Phát hiện và đánh giá tính gây bệnh của Pepper yellow leaf curl Việt Nam virus (Khóa luận tốt nghiệp)

Phát hiện và đánh giá tính gây bệnh của Pepper yellow leaf curl Việt Nam virusPhát hiện và đánh giá tính gây bệnh của Pepper yellow leaf curl Việt Nam virusPhát hiện và đánh giá tính gây bệnh của Pepper yellow leaf curl Việt Nam virusPhát hiện và đánh giá tính gây bệnh của Pepper yellow leaf curl Việt Nam virusPhát hiện và đánh giá tính gây bệnh của Pepper yellow leaf curl Việt Nam virusPhát hiện và đánh giá tính gây bệnh của Pepper yellow leaf curl Việt Nam virusPhát hiện và đánh giá tính gây bệnh của Pepper yellow leaf curl Việt Nam virusPhát hiện và đánh giá tính gây bệnh của Pepper yellow leaf curl Việt Nam virusPhát hiện và đánh giá tính gây bệnh của Pepper yellow leaf curl Việt Nam virus

HỌC VIỆN NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM

KHOA NÔNG HỌC

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP

ĐỀ TÀI

“Phát hiện và đánh giá tính gây bệnh của Pepper yellow leaf curl Việt Nam

virus ”

Giảng viên hướng dẫn : TS.Hà Viết Cường

Chuyên ngành : Bảo vệ thực vật

Hà Nội-2014

LỜI CẢM ƠN

Trong suốt quá trình hoàn thành báo cáo này ngoài những nỗ lực của bảnthân, tôi đã nhận được những sự giúp đỡ hết sức tận tình và quý báu từ nhiều tập thể

và cá nhân

Trước hết tôi xin được gửi lời cảm ơn chân thành và sâu sắc nhất tới thầy

TS Hà Viết Cường – Giám đốc trung tâm nghiên cứu bệnh cây nhiệt đới –

Trường Học viện nông nghiệp Việt Nam, Phó khoa Nông học và Ths Trần ThịNhư Hoa - Phó giám đốc trung tâm nghiên cứu bệnh cây nhiệt đới đã trực tiếphướng dẫn, tận tình chỉ bảo và tạo mọi điều kiện để tôi hoàn thành báo cáo

Tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành nhất tới cán bộ công nhân viên thuộcTrung tâm nghiên cứu bệnh cây nhiệt đới – Trường Học viện nông nghiệp ViệtNam, đã nhiệt tình giúp đỡ tôi trong suốt quá trình tôi thực tập tại Trung tâm

Đồng thời tôi cũng xin chân thành cảm ơn các Thầy giáo, Cô giáo trong bộmôn bệnh cây cũng như các Thầy cô trong khoa Nông học, Trường Học việnnông nghiệp Việt Nam đã nhiệt tình dạy dỗ, chỉ bảo cho tôi trong suốt thời giantôi học tập tại trường

Cuối cùng tôi xin được chân thành cảm ơn những người thân, gia đình, bạn bè

đã hết lòng giúp đỡ, động viên tôi trong quá trình học tập cũng như hoàn thành báocáo này

Một lần nữa tôi xin chân thành cảm ơn!

Hà Nội, ngày 31 tháng 7 năm 2014

Sinh viên

Hà Văn Dũng

MỤC LỤC

1 ĐẶT VẤN ĐỀ 11

1.1 Giới thiệu 11

1.2 Mục tiêu và yêu cầu của đề tài 12

1.2.1 Mục tiêu 12

1.2.2 Yêu cầu 12

2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 13

2.1 Tầm quan trọng của ớt và cà chua 13

2.2 Đặc điểm chung của Begomovirus 13

2.2.1 Đặc điểm hình thái 14

2.2.2 Cấu trúc genome của Begomovirus 14

2.2.3 Cấu trúc của phân tử DNA-A 15

2.2.4 Cấu trúc của phân tử DNA-B 16

2.2.5 Đặc điểm của vùng IR 16

2.2.6 Phân loại các Begomovirus 17

2.2.7 Tái sinh của Begomovirus 17

2.2.8 Triệu chứng bệnh do Begomovirus 18

2.2.9 Môi giới truyền bệnh và sự lan truyền 19

2.2.10 Thiệt hại kinh tế do Begomovirus gây ra 20

2.2.11 Phòng chống 21

2.3 Một số begomovirus hại cà chua 22

2.4 Một số begomovirus hại ớt 23

2.5 Kỹ thuật chẩn đoán bằng PCR 23

2.5.1 Giới thiệu và nguyên lý 23

2.6 Kỹ thuật RCA (Rolling circle amplication) 24

2.7 Kĩ thuật Agroinoculation 25

3 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 28

3.1 Đối tượng nghiên cứu 28

3.2 Địa điểm nghiên cứu và thời gian thực hiện 28

3.2.1 Địa điểm nghiên cứu 28

3.3 Thời gian thực hiện 28

3.4 Vật liệu nghiên cứu 28

3.4.1 Cây thí nghiệm: 28

3.4.2 Thu thập mẫu 29

3.4.3 Dòng vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens mang cấu trúc xâm nhiễm của

PepYLCVNV 30

3.4.4 Chất kháng sinh 32

3.4.5 Hóa chất, dung dịch đệm 32

3.4.6 Kit thương mại 33

3.4.7 Môi trường 33

3.4.8 Các thiết bị chủ yếu 33

3.4.9 Dụng cụ nghiên cứu 34

3.5 Phương pháp nghiên cứu 34

3.5.1 Phương pháp điều tra đồng ruộng 34

3.5.2 Thí nghiệm trong nhà lưới 35

3.5.3 Phương pháp kiểm tra virus bằng PCR 35

3.5.4 Tiến hành phản ứng PCR (Polymerase Chain Reaction) 37

3.5.5 Chạy điện di sản phẩm PCR và xem kết quả phản ứng 39

3.5.6 Tinh chiết sản phẩm điện di 40

3.5.7 Xây dựng cấu trúc xâm nhiễm 40

3.5.8 Chuẩn bị E.coli chủng X1 Blue khả biến 41

3.5.9 Biến nạp cấu trúc xâm nhiễm vào tế bào vi khuẩn E.coli khả biến bằng phương pháp sốc nhiệt 41

3.5.10 Phản ứng PCR kiểm tra các khuẩn lạc mọc trên môi trường chọn lọc 42

3.5.11 Tinh chiết plasmid 42

3.5.12 Chuẩn bị vi khuẩn A tumefaciens khả biến (competent cells) 43

3.5.13 Biến nạp cấu trúc xâm nhiễm vào tế bào vi khuẩn A.tumefaciens khả biến

44 3.5.14 Xác định trình tự gen và xử lý số liệu bằng các phần mềm chuyên dụng 45

3.5.15 Phản ứng PCR kiểm tra các khuẩn lạc mọc trên môi trường chọn lọc 45

3.5.16 Lây nhiễm nhân tạo sử dụng kỹ thuật agroinoculation 46

3.5.17 Đánh giá tính gây bệnh 47

3.5.18 Lây nhiễm nhân tạo dùng bọ phấn 48

3.5.19 Kiểm tra các mẫu bằng phản ứng ELISA 49

4 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 53

4.1 Kết quả kiểm tra một số loại virus gây hại trên ớt thu thập trên cả nước giai đoạn 2012-2013 53

4.1.1 Kiểm tra virus gây hại thu thập ngoài đồng từ các địa điểm điều tra giai đoạn 2012-2013 bằng phương pháp ELISA 53

4.1.2 Kiểm tra virus gây hại thu thập ngoài đồng từ các địa điểm điều tra giai

đoạn 2012-2013 bằng phản ứng PCR 55

4.2 Đánh giá tính gây bệnh của PepYLCVNV bằng lây nhiễm nhân tạo dùng kĩ thuật agroinoculation 58

4.2.1 Phục hồi các dòng vi khuẩn A tumefaciens mang cấu trúc xâm nhiễm của PepYLCVNV 58

Bảng 4.1 Kết quả phục hồi 2 dòng vi khuẩn mang cấu trúc xâm nhiêm của PepYLCVNV 59

