Khảo sát một số đặc tính của vi khuẩn bacillus n6 1 đối kháng edwardsiella ictaluri gây bệnh

Đã tiến hành 5 đợt thu mẫu với tổng số mẫu là 284 mẫu hệ tiêu hóa, nước và bùn, số khuẩn lạc đã sàng lọc qua AHLs là 592, vi khuẩn lactic là 120 khuẩn lạc, vi khuẩn thuộc nhóm Bacillus l

TP Hồ Chí Minh, 2011

1

CHƯƠNG I: MỞ ĐẦU 1.1 Đặt vấn đề

Nuôi trồng thủy sản là một trong những thế mạnh của Việt Nam Tính đến thời điểm này, kim ngạch xuất khẩu thủy sản của Việt Nam đạt hơn 3 tỷ USD với trên 843.000 tấn thủy sản các loại Bộ Nông nghiệp và Phát triển Nông thôn dự báo, giá trị xuất khẩu thủy sản của Việt Nam đến hết quý IV năm 2010 nhiều khả năng sẽ đạt mức 4,74 tỷ USD, trong đó riêng kim ngạch xuất khẩu cá tra sẽ chiếm ưu thế đạt khoảng 1,38 tỷ USD Sản lượng cá tra ngày càng gia tăng thì luôn đi kèm theo sự phát sinh của dịch bệnh Một trong những bệnh quan trọng trên cá tra nuôi là bệnh gan thận mủ, đã

có một số công trình nghiên cứu về bệnh này Và nguyên nhân gây bệnh được xác định

chủ yếu do vi khuẩn E ictaluri (Crumlish và ctv, 2002) Khi bệnh xảy ra, nông dân

thường lạm dụng kháng sinh và hóa chất diệt khuẩn để phòng bệnh và điều trị cho cá việc này đã tạo ra những chủng vi khuẩn gây bệnh kháng thuốc (Schwarz và ctv., 2001; Akinbowale và ctv., 2006) Để thay thế dần dần phương pháp phòng bệnh truyền thống, phương pháp phòng và trị bệnh bằng liệu pháp sinh học như sử dụng vaccine, các chất kích thích miễn dịch, các peptide kháng khuẩn, prebiotic (hợp chất tiền sinh học), đặc biệt là phương pháp trị liệu sinh học bằng vi sinh vật có lợi (probiotic) ngày càng được ưa chuộng Việc sử dụng vi sinh vật thay thế kháng sinh để chữa bệnh đã trở thành bước tiếp cận đầy hứa hẹn trong nuôi trồng thủy sản

Với ý nghĩa khoa học và tính thực tiễn nêu trên chúng tôi tiến hành “Khảo sát

một số đặc tính của vi khuẩn Bacillus N6.1 đối kháng Edwardsiella ictaluri gây bệnh

gan thận mủ trên cá tra” Đề tài được thực hiện tại Phòng thí nghiệm Vi sinh – Phòng Sinh học thực nghiệm – Viện Nghiên cứu Nuôi Trồng Thủy sản II

1.2 Tình hình nghiên cứu

Trong năm 2010, Viện Nghiên cứu Nuôi Trồng Thủy sản II đã tiến hành phân

lập, tuyển chọn các dòng vi khuẩn có đặc tính đối kháng vi khuẩn Edwardsiella ictaluri

gây bệnh gan thận mủ trên cá tra Nguồn vi sinh vật phân lập từ hệ tiêu hóa, nước, bùn

2

ao nuôi cá tra và nguồn vi sinh từ ngân hàng vi sinh Đã tiến hành 5 đợt thu mẫu với tổng số mẫu là 284 mẫu (hệ tiêu hóa, nước và bùn), số khuẩn lạc đã sàng lọc qua AHLs

là 592, vi khuẩn lactic là 120 khuẩn lạc, vi khuẩn thuộc nhóm Bacillus là 165 khuẩn lạc

Một số nghiên cứu khác về các vi khuẩn probiotic có đặc tính đối kháng với vi khuẩn gây bệnh trong nuôi trồng thủy sản Sàng lọc những vi khuẩn có đặc tính đối kháng vi khuẩn gây bệnh vẫn là cách tiếp cận được sử dụng chủ yếu trong việc phân lập vi khuẩn probiotic Trong quá trình sàng lọc này, đa số các nhà nghiên cứu áp dụng

phương pháp xác định hoạt tính ức chế in vitro (Spangaard và ctv., 2001; Chythanya và

ctv., 2002; Hjelm và ctv., 2004) Hiện nay, có bốn phương pháp thường được sử dụng

để sàng lọc các chủng vi khuẩn tiết ra các hợp chất ức chế in vitro: phương pháp lớp

kép (Dopazo và ctv., 1988), phương pháp đục lỗ trên mặt thạch, phương pháp cấy ria vuông góc, và phương pháp đĩa giấy khuếch tán Tất cả các phương pháp trên đều dựa trên một nguyên tắc là khi một chủng vi khuẩn sản xuất ra một hợp chất ngoại bào có tính chất ức chế một chủng vi khuẩn khác, hoạt tính này sẽ được thể hiện thông qua việc ức chế sự tăng trưởng của vi khuẩn khác trong môi trường agar

1.3 Mục đích nghiên cứu

Làm cơ sở để tạo ra những sản phẩm probiotic phù hợp có đặc tính đối kháng

với vi khuẩn gây bệnh gan thận mủ E ictaluri

1.4 Nội dung nghiên cứu

 Khảo sát khả năng sinh enzyme ngoại bào

 Khảo sát ảnh hưởng của pH, nhiệt độ, NaCl lên tăng trưởng và khả năng đối

kháng với E.ictaluri của Bacillus N6.1

 Khảo sát khả năng chịu pH thấp và muối mật

 Khả năng phân huỷ phân tử tín hiệu N-Hexanoyl hemoserine lactone

 Khảo sát bản chất đối kháng của Bacillus N6.1 lên sự phát triển của E ictaluri

bằng phương pháp nuôi chung (co-culture)

3

CHƯƠNG II: TỒNG QUAN 2.1 Tình hình nuôi cá tra ở Đồng Bằng Sông Cửu Long

Trong các năm gần đây, nghề nuôi thủy sản trong nước đã phát triển nhanh và

có nhiều nổi bật Hiện nay ở Đồng bằng sông Cửu Long, mặc dù diện tích nuôi cá tra không lớn (năm 2009 là 5540 ha) nhưng sản lượng hàng năm cho trên 1.000.000 tấn

Năm 2010, tình hình sản xuất, tiêu thụ cá tra ở vùng ĐBSCL có nhiều biến động Đến hết tháng 11/2010, tổng sản lượng sản xuất cá tra toàn vùng đạt gần 2,4 tỉ con cá giống, diện tích thả nuôi 5.420 ha, đạt 90,3% kế hoạch năm; nhờ nâng cao năng suất (trung bình đạt 261,2 tấn/ha/vụ) nên sản lượng cá thu hoạch 1.141.000 tấn, đạt 95,1%/năm Sản lượng cá xuất khẩu đạt 600.000 tấn, kim ngạch xuất khẩu đạt 1,3

tỉ USD, giảm 2,8% về lượng, 7,8% về kim ngạch xuất khẩu so cùng kỳ năm 2009 Dự kiến cả năm xuất khẩu đạt 645.000 tấn, kim ngạch xuất khẩu đạt 1,4 tỉ USD

Đi sâu vào hình thức và mô hình nuôi, nghề nuôi cá tra có sự chuyển đổi từ mô hình nước chảy trong lồng bè, đăng quần trên sông vùng thượng nguồn sông Tiền và sông Hậu sang mô hình nuôi ao dọc cồn bãi ven sông và càng dịch chuyển về phía hạ lưu với chất lượng cá tốt hơn Tuy nhiên, tình hình sản xuất và tiêu thụ cá tra đang thể hiện sự thiếu bền vững, trong đó có nhiều nguyên nhân chủ yếu là:

 Việc phát triển cá tra quá nhanh trong những năm vừa qua, đôi khi vượt quá quy hoạch của ngành, vượt ngoài sự quản lý của nhà nước dẫn đến các sự cạnh tranh không lành mạnh nhất là việc tiêu thụ sản phẩm trên thị trường quốc tế

 Sự không ổn định về mặt cung cầu do thiếu cơ chế liên kết phối hợp giữa các chuổi trong hệ thống đã dẫn đến các hệ lụy về biến động giá cả trên thị trường, chất lượng sản phẩm, ô nhiễm môi trường, sự phá sản của người nuôi

 Với số lượng lên đến trên 3 tỉ con giống hàng năm nhưng việc quản lý đàn cá bố

mẹ của các trại sản xuất trong thời gian dài vừa qua chưa thật sự được quan tâm về mặt quản lý và hổ trợ về mặt kỹ thuật Hệ quả dẫn đến chất lượng con giống cá tra đang có

ra các bệnh nội và ngoại ký sinh cũng là tác nhân gây tổn thất cho ao nuôi

 Vấn đề ảnh hưởng đến môi trường nuôi cũng như chất lượng môi trường nước cấp cho ao nuôi cũng là một thách thức đối với sự ổn định và bền vững trong nghề nuôi

cá tra Việc giải quyết chất thải và nước thải từ ao nuôi cá tra là thách thức lớn, đỏi hỏi phải có những giải pháp công nghệ và kỹ thuật để đảm bảo sự bền vững về môi trường

