Phát hiện và đánh giá tính gây bệnh của Pepper yellow leaf curl Việt Nam virusPhát hiện và đánh giá tính gây bệnh của Pepper yellow leaf curl Việt Nam virusPhát hiện và đánh giá tính gây bệnh của Pepper yellow leaf curl Việt Nam virusPhát hiện và đánh giá tính gây bệnh của Pepper yellow leaf curl Việt Nam virusPhát hiện và đánh giá tính gây bệnh của Pepper yellow leaf curl Việt Nam virusPhát hiện và đánh giá tính gây bệnh của Pepper yellow leaf curl Việt Nam virusPhát hiện và đánh giá tính gây bệnh của Pepper yellow leaf curl Việt Nam virusPhát hiện và đánh giá tính gây bệnh của Pepper yellow leaf curl Việt Nam virusPhát hiện và đánh giá tính gây bệnh của Pepper yellow leaf curl Việt Nam virus
HỌC VIỆN NƠNG NGHIỆP VIỆT NAM KHOA NƠNG HỌC KHĨA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐỀ TÀI “Phát đánh giá tính gây bệnh Pepper yellow leaf curl Việt Nam virus ” Giảng viên hướng dẫn : TS.Hà Viết Cường Họ tên : Hà Văn Dũng Lớp : BVTVB-K55 Chuyên ngành : Bảo vệ thực vật Hà Nội-2014 LỜI CẢM ƠN Trong suốt q trình hồn thành báo cáo ngồi nỗ lực thân, tơi nhận giúp đỡ tận tình quý báu từ nhiều tập thể cá nhân Trước hết xin gửi lời cảm ơn chân thành sâu sắc tới thầy TS Hà Viết Cường – Giám đốc trung tâm nghiên cứu bệnh nhiệt đới – Trường Học viện nông nghiệp Việt Nam, Phó khoa Nơng học Ths Trần Thị Như Hoa - Phó giám đốc trung tâm nghiên cứu bệnh nhiệt đới trực tiếp hướng dẫn, tận tình bảo tạo mọi điều kiện để tơi hồn thành báo cáo Tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành tới cán công nhân viên thuộc Trung tâm nghiên cứu bệnh nhiệt đới – Trường Học viện nơng nghiệp Việt Nam, nhiệt tình giúp đỡ tơi suốt q trình tơi thực tập Trung tâm Đồng thời xin chân thành cảm ơn Thầy giáo, Cô giáo môn bệnh Thầy cô khoa Nông học, Trường Học viện nơng nghiệp Việt Nam nhiệt tình dạy dỗ, bảo cho suốt thời gian học tập trường Cuối xin chân thành cảm ơn người thân, gia đình, bạn bè hết lòng giúp đỡ, động viên tơi q trình học tập hoàn thành báo cáo Một lần xin chân thành cảm ơn! Hà Nội, ngày 31 tháng năm 2014 Sinh viên Hà Văn Dũng MỤC LỤC ĐẶT VẤN ĐỀ 11 Giới thiệu 11 1.2 Mục tiêu yêu cầu đề tài 12 1.2 Mục tiêu 12 1.2 Yêu cầu 12 2TỔNGQUAÀILỆ 13 2.1 Tầm quan trọng ớt cà chua 13 Đặc điểm chung Begomovirus 13 2.1 Đặc điểm hình thái .14 Cấu trúc genome Begomovirus 14 2.3 Cấu trúc phân tử DNA-A 15 2.4 Cấu trúc phân tử DNA-B 16 2.5 Đặc điểm vùng IR 16 2.6 Phân loại Begomovirus .17 2.7 Tái sinh Begomovirus 17 2.8 Triệu chứng bệnh Begomovirus 18 2.9 Môi giới truyền bệnh lan truyền 19 2.10 Thiệt hại kinh tế Begomovirus gây 20 2.1 Phòng chống 21 2.3 Một số begomovirus hại cà chua .22 2.4 Một số begomovirus hại ớt 23 2.5 Kỹ thuật chẩn đoán PCR 23 2.51 Giới thiệu nguyên lý 23 2.6 Kỹ thuật RCA (Rolling circle amplication) 24 2.7 Kĩ thuật Agroinoculation 25 3VẬTLIỆUÀPHƯƠNGÁÊCỨ 28 3.1 Đối tượng nghiên cứu 28 3.2 Địa điểm nghiên cứu thời gian thực 28 3.21 Địa điểm nghiên cứu 28 Thời gian thực 28 3.4 Vật liệu nghiên cứu 28 3.41 Cây thí nghiệm: .28 3.42 Thu thập mẫu 29 .43 Dòng vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens mang cấu trúc xâm nhiễm PepYLCVNV 30 3.4 Chất kháng sinh 32 3.45 Hóa chất, dung dịch đệm 32 3.46 Kit thương mại 33 3.47 Môi trường .33 3.48 Các thiết bị chủ yếu .33 3.49 Dụng cụ nghiên cứu 34 3.5 Phương pháp nghiên cứu 34 3.51 Phương pháp điều tra