4.2.2 Nhân sinh khối dòng vi khuẩn A.tumerfaciens trong môi trường LB-lỏng 60

4.2.3 Kết quả đánh giá tính gây bệnh của PepYLCVNV bằng phương pháp Agroinoculation 61

4.2.4 Tính gây bệnh của DNA-A (lây nhiễm bằng agroinoculation) 63

4.2.5 Tính gây bệnh của cả DNA-A & DNA-B (lây nhiễm bằng agroinoculation) ………66

4.3 Đánh giá tính gây bệnh của PepYLCVNV bằng lây nhiễm nhân tạo dùng bọ phấn 69

4.3.1 Lây nhiễm PepYLCVNV bằng cây cà tím nguồn bệnh 70

4.3.2 Lây nhiễm PepYLCVNV bằng cây ớt nguồn bệnh 71

4.4 Đánh giá tính kháng của PepYLCVNV trên tập đoàn giống ớt của AVRDC 71

4.4.1 Thiết kế cấu trúc xâm nhiễm của PepYLVNV 72

4.4.2 Chuẩn bị vector pCAMBIA2300 74

5 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 82

5.1 Kết luận 82

5.2 Kiến nghị 82

6 TÀI LIỆU THAM KHẢO 0

6.1 TÀI LIỆU TIẾNG VIỆT 0

6.2 TÀI LIỆU TIẾNG ANH 0

6.3 CÁC TRANG WEB 4

DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT

dsDNA Double strand DNA

E.coli Escherichia coli

EDTA Ethylene diamine tetra acetic acid

ICTV International Committee on Taxonomy of Viruses

IR Itergenic region

ORF Open reading frame

PCR Polymerase Chain Reaction

RCA Rolling circle amplification

RE Restriction enzyme

Rep Replication protein

RNA Ribonucleic acid

Rnase Ribonuclease

SDS Sodium Dodecyl Sulphate

SsDNA Singe strand DNA

TAE Tris – acetate – EDTA

Vir Virulence region

β- ME Beta- Mercaptoethanol

DANH MỤC BẢNG

Bảng 3.4 Cây thí nghiệm 43

Bảng 3.3 Các mẫu ớt, cà tím thu thập (2013) 44

Bảng 3.1 Thang phân cấp bệnh 50

Bảng 3.6 Thí nghiệm lây nhiễm được thực hiện với các công thức 62

Bảng 4.1 Kết quả kiểm tra ELISA các mẫu ớt thu được tại Việt Nam giai đoạn 2012-2013 68

Bảng 4.2 Kết quả kiểm tra các mẫu ớt bằng PCR sử dụng cặp mồi BegoA – For1 và BegoA – Rev1 71

Bảng 5 Tính gây bệnh của PepYLCV khi lây nhiễm chỉ DNA-A giống cà chua Hồng Lan (T20) 79

Bảng 5 Tính gây bệnh của PepYLCV khi lây nhiễm chỉ DNA-A giống ớt Hiểm Lai F1-207 80

Bảng 4.13 Tính gây bệnh của PepYLCV khi lây nhiễm chỉ DNA-A trên cây chỉ thị 80

Bảng 5 Tính gây bệnh của PepYLCV khi lây nhiễm của cả DNA-A và DNA-B trên giống cà chua Hồng Lan (T20) 82

Bảng 5 Tính gây bệnh của PepYLCV khi lây nhiễm của cả DNA-A và DNA-B trên giống ớt Hiểm Lai F1-207 82

Bảng 4.13 Tính gây bệnh của PepYLCV khi lây nhiễm của cả A và DNA-B trên cây chỉ thị 83

Bảng 7 Kết quả lây nhiễm PepYLCV bằng bọ phấn trên cây cà tím nguồn bệnh .85

Bảng 8 Kết quả lây nhiễm PepYLCV bằng bọ phấn trên cây ớt nguồn bệnh 85

Bảng 4.10 Cấp bệnh xoăn vàng lá của các giống ớt AVRDC 86

Bảng 4.3 Tóm tắt các bước xây dựng cấu trúc xâm nhiễm 88

Bảng 4.4 Hiệu quả xử lý sản phẩm RCA với các phương pháp chiết khác nhau 91

Bảng 4.5 Tối ưu hóa điều kiện cho phản ứng cắt không hoàn toàn sản phẩm RCA của PepYLCV 93

DANH MỤC HÌNH

Hình 2.1 Hình thái của begomovirus 11

Hình 2.2 Cấu trúc phân tử DNA-A, DNA-B của begomovirus 12

Hình 2.3 Cấu trúc phân tử DNA-A của Begomovirus 13

Hình 2.4 Cấu trúc phân tử DNA-B của Begomovirus 13

Hình 2.5 Triệu chứng do Begomovirus gây ra trên ớt và cà chua 16

Hình 2.6 Bọ phấn Bemisia tabaci 18

Hình 3.1 Sơ đồ tổ chức bộ gen DNA-A 28

Hình 4.32 Kết quả ELISA phát hiện ChiVMV 52

Hình 4.1 Triệu chứng của Begomovirus gây hại trên ớt tại Đà Nẵng 54

Hình 4.2 Kiểm tra PCR các mẫu đậu đỗ bằng cặp mồi cặp mồi BegoA – For1 và BegoA – Rev1 54

Bảng 4.1 Kết quả phục hồi 2 dòng vi khuẩn mang cấu trúc xâm nhiêm của PepYLCVNV 56

Hình 4.2 Dòng vi khuẩn A.tumerfaciens chứa cấu trúc xâm nhiễm PepYLCVNV nuôi trong LB – lỏng 58

Hình4.6 Phương pháp tiêm trực tiếp dịch vi khuẩn vào mô lá 60

Hình 4.3 Sơ đồ các bước xây dựng cấu trúc xâm nhiễm của PepYLCVNV sử dụng kỹ thuật RCA 70

Hình 4.4 Sơ đồ vector pCAMBIA2300 71

Hình 4.5.Điện di sản phẩm PCR kiểm tra plasmid sử dụng cặp mồi pCAMseqF1/R 72

Hình 4.11 Điện di sản phẩm khi mở vòng pCAMBIA 2300 bằng BamHI 72

Hình 4.8 Xử lý sản phẩm RCA mẫu VNP1500 bằng cách cắt hoàn toàn với enzyme BamHI 10 u/µl 74

Hình 4.9.Cắt không triệt để sản phẩm RCA ở các điều kiện khác nhau 75

TÓM TẮTTrong nghiên cứu này chúng tôi tiến hành nghiên cứu tập trung chủ yếu vềbegomovirus đó là Pepper yellow leaf curl Vietnam virus (PepYLCVNV) gâybệnh xoăn vàng lá trên ớt và cà chua

Đánh giá đặc trưng sinh học bằng cách đánh giá tính gây bệnh thông quaAgrobacterium tumerfaciens (Agroinoculation), đồng thời chúng tôi tiến hành lâynhiễm PepYLCVNV thông qua môi giới truyền bệnh trung gian là bọ phấn

Dựa trên mồi đặc hiệu và mồi chung, các phản ứng PCR đã được thực hiệntrên một loạt các mẫu ớt thu tại miền Bắc và miền Trung Việt Nam nhằm pháthiện PepYLCV và begomovirrus khác Lần đầu tiên phát hiện sự có mặt củabegomovirrus trên ớt tại miền Bắc

Chúng tôi đã tiến hành xây dựng thành công cấu trúc xâm nhiễm củaPepYLCVNV, phân tích đặc trưng phân tử của của PepYLCVNV

1 ĐẶT VẤN ĐỀ 1.1 Giới thiệu

Chi Begomovirus là chi lớn nhất và quan trọng nhất trong họGeminiviridae cả về số lượng loài và bệnh do chúng gây ra với cây trồng.Begomovirus (được đặt tên từ Bean golden mosaic virus) là tên gọi chung chỉ cácvirus thuộc chi Begomovirus có phân virion (hạt virus) dạng hình cầu kép (hìnhchùy) và bộ gen DNA sợi vòng đơn, kích thước khoảng 2,7 kb, lan truyền trênđồng ruộng bằng bọ phấn (Bemisia tabaci) theo kiểu bền vững tuần hoàn

Begomovirus có thể có bộ gen đơn (gồm một phân tử DNA-A) hoặc có bộgen kép (gồm hai phân tử DNA-A và DNA-B) Ở một số loại cây chỉ cần phân tửDNA-A đã gây triệu chứng điển hình, còn ở một số loại cấy khác thì cần có cảphân tử DNA-A và DNA-B mới gây ra triệu chứng bệnh

Begomovirus gây bệnh trên các loại cây đều có các triệu chứng đặc trưng,điển hình là: cuốn lá (cong lại hình thìa); mép lá (đặc biệt ở lá non) biến vàng; lánhỏ hẹp; cây nhiễm sớm còi cọc với tỷ lệ đậu quả rất thấp Danh tính virus chỉ cóthể được xác định dựa vào các phân tích phân tử

Việt Nam được chứng minh là trung tâm đa dạng quan trọng củabegomovirus Mặc dù vậy số lượng begomovirus xác định trên thực vật của ViệtNam vẫn còn ít chỉ gồm 19 loài được phân lập từ nhiều loài cây, trong đó cónhiều cây dại (Green, Tsai et al., 2001), (Ha, 2007)

Trên cây họ cà, đã có 6 begomovirus được phát hiện gây bệnh xoăn vàng lá

cà chua tại Việt Nam Tuy nhiên hiện vẫn chưa có công bố nào cho thấy sự có mặtcủa begomovirus trên ớt Năm 2012, một loạt các mẫu ớt biểu hiện triệu chứngbệnh virus trên ớt đã được TTNC Bệnh cây Nhiệt đới (Trường ĐHNN Hà Nội)thu thập khắp cả nước Các phân tích phân tử từ một mẫu virus phân lập đầu tiên

từ ớt thu thập tại Đà Nẵng (mẫu VNP93) đã xác định được một loài begomovirusmới và virus này được đặt tên là Pepper yellow leaf curl Vietnam virus(PepYLCVNV)

Các nghiên cứu sơ bộ tại TT NCBC NĐ cũng cho thấy virus này cũngnhiễm tự nhiên cả trên cây cà chua bị bệnh xoăn vang lá Việc lần đầu tiên pháthiện được một begomovirus gây hại tự nhiên trên ớt ở Việt Nam có ý nghĩa quantrọng cả về mặt khoa học và thực tiễn vì cây cây ớt cũng như cây cà chua là cáccây trồng quan trọng của Việt Nam.