 Vần đề thị trường tiêu thụ cá tra, tương tự với sản phẩm tôm nuôi, chất lượng sản phẩm chế biến đạt tiêu chuẩn an toàn vệ sinh thực phẩm và đáp ứng yêu cầu truy xuất nguồn gốc của nhà nhập khẩu cũng được đặt ra đối với việc sản xuất, chế biến, bảo quản và xuất khẩu sản phẩm cá tra.(Oanh Lê - Nguồn viện nghiên cứu nuôi trồng thủy sản II)

Hình 2.1: Thu hoạch cá tra ở ĐBSCL

Edwardsiella thường gặp hai loài gây bệnh là: E.tarda và E.ictaluri E.tarda là

tác nhân gây bệnh nhiễm khuẩn ở cá nước ấm, đặc biệt là cá da trơn E ictaluri gây

bệnh nhiễm khuẩn trong các cơ quan nội tạng gan, thận, tụy của cá không vảy, gây bệnh nhiễm trùng đường ruột trên cá da trơn ở Mỹ, là tác nhân gây bệnh gan thận mủ

trên cá tra ở Việt Nam Edwardsiella thường gây bệnh ở động vật máu lạnh: rắn, cá sấu, cá… và một số động vật thủy sản khác Ở Việt Nam đã phân lập được E.tarda từ

cá trê giống; E.ictaluri từ cá tra, cá basa… Bệnh gây thiệt hại trong các ao nuôi cá

hương (cỡ từ 4-6cm) đến 5-6 tháng tuổi, ít xuất hiện hơn ở cá có kích cỡ trên 15cm, tỷ

lệ tử vong của cá từ 60-70%, có trường hợp tới 100% Bệnh xuất hiện nhiều nhất vào mùa xuân, mùa thu và trong ao nuôi mật độ cao, nuôi cá lồng bè

Hình 2.2: Vi khuẩn E.ictaluri (hình A) và cá tra bị bệnh do nhiễm

Edwardsiella (hình B)

A B

6

2.2.1.2 Đặc điểm sinh hóa

Theo Hawke và ctv (1981) Edwardsiella ictaluri, là loài thuộc

Enterobacteriacea, Gram âm, hình que, ngắn, kích thước 0.75x1.5-2.5μm Di động yếu

ở 25-300C, không di động khi nhiệt độ cao hơn, catalase dương tính, cytochrome oxidase âm tính và lên men glucose (Shott, 1989) Không sinh ra H2S và Indole âm

tính Vi khuẩn Edwardsiella ictaluri phát triển chậm trên môi trường BHI (36-48 giờ

tại 28-300C)

Ở Việt Nam, vi khuẩn Edwardsiella ictaluri gây bệnh chủ yếu trên cá tra (ở tất

cả các giai đoạn phát triển) Tỷ lệ hao hụt lớn trên cá tra giống, nhưng gây thiệt hại về kinh tế lớn nhất ở giai đoạn cá tra thịt cỡ 300-500g ( Thanh Dung và ctv., 2004) Theo

Ferguson và ctv (2001), bệnh này được ghi nhận xuất hiện ở ĐBSCL vào cuối năm

1998 và có tên là BNP (Bacilliaty Necrosis of Pangaius)

Vi khuẩn Edwardsiella ictaluri đã được phân lập trên cá tra nuôi bè ở Việt Nam,

với dấu hiệu có nhiều nốt trắng trên gan (Thanh Dung và ctv., 2005)

2.2.2 Bệnh gan thận mủ trên cá tra

2.2.2.1 Lịch sử phát hiện

Bệnh gan thận mủ trên cá tra xuất hiện lần đầu tiên vào cuối năm 1998, tác nhân gây bệnh lúc đầu được xác định bởi nhóm nghiên cứu của trường Đại học Stirling phối

hợp với trường Đại học Cần Thơ là Bacillus sp (Ferguson và ctv., 2001) Đến năm

2002 nhóm nghiên cứu này đã đính chính lại tác nhân gây bệnh gan thận mủ trên cá tra

là vi khuẩn Edwardsiella ictaluri (Crumlish và ctv., 2002) E ictaluri được báo cáo đầu tiên trên cá nheo Mỹ, Ictalurus punctatus (Hawke, 1979) E ictaluri gây bệnh

nhiễm khuẩn đường ruột cấp tính trên cá da trơn, hội chứng này được gọi tắt là ESC (Enteric Septicaemia of Catfish) và có thể dẫn đến tỉ lệ chết cao ở cá nheo Mỹ (Austin

và Austin, 1999)

Bệnh này được tìm thấy tại bất cứ nơi nào nuôi cá nheo tại nước Mỹ Bệnh xảy

ra ở tất cả các kích cỡ cá nuôi nhưng tập trung ở giai đoạn cá hương và cá giống

7

(USDA/APHIS, 2003) Bệnh xảy ra theo mùa, đặc biệt xảy ra thường xuyên khi nhiệt

độ nước nằm trong khoảng 20 – 29oC (Tucker và ctv., 2004) Cá bị bệnh ESC thường giảm ăn, lờ đờ, bơi dạng xoay vòng, xuất huyết xung quanh vùng miệng và phần bụng Nhiều vết lở loét nhỏ màu trắng có thể xuất hiện trên bề mặt da Cá nhiễm bệnh thường lồi mắt và bụng trương to

Bệnh do ký sinh trùng:

Cryptobia spp., Ichthyophthyrius multifiliis, Trichodina, Epistylis

3-Có thể xuất hiện những vết thương bên dưới biểu bì, cơ, khi ấn vào sẽ phát ra khí có mùi hôi Các vết thương này sẽ gây hoại tử vùng cơ xung quanh Bệnh xuất hiện khi

8

chất lượng nước trong môi trường nuôi xấu, nuôi với mật độ dày Nhiệt độ thích hợp để phát triển khoảng 300C

2.2.2.3 Một số nghiên cứu về biện pháp phòng bệnh gan thận mủ

Có khá nhiều nghiên cứu trên thế giới trong lĩnh vực sản xuất vaccine phòng

bệnh do E ictaluri gây ra trên cá da trơn Shoemaker và ctv (1999) nghiên cứu ảnh

hưởng của ba loại vaccine sống cải tiến dưới dạng đông khô (Immuno X+5, Immuno2 X+5, Serial 1A) và một loại vaccine sống truyền thống (RE-33) Cá nheo Mỹ

(Ictalurus punctatus) được gây miễn dịch bằng phương pháp ngâm ở các ngày tuổi

khác nhau (từ 7 ngày tuổi đến 31 ngày tuổi) Kết quả cho thấy hiệu lực của vaccine đã thể hiện được ngay từ khi cá được gây miễn dịch ở giai đoạn 7 ngày tuổi và 10 ngày tuổi Tỉ lệ sống của cá 7 ngày tuổi được gây miễn dịch dao động trong khoảng 58,4 – 77,5%, đối với cá 10 ngày tuổi thì dao động trong khoảng 64,1 – 78,9% Ba năm sau

đó, nhóm tác giả này cũng đã nghiên cứu phương pháp in vivo đối với việc sử dụng các

loại vaccine sống cải tiến này, khi gây miễn dịch từ giai đoạn trứng của cá nheo Mỹ, bằng phương pháp ngâm trong thời gian 10 phút Kết quả cho thấy phương pháp gây miễn dịch này là khá hiệu quả, với tỉ lệ bảo hộ khoảng 59,7% (Shoemaker và ctv., 2002)

Trong những năm gần đây, một số nhóm nghiên cứu đã quan tâm đến việc phát triển các chế phẩm vi sinh (probiotic) và một số chế phẩm sinh học khác bổ sung vào

thức ăn để phòng bệnh E ictaluri ở cá nheo Mỹ (Ictalurus punctatus)

Shelby và ctv (2007) bổ sung hai loại chế phẩm vi sinh có chứa Pediococcus

sp và Enterococcus sp (riêng lẻ hoặc phối hợp với nhau) vào thức ăn của cá nheo Mỹ (Ictalurus punctatus) giống và cho ăn trong vòng 5-8 tuần Sau đó tiến hành đo các chỉ

tiêu: tăng trọng, hệ số chuyển đổi thức ăn (FCR) và các thông số miễn dịch như protein huyết thanh, immunoglobulin, lysozyme, complement Các số liệu về vi sinh cho thấy hai chủng vi khuẩn probiotic vẫn tồn tại được trong thức ăn sau khi bổ sung trong thời gian bảo quản khoảng 4 tuần Tuy nhiên các tác giả không tìm thấy sự khác biệt nào về

Edwardsiella ictaluri Kết quả nghiên cứu cho thấy, ở nghiệm thức có bổ sung

Lymnozyme vào nước hàng ngày liên tục trong hai tuần, tỉ lệ chết của cá sau khi gây

nhiễm Edwardsiella ictaluri (45%) giảm một cách có ý nghĩa thống kê (p = 0,002) so

với nghiệm thức đối chứng (80%)

Các nhà khoa học Nauy và Mỹ đã nghiên cứu hiệu quả kháng khuẩn của hai lọai peptide tổng hợp cecropin B và cecropin P1 đối với một số chủng vi khuẩn gây bệnh

trên cá, trong đó có E ictaluri (Kjuul và ctv., 1999) Nồng độ ức chế tối thiểu (MIC)

của cecropin B dao động từ 0,3-1,3 µm Các dẫn xuất của cecropin B đã được biết đến

có họat tính kháng khuẩn đối với nhiều loài vi khuẩn gây bệnh, và có khả năng tăng

cường tính đề kháng của cá nheo Mỹ gây cảm nhiễm với E ictaluri (Kelly và ctv.,

1993)