đồng ruộng 34 3.52 Thí nghiệm nhà lưới 35 3.5 Phương pháp kiểm tra virus PCR 35 3.54 Tiến hành phản ứng PCR (Polymerase Chain Reaction) 37 3.5 Chạy điện di sản phẩm PCR xem kết phản ứng 39 3.56 Tinh chiết sản phẩm điện di 40 3.57 Xây dựng cấu trúc xâm nhiễm 40 3.58 Chuẩn bị E.coli chủng X1 Blue khả biến .41 539 Biến nạp cấu trúc xâm nhiễm vào tế bào vi khuẩn E.coli khả biến phương pháp sốc nhiệt 41 3.510 Phản ứng PCR kiểm tra khuẩn lạc mọc môi trường chọn lọc 42 3.51 Tinh chiết plasmid 42 3.512 Chuẩn bị vi khuẩn A tumefaciens khả biến (competent cells) 43 3.51 Biến nạp cấu trúc xâm nhiễm vào tế bào vi khuẩn A.tumefaciens khả biến 44 3.514 Xác định trình tự gen xử lý số liệu phần mềm chuyên dụng 45 3.51 Phản ứng PCR kiểm tra khuẩn lạc mọc môi trường chọn lọc 45 3.516 Lây nhiễm nhân tạo sử dụng kỹ thuật agroinoculation 46 3.517 Đánh giá tính gây bệnh .47 3.518 Lây nhiễm nhân tạo dùng bọ phấn 48 3.519 Kiểm tra mẫu phản ứng ELISA .49 4KẾTQUẢVÀOHLẬN 53 41 Kết kiểm tra số loại virus gây hại ớt thu thập nước giai đoạn 2012-2013 53 41 Kiểm tra virus gây hại thu thập đồng từ địa điểm điều tra giai đoạn 2012-2013 phương pháp ELISA 53 .412 Kiểm tra virus gây hại thu thập đồng từ địa điểm điều tra giai đoạn 2012-2013 phản ứng PCR 55 42 Đánh giá tính gây bệnh PepYLCVNV lây nhiễm nhân tạo dùng kĩ thuật agroinoculation .58 421 Phục hồi dòng vi khuẩn A tumefaciens mang cấu trúc xâm nhiễm PepYLCVNV 58 Bảng 4.1 Kết phục hồi dòng vi khuẩn mang cấu trúc xâm nhiêm PepYLCVNV 59 4.2 Nhân sinh khối dòng vi khuẩn A.tumerfaciens môi trường LB-lỏng 60 423 Kết đánh giá tính gây bệnh PepYLCVNV phương pháp Agroinoculation 61 4.2 Tính gây bệnh DNA-A (lây nhiễm agroinoculation) 63 4.25 Tính gây bệnh DNA-A & DNA-B (lây nhiễm agroinoculation) ……………………………………………………………………………………………………………………………………………………66 34 Đánh giá tính gây bệnh PepYLCVNV lây nhiễm nhân tạo dùng bọ phấn 69 4.31 Lây nhiễm PepYLCVNV cà tím nguồn bệnh 70 4.32 Lây nhiễm PepYLCVNV ớt nguồn bệnh 71 Đánh giá tính kháng PepYLCVNV tập đồn giống ớt AVRDC 71 4.1 Thiết kế cấu trúc xâm nhiễm PepYLVNV 72 4.2 Chuẩn bị vector pCAMBIA2300 74 KẾTLUẬNVÀĐỀGHỊ 82 5.1 Kết luận 82 5.2 Kiến nghị 82 6TÀILỆUHAMKẢO 6.1 TÀI LIỆU TIẾNG VIỆT 6.2 TÀI LIỆU TIẾNG ANH .0 6.3 CÁC TRANG WEB DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT Ký hiệu A tumefaciens AS ATP Bb CP CTAB ddNTP DNA Dntp dsDNA E.coli EDTA ICTV IR Kb LB ORF PCR RCA RE Rep RNA Rnase SDS SsDNA TAE Taq Vir β- ME Từ viết tắt Agrobacterium tumefaciens Acetosyringone Adenosine triphosphate Base pair Capsid protein Cetryl Ammonium Bromide Dideoxynucleoside triphosphate Deoxyribonucleic acid Deoxynucleoside triphosphate Double strand DNA Escherichia coli Ethylene diamine tetra acetic acid International Committee on Taxonomy of Viruses Itergenic region Kilo base Luria and Bertani Open reading frame Polymerase Chain Reaction Rolling circle amplification Restriction enzyme Replication protein Ribonucleic acid Ribonuclease Sodium Dodecyl Sulphate Singe strand DNA Tris – acetate – EDTA Thermus aquatic Virulence region Beta- Mercaptoethanol DANH MỤC BẢNG Bảng 3.4 Cây thí nghiệm .43 Bảng 3.3 Các mẫu ớt, cà tím thu thập (2013) .44 Bảng 3.1 Thang phân cấp bệnh .50 Bảng 3.6 Thí nghiệm lây nhiễm thực với công thức 62 Bảng 4.1 Kết kiểm tra ELISA mẫu ớt thu Việt Nam giai đoạn 2012-2013 68 Bảng 4.2 