Do PepYLCVNV là một virus mới nên phân bố cũng như đặc điểm sinhhọc, đặc biệt là phổ ký chủ của virus vẫn chưa được nghiên cứu

Dựa trên cơ sở khoa học và thực tiễn trên, chúng tôi tiến hành thực hiện đề

tài: “Phát hiện và đánh giá tính gây bệnh của Pepper yellow leaf curl Việt Nam virus”

1.2 Mục tiêu và yêu cầu của đề tài

- Thu thập mẫu bệnh trên ớt với triệu chứng cuốn lá điển hình

- Phát hiện PepYLCVNV bằng PCR dùng mồi đặc hiệu trên các mẫu ớt và

cà chua thu thập trong nghiên cứu này và thu thập từ trước

- Đánh giá tính gây bệnh của PepYLCVNV bằng lây nhiễm nhân tạo dùng

kỹ thuật agroinoculation trên cà chua, ớt và một số cây chỉ thị

- Đánh giá tính gây bệnh của PepYLCVNV bằng lây nhiễm nhân tạo dùngvector bọ phấn

2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1 Tầm quan trọng của ớt và cà chua

Cây ớt là một loại quả của cây cây thuộc chi Capsicum của họ Cà(Solanaceae) Ớt cĩ nguồn gốc từ châu Mỹ, ngày nay nĩ được trồng khắp nơi trênthế giới và được sử dụng làm gia vị, rau, và thuốc Hiện nay, Ấn Độ là nước sảnxuất ớt lớn nhất thế giới với khoảng 1 triệu tấn mỗi năm, nơi chỉ riêngChợ Guntur (lớn nhất châu Á) cĩ 1 triệu bao ớt Ở Việt Nam, ớt là một gia vịthường xuyên cĩ mặt trong các bữa ăn, ngồi ra ớt cịn cĩ rất nhiều cơng dụngnhư: cải thiện hệ tiêu hĩa, giảm cân, chữa bệnh ung thư, ngừa tai biến mạch, tăngsức đề kháng

Cà chua (S.lycopersicum) cĩ nguồn gốc từ Nam Mỹ, nĩ được người TâyBan Nha lan truyền tới Pilippine, Đơng Nam Á và tồn bộ Châu Á, cuối cùng làChâu Âu Cà chua là lồi trái cây vườn phổ biến nhất ở Hoa Kỳ Khoảng 150triệu tấn cà chua đã được sản xuất ra trên Thế giới trong năm 2009 Trung Quốc lànước sản xuất cà chua lớn nhất, chiếm khoảng một phần tư sản lượng tồn cầu,tiếp theo là Hoa Kỳ và Ấn Độ Các khu vực chế biến tại California chiếm 90%lượng sản xuất ở Mỹ và 35% lượng sản xuất thế giới (Hartz, Miyao et al., 1997).Cũng như ớt, ở nước ta cà chua là một gia vị hay cĩ trong mỗi bữa ăn, bởi cà chua

là một thực rất giàu : Nước (chiếm 93 đến 95 % ), giàu nguyên tố khống,vàvitamine A, C, và E Cà chua chín chứa nhiều sắc tố trong nhĩm của caroténọdes,như β-carotène cho một hoạt chất tiền vitamine A rất cĩ lợi cho sức khỏe

2.2 Đặc điểm chung của Begomovirus

Trong bốn chi của họ Geminiviradae, chi Begomovirus (được đặt tên từ

Bean golden mosaic virus) là chi quan trọng nhất, cả về số lượng lồi (198 lồivào năm 2010, website ICTV) cũng như các bệnh mà chúng gây ra trên cây trồng.Tất cả các begomovirus (tên gọi chỉ các virus thuộc chi Begomovirus) đều khơngtruyền qua hạt giống nhưng lan truyền ngồi tự nhiên nhờ bọ phấn (Bemisiatabaci) theo kiểu bền vững tuần hồn (Fauquet and Stanley, 2005)

2.2.1 Đặc điểm hình thái

Đặc điểm hình thái chung của các Begomovirus đều có cấu trúc phân tử(virion) tương tự nhau bao gồm 2 hình cầu 20 mặt (icosahedron), mỗi mặt là 1tam giác đều với số đơn vị tam giác (T) trên mỗi mặt bằng 1, nối với nhau để tạo

ra phân tử hình cầu đa diện kép (gemini) Do nối với nhau nên 2 hình cầu nàykhông hoàn thiện dẫn tới trên mỗi hình cầu chỉ có 55 tiểu phần protein (proteinvỏ) được xắp xếp thành 11 đơn vị hình thái, mỗi đơn vị gồm 5 tiểu phần protein(pentameric capsomer) Kết quả là toàn bộ phân tử có 110 tiểu phần và 22 đơn vịhình thái (Gafni and Yedidya, 2003), (Zhang, Cheng et al., 2001)

Hình 2.1 Hình thái của begomovirus (Nguồn ảnh:

www.ncbi.nlm.nih.gov)

2.2.2 Cấu trúc genome của Begomovirus

Begomovirus là virus thực vật có bộ gen DNA sợi vòng đơn có kích thước

khoảng 2,6- 2,8 kb Chúng hoặc có bộ gen kép (bipartite) gồm 2 phân tử DNA gọi

là DNA-A và DNA-B hoặc có bộ gen đơn (monopartite) tương đương DNA-A(Ha, 2007)

Hình 2.2 Cấu trúc phân tử DNA-A, DNA-B của begomovirus (Nguồn

ảnh: www.expasy.ch)

2.2.3 Cấu trúc của phân tử DNA-A

Cấu trúc của một DNA-A điển hình gồm 6 ORF (Open Reading Frame)được sắp xếp theo hai chiều ngược nhau Trên chiều kim đồng hồ (chiều virus) cóhai gen AV1 và AV2 Gen AV1(CP) mã hóa vỏ protein có chức năng chính là tạo

vỏ phân tử virus, lan truyền Begomovirus qua vector, vận chuyển bộ gen virus

vào và ra khỏi nhân tế bào ký chủ và vận chuyển bộ gen giữa các tế bào Gen AV2

mã hóa Protein có chức năng cảm ứng triệu chứng, di chuyển hệ thống và tích lũyDNA của virus Trên chiều ngược kim đồng hồ (chiều sợi tương đồng virus) gồm

có 4 ORF: AC1, AC2, AC3, AC4 Trong đó, gen AC1 mã hóa protein tái sinh(Rep protein) có chức năng chính là cắt- nối bộ gen virus trong quá trình tái sinh

và tương tác với protein của ký chủ điều khiển chu kỳ tế bào Gen AC2 Transcriptional Activator Protein) mã hóa Protein hoạt hóa phiên mã có chứcnăng ức chế phản ứng phòng thủ của cây Gen AC3 mã hóa protein tăng cường táisinh (REn- Replication Enhancer) có chức năng tương tác với prote ký chủ điềukhiển chu kỳ tế bào Gen AC4 mã hóa protein có chức năng liên quan tới phổ kýchủ, phát triển triệu chứng, ức chế hoạt động câm gen của tế bào ký chủ (Ha,2007)

(TrAP-Hình 2.3 Cấu trúc phân tử DNA-A của Begomovirus

(http://wcrc.confex.com)

2.2.4 Cấu trúc của phân tử DNA-B.

DNA-B của các Begomovirus kép chỉ chứa 2 ORF và cũng được sắp xếp

theo 2 chiều ngược nhau Trên chiều kim đồng hồ chứa gen BV1, trên chiềungược kim đồng hồ chứa gen BC1

BV1 là một protein con thoi: (NSP- Nuclear shuttle protein) có chức năng

chính là vận chuyển bộ gen virus vào, ra khỏi nhân tế bào, tuy vậy nó không liênquan đến việc nhập nhân của virus trong lúc xâm nhiễm, chức năng này đượckiểm soát bởi CP

BC1 là một protein vận chuyển : (MP- Movement protein) có chức năng

vận chuyển bộ gen virus giữa các tế bào ký chủ

Hình 2.4: Cấu trúc phân tử DNA-B của Begomovirus (Ha, Coombs et al.,

2008)