Prebiotic là những hợp chất bổ sung vào thức ăn, có tác dụng kích thích sinh trưởng và hoạt tính của hệ vi khuẩn có lợi hiện diện trong hệ tiêu hóa của vật chủ (Delzenne & Roberfroid, 1994) Prebiotic thường được sử dụng kết hợp với probiotic (gọi là synbiotic) Các hợp chất đường mạch ngắn đang được sử dụng phổ biến như là prebiotic bổ sung vào thức ăn thủy sản, trong số đó bao gồm: Inulin, fructose-oligosaccharide, transgalacto-oligosaccharide, lactulose (Mahious, 2005), isomalto-oligosaccharide (Li và ctv., 2009) Hiệu quả về dinh dưỡng và sức khỏe của một số oligosaccharide đã được chứng minh trên cá (Glencross và ctv., 2003; Li & Gatlin, 2005; Pryor và ctv., 2003) Isomalto-oligosaccharide ở nồng độ 0,2% sử dụng kết hợp

với vi khuẩn probiotic Bacillus OJ (108 cfu/g thức ăn) bổ sung vào thức ăn cho tôm thẻ

chân trắng (Penaeus vannamei) đã giúp điều chỉnh hệ vi sinh vật đường ruột, tăng

cường phản ứng miễn dịch và khả năng đề kháng đối với virus đốm trắng, thông qua

10

hiệu ứng tương hỗ của hai loại chế phẩm này (Li và ctv., 2009)

Mannan-oligosaccharide (MOS), một loại prebiotic chiết xuất từ nấm men, đã được chứng minh là có hiệu quả tăng cường đáp ứng miễn dịch và tính đối kháng đối

với vi khuẩn Edwardsiella ictaluri trên cá nheo Mỹ Ictalurus punctatus (Welker và

Vào năm 1965, Lilly và Still đã định nghĩa probiotic là những nhân tố thúc đẩy

sự phát triển được sản xuất bởi vi sinh vật Vào năm 1974, Parker đã định nghĩa probiotic dựa trên mối quan hệ giữa vi sinh với vật chủ “probiotic là những sinh vật và những cơ chất có lợi cho động vật có khả năng cải thiện hệ vi sinh đường ruột” Đến năm 1989, Fuller đã mở rộng định nghĩa về probiotic: “probiotic là sinh vật sống được cung cấp dưới dạng thức ăn cho động vật nhằm cải thiện cân bằng hệ sinh vật đường ruột” Havenaar và Huis Int Veld (1992) định nghĩa “probiotic là một chủng hay một hỗn hợp vi sinh vật sống, cung cấp cho người hoặc động vật, có lợi cho vật chủ bằng cách cải thiện đặc tính hệ vi sinh vật bản địa” Gatesoup (1999) định nghĩa “probiotic

là những sinh vật sống cung cấp dưới dạng thức ăn nhằm cải thiện sức khỏe cho vật chủ”

FAO/WHO (2002), Reid và cộng sự (2003) lại định nghĩa “probiotic là những vi sinh vật sống được kiểm soát chặt chẽ, với lượng thích hợp mang lại lợi ích cho vật chủ”

Vào năm 2003, Jean Fioramonti và cộng sự đã định nghĩa probiotic một cách ngắn gọn nhưng đầy xúc tích: “probiotic được định nghĩa là những vi sinh vật ảnh hưởng có lợi lên sức khỏe và tốt cho vật chủ”

11

Trước đây, probiotic thường được ứng dụng cho con người và động vật trên cạn,

vì vậy thuật ngữ probiotic thường được ngụ ý là những vi khuẩn gram dương chủ yếu

là Lactobacillus và dần dần các sinh vật được áp dụng làm probiotic ngày càng nhiều

gồm cả vi khuẩn gram âm, gram dương, bacteriophage, nấm men và tảo đơn bào, phạm

vi sử dụng rộng hơn, ngoài con người và động vật trên cạn, probiotic ngày nay được ứng dụng trên cả đối tượng động vật thủy sản

Khác với người và động vật trên cạn, động vật thủy sản được bao bọc bởi môi trường nước và ở đó các tác nhân gây bệnh tồn tại một cách độc lập với vật chủ Những

vi sinh vật gây bệnh được hấp thụ liên tục bởi vật chủ thông qua quá trình tiêu thụ thức

ăn, động vật thủy sản tiêu hóa một lượng lớn vi khuẩn từ môi trường nước, kết quả của mối tương tác tự nhiên giữa khu hệ vi sinh trong môi trường và đối tượng thủy sản Trong nuôi trồng thủy sản mối tương tác giữa probiotic và vật chủ không chỉ giới hạn trong đường ruột của vật chủ, probiotic còn có thể hoạt động trên mang, da và cả môi trường nước xung quanh vật chủ Do vậy, Verschuere và cộng sự (2000) đã đề xuất một định nghĩa mới cho phép mở rộng ứng dụng của thuật ngữ probiotic trong nuôi trồng thủy sản “probiotic là hỗn hợp vi sinh vật sống được thêm vào có lợi cho vật chủ bằng cách thay đổi các nhân tố liên quan đến vật chủ hoặc quần xã vi sinh vật xung quanh, cải thiện khả năng sử dụng thức ăn hoặc giá trị dinh dưỡng, tăng cường chống chịu bệnh, cải thiện chất lượng môi trường sống của vật chủ”

2.3.2 Đặc điểm chung của probiotic

 Có khả năng sống sót trong môi trường acid dạ dày, tồn tại tạm thời hoặc hình thành khuẩn lạc trong ruột non

 Không gây hại cho vật chủ

 Probiotic phải tới đúng vị trí cần tác động trong cơ thể vật chủ

 Biểu hiện có lợi đối với vật chủ (cạnh tranh đối kháng với các sinh vật gây bệnh, sinh các enzyme hoặc các chế phẩm cuối cùng mà vật chủ có thể sử dụng được)

12

 Không chứa gen gây độc hoặc gen kháng kháng sinh

2.3.3 Các cơ chế tác động của probiotic

Gia tăng khả năng bám hoặc đối kháng trực tiếp, những ảnh hưởng có hại của tác nhân gây bệnh là những yếu tố quan trọng của probiotic để làm giảm tính gây độc trong suốt quá trình nhiễm bệnh Các chủng probiotic phải có đặc tính kháng lại vi khuẩn gây bệnh ở điều kiện in vitro lẫn in vivo thông qua một số cơ chế khác nhau Đa

số các nghiên cứu về probiotic đã được công bố trong thập niên qua, trong đó có nhiều nghiên cứu giải thích cơ chế tác động của probiotic Nhìn chung, probiotic có các cơ chế tác động sau:

2.3.3.1 Sản sinh ra các hợp chất ức chế

Kháng khuẩn là một hiện tượng phổ biến trong tự nhiên Vì vậy, sự tương tác giữa các vi sinh vật đóng vai trò quan trọng đảm bảo trạng thái cân bằng giữa vi sinh vật hữu ích và những vi sinh vật gây bệnh

Những loài vi khuẩn khác nhau có thể giải phóng ra một số hợp chất hóa học có khả năng tiêu diệt hoặc kiềm hãm các vi khuẩn khác để đấu tranh giành lấy năng lượng hay các chất hóa học (Fredrickson và Stephanopoulos, 1981) Những hợp chất này bao gồm: bacteriocin, siderphore, lysozyme, protease, hydrogen peroxide và các acid hữu

cơ Vi khuẩn sinh acid lactic tạo hợp chất bacteriocin giúp ức chế các vi khuẩn khác

Có rất nhiều nghiên cứu in vitro đã chứng minh khả năng ức chế vi khuẩn gây bệnh của

một số chủng vi khuẩn được chọn lựa bổ sung vào môi trường ương nuôi ấu trùng

Gaixa (1889) đã có báo cáo đầu tiên về sự tồn tại của vi khuẩn trong nước biển

có khả năng ức chế Vibrio sp Sau đó, Rosenfeld và Zobell (1947) mô tả một nghiên

cứu sản sinh chất ức chế vi sinh vật biển và kể từ đó nhiều nghiên cứu tiếp theo, theo hướng sử dụng vi sinh vật như một tác nhân kiểm soát sinh học Nogami và Maeda

(1992), Nogami và ctv (1997) đã chứng minh vi khuẩn Thalasobacter utilis ức chế vi khuẩn Vibrio anguillarum, do đó làm gia tăng khả năng sống sót của ấu trùng cua xanh

Portunus trituberculatus, đồng thời cũng làm giảm số lượng Vibrio trong nước ương ấu

13

trùng Các nghiên cứu tiếp theo cho thấy chủng này ngăn chặn sự phát triển của vi

khuẩn V angillarum trên cá bơn trưởng thành Scophthalmus maximus và Limanda

limanda Sử dụng V alginolyticus như một probiotic đã được đề cập để tăng cường khả

năng sống sót và phát triển của ấu trùng tôm chân trắng Litopenaeus vannamei ở các trại nuôi ở Ecuador Gần đây một chủng vi khuẩn nước mặn, Pseudomonas I2 được phân lập từ cửa sông, có khả năng sinh hợp chất ức chế lại Vibrio gây bệnh trên tôm

