Phương pháp nhân nhiễm virus NPV trên sâu khoang ăn tạp (spodoptera liture)

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC KỸ THUẬT CÔNG NGHỆ TP HCM ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP PHƯƠNG PHÁP NHÂN NHIỄM VIRUS NPV TRÊN SÂU KHOANG ĂN TẠP (SPODOPTERA LITURE) Ngành : CÔNG NGHỆ SINH HỌC Chuyên ngành : CÔNG NGHỆ SINH HỌC Cán hướng dẫn : Th.S HOÀNG ANH TUẤN Sinh viên thực hiện: VÕ THỊ HUỲNH MAI MSSV: 0851110142 Lớp: 08DSH4 TP Hồ Chí Minh, 2012 Đồ án tốt nghiệp LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan đồ án là công trình nghiên cứu khoa học chính bản thân trực tiếp thực hiện Được thực hiện sở nghiên cứu lý thuyết, vận dụng kiến thức thực hành và tiến hành thí nghiệm nghiên cứu thực tiễn dưới sự hướng dẫn của Th Hoàng Anh Tuấn Các nội dung nghiên cứu và kết quả đồ án là trung thực, không chép số liệu người khác Nếu phát hiện có bất kỳ sự gian lận nào, xin hoàn toàn chịu trách nhiệm trước Hội đồng, cũng kết quả đồ án Thành Phố Hồ Chí Minh, tháng năm 2011 Sinh viên thực hiện Võ Thị Huỳnh Mai Đồ án tốt nghiệp LỜI CẢM ƠN Em xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành đến: Ban giám hiệu trường ĐH Kỹ Thuật Công Nghệ TP.HCM đã tạo mọi điều kiện thuận lợi giúp đỡ em quá trình học tập và hoàn thành đồ án Ban chủ nhiệm Khoa Môi Trường – Công Nghệ Sinh Học, cùng quý thầy cô khoa đã truyền đạt những kiến thức quý báu, tạo điều kiện, động viên, giúp đỡ cho em quá trình học tập Thầy Th Hoàng Anh Tuấn và cô TS Nguyễn Thị Hai đã trực tiếp hướng dẫn đề tài Trong suốt quá trình làm đồ án, quý thầy cô đã bỏ nhiều thời gian công sức, tận tình giúp đỡ em hoàn thành đồ án tốt nghiệp đúng định hướng ban đầu Thầy Thành và Thầy Dũng đã tạo tạo điều kiện cũng hỗ trợ trang thiết bị cho em suốt quá trình thực hiện đề tài Cô Trần Thị Thiên An cùng cô Oanh Trường ĐH Nông Lâm TP.HCM; thầy Thành và thầy Dũng Trường ĐH Kỹ Thuật Công Nghệ TP.HCM đã tạo điều kiện cũng giúp đỡ tận tình suốt thời gian em thực hiện đề tài Các bạn chung nhóm đề tài, cùng các bạn lớp và các bạn ở trường ĐH Nông Lâm đã giúp đỡ em quá trình thực hiện đề tài Cuối cùng, xin gửi lời cảm ơn, lời chúc sức khỏe đến cha, mẹ cùng hai em là người bên cạnh ủng hộ và chia sẽ mỗi lúc em gặp khó khăn Em xin chân thành cảm ơn! Võ Thị Huỳnh Mai Đồ án tốt nghiệp MỤC LỤC Danh mục các từ viết tắt iv Danh mục các bảng, đồ thị v Danh mục sơ đồ, hình ảnh vi CHƯƠNG 1: MỞ ĐẦU 1.1 Tính cấp thiết của đề tài 1.2 Mục tiêu nghiên cứu của đề tài .2 1.3 Thời gian – địa điểm thực hiện 1.4 Phương pháp nghiên cứu 1.5 Kết cấu của đồ án tốt nghiệp CHƯƠNG 