2.2.5 Đặc điểm của vùng IR

Vùng IR (Intergenic region) là vùng liên gen không mã hóa, nằm giữa 2vùng gen mã hóa ngược chiều nhau, có cả trên DNA-A và DNA-B Vùng này cóchứa nguồn gốc tái sinh (ori- origin of replication) gồm các chuỗi lặp đảo (iteron)cần thiết cho sự nhận biết và gắn kết protein Rep và 1 cấu trúc thân- thòng lọng(stem-loop) có chứa chuỗi TAATATTAC giống nhau ở tất cả các begomovirus Vịtrí T7 – C8 của chuỗi này là nơi protein Rep cắt và nối bộ gen Begomovirus trongquá trình tái sinh

Đối với begomovirus có bộ gen kép có chứa 1 chuỗi bảo thủ cao (khoảng

150 nucleotide) giữa 2 phân tử gọi là vùng chung CR (Common Region) Vùng

CR có vai trò quan trọng trong quá trình tái sinh của DNA-B bởi chuỗi ori- nguồn

gốc tái sinh nằm trên vùng này Tuy nhiên, với số gen ít ỏi của mình, DNA-Bkhông thể tự tái sinh trong tế bào ký chủ mà cần có sự nhận biết và cắt- nối củaprotein Rep được mã hóa trên DNA-A (Ha, 2008)

2.2.6 Phân loại các Begomovirus

Begomovirus được chia làm hai nhóm chính là nhóm Tân thế giới (New

world) bao gồm Châu Mỹ và nhóm Cựu thế giới (Old world) là khu vực Đôngbán cầu bao gồm châu Âu, châu Phi, châu Á (Padidam, Stanley et al., 1999),(Rybicki, 1994)

Các begomovirus của hai nhóm tân thế giới và cựu thế giới được phân biệt nhau bởi đặc điểm bộ gen Tất cả các begomovirus ở cụm Tân thế giới đều có bộ gen kép, trong khi đó các begomovirus ở cụm Cựu thế giới có cả bộ gen đơn và kép, thêm vào đó tất cả các begomovirus của cụm Cựu thế giới có thêm một gen

AV2 trên DNA-A, gen này không tồn tại ở các virus của cụm Tân thế giới

(Rybicki et al., 1994; Stanley et al., 2005) Begomovirus ở cụm Tân thế giới có

chuỗi PWRsmaGT ở đầu N trong vỏ protein (CP) mã hóa bởi gen AV1, chuỗi này

không có mặt ở begomovirus của cụm Cựu thế giới (Harrison and Robinson,

2005)

Rybicki (1994) dự đoán rằng bọ phấn di chuyển từ Châu Á sang châu Mỹ

có thể đã mang tổ tiên virus của cụm Tân thế giới mà chúng ta quan sát thấy ngàynay Các virus này sau đó tiến hóa theo một hướng khác với các virus ở cụm Cựuthế giới

2.2.7 Tái sinh của Begomovirus

Begomovirus tái sinh theo cơ chế vòng lăn (rolling circular mechanism)

Cơ chế vòng lăn có thể được chia làm 2 pha và được thực hiện trong nhân tế bào

ký chủ (Gutierrez, Ramirez-Parra et al., 2004), (Picó, Díez et al., 1996) Pha tổnghợp sợi DNA vòng đơn (bộ gen có mặt trong phân tử virus) thành sợi DNA vòngkép khi bộ gen virus được chuyển vào nhân tế bào Như vậy sợi kép sẽ gồm mộtsợi virus và một sợi tương đồng virus Pha này vẫn chưa được hiểu rõ (2) Pha táisinh theo cơ chế vòng lăn: Protein Rep (sau khi được tổng hợp) sẽ cắt sợi virus tạichuỗi bảo toàn TATATTAC Nhờ vật liệu cũng như enzyme DNA polymearase

của tế bào, sợi virus được tổng hợp liên tục trên sợi tương đồng virus Protein Replại tiếp tục cắt sợi virus mới được tổng hợp tại chuỗi TATATTAC (cũng vừa mớiđược tổng hơp) thành một sợi virus hoàn chỉnh dưới dạng sợi đơn mạch thẳng.Protein Rep sau đó sẽ nối 2 đầu của mạch thẳng để tạo ra bộ gen virus sợi đơnmạch vòng hoàn chỉnh.

2.2.8 Triệu chứng bệnh do Begomovirus

Do virus phải dựa hoàn toàn vào vật chất của tế bào ký chủ để sinh sản, nên

ở cây non và phần non của cây là nơi virus sinh sản rất mạnh Ở các cây, tế bàogià cỗi, quá trình này sẽ chậ m lại hay hầu như ngừng hẳn Vì vậy điều kiện ngoạicảnh như: nhiệt độ quá cao, quá thấp, độ pH của môi trường, ánh sáng, chế độdinh dưỡng, chăm sóc cũng có ảnh hưởng đến quá trình biểu hiện triệu chứng củabệnh do các begomovirus Tuy nhiên, thông thường triệu chứng xuất hiện sau 2-4tuần nhiễm bệnh và phát triển đầy đủ trong vòng 2 tháng (Pico et al., 1996) Mộtchất được nhiều nhà khoa học xác nhận có bản chất protein tan là interferon cóthể đã được sản sinh ra ở tế bào ký chủ khi virus xâm nhập Với nồng độ thấpkhoảng một phần triệu gram đã có khả năng ức chế sinh sản của virus Chính vìnhững lý do trên bệnh virus không gây được tác hại huỷ diệt ngay mà thường gâythoái hoá Sự huỷ diệt chỉ xảy ra khi điều kiện môi trường và cây bệnh thuận lợicho virus sinh sản và lây nhiễm, như trong các trận dịch của bệnh lúa vàng lụi ởnước ta những năm 1960 (Nguyễn Thị Hà Uyên, 2012)

Triệu chứng sớm nhất là lá cong xuống dưới vào phía bên trong Về sau, lá

không có hình dạng, nhỏ hẹp, biến vàng từ mép và chót lá lan vào giữa gân; lá

cuốn cong lên phía trên thành hình thuyền; lá non biến vàng mạnh, giòn và nhỏ hẹp Cuống lá có thể xoắn vặn Cây lùn còi cọc, mọc nhiều cành nhánh nhỏ,

đốt thân ngắn Cây nhiễm sớm thường không ra quả do hoa bị rụng (Picó, Díez etal., 1996) Bệnh thường xuất hiện vào các vụ có thời tiết nóng như hè thu và xuânhè

Hình 2.5 Triệu chứng do Begomovirus gây ra trên ớt và cà chua

(httpwww.avrdc.org)

2.2.9 Môi giới truyền bệnh và sự lan truyền

Tất cả các begomovirus lan truyền ngoài tự nhiên nhờ bọ phấn (B tabaci)

theo kiểu bền vững tuần hoàn (persistant- circulant) Bọ phấn Bemisa tabaci

Gennadius (1989) thuộc họ rầy phấn (Aleyrodidae), bộ cánh đều (Homotera)

Cho đến nay trên thế giới có hai loài bọ phấn được công nhận đó là:

Bemisia tabaci và Bemisia argentifolii, loài Bemisia argentifolii được tìm thấy

nhiều ở Hoa kỳ, Nhật, Pháp, Colombia, Israel, Ai Cập, Trung Quốc, … Sự khác

nhau giữa hai loài bọ phấn này là B argentifolii ăn tạp, mắn đẻ hơn, gây rối loạn

độc tố cho cây trồng

Theo Navot và cộng sự (1991), bọ phấn Bemisia tabaci hoàn thành một

vòng đời khoảng 20 – 30 ngày ở điều kiện thích hợp Trung bình có khoảng 11 –

15 lứa/năm Bọ phấn phát triển mạnh trong điều kiện khô và nóng, mưa nhiều làmgiảm mật độ bọ phấn, chúng thường chích hút và bay vào buổi sáng, buổi chiềumát Để tránh ánh sáng mặt trời bọ phấn núp vào mặt dưới của lá, điều này phùhợp với phân bố chủ yếu ở khí hậu nhiệt đới và cận nhiệt đới

Chưa có bằng chứng chứng minh begomovirus nhân lên trong cơ thể bọphấn Bọ phấn dùng vòi chọc vào mô mạch dẫn để hút dịch cây từ mạch phloem.Virus được hút qua vòi, tới diều, thấm qua màng ruột vào xoang cơ thể, đạt tớituyến nước bọt và cuối cùng vào ống nước bọt Chúng hút dịch cây trong khoảng

15 – 30 phút và tiềm ẩn trong cơ thể chúng là 8-24 giờ (thời gian để virus nângcao nồng độ trong bọ phấn) là chúng có khả năng truyền bệnh, khoảng thời gian

để chúng truyền ngắn nhất là 15 phút (EPPO/CABI, 1996) Thời gian chích hútcủa bọ phấn dài hơn thời gian truyền dịch virus sang cây khỏe và thời gian tiềm

