách chiết ADN phôi thai từ huyết tương máu mẹ: ADN phôi thai tách chiết từ huyết máu mẹ QIAgen Blood KIT (Qiagen) theo qui trình nhà sản suất có cải biên [4] Phương pháp nhân gen In vitro (PCR): gen đặc hiệu giới tính nam - SRY nằm nhiễm sắc thể giới tính Y khuyếch đại với mồi đặc hiệu máy nhân gen ABI 9800 FAST Trình tự mồi: SRY-F 5’-GGT GTT GAG GGC GGA GAA ATG-3’; SRY-R 5’-ATA AGA AAG TGA GGG CTG TAA GTT-3’ Chu trình nhiệt: biến tính phút/ 940C, gắn mồi 2phút/ 550C, nối dài 720C/3 phút; tổng số 2530 chu kỳ Điện di kiểm tra sản phẩm PCR phát băng đặc hiệu Nghiên cứu thiết kế theo kiểu mù đơn, mù kép kết hợp với tiến cứu Giới tính thai nhi kiểm chứng qua siêu âm thai sau tuần thứ 25 sau sinh Kết bàn luận Tách chiết ADN phôi thai huyết tương mẹ qua gen đặc hiệu giới tính nam - SRY nhiễm sắc thể Y Hình ảnh kết điện di xác định gen đặc hiệu giới tính nam-SRY ADN phôi thai tự tách chiết từ máu ngoại vi mẹ: 1: thang ADN chuẩn; 2: mẫu chứng +; 3,4,7,8: thai nam; 5,6,8: thai nữ Kết tách chiết ADN phôi thai tự huyết mẹ xác định qua phân tích PCR gen SRY trình bày bảng sau: Trường Tuổi thai hợp (Tuần) SRY (+/-) 10 + 18 + + 28 - Giới tính Trường hợp (SÂ/SS) Sau sinh 16 (Nam) Siêu âm 17 (nam) Siêu âm 18 (Nam) Siêu âm 19 (nữ) Tuổi thai (Tuần) SRY (+/-) 32 + + 13 - 14 - Giới tính (SÂ/SS) Sau sinh (Nam) Chưa có kết Siêu âm (nữ) Siêu âm (nữ) Siêu âm Sau sinh 20 32 + (nam) (Nam) Siêu âm Sau sinh 21 32 (nữ) (nữ) Siêu âm Siêu âm 12 22 18 + (nữ) (nam) Sau sinh Siêu âm 36 23 27 (Nữ) (nữ) Siêu âm Siêu âm 17 + 24 24 + (nam) (nam) Sau sinh Siêu âm 10 38 + 25 24 (Nam) (nữ) Siêu âm Sau sinh 11 23 26 34 + (nữ) (nam) Siêu âm Sau sinh 12 20 + 27 31 (nam) (nữ) Siêu âm Siêu âm 13 15 + 28 20 (nam) (nữ) Siêu âm Sau sinh 14 28 29 35 + (nữ) (nam) Siêu âm 15 15 (nữ) Từ bảng kết cho thấy: số 29 trường hợp, 15 thai xác định 22 + nam, 14 thai xác định nữ Trong 28/29 trường hợp xác định qua siêu âm sau tuần thứ 25 sau sinh Kết phân tích cho thấy có độ xác cao Nghiên cứu nhiều tác giả khác giới cho thấy khả tách chiết xác định giới tính qua phân tích ADN phơi thai tự máu mẹ có độ xác cao: Chungwen Wei cộng (2001), nghiên cứu tách chiết ADN phôi thai tự 30 phụ nữ mang thai chẩn đốn xác 100% giới tính (19 thai nam), đặc biệt phát tăng cao bất thường nồng độ ADN phôi thai tự máu mẹ thai trisomy-21 Kết xác chẩn qua phân tích kiểu nhân (Karyotyping) [4] Zhao Y cộng (2004) dùng kỹ thuật PCR xác định giới tính qua phân tích ADN phơi thai tự máu mẹ 44 phụ nữ mang thai từ đến 41 tuần với độ xác 100% [10] Về chế xuất ADN phôi thai tự máu mẹ nhiều điều chưa rõ [3] Khác với tế bào phôi thai máu mẹ có ba loại bạch cầu lymhpo, tế bào màng ni (trophoblast) tế bào hồng cầu có nhân phôi thai (fetal nucleated red blood cell) tồn lâu sau sinh sẩy thai, ADN phôi thai tự tồn thời gian ngắn: ngày thứ tư sau sinh sẩy thai không phát thấy [8] Kết luận kiến nghị Từ kết nghiên cứu thu được, đến số kết luận sau: -Tách chiết ADN phôi thai tự lưu hành máu ngoại vi mẹ -Dùng kỹ thuật PCR khuếch đại gen đặc hiệu giới tính nam cho phép phát khẳng định có mặt ADN phơi thai huyết tương máu ngoại vi mẹ với độ nhạy cao ADN phôi thai tự máu mẹ có giá trị dùng để chẩn đốn trước sinh bệnh di truyền liên kết giới tính nhiều bệnh lý di truyền khác biện pháp không can thiệp qua phân tích gen đặc hiệu góp phần cho cơng tác tư vấn di truyền y học Tài liệu tham khảo Ana Bustamante et al (2006) Detection of a Paternally Inherited Fetal mutation in maternal Plasma by the use of