2: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1 Sơ lược về lịch sử phòng trừ sâu hại nông nghiệp 2.1.1 Những nghiên cứu ngoài nước 2.1.2 Những nghiên cứu nước 2.2 Giới thiệu chung về sâu khoang – Spodoptera litura Fab 2.2.1 Phân loại .6 2.2.2 Đặc điểm về hình thái – sinh học 2.2.2.1 Đặc điểm hình thái .7 2.2.2.2 Đặc điểm sinh học 2.2.3 Phân bố – phạm vi ký chủ 2.2.4 Các biện pháp phòng trừ 10 2.2.4.1 Biện pháp canh tác 10 2.2.4.2 Biện pháp giới – vật lý 10 2.2.4.3 Biện pháp hóa học .10 2.2.4.4 Biện pháp sinh học 10 2.3 Tổng quan về virus gây bệnh côn trùng 11 2.3.1 Virus gây bệnh côn trùng 11 2.3.2 Lịch sử nghiên cứu virus gây bệnh côn trùng 12 2.3.3 Phân loại virus gây bệnh côn trùng chính .13 i Đồ án tốt nghiệp 2.3.3.1 Nhóm CPV (Reoviridae) .13 2.3.3.2 Nhóm EV (Poviridae) 13 2.3.3.3 Nhóm Irido viruses (Iridoviridae) .13 2.3.3.4 Nhóm Denso virus (Parvoridae) 14 2.3.3.5 Nhóm Virus ARN (Picornaviridae) .14 2.3.3.6 Nhóm Sigma virus (Rhabdoviridae) 14 2.4 Nuclear polyhedrosis virus (NPV) 15 2.4.1 Một số đặc điểm hình thái và cấu trúc của NPV 15 2.4.1.1 Hình thái 15 2.4.1.2 Cấu trúc 15 2.4.1.3 Cấu tạo của thể virus 15 2.4.1.4 Cấu tạo khối đa diện (polyhedral) .16 2.4.2 Cơ chế xâm nhiễm 17 2.4.3 Triệu chứng của côn trùng nhiễm NPV 20 2.4.4 Ưu và nhược điểm của chế phẩm NPV 20 2.4.4.1 Ưu điểm .20 2.4.4.2 Nhược điểm 21 2.4.5 Hiệu lực diệt sâu của virus NPV .21 2.5 Phương pháp sản xuất chế phẩm NPV 22 2.5.1 Quy trình sản xuất chế phẩm NPV bằng phương pháp in vivo 23 2.5.2 Phương pháp nhân nhiễm virus 26 2.5.2.1 Những nghiên cứu ngoài nước 26 2.5.2.2 Những nghiên cứu nước .27 2.5.3 Thời gian thu nhận virus 28 2.5.3.1 Những nghiên cứu ngoài nước 28 2.5.3.2 Những nghiên cứu nước .30 2.5.4 Phương pháp tinh sạch 30 2.5.4.1 Những nghiên cứu ngoài nước 30 2.5.4.2 Những nghiên cứu nước .32 ii Đồ án tốt nghiệp CHƯƠNG 3: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 3.1 Dụng cụ – Vật liệu thí nghiệm .33 3.1.1 Dụng cụ .33 3.1.2 Vật liệu 33 3.1.2.1 Nguồn sâu thí nghiệm 33 3.1.2.2 Nguồn virus để nhiễm sâu 33 3.1.2.3 Nguồn thức ăn nhân tạo .34 3.2 Nội dung nghiên cứu 34 3.3 Phương pháp nghiên cứu lây nhiễm tạo NPV 35 3.3.1 Xác định mật độ nhiễm sâu hợp lý 35 3.3.2 Xác định thời gian thu nhận sâu chết phù hợp 36 3.3.3 Xác định phương pháp ly tâm phù hợp để trích ly số PIB .37 3.4 Cách kiểm tra số lượng PIB 38 3.5 Phương pháp xử lý số liệu .39 CHƯƠNG 4: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 4.1 Xác định mật độ sâu nhiễm hợp lý 40 4.1.1 Tỷ lệ sâu chết của sâu ở các mật độ nuôi nhiễm NPV .40 4.1.2 Sản lượng PIB/sâu thu được ở các mật độ 41 4.1.3 Chi phí sản xuất 43 4.2 Xác định thời gian thu nhận sâu nhiễm thích hợp 44 4.2.1 Sản lượng PIB/sâu thu được .45 4.2.2 Thời gian thu lấy mẫu .45 4.3 Xác định phương pháp ly tâm thích hợp để trích ly các thể PIB 46 4.3.1 Mức độ tinh sạch của dịch virus NPV sau ly tâm ở các phương pháp ly tâm 47 4.3.2 Tỷ lệ virus thu nhận từ các phương pháp ly tâm thích hợp 50 CHƯƠNG 5: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 5.1 Kết luận 52 5.2 Đề nghị 52 iii Đồ án tốt nghiệp DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT NPV : Virus đa diện nhân (Nuclear polyhedrosis virus) GV : Virus hạt (Granuloviruses) SlNPV : Virus đa diện nhân ký sinh sâu khoangn (Spodoptera litura nucleaopolyhedro virus) CPV : Virus đa diện tế bào chất (Ctyplasmic Polyhedrosis viruses) EV : Entomopox viruses PIB : Hạt thể vùi đa diện (Polyhedra Inclusion Body) LE : Larval – equivalent DNP : Deoxyribo nucleoprotein HaNPV : Virus đa diện nhân ký sinh sâu xanh Helicoverpa armigera Nuclear polyhedrosis viruses BVTV : Bảo vệ thực vật SDS : Sodium dodecyl sulfate CNSH : Công nghệ sinh học Bt : Vi khuẩn Bacillus thuringiensis IPM : Quản lý dịch hại tổng hợp iv Đờ án tớt nghiệp DANH MỤC CÁC BẢNG, ĐỜ THỊ Bảng 4.1 Tỷ lệ sâu chết NPV thu nhận được ở các công thức 40 Bảng 4.2 Ảnh hưởng của mật độ sâu nhiễm đến sản lượng và hiệu suất nhân của NPV 42 Bảng 4.3 Giá thành sản xuất cho 100 sâu chết virus ở các công thức 43 Bảng 4.4 Số PIB/sâu ở các công thức 45 Bảng 4.5 Thời gian lấy mẫu của 100 sâu ở các công thức .46 Bảng 4.6 Số PIB/sâu ở các công thức 49 Đồ thị 4.1 Sản lượng PIB/sâu ở các thời điểm khác .44 Đồ thị 4.2 Sảnlượng PIB/sâu ở các công thức .49 v Đồ án tốt nghiệp DANH MỤC CÁC SƠ ĐỜ, HÌNH ẢNH Sơ đờ 2.1 Quy trình công nghệ sản xuất chế phẩm NPV 23 Hình 2.1 Sâu khoang Hình 2.2 Vòng đời sâu khoang Hình 2.3 Cấu trúc của Baculovirus 16 Hình 2.4 Cơ chế xâm nhập của virus NPV .17 Hình 2.5 Chu trình lây nhiễm virus NPV sâu khoang .19 Hình 3.1 Hình thể vùi của virus NPV buồng đếm hồng cầu bằng kính hiễn vi quang học với độ phóng đại 4000 lần, ở độ pha loãng 102 .39 Hình 4.1 Sự thay đổi màu sắc của thức ăn sau ngày nhiễm 47 Hình 4.2 Sự thay đổi màu sắc của thức ăn sau ngày nhiễm 47 Hình 4.3 Hình minh họa mức độ ôi thiu của thức ăn nhiễm NPV 48 vi Đờ án tớt nghiệp PHỤ LỤC MỢT SỚ HÌNH ẢNH TRONG QUÁ TRÌNH LÀM THÍ NGHIỆM Hình sâu khoang ngày tuổi bị bỏ đói giờ trước nhiễm Hình Các giai đoạn nhiễm virus NPV sâu khoang (A): Sâu mới nhiễm virus, hoạt động bình thường (B) : Sâu có triệu chứng: thể căng phồng, màu thân chuyển sang hồng nhạt, lờ đờ và ngừng ăn (C) : Sâu vừa chết (D): Sâu chết và dịch virus chảy Đồ án tốt nghiệp Hình Một số hình ảnh sâu khoang và nhộng chết virus NPV Hình Sâu nuôi tập thể bị nhiễm NPV Đồ án tốt nghiệp Hình Các lọ đựng mẫu sâu ở thí nghiệm xác định thời gian thu thich hợp Hình Lọc virus NPV Đồ án tốt nghiệp (a) (b) Hình Ly tâm mẫu (a): dịch virus mới ly tâm có sự phân tách các lớp (b): đánh đều mẫu sau ly tâm Hình Các ống COD chứa dịch virus NPV sau ly tâm Đồ án tốt nghiệp Hình Các PIB của virus NPV quan sát dưới kính hiển vi MỘT SỐ BẢNG SỐ LIỆU Bảng Giá thành phần của một mẻ thức ăn và giá trị của sâu khoang Một mẻ thức ăn nhân tạo (TANT) Khối lượng Đậu xanh Thành phần Đậu xanh Methyl- paraben Sorbic acid Ascorbic acid Men mì Casein Vitamin tổng hợp (Vitaral) Agar Công Giá thành của mẻ thức ăn ( Vnđ) 150g 2,5g 1,5g 3g 15g 15g 10ml 13g 5.250 7.500 2.000 3.000 3.000 10.000 6.000 4.500 50.000 91.500 Đồ án tốt nghiệp Bảng 2.Giá thành trung bình của một sâu chết – một mẻ thức ăn Tên dụng cụ - hóa chất STT Số lượng Giá/1 đơn vị (Vnđ) Tổng giá (Vnđ) Cốc lớn 500ml cái 30.000 30.000 Cốc nhỏ 100ml cái 22.000 88.000 Hũ yaourt, V= 30ml lốc 7.000 56.000 Hộp nhựa vuông 16x10,5cm cái 15.000 90.000 Thùng giấy A4 20,5x29,5cm cái 5.000 15.000 Hợp nhựa tròn đường kính 8cm 20 cái 2.000 40.000 Hợp nhựa tròn đường kính 32cm 10 cái 2.000 20.000 Lọ thủy tinh V= 100ml 20 lọ 1.000 20.000 Cọ quét 5.000 15.000 10 Dao 10.000 10.000 11 Bông thắm bịt 130.000 130.000 12 Bông không thắm bịt 130.000 130.000 13 Đũa thủy tinh 7.000 7.000 14 Máy xay sinh tố cái 700.000 700.000 15 Cân kỹ thuật cái 8.000.000 8.000.000 Đồ án tốt nghiệp 16 Bếp đun cái 484.000 484.000 17 Giấy thấm bịt 30.000 60.000 18 Bao tay hộp 90.000 90.000 19 Khẫu trang hợp 60.000 60.000 20 Ớng COD 50 ống 14.000 700.000 21 Eppendor bịt 254.000 254.000 22 Rỗ nhựa lớn cái 58.000 174.000 23 kệ xếp cái 50.000 50.000 24 pipet 1ml cái 9.000 9.000 25 pipet 2ml cái 11.000 22.000 26 pipet 5ml cái 15.000 15.000 27 pipet 10ml cái 18.000 18.000 28 bóp cao su cái 20.000 40.000 29 Phiễu lọc cái 16.000 80.000 30 Kính hiển vi cái 31 Buồn đếm hồng cầu cái 29.000.000 29.000.000 1.300.000 1.300.000 Đồ án tốt nghiệp 32 Kẹp cái 22.000 22.000 33 Muỗng múc hóa chất cái 12.000 12.000 34 Tủ lưu mẫu cái 35 Giá đỡ ống nghiệm cái 96.000 96.000 36 Cối - chày xứ cái 32.000 32.000 37 Nời inox cái 60.000 60.000 55.000.000 55.000.000 TỞNG CỢNG CHI PHÍ (Vnđ) 96.911.000 Ghi chú: Mỗi thí nghiệm tiến hành lặp lại lần với 15 sâu/ lần nhiễm thì cần mợt mẻ thức ăn nhân tạo MỢT SỚ BẢNG XỬ LÝ SỐ LIỆU Ớ CÁC CÔNG THỨC THÍ NGHIỆM Số PIB/sâu ở các công thức ANOVA Table