Hợp chất kháng khuẩn này được chứng minh có khối lượng phân tử thấp, bền nhiệt, tan trong chloroform, và kháng được sự thủy giải của các ezyme (Chythanya và cộng sự, 2002)

2.3.3.2 Cạnh tranh chất dinh dưỡng hay năng lượng sẵn có

Đấu tranh giành lấy các chất dinh dưỡng hay năng lượng có sẵn có thể đóng một vai trò quan trọng trong việc hình thành hệ vi sinh vật đường ruột hay trong môi trường

nuôi thủy sản

Minh chứng điển hình cho tác động này là những vi khuẩn có khả năng sinh siderophore Tất cả vi khuẩn đều cần sắt để tăng trưởng, siderophore là chất có trọng lượng phân tử thấp, có khả năng gắn với ion sắt Siderophore có thể hòa tan sắt kết tủa thành dạng dễ sử dụng, do đó nó là một công cụ thu lượm sắt hiệu quả

Các chủng vi khuẩn vô hại có thể sản xuất siderophore được sử dụng như probiotic để cạnh tranh với các vi khuẩn gây bệnh khi tính gây bệnh có liên quan đến việc sản xuất siderophore và đấu tranh giành lấy phân tử sắt trong môi trường thiếu sắt

năng đề kháng đối với vi khuẩn gây bệnh Vibrio P, Vibrio splendidus ở ấu trùng cá bơn Nghiên cứu in vitro cho thấy rằng, Vibrio E có thể phát triển trong môi trường đã

bị tách hết sắt trong khi Vibrio P thì không Hơn nữa, cá bơn bột được cho ăn rotifer được làm giàu chất siderophore deferoxamine của Vibrio E đã đạt được tỉ lệ sống cao hơn sau khi gây nhiễm với Vibrio P, so với lô đối chứng (Gatesoupe, 1997) Từ những kết quả có liên quan trong các thí nghiệm in vitro và in vivo, các nhà khoa học đã kết

14

luận rằng hiệu quả probiotic của Vibrio E có thể một phần là do sự đấu tranh giành lấy

phân tử sắt với tác nhân gây bệnh

2.3.3.3 Cạnh tranh vị trí bám dính với vi khuẩn có hại

Khả năng hình thành khuẩn lạc và khả năng bám dính của probiotic trong biểu

mô ruột và trong lớp nhầy đường ruột vật chủ là cơ chế bảo vệ vật chủ chống lại tác nhân gây bệnh thông qua cạnh tranh các thụ quan bám dính, dinh dưỡng và không gian, oxy và sự sản sinh các cơ chất kháng khuẩn Một số cơ chế liên quan đến sự bám dính của vi sinh vật lên tế bào biểu mô ruột bao gồm: Liên kết hydro, tương tác tĩnh điện, vị trí gắn dựa trên các cấu trúc chuyên biệt Những đặc tính này là một thế mạnh cạnh tranh quan trọng giúp duy trì vi khuẩn trong đường ruột động vật

Các yếu tố ảnh hưởng tới sự hình thành khuẩn lạc của vi sinh vật có thể phụ thuộc vào:

 Mối quan hệ với vật chủ như: nhiệt độ cơ thể, enzyme, đặc tính do kháng di truyền Ví dụ, vi khuẩn có thể theo nguồn nước và thực phẩm đến miệng và đóng góp vào quá trình dinh dưỡng, ở đó một số chủng được giữ lại trở thành quần cư của vi khuẩn đường ruột Những chủng còn lại bị tiêu diệt thông qua quá trình tiêu hoá và bị loại thải thông qua quá trình bài tiết Ngoài ra, sự sinh trưởng của vi khuẩn trong đường ruột còn có thể bị ức chế do hợp chất kháng khuẩn tiết ra từ vật chủ

 Các yếu tố có mối quan hệ với vi sinh vật như: ảnh hưởng của các hợp chất kháng khuẩn, protease, bacteriocin, hydrogen peroxide, sự hình thành NH3, diacetyl, và

sự biến đổi pH do sản sinh các acid hữu cơ

 Các nghiên cứu gần đây đã chứng minh chủng Lactobacillus plantarum có khả

năng bám dính và hình thành màng nhầy bên trong đường ruột, chủng này sử dụng vị trí gắn chuyên biệt là manose để cạnh tranh vị trí gắn với các chủng gram âm gây bệnh trên lớp nhầy đường ruột của cá

Ngoài ra, sự hình thành khuẩn lạc và khả năng bám dính của probiotic đóng vai trò quan trọng trong điều hòa và kích thích hệ thống miễn dịch của tế bào chủ

15

2.3.3.4 Đóng góp về mặt dinh dưỡng và enzyme tiêu hóa

Một số nghiên cứu chỉ ra rằng vi sinh vật ảnh hưởng có lợi cho quá trình tiêu hóa của động vật thủy sản: khử độc các hợp chất độc hại trong thức ăn, phân hủy các hợp chất khó tiêu như chitin, cellulose…trong thức ăn nhờ các enzyme thủy giải (cellulase, amylase…) Ngoài ra probiotic còn cung cấp vitamin (biotin và vitamin

B12), carotenoid, protein, acid béo chuỗi ngắn và chuỗi acid béo không bão hòa (PUFAs-polyunsaturated fatty acids) như eicosapentaenoic acid (EPA) và docosahexaenoic acid (DHA) cần thiết cho sự sinh trưởng của cá

Ở mức độ in vivo, có nhiều báo cáo cho rằng khi cho cá ăn probiotic ở nồng độ

từ 103-1012 cfu/g trong thời gian từ 30-90 ngày có thể gia tăng tỷ lệ sống sót, tăng trọng, giảm hệ số chuyển đổi thức ăn

Ở cá, có báo cáo cho rằng Bacteroides và Clostridium đã đóng góp về mặt dinh dưỡng cho vật chủ đặc biệt là cung cấp acid béo và vitamin Một số vi sinh vật như

Agrobacterium sp., Pseudomonas sp., Brevibacterium sp., Microbacterium sp., và Staphylococcus sp có thể đóng góp vào quá trình tiêu hóa ở cá hồi chấm hồng Bắc cực

(Salvelinus alpinus L.) Một số chủng Bacillus (Bacillus licheniformis, B subtilis, B

polymixa, B laterosporus và B circulans) thúc đẩy tăng trưởng của ấu trùng cá tầm Acipenser nudiventris: tăng chiều dài và khối lượng, tăng hệ số chuyển đổi thức ăn,

tăng hệ số tăng trưởng đặc hiệu (Specific Growth Rate) Ngoài ra một số vi khuẩn còn tham gia vào quá trình tiêu hóa của những loài nhuyễn thể hai mảnh vỏ bằng cách sản sinh các enzyme ngoại bào như protease, lipase, đồng thời cung cấp các nhân tố dinh dưỡng cần thiết Những nghiên cứu tương tự cho thấy hệ vi sinh vật khu trú ở tôm

Penaeus chinensis bổ sung nguồn enzyme tiêu hóa và các hợp chất đồng hóa tương tự

như ở động vật

2.3.3.5 Cải thiện chất lượng nước

Chất lượng nước đã được cải thiện nhờ bổ sung các chủng probiotic đặc biệt là

các chủng Bacillus sp Các chủng Gram dương chuyển đổi các hợp chất hữu cơ thành

16

CO2 tốt hơn các chủng gram âm Có báo cáo cho rằng việc sử dụng các chủng Bacillus

sp cải thiện chất lượng nước, tăng khả năng sống và tăng tốc độ phát triển của Penaeus monodon và làm giảm tác nhân gây bệnh Vibrio

Việc xử lý nước nuôi thủy sản bằng probiotic đã cho thấy tác dụng giảm được chất hữu cơ trong nước ao nuôi thủy sản, giảm hàm lượng BOD và giảm độc tố do amoni, nitrite và hydro sulfua, khống chế được vi khuẩn gây bệnh, tăng năng suất tôm

cá

2.3.3.6 Tăng cường đáp ứng miễn dịch

Hệ thống miễn dịch không đặc hiệu có thể được kích thích bởi probiotic, quá trình hình thành khuẩn lạc và sự bám dính của probiotic trong ruột cá là điều kiện cần thiết để tăng cường đáp ứng miễn dịch thông qua liên kết giữa các kiểu phân tử liên quan đến vi khuẩn- BAMPs (bacteria associated molecular patterns) có tính bảo tồn cao và các thụ thể chyên biệt trên bề mặt của tế bào biểu mô ruột

Một số nghiên cứu đã chứng minh Clostridium butyricum giúp gia tăng khả năng kháng Vibrio của cá hồi và gia tăng hoạt tính thực bào của bạch cầu Rengpipat

và ctv (2000) cho rằng sử dụng Bacillus sp (chủng S11) đã bảo vệ tôm sú Penaeus

monodon khỏi tác nhân gây bệnh bằng cách hoạt hóa hệ thống miễn dịch dịch thể ở

tôm Balca´zar (2003) chứng minh sử dụng hỗn hợp vi khuẩn Bacillus sp và Vibrio sp

ảnh hưởng tốt tới sự phát triển và khả năng sống sót của ấu trùng tôm thẻ chân trắng