Automated Sequencing Ann NY Acad Sci.1075: 108-117 Avent ND; Chitty LS (2006) Non-invasive diagnosis of fetal sex; utilisation of free fetal DNA in maternal plasma and ultrasound Prenat Diagn 26(7): 598-603 (ISSN: 0197-3851) Chiu RW; Lo YM (2006) Noninvasive prenatal diagnosis by analysis of fetal DNA in maternal plasma Methods Mol Biol.; 336:101-9 (ISSN: 1064-3745) Chungwen Wei et al (2001) Screening cell-free fetal DNA in maternal plasma Clin Chem.47, 336 Reference QIAGEN News, 14-16 Deng Z; Wu G; Li Q; Zhang X; Liang Y; Li D; Gao S; Lan Y (2006) Noninvasive genotyping of Y-chromosome specific STR loci using circulatory fetal DNA in maternal plasma by multiplex PCR Prenat Diagn; 26(4): 362-8 (ISSN: 0197-3851) Denis L Y.M et al (1998) Quantitatve Analysis of Fetal DNA in Maternal Plasma and Serum: Implication for noninvasive Prenatal Diagnosis Am.J.Hum.Genet., 62: 768-775 Finning K; Martin P; Daniels G A (2004) Clinical service in the UK to predict fetal Rh (Rhesus) D blood group using free fetal DNA in maternal plasma Ann NY Acd Sci 1022: 119-23 (ISSN: 0077-8923) Smid M; Galbiati S, Vassallo A, Gambini D, Ferrari A, Viora E, Pagliano M, Restangno G, Ferrari M, Cremonesi L (2003) Noevidence of fetal DNA persistence in materanl plasma after pregnancy Hum genet 112 (5-6: 617-8 (ISSN: 03406717) Warunee Tungwiwat et al (2006) Development and Application of a RealTime Quantitative PCR for Prenatal Detection of Fetal Thalassemia from maternal Plasma Ann NY Acad Sci.1075: 103-107 10 Zhao Y; Zou L (2004) Application of fetal DNA in maternal plasma in noninvasive prenatal diagnosis J Huazhong Univ Sci Technolog Med Sci 24(1): 59-61(ISSN: 1672-0733) Summary DETECTION OF CELL-FREE FETAL DNA IN MATERNAL PERIPHERAL BLOOD: IMPLICATIONS FOR NON-INVASIVE PRENATAL DIAGNOSIS Khoa Tran Van, Bac Nguyen Duy, Tho Ho Huu, Trung Nguyen Viet Military Academy of Medicine INTRODUCTION: Recent discovery of the presence of fetal DNA in maternal plasma has opened up a new method for non-invasive prenatal diagnosis The aim of this study was to extract cell-free fetal DNA in maternal peripheral blood with a view of using for non-invasive prenatal diagnosis MATERIALS AND METHODS: Fetal DNA was extracted from maternal plasma of 29 pregnant women during the 7th to 38th weeks of gestation PCR analysis of the SRY gene was performed Routine ultrasound was also performed on the pregnant women after 25 weeks of gestation to confirm fetal gender RESULTS: 15 of 29 pregnancies were found male fetuses by PCR analysis with male specific geneSRY Which were totally correlated to the results by ultrasound examination or confirmed by the gender determining after birth CONCLUSIONS: Cell-free fetal DNA extracted in maternal plasma seems to be useful for non-invasive prenatal diagnosis of inherited diseases *Key words: Cell-free fetal DNA, prenatal diagnosis ... chiết ADN phôi thai tự lưu hành máu ngoại vi mẹ -Dùng kỹ thuật PCR khuếch đại gen đặc hiệu giới tính nam cho phép phát khẳng định có mặt ADN phơi thai huyết tương máu ngoại vi mẹ với độ nhạy cao ADN. .. 5ml máu Máu sau lấy li tâm 5000 vòng/phút 10 phút Bảo quản huyết tương thu tủ lạnh âm – 80oC tách ADN Phương pháp tách chiết ADN phôi thai từ huyết tương máu mẹ: ADN phôi thai tách chiết từ huyết. .. dụng ADN phơi thai tự phân tích đột biến nhận dạng cá thể thai hình pháp y [5] Đề tài thực nhằm số mục tiêu sau: - Nghiên cứu tách chiết ADN thai huyết tương máu mẹ - Xác định ADN phôi thai tự