Kết kiểm tra mẫu ớt PCR sử dụng cặp mồi BegoA – For1 BegoA – Rev1 71 Bảng Tính gây bệnh PepYLCV lây nhiễm DNA-A giống cà chua Hồng Lan (T20) 79 Bảng Tính gây bệnh PepYLCV lây nhiễm DNA-A giống ớt Hiểm Lai F1-207 80 Bảng 4.13 Tính gây bệnh PepYLCV lây nhiễm DNA-A thị 80 Bảng Tính gây bệnh PepYLCV lây nhiễm DNA-A DNA-B giống cà chua Hồng Lan (T20) .82 Bảng Tính gây bệnh PepYLCV lây nhiễm DNA-A DNA-B giống ớt Hiểm Lai F1-207 82 Bảng 4.13 Tính gây bệnh PepYLCV lây nhiễm DNA-A DNAB thị 83 Bảng Kết lây nhiễm PepYLCV bọ phấn cà tím nguồn bệnh 85 Bảng Kết lây nhiễm PepYLCV bọ phấn ớt nguồn bệnh .85 Bảng 4.10 Cấp bệnh xoăn vàng giống ớt AVRDC .86 Bảng 4.3 Tóm tắt bước xây dựng cấu trúc xâm nhiễm 88 Bảng 4.4 Hiệu xử lý sản phẩm RCA với phương pháp chiết khác 91 Bảng 4.5 Tối ưu hóa điều kiện cho phản ứng cắt khơng hồn tồn sản phẩm RCA PepYLCV 93 DANH MỤC HÌNH Hình 2.1 Hình thái begomovirus 11 Hình 2.2 Cấu trúc phân tử DNA-A, DNA-B begomovirus 12 Hình 2.3 Cấu trúc phân tử DNA-A Begomovirus 13 Hình 2.4 Cấu trúc phân tử DNA-B Begomovirus 13 Hình 2.5 Triệu chứng Begomovirus gây ớt cà chua 16 Hình 2.6 Bọ phấn Bemisia tabaci 18 Hình 3.1 Sơ đồ tổ chức gen DNA-A 28 Hình 4.32 Kết ELISA phát ChiVMV .52 Hình 4.1 Triệu chứng Begomovirus gây hại ớt Đà Nẵng 54 Hình 4.2 Kiểm tra PCR mẫu đậu đỗ cặp mồi cặp mồi BegoA – For1 BegoA – Rev1 54 Bảng 4.1 Kết phục hồi dòng vi khuẩn mang cấu trúc xâm nhiêm PepYLCVNV 56 Hình 4.2 Dòng vi khuẩn A.tumerfaciens chứa cấu trúc xâm nhiễm PepYLCVNV nuôi LB – lỏng 58 Hình4.6 Phương pháp tiêm trực tiếp dịch vi khuẩn vào mơ .60 Hình 4.3 Sơ đồ bước xây dựng cấu trúc xâm nhiễm PepYLCVNV sử dụng kỹ thuật RCA 70 Hình 4.4 Sơ đồ vector pCAMBIA2300 71 Hình 4.5.Điện di sản phẩm PCR kiểm tra plasmid sử dụng cặp mồi pCAMseqF1/R .72 Hình 4.11 Điện di sản phẩm mở vòng pCAMBIA 2300 BamHI 72 Hình 4.8 Xử lý sản phẩm RCA mẫu VNP1500 cách cắt hoàn toàn với enzyme BamHI 10 u/µl 74 Hình 4.9.Cắt khơng triệt để sản phẩm RCA điều kiện khác 75 TÓM TẮT Trong nghiên cứu tiến hành nghiên cứu tập trung chủ yếu begomovirus Pepper yellow leaf curl Vietnam virus (PepYLCVNV) gây bệnh xoăn vàng ớt cà chua Đánh giá đặc trưng sinh học cách đánh giá tính gây bệnh thơng qua Agrobacterium tumerfaciens (Agroinoculation), đồng thời tiến hành lây nhiễm PepYLCVNV thông qua môi giới truyền bệnh trung gian bọ phấn Dựa mồi đặc hiệu mồi chung, phản ứng PCR thực loạt mẫu ớt thu miền Bắc miền Trung Việt Nam nhằm phát PepYLCV begomovirrus khác Lần phát có mặt begomovirrus ớt miền Bắc Chúng tiến hành xây dựng thành cơng cấu trúc xâm nhiễm PepYLCVNV, phân tích đặc trưng phân tử của PepYLCVNV ĐẶT VẤN ĐỀ 1.1 Giới thiệu Chi Begomovirus chi lớn quan trọng họ Geminiviridae số lượng loài bệnh chúng gây với trồng Begomovirus (được đặt tên từ Bean golden mosaic virus) tên gọi chung virus thuộc chi Begomovirus có phân virion (hạt virus) dạng hình cầu kép (hình chùy) gen DNA sợi vòng đơn, kích thước khoảng 2,7 kb, lan truyền đồng ruộng bọ phấn (Bemisia tabaci) theo kiểu bền vững tuần hoàn Begomovirus có gen đơn (gồm phân tử DNA-A) có gen kép (gồm hai phân tử DNA-A DNA-B) Ở số loại cần phân tử DNA-A gây triệu chứng điển hình, số loại cấy khác cần có phân tử DNA-A DNA-B gây triệu chứng bệnh Begomovirus gây bệnh loại có triệu chứng đặc trưng, điển hình là: (cong lại hình thìa); mép (đặc biệt non) biến vàng; nhỏ hẹp; nhiễm sớm còi cọc với tỷ lệ đậu thấp Danh tính virus xác định dựa vào phân tích phân tử Việt Nam chứng minh trung tâm đa dạng quan trọng begomovirus Mặc dù số lượng begomovirus xác định thực vật Việt Nam gồm 19 lồi phân lập từ nhiều lồi cây, có nhiều dại (Green, Tsai et al., 2001), (Ha, 2007) Trên họ cà, có begomovirus phát gây bệnh xoăn vàng cà chua Việt Nam Tuy nhiên chưa có cơng bố cho thấy có mặt begomovirus ớt Năm 2012, loạt mẫu ớt biểu triệu chứng bệnh virus ớt TTNC Bệnh Nhiệt đới (Trường ĐHNN Hà Nội) thu thập khắp nước Các phân tích phân tử từ mẫu virus phân lập từ ớt thu thập Đà Nẵng (mẫu VNP93) xác định loài begomovirus virus đặt tên Pepper yellow leaf curl Vietnam virus (PepYLCVNV) đồng thời xác định chất DNA-A hay DNA-B plasmid VNP1500-20 Kết tìm kiếm trình bày Bảng 4.16 Kết tìm kiếm trực tuyến cho thấy DNA-A mẫu virus VNP1500 gần gũi với DNA-A Pepper leaf curl (Malaysia) virus (mức đồng trình tự 88 %) Kết tìm kiếm trực tuyến cho thấy đoạn trình tự virus plasmid VNP1500-20 DNA-B gần gũi với DNA-B Tomato yellow leaf curl Kanchanaburi virus với mức đồng trình tự 89% (bảng 4.16) Các mức đồng trình tự thấp chưa đủ để kết luận danh tính virus Bảng 4.16 Kết tìm kiếm virus gần gũi Ngân hàng gen (Genbank) dùng trình tự thu được mẫu virus VNP1500 Virus gần gũi Ngân hàng gen* Mã Ngân hàng gen Phần trăm đoạn so sánh (%) Mức đồng trình tự (%0 AF414287 100 88 DQ64169 97 89 Pepper leaf curl virus (Thái Lan), DNA-A AF134484 100 97 Tomato yellow leaf curl Kanchanaburi virus (Thái Lan, isolate E4), DNA-B KF446664 93 89 VNP1500 Tomato yellow leaf curl Kanchanaburi -20 virus (Thái Lan, isolate P4), DNA-B KF446672 93 89 Tomato yellow leaf curl Kanchanaburi virus (Thái Lan, isolate P3), DNA-B KF446670 93 89 Plasmid giải trình tự Tên virus (nguồn gốc), loại phân tử gen Pepper leaf curl Malaysia virus (Malaysia), DNA-A VNP1500 -1 (DNA- Erectites yellow mosaic virus (Việt Nam), A) DNA-A * Chỉ trình bày virus gần gũi dung phần mềm tìm kiếm trực tuyến BLAST NCBI 4.5.2 So sánh trình tự với PepYLCVNV Do DNA-A mẫu virus VNP1500 ln có phản ứng PCR dương tính với mồi đặc hiệu PepYLCVNV Bộ gen virus chưa gửi Ngân hàng gen nên tiến hành so sánh trình tự mẫu virus VNP1500 với PepYLCVNV (VNP93) Trình tự virus gần gũi Ngân hàng gen như: PepLCV, TYLCKaV ErYV sử dụng phân tích Kết so sánh trình bày bảng 4.17 Kết so sánh cho thấy phân tử DNA-A DNA-B mẫu VNP1500 có mức đồng trình tự cao (>90%) virus PeYLCVNV (mẫu VNP93) Mặc dù danh tính xác virus xác định dựa trình tự tồn bộ gen mức đồng cao cho thấy mẫu VNP1500 PepYLCVNV Kết cho thấy PepLCVNV có phân bố rộng, tỉnh miền Trung miền nam nước ta Bảng 4.17 So sánh đoạn trình tự thu được mẫu virus VNP1500 với PepYLCVNV (VNP93) gần gũi Ngân hàng gen Loại phân tử geno me Mức đồng trình tự (%)* Virus so sánh DNA- PepYLCVNV (VNP93, Việt nam, A DNA-A) VNP1500-1 90.9 PepLCV (AF414287, Malaysia, DNA-A) 87.8 PepLCV (AF134484, Thái Lan, DNA-A) 86.3 EYMV (DQ641698, Việt Nam, DNAA) 86.9 VNP1500-20 TYLCKaV (AF511529, Thai Lan, DNA-A) 71.7 PepYLCVNV (VNP93, Việt nam, DNA- DNA-B) B TYLCKaV (AF511528, Thái Lan, 92.5 86.6 DNA-B) * Chỉ tính đoạn trình tự thu mẫu VNP1500 (1697 nts plasmid VNP1500-1 1396 nts plasmid VNP1500-20) 4.6 Kết kiểm tra số loại virus gây hại ớt thu thập miền Bắc miền Trung giai đoạn 2012-2013 4.6.1 Kiểm tra virus gây hại