đồng thời bảo vệ chống lại Vibrio harveyi và virus gây hội chứng đốm trắng Sự bảo vệ

này xuất phát từ sự kích thích hệ thống miễn dịch bằng việc gia tăng thực bào và hoạt động kháng khuẩn Ngoài ra, nhiều tác giả chứng minh sử dụng vi khuẩn lactic

Lactobacillus rhamnosus (chủng ATCC 53103) ở hàm lượng 105 cfu/g, Lactococcus

lactis, Leuconostoc mesenteroides, L sakei kích thích miễn dịch ở cá hồi Oncorhynchus mykiss bằng cách thúc đẩy hoạt tính thực bào, sản sinh superoxide,

lyzozyme, tăng cường hoạt tính bổ trợ (ACH50)

17

2.3.3.7 Tác động kháng virus

Một số vi khuẩn được sử dụng như probiotic có tác dụng kháng virus, mặc dù

cơ chế này vẫn chưa được hiểu chính xác Việc kiểm tra trong phòng thí nghiệm chỉ ra

có sự bất hoạt virus nhờ các hợp chất hóa học và hợp chất sinh học như là dịch chiết từ tảo biển và dịch chiết ngoại bào từ vi khuẩn

Kamei và ctv (1988) báo cáo cho rằng các chủng Pseudomonas sp, Vibrios sp,

Aeromonas sp và nhóm Coryneform phân lập từ các trại ấp trứng cá hồi có hoạt tính

kháng virus IHHNV (infectious hypodermal and hematopoietic necrosis virus)

Direkbusarakom và ctv (1998) phân lập được hai chủng Vibrio sp là NICA

1030 và NICA 1031 có hoạt tính kháng IHHNV và Oncorhynchus masou virus (OMV)

với tỷ lệ giảm hai virus trên lần lượt từ 62% và 99%

2.3.4 Vai trò của probiotic trong nuôi trồng thủy sản

Khi đưa probiotic vào môi trường nước ao, các vi sinh vật sẽ sinh sôi và phát triển rất nhanh trong môi trường nước Sự hoạt động của các vi sinh vật có lợi sẽ có các tác dụng sau đây trong các ao hồ nuôi thủy sản:

 Phân hủy các chất hữu cơ trong nước, hấp thu xác tảo chết và làm giảm sự gia tăng của lớp bùn đáy

 Giảm các độc tố trong môi trường nước (do các chất khí: NH3, H2S… phát sinh), do đó sẽ làm giảm mùi hôi trong nước

 Giúp ổn định độ pH của nước, ổn định màu nước do probiotic hấp thu chất dinh dưỡng hòa tan trong nước nên hạn chế tảo phát triển nhiều, do đó sẽ giảm chi phí thay nước

 Nâng cao khả năng miễn dịch của tôm cá (kích thích hệ miễn dịch không đặc hiệu ở tôm, cá)

 Ức chế sự hoạt động và phát triển của vi sinh vật có hại (do các loài vi sinh vật có lợi sẽ cạnh tranh thức ăn và tranh giành vị trí bám với vi sinh vật có hại) Trong

Vì vậy, sử dụng probiotic sẽ có ý nghĩa nhiều mặt trong việc nâng cao hiệu quả kinh tế cho các mô hình nuôi thủy sản như:

 Làm tăng hiệu quả sử dụng thức ăn (giảm hệ số thức ăn)

 Tôm cá mau lớn, rút ngắn thời gian nuôi

 Tăng tỷ lệ sống và tăng năng suất do tôm cá nuôi ít bị hao hụt

 Giảm chi phí thay nước

 Giảm chi phí sử dụng kháng sinh và hóa chất trong điều trị bệnh

2.3.5 Giới thiệu về quorum sensing và khả năng bẻ gãy hệ thống quorum sensing

ở vi khuẩn gây bệnh trong nuôi trồng thủy sản

2.3.5.1 Định nghĩa quorum sensing

Vi khuẩn có thể giao tiếp với nhau bằng cách sử dụng các phân tử tín hiệu hóa học Chúng tiết ra, tiếp nhận và phản ứng với sự tích lũy của những phân tử tín hiệu này Việc phát hiện các phân tử tín hiệu trong môi trường cho phép vi khuẩn phân biệt giữa các quần thể vi khuẩn mật độ thấp và mật độ cao, và kiểm sóat việc biểu thị gen đối với sự thay đổi về mật độ tế bào Quá trình này được gọi là quorum sensing Nhiều kiểu hình ở vi khuẩn được điều khiển bởi quorum sensing, bao gồm độc lực, sự sản xuất kháng sinh, sự tạo thành màng sinh học …

Trong thế giới vi sinh vật tồn tại cả hai lọai ngôn ngữ quorum sensing, ngôn ngữ phổ biến và ngôn ngữ đặc hiệu, cho phép vi khuẩn giao tiếp trong cùng một loài và giữa các loài Quá trình quorum sensing ở vi khuẩn Gram âm được điều khiển bởi phân

tử tín hiệu N-acyl homoserine lactone (AHL) Ở vi khuẩn Gram dương, quá trình

ở trên 25 loài vi khuẩn Gram âm Trong mọi trường hợp, AHL là một loại phân tử tín hiệu mà việc tổng hợp phụ thuộc vào protein I Một protein khác (protein R) chịu trách nhiệm việc nhận biết phân tử tín hiệu AHL và sau đó là quá trình hoạt hóa việc phiên

mã của một số gen đích Phân tử tín hiệu AHL đã được chứng minh là có liên quan đến quá trình quorum sensing ở nhiều tác nhân gây bệnh ở người và thực vật như

Pseudomonas aeruginosa (Rumbaugh và ctv., 2000), Erwinia carotovora, Agrobacterium tumefaciens (Whitehead và ctv., 2001), cũng như ở Vibrio harveyi

(Manefield và ctv., 2000) và những loài vi khuẩn gây bệnh khác trong nuôi trồng thủy sản (Bruhn và ctv., 2005)

2.3.5.2 Hệ thống quorum sensing của vi khuẩn Edwardsiella spp

Hệ thống quorum sensing gần đây cũng được phát hiện ở nhóm vi khuẩn gây

bệnh quan trọng trên cá (Edwardsiella spp.) Han và ctv (2010) xác định có bốn loại

phân tử tín hiệu AHL (BHL, HHL, 3-oxo-HHL và một phân tử AHL chưa xác định

được) liên quan đến độc lực của Edwardsiella tarda, tác nhân gây bệnh trên các loài cá

nước ngọt và nước mặn như lươn, cá nheo Mỹ, cá đối, cá tráp, cá rô phi, ca bơn Gần đây, nhóm nghiên cứu trên lại xác định bốn loại phân tử tín hiệu AHL nói trên cũng tồn

tại ở Edwardsiella ictaluri, vi khuẩn gây bệnh nhiễm khuẩn đường ruột cấp tính trên cá nheo Mỹ (Ictalurus punctatus) và bệnh gan thận mủ trên cá tra (Pangasianodon

hypophthalmus) nuôi ở Việt Nam

20

2.3.5.3 Bẻ gãy hệ thống quorum sensing ở vi khuẩn gây bệnh

Hình 2.4: Một số phương pháp bẻ gãy quá trình quorum sensing ở vi khuẩn

Có hai chiến lược chủ yếu trong việc kiểm soát bệnh nhiễm khuẩn, hoặc giết chết vi khuẩn gây bệnh, hoặc làm suy giảm độc lực của nó để sau đó mầm bệnh không thể thích nghi với môi trường bên trong vật chủ hoặc dễ dàng bị đào thải bởi hệ miễn dịch tự nhiên của vật chủ Việc phát hiện ra hệ thống quorum sensing ở vi khuẩn, có chức năng gắn liền với việc sản xuất ra các hợp chất trao đổi chất thứ cấp và những yếu

tố liên quan đến độc lực, là tiền đề cho cách tiếp cận thứ hai

Việc bẻ gãy hệ thống quorum sensing ở vi khuẩn gây bệnh đã được đề nghị như

là cách tiếp cận mới trong việc kiểm soát bệnh nhiễm khuẩn Một số phương pháp bẻ gãy hệ thống quorum sensing đã được nghiên cứu, bao gồm (Hình 2.4) :

(1) Ức chế quá trình sinh tổng hợp phân tử tín hiệu quorum sensing

(2) Ứng dụng các hợp chất đối kháng quorum sensing

(3) Ức chế bằng hóa học đối với phân tử tín hiệu quorum sensing

(4) Phân hủy sinh học bằng các enzyme của vi khuẩn

21

Một số báo cáo liên quan đến việc bẻ gãy hệ thống quorum sensing ở các vi khuẩn gây bệnh trong nước, cùng với những kết quả đạt được đối với vi khuẩn gây bệnh ở người và thực vật, đã chỉ ra rằng phương pháp tiếp cận mới này có nhiều tiềm năng trong việc kiểm soát bệnh trong nuôi trồng thủy sản

2.3.5.4 Quá trình phân hủy sinh học bằng enzyme đối với phân tử tín hiệu quorum sensing

Khả năng phân hủy phân tử AHL phân bố rộng rãi trong giới vi khuẩn Những enzyme có thể phân hủy phân tử AHL đã được phát hiện ở nhiều lòai vi khuẩn thuộc nhóm β-Proteobacteria (Zhang và ctv., 2002), α- Proteobacteria (Uroz và ctv., 2003) và γ- Proteobacteria cũng như ở một số lòai thuộc nhóm vi khuẩn Gram dương (Dong và ctv., 2002) Những loài vi khuẩn thuộc các nhóm này có khả năng khóa hệ thống quorum sensing của những lòai vi khuẩn cạnh tranh để đạt được ưu thế chọn lọc Quá trình bẻ gãy các phân tử tín hiệu AHL có thể được xúc tác bởi hai lọai enzyme: AHL-acylase và AHL-lactonase (Hình 2.5)