ẩn là 21 giờ Bọ phấn hút dịch cây ở giai đoạn sâu non và ngay sau khi hóa trưởngthành chúng có thể truyền nhiễm bệnh virus theo hệ thống và không truyền lạicho đời sau Có thể phát hiện thấy virus ở bất kì giai đoạn phát triển nàocủa bọphấn từ giai đoạn trứng (Ghanim and Czosnek, 2000) Triệu chứng xuất hiện trêncây con khi bị xâm nhiễm từ 2 – 5 tuần Virus không truyền qua chứng bọ phấn

Hình 2.6 Bọ phấn Bemisia tabaci 2.2.10 Thiệt hại kinh tế do Begomovirus gây ra

Nhiều bệnh nghiêm trọng trên cây trồng đã được xác định là do

begomovirus gây ra như bệnh bệnh xoăn vàng lá (ngọn) cà chua, một bệnh được

xem là bệnh virus nguy hiểm nhất trên cà chua khắp thế giới (Moriones andNavas-Castillo, 2000).Các bệnh nguy hiểm tương tự là bệnh khảm lá sắn, bệnhcuốn lá bông (Briddon, 2003) Trong đó gây thiệt hại lớn nhất là bệnh xoăn vàng

lá ngọn cà chua

Bệnh xoăn vàng lá cà chua gây thiệt hại lớn cả về năng suất và chất lượng.Bệnh đã trở thành bệnh virus quan trọng nhất trên cây cà chua khắp Thế Giới, đặcbiệt vùng nhiệt đới và cận nhiệt đới (Picó, Díez et al., 1996)

2.2.11 Phòng chống

Cho đến nay vẫn chưa có loài thuốc hóa học nào phòng trừ được trực tiếpbệnh do virus gây ra Phòng trừ begomovirus chủ yếu dựa vào 2 chiến lược chính

là phòng chống vector và tạo cây kháng bệnh

- Phòng chống vector: (Kheyr-Pour, Bendahmane et al., 1991) cho biết, trên thếgiới có khoảng 500 loài cây là ký chủ của bọ phấn, chúng có mặt quanh nămtrên đồng ruộng Đây là nguyên nhân khiến cho việc phòng trừ bọ phấn gặpnhiều khó khăn (Murugan and Uthamasamy, 2001) nghiên cứu đặt bẫy dínhbọ phấn theo dõi mặt độ bọ phấn trên cánh đồng bông ở Coimbatace (Ấn Độ)cho thấy: từ tháng 9 đến tháng 3 năm sau lượng mưa thấp, nhiệt độ cao, cường

độ ánh sáng lớn với ẩm độ trung bình tạo điều kiện cho bọ phấn sinh sôi nảy

nở nhanh chóng nên mật độ bọ phấn cao, từ tháng 5 đến tháng 8 mưa nhiềunên mật độ bọ phấn thấp, đỉnh cao của mật độ bọ phấn khoảng tháng 11 đếntháng 1 năm sau Từ đặc điểm đó, nhiều kỹ thuật phòng trừ bọ phấn được ápdụng tùy điều kiện:

+ Dùng giống kháng bọ phấn

+ Dùng thuốc hóa học

+ Trồng cây trong nhà lưới, nhà kính

+ Dùng bẫy hấp dẫn màu vàng hoặc bề mặt phản xạ (chỉ áp dụng cóhiệu quả trong điều kiện nhà lưới)

- Tạo giống kháng virus: Tính kháng begomovirus có thể được tạo ra nhờ 2

cơ chế: Tính kháng từ cây và tính kháng từ tác nhân gây bệnh (PRD).Những năm gần đây, cùng với tiến bộ khoa học kĩ thuật các nhà khoa học

đã tạo ra các giống ớt có khả năng chống lại sự xâm nhiễm, tái tổ hợp củavirus trong tế bào cây Trung tâm nghiên cứu và phát triển rau châu Á(AVRDC) đã lai tạo ra những dòng ớt có tính kháng rất cao với bọ phấn

Bemisia tabaci cũng như kháng bệnh do begomovirus gây ra Ở nước ta

đang có dự án thí nghiệm nghiên cứu tính kháng bệnh virus (begomovirus)

củ 34 giống ớt có nguồn gốc từ AVRDC (trung tâm rau màu thế giới) tại

Đồng Tháp bước đầu đã cho những kết quả rất khả quan, đây đều là cácgiống kháng chuyển gen dùng gen kháng từ cây.

2.3 Một số begomovirus hại cà chua

Hiện nay có tới hơn 50 begomovirus phân lập từ cà chua (có từ tomato ởđầu tên virus) đã được công bố trên thế giới (Fauquet, Briddon et al., 2008) Trêncây cà chua, các begomovirus tạo triệu chứng giống nhau, điểm hình là cuốn lá(cong lại hình thìa); mép lá (đặc biệt ở lá non) biến vàng; lá nhỏ hẹp; cây nhiểmsớm còi cọc với tỷ lệ đậu quả rất thấp Danh tính virus gây bệnh chỉ có thể biếtđược dựa vào các phân tích phân tử (Moriones & Navas-Castillo, 2000)

Tại Việt Nam, bệnh xoăn vàng lá được xem là bệnh virus quan trọng nhấttrên cà chua với tỉ lệ nhiễm bệnh trên các ruộng trồng cà chua thường rất cao, cókhi tới 100% Bệnh đã được phát hiện thấy trên cà chua từ những năm 80 Một sốnghiên cứu về tạo huyết thanh chuẩn đoán, lây nhiễm nhân tạo đã được thực hiệntrong thời gian này nhưng bản chất thực sự của virus vẫn chưa rõ Gần đây dựavào các phân tích phân tử, có ít nhất 3 loài begomovirus được phát hiện gây rabệnh xoăn vàng lá cà chua ở Việt Nam Loài thứ nhất là Tomato leaf curl ViệtNam virus (ToLCVNV) được phân phập từ cây cà chua bị bệnh xoăn vàng ngọn ởmiền Bắc vào năm 2001 (Green et al., 2001), Loài thứ hai là Tomato yellow leafcurl Kanchanaburi virus (TYLCKaV), được phân lập đầu tiên ở tỉnhKanchanaburi (Thái Lan) vào năm 2002 (Green et al., 2002) và được phát hiệntrên cây cà chua ở Việt Nam vào năm 2005 (mã số Genbank của mẫu Việt Nam làDQ169054, -55) Năm 2007, từ một mẫu cà chua bị bênh xoăn vàng ngọn thuthập tại Hà Nội, cùng với ToLCVV, một loài begomovirus thứ ba cũng đã đượcphân lập Loài này được đặt tên là Tomato yellow leaf curl Việt Nam virus(ToYLCKaV) (Hà et al., 2008) Trong số 3 virus trên có 2 virus được phân lậptrên mẫu cà chua gây bệnh xoăn vàng lá ở miền Bắc là ToLCVNV và TYLCVNV

nhau đã được phát hiện trong đó có những loài thuộc chi Begomovirus (AVRDC,

2001)

Theo kết quả nghiên cứu của (Green and Kim, 1991), triệu chứng cuốn lá

ớt trồng ở Banthra lan truyền qua bọ phấn Bemissia tabaci là do Chilli Leaf Curl Virus (ChiLCV) gây ra.

Số lượng các loài virus mới gây hại trên ớt ngọt và ớt cay ngày càng được

phát hiện Đã có hơn 9 loài virus thuộc chi begomovirus gây hại trên các cây trồng khác ở Trung Quốc và Đài Loan

Ở nước ta, tại miền Bắc, Nguyễn Thị Thu Ngọc (2009) đã phát hiện được

sự có mặt của begomovirus cụ thể là 2 virus Tomato yellow leaf curl virus (TYLCVNV) và Tomato leaf curl Vietnam virus (ToLCVV) trên ớt Tuy nhiên

hiện tại ở Việt Nam lại chưa có nhiều nghiên cứu về xác định thành phần bệnhvirus hại ớt nói chung và Begomovirus hại ớt nói riêng

Trên ớt triệu chứng do begomovirus gây ra gồm có: biến vàng, cuốn lá,

khảm lá, Triệu chứng của Pepper leaf curl virus gây ra: gây hại là non, lá biến

dạng, bị cuốn mép

2.5 Kỹ thuật chẩn đoán bằng PCR

Giới thiệu: PCR là một trong các phát minh quan trọng nhất của thế kỷ 20

trong sinh học phân tử PCR là kỹ thuật đơn giản nhưng được sử dụng trong hầuhết các nghiên cứu CNSH (Hà Viết Cường, 2010), đặc biệt là trong lĩnh vực chẩnđoán bệnh virus Ngoài các kỹ thuật chẩn đoán thông thường bằng mắt, chỉ thị,kháng nguyên- kháng thể thì PCR là kỹ thuật chẩn đoán cho kết quả chính xác vàhiệu quả nhất Trên thực tế những loài tác nhân gây bệnh trong cùng 1 chi hay 1họ sẽ gây ra những triệu chứng tương tự nhau, khó phân biệt PCR giúp phân biệtchính xác đến loài nhờ vào mồi đặc hiệu, được thiết kế trên vùng bảo thủ của gen

Nguyên lý: PCR là phản ứng sinh tổng hợp DNA, gồm nhiều chu kỳ nối

tiếp nhau, mỗi chu kỳ gồm 3 bước:

- Biến tính: Hỗn hợp phản ứng được dặt ở nhiệt độ cao (92-940C) trong khoảngthời gian ngắn (20-60 giây) Ở nhiệt độ này, khuôn DNA dạng sợi kép táchthành sợi đơn.