thu thập đồng từ địa điểm điều tra giai đoạn 2012-2013 phương pháp ELISA Nhằm xác định nguyên nhân gây bệnh virus gây hại ớt , tiến hành thu thập mẫu bệnh có triệu chứng điển hình thu thập từ địa điểm điều tra Mẫu bệnh thu làm khô bảo quản silicagel Để kiểm tra mẫu có triệu chứng thu được, tiến hành kiểm tra phản ứng ELISA trực tiếp (DAS – ELISA) Nguồn kháng huyết sử dụng kháng huyết Chilli Veinal mottle Virus (ChiVMV), potyvirus phổ biến ớt Việt Nam Tổng số 28 mẫu có triệu chứng virus thu thập q trình điều tra ngồi đồng ruộng kiểm tra ELISA, mẫu kết luận dương tính có trị số ELISA lớn gấp đôi trị số ELISA đối chúng âm (cây khỏe) Kết thể bảng 4.1, hình 4.1.1 Kết bảng 4.1 hình 4.32 hình 4.33 cho thấy: Kết kiểm tra cho thấy có 12/28 mẫu bị nhiễm ChiVMV (chiếm 54.55%) Điều đó, cho thấy chủng ChiVMV virus quan trọng ớt Việt Nam Bảng 4.18 Kết kiểm tra ELISA mẫu ớt thu được Việt Nam giai đoạn 2012-2013 ST T ChiVMV Ký hiệu Triệu chứng Địa điểm OD KL VNP96 Cuốn lá, khảm Túy Loan-Đà Nẵng 0.874 + VNP120 Khảm Thái Bình 2.717 VNP179 Cuốn lá, khảm Cam Lộ-Quảng Trị 0.156 + – VNP192 Khảm Cam Đường-Lào Cai 0.162 – VNP217 Khảm Cò Nòi-Sơn La 0.244 + VNP237 Cuốn lá,khảm Cổ Phúc-Yên Bái 0.146 – VNP251 Cuốn lá,khảm Chiềng Sinh-Sơn La 0.923 + VNP291 Khảm vàng, nhỏ Vĩnh Tường-Vĩnh Phúc 1.642 + VNP300 Xoăn vàng Sóc Sơn-Hà Nội 0.150 – 10 VNP306 Khảm vàng Yên Thế-Bắc Giang 0.180 – 11 VNP313 Khảm vàng Châu Thành-An Giang – 12 VNP453 Khảm vàng Vĩnh Bảo-Hải Phòng 0.161 2.174 13 VNP535 Khảm Hòa An-Cao Bằng 0.144 14 VNP558 Khảm vàng Chợ Mới-Bắc Kạn 0.158 – – 15 VNP626 Khảm Túy Loan-Đà Nẵng 0.151 – 16 VNP632 Khảm vàng Túy Loan-Đà Nẵng 0.623 + 17 VNP634 Khảm vàng Điện Bàn-Quảng Nam 0.673 + 18 VNP649 Khảm vàng Phù Cát-Bình Định 1.058 + 19 VNP683 Khảm Thanh Bình-Đồng Tháp 2.160 + 20 VNP706 Khảm vàng Châu Thành-An Giang 1.844 + 21 VNP716 Khảm Yên Thế-Bắc Giang >3 22 VNP785 Khảm Bình Thủy-Cần Thơ 0.145 + – TTBCNĐ- ĐHNNHN 0.162 – TTBCNĐ- ĐHNNHN 0.160 – TTBCNĐ- ĐHNNHN 0.172 – TTBCNĐ- ĐHNNHN >3 + 23 24 25 26 Đối chứng (–) Không bị bệnh Đối chứng (–) Không bị bệnh Đối chứng (–) Không bị bệnh Đối chứng (+) Khảm vàng, nhỏ + 27 28 Đối chứng (+) Khảm vàng, nhỏ TTBCNĐ- ĐHNNHN >3 + Đối chứng (+) Khảm vàng, nhỏ TTBCNĐ- ĐHNNHN >3 + Số mẫu + 12 Tỷ lệ mẫu + 54.55% Ghi chú: OD: Mật độ quang học đo bước sóng 405 nm; KL: Kết luận; ( -) : Cây không nhiễm bệnh; (+): Cây nhiễm bệnh × trị số trung bình giá trị giếng đối chứng âm + độ lệch chuẩn=0.178 Hình 4.22 Kết ELISA phát hiện ChiVMV 4.6.2 Kiểm tra virus gây hại thu thập đồng từ địa điểm điều tra giai đoạn 2012-2013 phản ứng PCR Kết kiểm tra ELISA cho thấy, nhiều mẫu với triệu chứng điển khảm vàng tồn diện tích lá, lá, biến dạng lá… lại khơng dương với virus ChiVMV Chính chúng tơi nghi ngờ mẫu nhiễm begomovirus Vì vậy, chọn số mẫu âm với virus ChiVMV, với số mẫu nghi ngờ nhiễm begomovirus thu thập để kiểm tra PCR Tất mẫu chiết DNA tổng số CTAB phản ứng PCR sử dụng cặp mồi chung BegoA – For1/BegoA – Rev1 Kết trình bày bảng (4.2) hình 4.1.2 Kết kiểm tra cho thấy, 12 mẫu kiểm tra phát thấy mẫu phản ứng PCR dương (+), tức nhiễm bệnh, chiếm tỷ lệ 66,67% Các mẫu có phản ứng dương với cặp mồi chung BegoA – For1/BegoA – Rev1 tạo băng đơn gel, trùng kích thước sản phẩm băng điện di mong muốn ~1.2 kb, mẫu đối chứng dương có phản ứng Như vậy, kết kiểm tra xác nhận có