Enzyme AHL-acylase có khả năng bẻ gãy mạch cacbon, phân hủy AHL thành acid béo và homoserine lactone (Dong và ctv., 2001; Lee và ctv., 2002; Wang và ctv., 2004), tuy nhiên không làm thay đổi nhiều đến cấu trúc của phân tử AHL Trong khi

đó enzyme AHL-lactonase, điều khiển bởi gen aiiA, có khả năng phân hủy phân tử

Hình 2.5: Quá trình bẻ gãy phân tử AHL bằng enzyme

22

AHL bằng cách xúc tác phản ứng mở vòng lactone Điều này dẫn đến sự thay đổi về cấu trúc hình thể tương đối của phân tử AHL, gây trở ngại cho việc gắn kết của phân tử AHL với protein điều tiết việc phiên mã protein R, vì vậy một số kiểu hình (trong đó

có yếu tố độc lực ở vi khuẩn gây bệnh) không thể được biểu hiện Gen aiiA đầu tiên được tìm thấy ở chủng vi khuẩn Gram dương Bacillus sp 240B1 (Dong và ctv., 2000) Các dạng tương đồng của gen aiiA sau đó được tìm thấy ở nhiều lòai Bacillus khác, bao gồm Bacillus thuringiensis, B cereus, B anthracis, B mycoides và B subtilis

(Dong và ctv., 2002; Lee và ctv., 2002; Uroz và ctv., 2003; Wang và ctv., 2004; Dong

& Zhang, 2005; Pan và ctv., 2008) Các gen này có độ tương đồng cao (89 – 96%) so

với gen aiiA của chủng 240B1 Gần đây, Yin và ctv (2010) đã phân lập được gen aiiA

từ ADN của Bacillus amyloliquefaciens, một lòai gần gũi với B subtilis Gen này có độ tương đồng 87 – 99,3% so với các dạng tương đồng ở các lòai Bacillus khác, trong khi

trình tự acid amin của AHL-lactonase có độ tương đồng 89,6 – 99,6%

Có khá nhiều nghiên cứu trên thế giới về việc ứng dụng gen aiiA tái tổ hợp như

là một biện pháp kiểm soát sinh học đối với các bệnh trên cây trồng có liên quan đến việc tiết ra phân tử tín hiệu AHL Báo cáo đầu tiên được ghi nhận trong nghiên cứu của

Dong và ctv (2000) Trong nghiên cứu này, gen aiiA được gắn vào plasmid của chủng

Erwinia carotovora SCG1, vi khuẩn gây bệnh thối rễ ở bắp cải Trung Quốc Kết quả

cho thấy sự biểu hiện của enzyme AHL lactonase làm giảm mạnh tín hiệu AHL ở

Erwinia carotovora SCG1, từ đó làm giảm độc lực của chủng vi khuẩn này Một

nghiên cứu khác năm 2004 của cùng nhóm tác giả khẳng định, B thuringiensis chỉ bẻ gãy phân tử tín hiệu AHL tiết ra bởi Erwinia carotovora mà không làm ảnh hưởng đến

sự tăng trưởng bình thường khi hai lòai được nuôi chung với nhau Khi gen aiiA bị đột biến, B thuringiensis bị mất khả năng kiểm sóat tác nhân gây bệnh (Dong và ctv.,

2004; Zhou và ctv., 2006) Bên cạnh đó, Dong và ctv (2001) tiến hành tái tổ hợp gen

aiiA vào trong bộ gen của cây thuốc lá và cây khoai tây Hoạt tính của enzyme

AHL-lactonase được phát hiện trong cả hai loại cây được tái tổ hợp Điều này giúp cho

23

chúng tăng sức đề kháng đối với bệnh thối rễ do E carotovora Tiếp tục phương pháp tiếp cận của Dong và ctv., Ban và ctv (2009) tổng hợp được gen aiiA và sau đó gắn nó vào trong bộ gen của cây thảo dược Amorphallus konjac, điều này cũng giúp cho loài cây này tăng sức đề kháng bệnh thối rễ do E carotovora

2.4 Khái quát về Bacillus

2.4.1 Đặc điểm chung của chi Bacillus

Theo Bergey / s Manual of Systematic Bacteriology, Bacillus được phân loại như

không khí, nước, trên cơ thể thực vật, bụi cỏ khô và rơm rạ, hầu hết là các vi khuẩn hình que, Gram dương, hiếu khí, tạo nội bào tử, các tế bào tồn tại riêng lẽ hay dính nhau thành chuỗi ngắn Nội bào tử được miêu tả đầu tiên bởi Cohn khi nghiên cứu về

B subtilis và sau đó là Koch trong các nghiên cứu về các loài gây bệnh như B anthracis vào năm 1976

Tuy nhiên, cũng có một số loài Bacillus không tạo bào tử như B

thermoamylovorans (Combet- Blanc và ctv.,1995), B halodenitrificans (Denariaz và

ctv.,1989), một số khác có Gram âm hay Cram dương yếu như B thermosphaericus (

Andersson và ctv., 1995), B horti (Yumoto ctv., 1998), B oleronius (Kuhnigk ctv., 1995), B azotoformans (Pichinoty ctv., 1983) Thêm vào đó, khi phân loại dựa vào giải

24

trình tự RNA/ DNA, dạng vi khuẩn không tạo bào tử, kỵ khí bắt buộc cũng thuộc nhóm Bacillus như B infernus (Boone và ctv., 1995)

Phản ứng Gram của Bacillus có thể thay đổi theo chu trình sống của nó, chỉ các

tế bào trẻ mới chắc chắn Gram dương Wiegel (1981) đã cho thấy rằng dưới kính hiển

vi, cấu trúc của vách tế bào, không hoàn toàn giống nhau như phản ứng nhuộm Gram Tức là, vách tế bào của một sinh vật nhuộm ra Gram âm, có thể có cấu trúc Gram dương thật sự Một vách tế bào có cấu trúc Gram âm sẽ luôn luôn nhuộm ra Gram âm Tuy nhiên, một vách tế bào có cấu trúc Gram dương, có thể nhuộm ra Gram âm hoặc dương dưới một số điều kiện nhất định

Tế bào sinh dưỡng Bacillus thẳng, có đầu tròn hay vuông, kích thước từ 0,5 – 1,2x 2,5- 10 µm, ở dạng đơn lẻ hay chuỗi ngắn hoặc dài Đối với Bacillus có nội bào tử

thì bào tử hình trụ, oval, tròn, thỉnh thoảng có hình bầu dục Tùy theo loài, bào tử có thể nằm ở giữa, gần cuối hoặc ở cuối, và túi bào tử phồng hoặc không phồng Dưới một số điều kiện đặc biệt (có HCO3- trong bình kỵ khí hoặc môi trường CO2), B

anthracis, B subtilis, B licheniformis và B megaterium tạo ra một vỏ polypeptide (

poly- γ- D- glutamic acid) nhìn thấy được khi nhuộm tế bào với polychrome methylene

blue Trừ B anthracis và B mycoides, hầu hết các loài Bacillus đều di động, mặc dù có

sự khác biệt rất lớn về khả năng di động trong mỗi loài Đa số các loài có catalase dương tính

2.4.2 Dinh dưỡng và tăng trưởng

2.4.2.1 Môi trường nuôi cấy

Phần lớn các chi Bacillus phát riển tốt trên các môi trường dinh dưỡng thương

mại gồm các thành phần cơ bản như: pepton, cao thịt, glucose, lactose, chất khoáng,

…, mặc dù trong một số trường hợp đặc biệt, các môi trường này cần được điều chỉnh

pH hoặc nồng độ muối (pH từ 2-11, và nồng độ muối từ dưới 2-25%) Trong phòng thí

nghiệm, dưới điều kiện phát triển tối ưu, thời gian thế hệ của Bacillus khoảng 25 phút

25

Trong môi trường nuôi cấy lỏng chúng tạo váng trên bề mặt Trên môi trường thạch tạo khuẩn lạc to, tròn hay hình dạng bất thường, có màu xám ngả vàng nhạt, bề mặt khóm sần sùi, hơi nhăn hoặc tạo màng mịn lan trên bề mặt thạch

Hình dạng khuẩn lạc thay đổi tùy theo độ tuổi, và các đĩa nuôi cấy riêng lẻ có

thể tạo ra các dạng khuẩn lạc khác nhau B larvae và B popilliae trong môi trường

nuôi cấy cần có thêm thiamine Chúng thường phát triển trên môi trường J chứa

trypton, glucose, dịch chiết nấm men B pasteuri cần bổ sung 0.5-1% urea vào tất cả môi trường nuôi cấy B stearothermophilus phát triển trên môi trường dinh dưỡng có

bổ sung calci và sắt

 Môi trường tối thiểu

B subtilis và nhiều thành viên khác trong chi phát triển được trong môi trường

muối đơn giản chứa các ion ammonium như nguồn nitrogen và glucose như nguồn cacbon Môi trường muối tối thiểu thường được sử dụng là Spizizen’s minimal medium (SMM)