- Gắn mồi: Hỗn hợp phản ứng được đặt ở nhiệt độ gắn mồi trong thời gian ngắn(35 giây) Nhiệt độ gắn mồi được tính toán tùy thuộc đặc điểm mồi, thườngtrong khoảng 40-600C, ở nhiệt độ này mồi được gắn vào sợi khuôn ở vị trí đặchiệu

- Tổng hợp sản phẩm PCR: hỗn hợp phản ứng được tăng tới nhiệt độ tối ưu chophản ứng tổng hợp chuỗi, tùy thuộc DNA polymerase chịu nhiệt

2.6 Kỹ thuật RCA (Rolling circle amplication)

Gần đây, một phương pháp nhân bản DNA mới dùng kỹ thuật RCA(Rolling Circle Amplification) đã được sử dụng để nhân các bộ gen DNA dạngmạch vòng Kỹ thuật RCA dùng enzyme DNA polymerase của thực khuẩn thểΦ29, một enzyme có hoạt tính chuyển mạch (strand-displacement) rất cao, và mồihexamer để nhân các phân tử DNA mạch vòng thành các multimer mạch thẳng(gồm nhiều bộ gen virus liên tiếp) (Hình 2.10) Sản phẩm RCA sẽ được cắt bằngenzyme cắt giới hạn thích hợp và được dòng hóa trong các vector dòng hóa thôngthường Đây là kỹ thuật hiện đang rất thông dụng trong nghiên cứu các virus có

bộ gen DNA mạch vòng kể cả các begomovirus và vệ tinh ((Inoue-Nagata,Albuquerque et al., 2004), (Haible, Kober et al., 2006), (Knierim and Maiss,2007))

Hình 2.7 Cơ chế tái bản các phân tử DNA mạch vòng bằng kỹ thuật RCA (Rolling Circle Amplification) dùng hexamer và Φ29 polymerase DNA

(Fujii, Kitaoka et al., 2006)

Kỹ thuật RCA đã được ứng dụng để thiết kế các cấu trúc xâm nhiễm củabegomovirus.Sản phẩm RCA dạng multimers được cắt đơn bằng enzyme cắt giớihạn thích hợp trong điều kiện không triệt để để tạo ra nhiều sản phẩm monomer(1 bộ gen), dimer (2 bộ gen) và multimer (nhiều bộ gen) Chỉ các sản phẩm dimerđược tinh chiết khỏi gel agarose và nối vào vector nhị nguyễn.Bằng cách đơn giảnnày, các cấu trúc xâm nhiễm của begomovirus có thể được tạo ra khá nhanhchóng (Inoue-Nagata, Albuquerque et al., 2004), (Knierim and Maiss, 2007),(Ferreira, Lemos et al., 2008), (Wu, Lai et al., 2008), (Wu, Lai et al., 2008),(Wyant, Gotthardt et al., 2011)

2.7 Kĩ thuật Agroinoculation

Kỹ thuật chuyển cấu trúc xâm nhiễm vào tế bào cây nhờ vi khuẩnA.tumerfaciens được gọi là agroinoculation.Agroinoculation là kỹ thuật chuyển

cấu trúc xâm nhiễm vào tế bào cây nhờ vi khuẩn A tumerfaciens.

Agrobacterium tumerfaciens là vi khuẩn đất, gram (-), được sử dụng như các vector tự nhiên để mang các gen ngoại lai vào mô và tế bào thực vật A tumerfaciens có chứa một plasmid lớn kích thước khoảng 200 kb gọi là Ti-

plasmid (Tumor inducing plasmid) chính là tác nhân truyền bệnh cho cây Khi cây

bị nhiễm A tumefaciens qua các vết thương, biểu hiện bệnh rõ nhất là các khối u

được hình thành ở ngay chỗ lây nhiễm Sự hình thành khối u sau đó có thể tiếptục mà không cần thiết phải có sự hiện diện của vi khuẩn Khả năng này có được

do A tumefaciens đã chuyển một đoạn DNA của Ti-plasmid (T-DNA) xâm nhập

vào hệ gen của cây bị bệnh, dẫn đến sự rối loạn các chất sinh trưởng nội sinh, tạo

ra khối u

Kỹ thuật agroinoculation đòi hỏi 1 cấu trúc xâm nhiễm bao gồm bộ gen

virus (hoặc vệ tinh) được thiết kế chứa 2 nguồn gốc tái sinh (ori) ở 2 đầu và được

gắn vào vị trí giữa bờ trái và bờ phải của 1 vector nhị nguyên Cấu trúc xâm

nhiễm sẽ được biến nạp vào tế bào vi khuẩn A tumerfaciens Khi lây nhiễm, tế

bào vi khuẩn sẽ tiếp xúc với tế bào cây ký chủ và các protein chức năng (nằm trênTi-plasmid) sẽ chuyển toàn bộ phần DNA nằm giữa bờ trái và bờ phải của cấutrúc xâm nhiễm vào nhân tế bào cây ký chủ và tổng hợp phần DNA này vào bộgen tế bào cây ký chủ Trong tế bào chứa gen chuyển, gen Rep của virus sẽ đượcbiểu hiện thành protein Rep Protein Rep sẽ cắt bộ gen virus khỏi bộ gen tế bàocây tại vị trí đặc hiệu trên chuỗi ori và nối lại thành bộ gen virus nguyên vẹn Bộgen virus nguyên vẹn này sẽ thực hiện chức năng sinh học và gây bệnh

Hình 2.8 Khối u do A.tumerfaciens gây ra Hình 2.9 Quá trình lây nhiễm của Ti

Plasmid trong A.tumerfaciens vào cây

A: Agrobacterium tumefaciens B: Agrobacterium genome C: Ti Plasmid : a: T-DNA , b: Vir genes , c: Replication origin , d: Opines catabolism genes D: Plant cell E: Mitochondria F: Chloroplast G: Nucleus

Có 3 kỹ thuật agroinoculation chính là: (i) thấm chân không (lá cây đượcnhúng trong dung dịch vi khuẩn, được xử lý chân không để hút khí trong gianbào; vi khuẩn sẽ dễ dàng xâm nhập vào trong mô qua khí khổng khi áp suất trở lạibình thường); (ii) tiêm trực tiếp vi khuẩn vào mô; và (iii) tưới trực tiếp dịch vikhuẩn vào đất

3 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 3.1 Đối tượng nghiên cứu

Virus: Pepper yellow leaf curl virus (PepYLCV)

Cây: ớt, cà chua

3.2 Địa điểm nghiên cứu và thời gian thực hiện

3.2.1 Địa điểm nghiên cứu

- Điều tra, thu mẫu đồng ruộng đồng ruộng được thực hiện tại Khu trồng rauLĩnh Nam (Thanh Trì – Hà Nội), Văn Đức (Văn Giang – Hưng Yên),Quỳnh Phụ (Thái Bình)

- Thí nghiệm trong phòng được thực hiện tại Trung tâm nghiên cứu bệnh câynhiệt đới - Trường Đại học Nông nghiệp Hà Nội

3.3 Thời gian thực hiện

Từ tháng 1/2014 đến tháng 7/2014

3.4 Vật liệu nghiên cứu

3.4.1 Cây thí nghiệm:

Bảng 3.1 Cây thí nghiệm

Chuẩn nhiễm (không chứa gen kháng)

Cây mô hình cho virus thựcvật

5 Thuốc lá (N tabacum) cv.

Samsum AVRDC Cây chỉ thị

6 Thuốc lá (N tabacum) cv Xanthi AVRDC Cây chỉ thị

7 Thuốc lá (N tabacum) cv K326 Viện NCTL Cây chỉ thị

8 Thuốc lào (N.

9

Hoa ngũ sắc(Ageratumconyzoides)

Cây dại Cây chỉ thị

3.4.2 Thu thập mẫu

Mẫu bênh có triệu chứng điển hình được thu thập từ các địa điểm điều tra(bảng 3.3), sau đó được bảo quản khô bằng hạt Silicagel để kiểm tra virus

Bảng 3.2 Các mẫu ớt, cà tím thu thập (2013)