for PIB/sâu by MAT DO Source Between groups Within groups Total (Corr.) Sum of Squares Df Mean Square F-Ratio P-Value 3.3818E21 8.4545E20 3.08 0.0681 2.74852E21 10 27.7993 6.13033E21 14 2.74852E20 Có p-Value =0,0681>0,05 nên số PIB/sâu ở các công thức không có sự khác biệt về mặt thống kê với mức ý 5% Multiple Range Tests for PIB/sâu by MAT DO Mat Count Mean 15 30 3 1.75123E9 2.66883E9 Homogeneouus Groups X X Đồ án tốt nghiệp 10 2.99198E9 X 3.11667E9 X 4.01509E10 X Tỷ lệ sâu chết NPV sau ngày nhiễm ở từng mật độ ANOVA Table for TY LE SAU CHET by MAT DO Source Sum of Squares Between 2647.38 groups Within 277.993 groups Total 2925.37 (Corr.) Vì p-Value = 0,000 < 0,05 nên Df Mean Square F-Ratio P-Value 661.845 23.81 0.0000 10 27.7993 14 tỷ lệ sâu chết giữa các công thức có sự khác biệt ý nghĩa 5% Multiple Range Tests for TY LE CHET by MAT DO Mat Count Mean 15 64.4433 30 66.6633 10 66.6667 77.6667 100 ANOVA Table for LE by mat Sum of Source Df Squares Between 106.365 Groups Within 15.1817 10 Groups Total (Corr.) 121.547 14 Homogeneouus Groups X X X X X Mean Square F-Ratio PValue 26.5913 17.52 0.0002 1.51817 Đồ án tốt nghiệp Vì p-Value = 0,000 < 0,05 nên số LE ở các công thức có sự khác biệt với mức ý nghĩa 5% Mat Count Mean Homogeneouus Groups 10 3 366.588 426.129 X XX 15 30 3 445.677 500.402 527.066 XXX XX X Multiple Range Tests for LE by mat Homogeneouus Groups 15 4.15333 X 30 6.38 XX 10 8.26667 XX 10.2667 XX 11.5933 X ANOVA Table for chi phi san xuat by mat Mat Source Count Sum of Squares Mean Df Mean Square F-Ratio P-Value Between 47926.0 11981.5 4.96 0.0183 Groups Within 24164.7 10 2416.47 Groups Total (Corr.) 72090.7 14 Có p-Value =0,0183 < 0,05 Vậy chi phí sản xuất ở các công thức co sự khác biệt về mặt thống kê với mức ý nghĩa 5% Multiple Range Tests for chi phi san xuat by mat 10 Đồ án tốt nghiệp Sản lượng virus thu được ở các mật độ ANOVA Table for san luong virus thu duoc by MAT DO Sum of Mean Source Df F-Ratio P-Value Squares Square Between 9.91499E18 2.47875E18 12.86 0.0006 Groups Within 1.93405E18 10 1.93405E17 Groups Total (Corr.) 1.1849E19 14 Có p-value=0,0006< 0,05, suy sản lượng virus thu được có sự khác biệt ở mức ý nghĩa 5% Multiple Range Tests for san luong virus thu duoc by MAT DO Mat Count Mean Homogeneouus Groups 1.66E9 30 2.66667E9 10 3.04667E9 3.09E9 4.19E9 Hiệu suất nhân sinh khối ở các mật độ 15 X X X X X ANOVA Table for HSNSK by MAT DO Sum of Mean Source Df F-Ratio P-Value Squares Square Between 229.019 57.2547 13.96 0.0004 Groups Within 41.0131 10 4.10131 Groups Total (Corr.) 270.032 14 P-value = 0,0004