mặt begomovirus 12 mẫu ớt kiểm tra Bảng 4.19 Kết kiểm tra mẫu ớt PCR sử dụng cặp mồi BegoA – For1 BegoA – Rev1 STT Mẫu Triệu chứng Cuốn lá, khảm Địa điểm Kết PCR FAVRI + Cam Lộ – Quảng Trị + VNP4 VNP179 Khảm vàng VNP192 Khảm Cam đường – Lào Cai – VNP234 Khảm Cổ Phúc – Yên Bái – VNP246 Xoăn Chiềng Sinh – Sơn La + VNP300 Khảm vàng Sóc Sơn – Hà Nội – VNP306 Khảm Yên Thế – Bắc Giang + VNP456 Sáng gân Quỳnh Phụ – Thái Bình – VNP459 Quỳnh Phụ – Thái Bình – 10 VNP535 Khảm Hòa An – Cao Bằng – 11 VNP558 Khảm nhăn Chợ Mới – Bắc Kạn – 12 VNP961 An dương – Hải Phòng – Sáng gân từ cuống Khảm, biến vàng Số mẫu dương/tổng số mẫu thử Tỷ lệ(%) Ghi chú: (+) Cây nhiễm virus, (–) Cây khơng nhiễm virus 8/12 66,67 Hình 4.23 Triệu chứng Begomovirus gây hại ớt Đà Nẵng Hình 4.24 Kiểm tra PCR mẫu ớt cặp mồi cặp mồi BegoA – For1 BegoA – Rev1 MarkerH2OVNP4VNP179VNP192VNP234VNP246VNP300 VNP306VNP456VNP459VNP538VNP558VNP9611 (ladder: 1kb) Từ kết trên, nhận thấy mẫu bệnh miền Bắc phản ứng PCR dương: VNP246 VNP306 Vì begomovirus chưa xuất miền Bắc, chúng tơi tiến hành kiểm tra PCR mẫu thêm lần Kết trình bày bảng (4.3) hình 4.1.3 Bảng 4.20 Kết kiểm tra mẫu ớt PCR sử dụng cặp mồi BegoA – For1 BegoA – Rev1 STT Mẫu Triệu chứng Địa điểm Kết PCR VNP246 Xoăn Chiềng Sinh – Sơn La – VNP306 Khảm Yên Thế – Bắc Giang + Số mẫu dương/tổng số mẫu thử 1/2 Tỷ lệ(%) 50 Ghi chú: (+) Cây nhiễm virus, (–) Cây không nhiễm virus Hình 4.24 Kiểm tra PCR mẫu ớt thu miền Bắc cặp mồi cặp mồi BegoA – For1 BegoA – Rev1 MarkerH2OVNP4VNP179 (ladder: 1kb) KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 5.1 Kết luận Đã phục hồi dòng vi khuẩn A tumerfaciens mang cấu trúc xâm nhiễm PepYLCVNV AT-VNP93-5-4-11 AT-VNP93-5-8-1 Đã lây nhiễm PepYLCVNV agroinoculation giống: cà chua Hồng Lan (T20), ớt Hiểm Lai F1-207, thị Đã lây nhiễm PepYLCVNV bọ phấn (B tabaci) giống: cà chua Hồng Lan (T20), cà tím GS505, ớt Hiểm lai F1-207 Kết cho thấy giống thí nghiệm biểu triệu chứng bệnh với tỷ lệ 100% nhiễm bệnh lây nhiễm bọ phấn Xây dựng thành công cấu trúc xâm nhiễm PepYLCVNV kỹ thuật RCA (rolling circle amplification) Đã giải trình tự tồn bộ gen gồm thành phần DNA-A DNA-B mẫu virus gây bệnh ớt thu Đồng Tháp (mẫu VNP1500) Đã kiểm tra PCR với cặp mồi chung để phát begomovirus mẫu ớt thu thập miền Bắc miền Nam Việt Nam Kết cho thấy có 2/12 (16.7%) mẫu ớt thu miền Bắc 6/12 (50%) mẫu ớt thu miền Trung nhiễm begomovirus 5.2 Kiến nghị Tiếp tục tối ưu hóa phương pháp lây nhiễm nhân tạo sử dụng vi khuẩn Agrobacterium tumerfaciens (Agroinoculation) PepYLCVNV nhằm đánh giá tính gây bệnh PepYLCVNV Sử dụng cấu trúc xâm nhiễm PepYLCVNV thiết kế để đánh giá tính gây bệnh PepYLCVNV Đánh giá tính gây bệnh begomovirus gây bệnh ớt kỹ thuật Agroinoculation Tiếp tục đánh gia đa dạng begomovirus ớt Việt Nam Lần phát virus begomovirus ớt miền Bắc nên cần kiểm tra lại TÀI LIỆU THAM KHẢO 6.1 TÀI LIỆU TIẾNG VIỆT Hà Viết Cường (2010), Công nghệ sinh học bệnh Hà Viết Cường (2012), Virus thực vật, Phytoplasma Viroid NXB Đại học Nơng nghiệp Vũ Triệu Mân (2003), Chẩn đốn nhanh bệnh hại thực vật, NXB Nông Nghiệp Vũ Triệu Mân – Lê Lương Tề chủ biên (2001) Giáo trình Bệnh Nơng Nghiệp NXB Nơng Nghiệp Lê Lương Tề, Vũ Triệu Mân (1999), Bệnh vi khuẩn virus hại trồng NXB Giáo dục, Hà Nội Nguyễn Thị Hà Uyên (2012) Xác định đánh giá khả gây bệnh số begomovirus cà