Ký hiệu Địa điểm, khu vực thu mẫu Đối tượng Triệu chứng

VNP 234 Cổ Phúc- Yên Bái Ớt Khảm

VNP 251 Chiềng Sinh- Sơn La Ớt Cuốn lá, khảmVNP 291 Vĩnh Tường- Vĩnh Phúc Ớt Khảm vàng, lá nhỏ

VNP 456 Quỳnh Phụ- Thái Bình Ớt Sáng gân

VNP 459 Quỳnh phụ- Thái Bình Ớt Sáng gân từ cuống

1501 Thái Bình- Đồng Tháp Cà tím Vàng lá

Các mẫu gây bệnh virus trên cà tím, ớt và một số cây trồng khác được chúng tôithu thập sử dụng cho nghiên cứu này,chủ yếu tập trung nghiên cứu một số mẫubegomovirus quan trọng trên ớt,cà tím thu được tại miền Trung Việt Nam vớinhững triệu chứng đặc trưng của begomovirus

3.4.3 Dòng vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens mang cấu trúc xâm nhiễm

của PepYLCVNV

PepYLCVNV là một begomovirus có bộ gen kép (có cả A và B) Cấu trúc xâm nhiễm của cả 2 thành phần genome của virus đã được xây dựngsẵn trên vector chuyển gen thực vật là pCAMBIA2300 và đã được biến nạp vào

DNA-tế bào A tumefaciens chủng LBA4404 Hai dòng vi khuẩn A tumefaciens mang

cấu trúc xâm nhiễm của PepYLCVNV là:

- AT-5-4-11: mang cấu trúc xâm nhiễm của DNA-A

- AT-5-8-1: mang cấu trúc xâm nhiễm của DNA-B

Cả hai dòng vi khuẩn trên được bảo quản trong glycerol 15% ở -80oC Bakháng sinh chọn lọc các dòng vi khuẩn mang cấu trúc xâm nhiễm là:

- Rifampicin: gen kháng nằm trên bộ genome vi khuẩn

- Streptomycin: Gen kháng nằm trên plasmid hỗ trợ (Ti plasmid pAL4404)

có sẵn trong tế bào vi khuẩn

- Kanamycin: Gen kháng nằm trên plasmid pCAMBIA2300

3.4.3.1 Mồi PCR

Cặp mồi chung phát hiện DNA-A của Begomovirus là BegoA-ReV1 &

Bego-AFor1 (Ha Viet Cuong et al., 2006).

BegoA-ReV1: 5’- ATHCCMDCHATCKTBCTiTGCAATCC*-3’

BegoA-For1 : 5’- TGYGARGGiCCiTGYAARGTYCARTC* -3’

(CEGPCKVQS) AV2

BegoAFor 1

DNA-A

Hình 3.1: Sơ đồ tổ chức bộ gen DNA-A (biểu diễn dưới dạng mạch thẳng) của begomovirus và vị trí tương đối của cặp mồi BegoA-For1 và BegoA-Rev1 Mũi tên dạng hộp biểu diễn vị trí và hướng của các ORF Dãy chữ trong 2 ngoặc kép là các chuỗi axit amin bảo thủ tương ứng với 2 mồi BegoAFor1 và BegoARev1.

* Y (C / T), R (G / A), H (A / C / T), M (A / C), B (C / G / T), D (A / G /T), K (G / T) và i = inosine

+ Các cặp mồi đặc hiệu được sử dụng:

Bảng 3.3 Các mồi đặc hiệu

Sản phẩm (kb)

Begomovirus

6 BegoAFor1 TGYGARGGiCCiTGYAA

RGTYCARTC*

3.4.4 Vật liệu nghiên cứu

3.4.4.1 Chất kháng sinh

Các kháng sinh được sử dụng trong nghiên cứu gồm: Rifampicin,kanamycin, streptomycin, tetracylin Các kháng sinh được chuẩn bị dưới dạngdung dịch gốc như sau:

- Rifampicin 34 μg/μl: hòa 0,034 g trong 1 ml Methanol

- Kanamycin 100 μg/μl: hòa 0,1 g trong 1 ml nước cất hai lần

- Streptomycin 50 μg/μl: hòa 0,05 g trong 1 ml nước cất hai lần

- Tetracylin 12,5 μg/μl: hòa 0,012 g trong 1 ml ethanol 70 %Các kháng sinh được bảo quản ở tủ lạnh sâu – 20oC, trong đó rifampicin vàkanamycin được bọc kín bằng giấy bạc

3.4.4.2 Các chủng vi khuẩn sử dụng trong nghiên cứu

- Chủng vi khuẩn A tumefaciens khả biến

Chủng vi khuẩn A.tumefaciens được sử dụng là LBA4404 Chủng này chứa

Ti plasmid pAL4404 Gen kháng Rifampicin nằm trên bộ genome vi khuẩn còngen kháng streptomycin nằm trên Ti plasmid pAL4404

Hình 3.1.Hình thái vi khuẩn A.tumefaciens

- Chủng vi khuẩn E.coli khả biến

Chủng vi khuẩn E.coli được sử dụng là chủng XL1-Blue Chủng này chứagen kháng Tetracylin nằm trên bộ gen của vi khuẩn

3.4.5 Hóa chất, dung dịch đệm

- Các hóa chất thông dụng và hóa chất để pha dung dịch đệm, chất nền, cáckháng huyết thanh của các virus thử nghiệm

- Đệm điện di agarose (1X TAE): 10 mM Tris-acetate, 0.5 mM EDTA (pH 7.8)

- Đệm CTAB: 2% CTAB (hexadecyltrimethylammonium bromide), 2% PVP(polyvinylpyrrolidone), 100 mM Tris-HCl pH 8.0 và 25 mM EDTA

- Đệm TE, pH8: 10 mM Tris-Cl and 1 mM EDTA

- Beta-mercaptoethanol (β-ME)

- Đệm chiết Chloroform:isoamyl alcohol (24:1)

- Cồn tuyệt đối

- Agarose

3.4.6 Kit thương mại

Kít PCR: GoTaq Green (hãng Promega) chứa sẵn đệm phản ứng, Taqpolymerase, dNTPs

3.4.7 Môi trường

a Môi trường LB lỏng :

Bacto®-tryptone (10g/L), Bacto®-yeast extract (5g/L)và NaCl (5g/L).Các thành phần được hòa trong nước cất và môi trường được hấp khửtrùng ở 121oC trong 20 phút Các kháng sinh cho vào môi trường đang ấmkhoảng 55oC trước khi sử dụng

b Môi trường LB agar: Thành phần giống môi trường LB lỏng nhưng chứa15g agar/L Các thành phần được hòa trong nước cất và môi trường đượchấp khử trùng ở 121oC trong 20 phút Để môi trường nguội khoảng 55oCrồi rót vào đĩa petri đường kính 9 cm Các kháng sinh cần thiết được bổsung trước khi rót môi trường vào đĩa petri

3.4.8 Các thiết bị chủ yếu

- Máy PCR

- Thiết bị điện di

- Máy đọc bản ELISA

- Buồng cấy vô trùng

- Bình thủy tinh loại 50-1000 ml

- Phễu lọc, vải lọc, giấy thấm

- Hộp nhựa có nắp đựng bản ELISA

3.5 Phương pháp nghiên cứu

3.5.1 Phương pháp điều tra đồng ruộng

- Phương pháp điều tra tỷ lệ bệnh virus hại cây cà chua, ớt ở ruộng sản xuất:

Áp dụng phương pháp nghiên cứu, điều tra và phát hiện bệnh hại theo

“Phương pháp nghiên cứu bảo vệ thực vật” của Viện bảo vệ thực vật (2003).

Mỗi điểm trồng ớt điều tra 3 ruộng đại diện cho mỗi giống Đại diện chogiai đoạn sinh trưởng và phát triển của cây Điều tra theo phương pháp 5 điểmchéo góc ( cách bờ 2 mét) mỗi điểm điều tra 50 -100 cây đói với ruộng có diệntích lớn, điều tra 100% số cây đói với ruộng có diện tích nhỏ

Theo dõi định kỳ 10 ngày một lần , thu thập số liệu và tính tỉ lệ bệnh.Quansát và mô tả đặc điểm cây nhiễm bệnh Dựa trên triệu chứng điển hình của bệnhPepYLCVNV trên đồng ruộng tính tỉ lệ bệnh theo công thức:

TLB (%) = x100Trong đó: TLB: tỉ lệ bệnh (%)

A: số cây bị bệnhB: tổng số cây điều tra

- Phương pháp điều tra diễn biến mật độ bọ phấn: Tiến hành điều tra theo 5điểm chéo góc, mỗi điểm cố định 5 cây, trên mỗi cây đếm toàn bộ ấu trùng vàtrưởng thành

- Phương pháp thu thập mẫu lá bệnh:

Được tiến hành theo giai đoạn sinh trưởng, tại mỗi điểm trồng ớt, thu 3mẫu/giống với triệu chứng điển hình Các mẫu được số liệu hóa (thời gian, địađiểm, triệu chứng, giai đoạn sinh trưởng) và được xử lý khô bằng silicagel tự chỉthị để bảo quản lâu dài