 Môi trường tạo bào tử

Hầu hết các loài Bacillus cần một môi trường đặc biệt để có thể tạo bào tử Sự

tạo bào tử được cảm ứng sau pha tăng trưởng hàm mũ do nồng độ dinh dưỡng bị cạn kiệt, đặc biệt là việc thiếu nguồn cacbon, nitrogen hoặc phospho Có thể sử dụng môi trường nhân tạo để cảm ứng tạo bào tử như Difico sporulation agar (DSM), 2x SG agar, CDSM medium

2.4.2.2 Nhiệt độ phát triển

Phần lớn các chủng Bacillus ưu nhiệt trung tính, và tạo khuẩn lạc đặc trưng sau

24 giờ nuôi cấy ở 370C Các loài ưu nhiệt như B stearothermophilus phát triển từ 55

đến 700C, thường là khoảng 600C Các loài này ưu nhiệt bắt buộc và không thể phát triển ở 370C Loài ưu nhiệt trung bình như B coagulans phát triển tốt tại 45- 500C

Loài gây bệnh cho côn trùng như B larvae và B popilliae phát triển ở nhiệt độ từ 25-

300C Tương tự như vậy đối với B thuringiensis và B cereus

26

2.4.3 Hệ enzyme của vi khuẩn Bacillus

Bacillus rất đa dạng về hình thái, do đó các enzyme của chúng cũng vô cùng

phong phú Ở các loài Bacillus khác nhau đã tìm thấy các enzyme thuộc các nhóm

cacbonhydrate (gồm amylase, cellulase, chitinase, protease, penicillinase, lipase, thiaminase, enzyme phân giải vi khuẩn…)

Trong nhóm enzyme amylase thường gặp nhất là α – amylase Chúng thủy phân liên kết α – 1,4 glucosidase của tinh bột tạo thành các polysaccharite Có 2 loại α –

amylase chính được tạo từ Bacillus là: Enzyme dịch hóa tinh bột ( liquefying enzyme)

và enzyme đường hóa ( saccharifying enzyme) Hai loại enzyme này có thể phân biệt với nhau dựa trên sự tác động của chúng đối với tinh bột Trước kia người ta cho rằng

α – amylase và cyclodextrin glucosytransferase của B maceransualaf là những enzyme duy nhất phân giải tinh bột của chi Bacillus , nhưng gần đây người ta đã tìm thấy

những enzyme khác cũng thủy phân tinh bột như β- amylase và các enzyme cắt mạch nhánh

Phần lớn trong số 34 loài Bacillus có tên trong Bergey / s Manual of Systematic Bacteriology đều có khả năng sinh tổng hợp protease Trong đó những lòai quan trọng

nhất là: B subtilis, B polymyxa, B megaterium, B thermoproteolyticus thường được

chia làm 4 nhóm dựa vào cơ chế tác động của chúng: protease chứa serine, protease chứa kim loại, protease chứa lưu huỳnh, protease acid Các protease ngọai bào của Bacillus thường thuộc nhóm protease kim loại và serine

2.4.4 Ứng dụng của Bacillus

Bacillus được ứng dụng nhiều trong sản xuất enzyme công nghiệp vì nó có khả năng sinh các loại enzyme như amylase, alkaline phosphatase, cellulase, cyclodextran, glucanotransferase, galactosidase, chitinase, glucose isomerase, glucanase, lipase,

serine protease, urease, … Ngoài ra, Bacillus còn có khả năng sinh các chất chuyển

hóa sơ cấp như nucleotide xanthanylic acid, inosinic acid, guanilic acid,…Dưới điều

27

kiện sống thiếu dinh dưỡng Bacillus còn có khả năng sinh các loại kháng sinh peptid

như surfactin vừa có tình kháng khuẩn và kháng khối u

Trong chế phẩm sinh học, Bacillus thuringiensis được ứng dụng làm thuốc trừ sâu vi sinh, Bacillus thuringiensis làm chế phẩm Israelensis serotype H14 diệt lăng

quăng Do khả năng tạo bào tử chịu nhiệt, sinh các loại enzyme ngoại bào và khả năng

đối kháng với các vi sinh gây bệnh như Streptococcus pyogenes, Haemophilus

influenzae, Candida albicans, E coli, S aureus, Salmonella, Shigella, Vibrio spp.,

…nên Bacillus sp được sử dụng làm probiotic trong chăn nuôi và thủy sản

Bacillus ứng dụng trong thủy sản như: làm tăng khả năng sống, thúc đẩy sinh

trưởng (Gomez-Gil và ctv., 2000), kích thích tiêu hóa (Ziaei-Nejad và ctv., 2006), tăng cường đáp ứng miễn dịch (Gatesoupe, 1999) và cải thiện chất lượng nước (Kennedy và

ctv., 1998; Moriarty và ctv., 1998) Các chủng B subtilis sản xuất enzyme ngoại bào

như protease và một số enzyme khác đã đóng góp vào hoạt tính enzyme tự nhiên của chủng chủ (Ziaei Nejad và ctv., 2006), đóng góp nguồn vi lượng và đa lượng bổ sung

thức ăn (Verschuere và ctv., 2000) Hơn nữa, B subtilis sản sinh các hợp chất kháng

khuẩn, cạnh tranh dinh dưỡng và không gian sống góp phần ức chế vi khuẩn gây bệnh

(Vaseeharan và ctv., 2003) B.licheniformis được chứng minh có hoạt tính kháng virut (Arena và ctv., 2006), trong khi đó B pumilus sản xuất enzyme ngoại bào bao gồm

amylase, cellulase, là những enzyme quan trọng trong hoạt động tiêu hóa của cá bột (Ghosh và ctv., 2002)

Hơn nữa Bacillus có tác dụng giảm lượng bùn hữu cơ, giúp giảm chu kì thay

nước và cải thiện môi trường, do có khả năng khử nitrate, phân hủy chất hữu cơ thải ra

từ thức ăn thừa nhờ có các enzyme ngoại bào như protease, amylase, lipase….Ngoài ra,

một số chủng Bacillus còn có hoạt tính kháng khuẩn, kháng Vibrio sp, Aeromonas sp,

… giúp phòng và ức chế bệnh trong nuôi trồng thủy sản

28

CHƯƠNG 3: NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

3.1 Thời gian và địa điểm nghiên cứu

3.1.1 Thời gian

Từ 1/4/2011 đến 30/6/2011

3.1.2 Địa điểm nghiên cứu

Phòng Sinh học Thực Nghiệm - Viện Nghiên Cứu Nuôi Trồng Thủy Sản II

3.2 Vật liệu nghiên cứu

3.2.1 Đối tượng nghiên cứu

 Chủng vi khuẩn Bacillus N6.1 được phân lập từ nước ao nuôi cá tra được nhận

từ Phòng Sinh Học Thực Nghiệm, Viện Nghiên Cứu Nuôi Trồng Thủy Sản II

 Vi khuẩn gây bệnh gan thận mủ (Edwardsiella ictaluri Gly 09M) trên cá tra

nhận từ Trung Tâm Quốc Gia Quan Trắc Cảnh Báo Môi Trường và Phòng Ngừa Dịch Bệnh Thủy Sản Khu Vực Nam Bộ, Viện Nghiên cứu Nuôi trồng Thủy sản II

 Chủng CV026, thể đột biến từ chủng vi khuẩn Chromobacterium violaceum

(McClean và ctv., 1997), được sử dụng làm vi sinh vật chỉ thị để phát hiện nồng độ dư lượng AHL còn lại trong môi trường chủng này có khả năng tạo sắc tố màu tím violacein khi có sự hiện diện của các phân tử AHL mạch ngắn (từ 4-8 cacbon) trong môi trường Chủng CV026 được nuôi cấy trong môi trường BHI, có bổ sung 20mg/l kanamycin

3.2.2 Dụng cụ, thiết bị thí nghiệm, hóa chất và môi trường

29

 Cân điện tử 4 số lẻ AY220

 Máy đo pH để bàn Thermo Orion

 Tủ mát Sanyo

 Tủ lạnh sâu (– 80oC)

 Nồi hấp vô trùng Hirayama

 Máy cất nước Hamilton

 Máy đo giá trị OD

3.2.2.2 Hóa chất và môi trường

 Dung dịch đệm Phosphate Buffer Saline (PBS)

 Nước muối sinh lý 0.85%

 Thuốc thử cho các phản ứng khả năng sinh enzyme ngoại bào: Lugol, TCA 25% (tricloric acetic acid 25%)…

 CMC 1%, glycerol 40%, CaCl2,

 Môi trường dinh dưỡng thông thường: Nutrient Agar (NA),Brain Heart Infusion Agar (BHIA), Brain Heart Infusion Broth (BHIB), Blood Agar (BA)

 Môi trường tạo bào tử Bacillus: Difco Sporulation Medium (DSM)

 Môi trường thử nghiệm khả năng sinh enzyme ngoại bào: enzyme cellulase, amylase, protease và lipase

30

3.3 Bố trí thí nghiệm

3.3.1 Khảo sát khả năng sinh enzyme ngoại bào

Đối với các chủng vi sinh vật dùng làm probiotic trong thủy sản, khả năng sinh các enzyme ngoại bào là một tiêu chí chọn lọc quan trọng giúp hổ trợ tiêu hóa cho vật chủ và cải thiện môi trường sống của động vật nước ngọt bằng cách phân hủy nhanh chóng thức ăn dư thừa Các enzyme thử nghiệm là amylase, protease, cellulase, lipase (Ertuğrul và ctv, 2007; Trần Thị Ánh Tuyết và Trương Quốc Huy, 2010; Trần Linh Thước, 2010)