chua phương pháp lây nhiễm nhân tạo dùng vi khuẩn Agrobacterium tumerfaciens 6.2 TÀI LIỆU TIẾNG ANH (1990) "High efficiency transformation of< i> Escherichia coli with plasmids." Gene 96(1): 23-28 Briddon (2003) "Cotton leaf curl disease, a multicomponent begomovirus complex." Molecular Plant Pathology 4(6): 427-434 Doyle (1987) "A rapid DNA isolation procedure for small quantities of fresh leaf tissue." Phytochem bull 19: 11-15 Fauquet and Stanley (2005) "Revising the way we conceive and name viruses below the species level: a review of geminivirus taxonomy calls for new standardized isolate descriptors." Archives of virology 150(10): 21512179 Fauquet, et al (2008) "Geminivirus strain demarcation and nomenclature." Archives of virology 153(4): 783-821 Ferreira, et al (2008) "One-step cloning approach for construction of agroinfectious begomovirus clones." Journal of virological methods 147(2): 351-354 Fujii, et al (2006) "Error-prone rolling circle amplification: the simplest random mutagenesis protocol." Nature protocols 1(5): 2493-2497 Gafni and Yedidya (2003) "Tomato yellow leaf curl virus, the intracellular dynamics of a plant DNA virus." Molecular plant pathology 4(1): 9-15 Ghanim and Czosnek (2000) "Tomato yellow leaf curl geminivirus (TYLCV-Is) is transmitted among whiteflies (Bemisia tabaci) in a sex-related manner." Journal of Virology 74(10): 4738-4745 10.Green (1991) Characteristics and control of viruses infecting peppers: a literature review, Asian Vegetable Research and Development Center 11.Green and Kim (1991) Characteristics and control of viruses infecting peppers: a literature review, Asian Vegetable Research and Development Center 12.Green, et al (2001) "Molecular characterization of begomoviruses associated with leafcurl diseases of tomato in Bangladesh, Laos, Malaysia, Myanmar, and Vietnam." Plant Disease 85(12): 1286-1286 13.Gutierrez, et al (2004) "Geminivirus DNA replication and cell cycle interactions." Veterinary microbiology 98(2): 111-119 14.Ha (2007) "Detection and identification of potyviruses and geminiviruses in Vietnam." 15.Ha (2008) "Molecular characterization of begomoviruses and DNA satellites from Vietnam: additional evidence that the New World geminiviruses were present in the Old World prior to continental separation." Journal of General Virology 89(1): 312-326 16.Ha, et al (2008) "Molecular characterization of begomoviruses and DNA satellites from Vietnam: additional evidence that the New World geminiviruses were present in the Old World prior to continental separation." Journal of General Virology 89(1): 312-326 17.Haible, D., et al (2006) "Rolling circle amplification revolutionizes diagnosis and genomics of geminiviruses." Journal of virological methods 135(1): 9-16 18.Harrison and Robinson (2005) "Another quarter century of great progress in understanding the biological properties of plant viruses." Annals of applied biology 146(1): 15-37 19.Hartz, T., et al (1997) Processing tomato production in California, UCANR Publications 20.Hofgen and Willmitzer (1988) "Storage of competent cells for Agrobacterium transformation." Nucleic Acids Research 16(20): 9877-9877 21.Inoue-Nagata, et al (2004) "A simple method for cloning the complete begomovirus genome using the bacteriophage φ29 DNA polymerase." Journal of