3.5.2 Thí nghiệm trong nhà lưới

- Phân cấp bệnh

Sử dụng thang phân cấp sau để đánh giá triệu chứng

Bảng 3.4 Thang phân cấp bệnh

1 Cây bình thường , không xuất hiện triệu chứng gì Cây khỏe

2 Lá vàng rất nhẹ , khảm, hoặc bắt đầu có triệu chứng hơi quăn Rất nhẹ

3 Lá vàng nhẹ, khảm hoặc có triệu chứng quăn Nhẹ

5 Lá vàng dữ dội, cong và lá bị phồng dộp Nặng

6 Lá biến dạng, lá nhỏ, cây còi cọc Rất nặng

3.5.3 Phương pháp kiểm tra virus bằng PCR

3.5.3.1 Chiết DNA tổng số từ mô lá

DNA tổng số từ mô lá được chiết theo 2 phương pháp:

+ Phương pháp chiết nhanh nhanh bằng NaOH (Wang, Qi et al., 1993,

Wang, Cardiff et al., 1994)

Cho khoảng 50 mg mô lá mẫu bệnh vào tube 1,5 mL, cho tiếp 500 µl dungdịch NaOH 0,5 M vào tube 1,5mL, dùng chày nhựa chuyên dụng để nghiềnnhuyễn mẫu lá Lấy 100 µl dung dịch đệm Tris 0,1 M, pH = 8 vào tube 1,5mL,sau khi nghiền mẫu xong lấy 2 µl dịch nghiền cho vào tube 1,5mL chứa dungdịch đệm Tris 0,1M, pH = 8 Dịch hòa loãng này được dùng để chạy PCR

+ Phương pháp chiết DNA bằng dung dịch đệm CTAB (Cetryl Ammonium

Bromide ) theo mô tả của (Doyle, 1987) như sau:

- Bước 1: Ủ đệm CTAB + β-ME (100 µl β-ME + 10 ml CTAB) ở 65oC trong 30phút

- Bước 2: Cho mẫu bênh cần chuẩn đoán vào tube 1,5 mL theo tỉ lệ 0,1g/1 mlđệm CTAB + β-ME

- Bước 3: Cho vào tube 500 µl CTAB + β-ME Nghiền nhỏ mẫu, lắc nhẹ

- Bước 4: Ủ trong điều kiện 60 - 65oC, trong khảng 5 phút

- Bước 5: Ly tâm 7 phút

- Bước 6: Lấy dịch trên tủa (khoảng 400 µl)

- Bước 7: Chiết một thể tích tương đương (400 µl) dung dịch Chlorofom :isoamyl alcohol (24:1)

- Bước 8: Ly tâm trong 5 phút

- Bước 9: Lấy dịch trên tủa (khoảng 300 µl), để trong tủ lạnh -20 oC trongkhoảng ít nhất 2 phút

- Bước 10: Chiết lần 2 với 300 µl Chlorofom : isoamyl alcohol (24:1) Để lạnh 5phút

- Bước 11: Ly tâm trong 5 phút.

- Bước 12: Lấy dịch trên tủa (khoảng 200 µl) cho vào tube 1,5 mL

- Bước 13: Bổ sung một thể tích tương đương (khoảng 200 µl) isopropanollạnh Để ở nhiệt đọ -20oC trong 20 phút

- Bước 14: Lắc đều, ly tâm trong 15 phút

- Loại bỏ dịch trên tủa, giữ lại cặn Spin trong 15 phút để hút hết dịch trong tubera

- Bước 16: Rửa cặn DNA 2 lần với etanol 70% (khoảng 700 µl)

- Bước 17: Làm khô cặn bằng không khí

- Bước 18: Hòa cặn DNA với 20 – 25 µl TE, búng nhẹ để DNA tan hết, giữ tube

- Chu trình phản ứng Multiplex – PCR kiểm tra DNA của begomovirus, sửdụng cặp mồi đặc hiệu VNP93-A-F1/B-F1 và VNP93-A-F1/B-F1:

Multiplex – PCR : là phản ứng sử dụng đồng thời nhiều cặp mồi để khuếchđại nhiều đoạn DNA trong cùng một phản ứng PCR Phương pháp này được thửnghiệm thành công vào năm 1988 và được áp dụng và nhiều công trình nghiêncứu Cho đến nay, vẫn chưa rõ nguyên tắc chung hay thành phần chuẩn nào choviệc tối ưu hóa phản ứng multiplex – PCR Do vậy, ứng với mỗi điều kiện phảnứng, cần phải điều chỉnh cho phù hợp với mục đích mong muốn

3.5.5 Tinh chiết sản phẩm điện di

Sử dụng bộ kit tinh chiết của BioNeer - Accuprep Gel Purification Kit Cácbước tinh chiết thực hiện theo hướng dẫn của nhà sản xuất

3.5.6 Xây dựng cấu trúc xâm nhiễm

- Mở vector pCAMBIA2300 bằng BamHI

pCAMBIA (cắt bằng BamHI, purified) 30 μL

10X Alkaline Phosphatase buffer (Roche) 4 μL

Alkaline Phosphatase (Roche) 6 μL

Sau đó ủ ở 370C trong một giờ và tinh sạch bằng kit Purelink PCRpurification kit (Invitrogen)

Nối vector pCAMBIA (dephosphorylated, purified) and Dimeric (gelpurified)

Sau đó ủ ở 22oC trong 2h và để ở 4oC qua đêm

3.5.7 Chuẩn bị E.coli chủng X1 Blue khả biến

Tế bào E.coli X1Blue khả biến được chuẩn bị theo Inoue và cộng sự (1990)

Bước 1: Nuôi cấy vi khuẩn trong 5 ml môi trường LB lỏng, để qua đêm ởnhiệt độ 37oC trong tủ nuôi cấy có lắc (250 rpm)

Bước 2: Chuyển 2 ml dịch vi khuẩn ở bước 1 sang 50 ml môi trường LBlỏng đựng trong lọ định mức ở 500 ml Ủ trong tủ nuôi cấy có lắc (250 rpm / 37 0

C) cho tới khi mật độ quang OD600 đạt 0,5 - 1,0

Bước 3: Làm lạnh vi khuẩn bằng để bình trong đá khoảng 5 phút Cho toàn

bộ dung dịch chứa vi khuẩn ly tâm với tốc độ 3000 g trong vòng 5 phút ở 40C

Bước 4: Loại bỏ dịch trên tủa (dùng pipes hút hết dịch trên tủa) Hoà cặn vikhuẩn với 80 ml dung dịch TB đã được làm lạnh trước trong đá, bổ xung thêmDMSO cho đến khi đạt nồng độ 7% Sau đó phân phối cứ 0,1 ml dịch vi khuẩn thìcho vào 1 tube Eppendorf loại 1,5 ml được làm lạnh trước trong đá Hoá đông vikhuẩn khả biến và bảo quản trong tủ lạnh sâu – 800C

3.5.8 Biến nạp cấu trúc xâm nhiễm vào tế bào vi khuẩn E.coli khả biến bằng

phương pháp sốc nhiệt

- Đầu tiên lấy tube chứa XL1–Blue compentent cell (ở tủ -80oC ) cho lên khay

đá vụn để tan đông trong 20 – 30 phút (để trong box cấy)

- Cho máy lắc vào trong tủ ầm và đặt nhiệt độ 37oC, chuẩn bị 4 đĩa LB đặc

- Cho 150 μL vi khuẩn dã đông vào tube 1.5 ml đã đặt trên đá trước đó Cho 10

μL sản phẩm nối vào tube chứa vi khuẩn, ủ trên đá ít nhất 30 phút

- Sốc nhiệt ở 42oC trong 1 phút rồi để trên đá lạnh 5 phút, spin nhẹ

- Thêm 600 μL SOC vào mỗi tube, nuôi lắc 1 giờ ở 37oC

- Ly tâm 3-5 phút, loại bỏ dịch trên tủa để lại 100 μL Cấy dịch vi khuẩn trên đĩa

LB agar + Kanamycin + Tetracylin

- Nuôi qua đêm ở 37oC trong tủ binder, kiểm tra số khuẩn lạc mọc

3.5.9 Phản ứng PCR kiểm tra các khuẩn lạc mọc trên môi trường chọn lọc

Nuôi cấy từng khuẩn lạc mọc trong 3 ml môi trường LB lỏng (chứa hai loạikháng sinh) ở 37oC, lắc 250 vòng/ phút qua đêm Ly tâm dịch vi khuẩn sau đó rửacặn vi khuẩn hai lần bằng nước vô trùng Hút 50 μL nước vô trùng và hòa tan cặn

vi khuẩn và để trong tủ -20oC ít nhất 30 phút Lấy tube ra thả vào nước sôi 10phút, đảo đều tube và đem dịch vi khuẩn đi chạy PCR