3.3.1.1 Khảo sát khả năng sinh enzyme amylase của Bacillus N6.1

Một số vi sinh vật có khả năng tiết ra enzyme ngoại bào có tác dụng phân hủy tinh bột thành các đường đơn Phản ứng này nhận biết được khi ta nhỏ dung dịch lugol vào trong môi trường thạch nuôi cấy, nếu trong môi trường có tinh bột thì môi trường chuyển sang màu xanh đậm, ngược lại thì lugol sẽ không làm chuyển màu môi trường

Cách tiến hành:

 Hoạt hóa chủng Bacillus N6.1 trên môi trường BHIA ủ ở 30oC trong 24 giờ

 Dùng que cấy vô trùng cấy chủng vi khuẩn lên môi trường thạch dinh dưỡng (NA) bổ sung 0.5% tinh bột tan

 Ủ ở 30oC trong 24 giờ

 Nhỏ lugol, đọc kết quả:

 Dương tính: Xuất hiện vòng trong xung quanh khóm khuẩn lạc

 Âm tính: Xuất hiện màu xanh đậm xung quanh khóm khuẩn lạc

3.3.1.2 Khảo sát khả năng sinh enzyme lipase của Bacillus N6.1

Một số sinh vật có khả năng tiết ra các enzyme lipase phân giải dầu thực vật và một số hợp béo khác Trong thử nghiệm lipase môi trường có chứa CaCl2 và Tween80 Nếu vi khuẩn có khả năng tiết ra enzyme lipase sẽ phân giải Tween 80 tạo các acid béo

tự do, các acid béo này sẽ tủa khi có mặt Ca2+, tạo nên vùng mờ đục dưới và xung quanh khuẩn lạc

31

Cách tiến hành:

 Hoạt hóa chủng Bacillus N6.1 trên môi trường BHI ủ ở 30oC, 24 giờ

 Dùng que cấy vô trùng cấy chủng vi khuẩn lên môi trường thạch dinh dưỡng (NA) có bổ sung CaCl2 (100ppm) và Tween 80 (10ml/l)

 Ủ 30oC, trong 24 giờ

 Đọc kết quả

 Dương tính: Tủa mờ đục xung quanh khóm khuẩn lạc

 Âm tính: Không có tủa mờ đục xung quanh khóm khuẩn lạc

3.3.1.3 Khảo sát khả năng sinh enzyme protease của Bacillus N6.1

Thử nghiệm 2 enzyme trong nhóm protease là gelatinase và caseinase

 Đối với những sinh vật có nhóm enzyme gelatinase thì nó sẽ phân hủy được gelatine tạo vòng trong xung quanh khóm khuẩn lạc

Cách tiến hành:

 Hoạt hóa chủng Bacillus N6.1 trên môi trường BHIA ủ ở 30oC trong 24 giờ

 Dùng que cấy vô trùng cấy chủng vi khuẩn lên môi trường thạch dinh dưỡng (NA) có bổ sung 1% gelatine

 Ủ 30oC, trong 24 giờ

 Nhỏ TCA 25% ( Trichloric Acetic Acid 25%) , xem kết quả

 Dương tính: Xuất hiện vòng trong xung quanh khóm khuẩn lạc

 Âm tính: Không xuất hiện vòng trong xung quanh khóm khuẩn lạc

 Môi trường có casein sẽ có màu trắng đục, vi khuẩn tiết enzyme caseinase sẽ tạo vùng phân giải xung quanh khuẩn lạc

Cách tiến hành:

 Hoạt hóa chủng Bacillus N6.1 trên môi trường BHIA ủ ở 30oC, trong 24 giờ

 Dùng que cấy vô trùng cấy chủng vi khuẩn lên môi trường Skim milk Agar (1% skim milk)

32

 Ủ 30oC, 24 giờ, đọc kết quả

 Dương tính: Xuất hiện vòng trong xung quanh khuẩn lạc

 Âm tính: Xung quanh khuẩn lạc có màu trắng đục

3.3.1.4 Khảo sát khả năng sinh enzyme cellulase của Bacillus N6.1

Chủng kiểm tra được nuôi trên môi trường có bổ sung CMC 1% (Carbonyl methyl cellulose), những vi khuẩn có enzyme cellulase sẽ phân giải CMC và sau khi nhuộm với lugol sẽ tạo được các vòng trong xung quanh khuẩn lạc

Cách tiến hành:

 Hoạt hóa chủng Bacillus N6.1 trên môi trường BHIA ủ ở 30oC, trong 24 giờ

 Dùng que cấy vô trùng cấy chủng vi khuẩn lên môi trường thạch dinh dưỡng (NA) có bổ sung CMC 1%

 Ủ 30oC, trong 24 giờ

 Nhỏ lugol, đọc kết quả

 Dương tính: Xuất hiện vòng trong xung quanh khóm khuẩn lạc

 Âm tính: Xuất hiện màu xanh đậm xung quanh khóm khuẩn lạc

3.3.2 Dựng đường chuẩn tương quan giữa giá trị OD và mật độ vi khuẩn Bacillus N6.1; E.ictaluri

Chủng vi khuẩn Bacillus N6.1 và E.ictaluri (- 80oC) sau khi hoạt hoá trên môi trường BHIA, chọn một khuẩn lạc đặc trưng nuôi trong erlen chứa 50ml môi trường BHIB ủ ở 30oC, lắc 120 vòng /phút trong 24 giờ

Đo giá trị OD ở bước sóng 600nm của canh khuẩn được tăng sinh trong môi trường BHIB sau 24 giờ ở các nồng độ pha loãng tăng dần 20, 2-1, 2-2, 2-3…

Tại mẫu pha loãng có giá trị OD600nm gần bằng 0, tiến hành pha loãng và trải đĩa

ở 3 nồng độ 10-1, 10-2, 10-3, mỗi nồng độ trải 3 đĩa Ủ ở 30oC sau 24 giờ tiến hành đếm khuẩn lạc

33

Đếm số khuẩn lạc ở mỗi đĩa (Chọn đĩa có số khuẩn lạc nằm trong khoảng từ

25-300 khuẩn lạc).Tính số khuẩn lạc trung bình, từ đó suy ra mật độ vi khuẩn (cfu/ml) ở các nồng độ khác nhau => dựng đường chuẩn

3.3.3 Khảo sát ảnh hưởng của pH, nhiệt độ, NaCl lên tăng trưởng và khả năng đối kháng với E ictaluri của Bacillus N6.1

Mục đích: Xác định khoảng chịu pH, nhiệt độ, NaCl của chủng vi khuẩn

Bacillus N6.1 trong môi trường nuôi trồng thủy sản

Chủng Bacillus N6.1 (-80oC) sau khi hoạt hoá trên môi trường BHIA, chọn một khuẩn lạc đặc trưng tăng sinh trong ống nghiệm chứa 10 ml môi trường BHIB ủ ở

30oC, lắc 120 vòng /phút Sau 24 giờ, đo OD600nm, dựa vào phương trình đường chuẩn xác định mật độ, điều chỉnh về 2x106 (cfu/ml) Sau đó nuôi trên ống nghiệm chứa 10ml môi trường BHIB ở các điều kiện pH (4, 5, 6, 7, 8, 9, 10), nhiệt độ (25oC, 30oC, 35oC,

40oC), nồng độ muối (0.5%, 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%) ở 30oC, lắc 120 vòng/phút Sau 24 giờ tiến hành đo OD600nm ở tất cả các điều kiện trên Đồng thời sử dụng phương pháp giếng khuếch tán (well diffusion method) để đánh giá khả năng đối kháng của

Bacillus N6.1 bằng cách vi khuẩn gây bệnh E ictaluri (-80oC) sau khi hoạt hoá trên môi trường BA, chọn một khuẩn lạc đặc trưng tăng sinh trong ống nghiệm chứa 10 ml môi trường BHIB ủ ở 30oC, lắc 120 vòng/phút Sau 24 giờ, đo OD600nm, dựa vào phương trình đường chuẩn xác định mật độ, điều chỉnh về 2x108 (cfu/ml) Trải 50µl canh khuẩn gây bệnh lên môi trường thạch BHI, để khô trong 15 phút Sau đó khoan 3

giếng (đường kính 8mm) trên mỗi đĩa Hút 50µl canh khuẩn Bacillus N6.1 nhỏ vào giếng trên đĩa thạch vừa tráng vi khuẩn Edwardsiella ictaluri, ủ ở nhiệt độ 300C và đo kích thước vòng kháng khuẩn sau 24 giờ

34

Hình 3.1: Khảo sát ảnh hưởng của pH, nhiệt độ, NaCl lên tăng trưởng và khả năng đối

kháng với E ictaluri của Bacillus N6.1

10ml BHIB

Ủ 30oC, 24 giờ

Đo OD600nm, xác định mật độ điều chỉnh về 2x106 cfu/ml

Hoạt hóa vi khuẩn bằng cách

cấy ria lên BA

Đo OD 600, điều chỉnh về 2x108cfu/ml

Hút 50 µl trải trên BHIA,

Khảo sát ảnh hưởng của muối % (0.5,1,2,3,4,5,6) 4,5,6,7,8,9,10)