virological methods 116(2): 209-211 22.Kheyr-Pour, et al (1991) "Tomato yellow leaf curl virus from sardinia is a whitefly-transmitted monoparatite geminivirus." Nucleic Acids Research 19(24): 6763-6769 23.Knierim and Maiss (2007) "Application of Phi29 DNA polymerase in identification and full-length clone inoculation of tomato yellow leaf curl Thailand virus and tobacco leaf curl Thailand virus." Archives of virology 152(5): 941-954 24.Moriones and Navas-Castillo (2000) "Tomato yellow leaf curl virus, an emerging virus complex causing epidemics worldwide." Virus Research 71(1): 123-134 25.Murugan and Uthamasamy (2001) "Dispersal behaviour of cotton whitefly Bemisia tabaci (Genn.) under cotton based gardenland agro ecosystem of Coimbatore, Tamil Nadu." MADRAS AGRICULTURAL JOURNAL 88(1/3): 1-6 26.Navot, N., et al (1991) "Tomato yellow leaf curl virus: a whiteflytransmitted geminivirus with a single genomic component." Virology 185(1): 151-161 27.Padidam, et al (1999) "Possible emergence of new geminiviruses by frequent recombination." Virology 265(2): 218-225 28.Picó, et al (1996) "Viral diseases causing the greatest economic losses to the tomato crop II The Tomato yellow leaf curl virus—A review." Scientia Horticulturae 67(3): 151-196 29.Picó, B., et al (1996) "Viral diseases causing the greatest economic losses to the tomato crop II The Tomato yellow leaf curl virus—a review." Scientia Horticulturae 67(3): 151-196 30.Rybicki (1994) "A phylogenetic and evolutionary justification for three genera of Geminiviridae." Archives of Virology 139(1-2): 49-77 31.Sambrook, et al (1989) "Extraction and purification of plasmid DNA." Molecular cloning: a laboratory manual 1: 1.21-21.52 32.Wang, et al (1993) "A simple method of preparing plant samples for PCR." Nucleic Acids Res 21(17): 4153-4154 33.Wang, T C., et al (1994) "Mammary hyperplasia and carcinoma in MMTVcyclin D1 transgenic mice." 34.Wu, et al (2008) "A simplified method of constructing infectious clones of begomovirus employing limited restriction enzyme digestion of products of rolling circle amplification." Journal of virological methods 147(2): 355-359 35.Wyant, et al (2011) "The genomes of four novel begomoviruses and a new Sida micrantha mosaic virus strain from Bolivian weeds." Archives of virology 156(2): 347-352 36.Zhang, et al (2001) "Movement proteins (BC1 and BV1) of Abutilon mosaic geminivirus are cotransported in and between cells of sink but not of source leaves as detected by green fluorescent protein tagging." Virology 290(2): 249-260 6.3 CÁC TRANG WEB http://www.avrdc.org http://www.basic.northwestern.edu/biotools/oligocalc.html http://wcrc.confex.com http://www.informaworld.com http://www.ncbi.nlm.nih.gov/ ... cứu tập trung chủ yếu begomovirus Pepper yellow leaf curl Vietnam virus (PepYLCVNV) gây bệnh xoăn vàng ớt cà chua Đánh giá đặc trưng sinh học cách đánh giá tính gây bệnh thơng qua Agrobacterium... phân tử, có lồi begomovirus phát gây bệnh xoăn vàng cà chua Việt Nam Loài thứ Tomato leaf curl Việt Nam virus (ToLCVNV) phân phập từ cà chua bị bệnh xoăn vàng ngọn miền Bắc vào năm 2001 (Green... mặt begomovirus cụ thể virus Tomato yellow leaf curl virus (TYLCVNV) Tomato leaf curl Vietnam virus (ToLCVV) ớt Tuy nhiên Việt Nam lại chưa có nhiều nghiên cứu xác định thành phần bệnh virus hại