Trong nghiên cứu này tiến hành nghiên cứu tập trung chủ yếu về begomovirus đó là Pepper yellow leaf curl Vietnam virus (PepYLCVNV) gây bệnh xoăn vàng lá trên ớt và cà chua.
HOC VIÊN NƠNG NGHIÊP VIÊT NAM ̣ ̣ ̣ ̣ KHOA NƠNG HOC ̣ KHĨA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐỀ TÀI “Phát hiện và đánh giá tính gây bệnh của Pepper yellow leaf curl Việt Nam virus ” Giảng viên hướng dẫn : TS.Hà Viết Cường Họ và tên : Ha Văn Dung ̀ ̃ Lớp : BVTVBK55 Chun ngành : Bao vê th ̉ ̣ ực vâṭ Hà Nội2014 LỜI CẢM ƠN Trong suốt q trình hồn thành báo cáo này ngồi những nỗ lực của bản thân, tơi đã nhận được những sự giúp đỡ hết sức tận tình và q báu từ nhiều tập thể và cá nhân Trước hết tơi xin được gửi lời cảm ơn chân thành và sâu sắc nhất tới thầy TS. Hà Viết Cường – Giám đốc trung tâm nghiên cứu bệnh cây nhiệt đới – Trường Hoc viên nơng nghiêp Viêt Nam, Phó khoa Nơng h ̣ ̣ ̣ ̣ ọc và Ths. Trần Thị Như Hoa Phó giám đốc trung tâm nghiên cứu bệnh cây nhiệt đới đã trực tiếp hướng dẫn, tận tình chỉ bảo và tạo mọi điều kiện để tơi hồn thành báo cáo Tơi xin gửi lời cảm ơn chân thành nhất tới cán bộ cơng nhân viên thuộc Trung tâm nghiên cứu bệnh cây nhiệt đới – Trường Hoc viên nơng nghiêp Viêt ̣ ̣ ̣ ̣ Nam, đã nhiệt tình giúp đỡ tơi trong suốt q trình tơi thực tập tại Trung tâm Đồng thời tơi cũng xin chân thành cảm ơn các Thầy giáo, Cơ giáo trong bộ mơn bênh cây cũng nh ̣ ư các Thầy cơ trong khoa Nơng hoc, ̣ Trường Hoc viên ̣ ̣ nơng nghiêp Viêt Nam ̣ ̣ đã nhiệt tình dạy dỗ, chỉ bảo cho tơi trong suốt thời gian tơi học tập tại trường Cuối cùng tơi xin được chân thành cảm ơn những người thân, gia đình, bạn bè đã hết lòng giúp đỡ, động viên tơi trong q trình học tập cũng như hồn thành báo cáo này Một lần nữa tơi xin chân thành cảm ơn! Hà Nội, ngày 31 tháng 7 năm 2014 Sinh viên Ha Văn Dung ̀ ̃ MUC LUC ̣ ̣ DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT Ký hiệu Từ viết tắt A. tumefaciens Agrobacterium tumefaciens AS Acetosyringone ATP Adenosine triphosphate Bb Base pair CP Capsid protein CTAB Cetryl Ammonium Bromide ddNTP Dideoxynucleoside triphosphate DNA Deoxyribonucleic acid Dntp Deoxynucleoside triphosphate dsDNA Double strand DNA E.coli Escherichia coli EDTA Ethylene diamine tetra acetic acid ICTV International Committee on Taxonomy of Viruses IR Itergenic region Kb Kilo base LB Luria and Bertani ORF Open reading frame PCR Polymerase Chain Reaction RCA Rolling circle amplification RE Restriction enzyme Rep Replication protein RNA Ribonucleic acid Rnase Ribonuclease SDS Sodium Dodecyl Sulphate SsDNA Singe strand DNA TAE Tris – acetate – EDTA Taq Thermus aquatic Vir Virulence region β ME Beta Mercaptoethanol DANH MỤC BẢNG DANH MỤC HÌNH TĨM TẮT Trong nghiên cứu này chúng tơi tiến hành nghiên cứu tập trung chủ yếu về begomovirus đó là Pepper yellow leaf curl Vietnam virus (PepYLCVNV) gây bệnh xoăn vàng lá trên ớt và ca chua. ̀ Đánh giá đặc trưng sinh học bằng cách đánh giá tính gây bệnh thơng qua Agrobacterium tumerfaciens (Agroinoculation), đơng th ̀ ơì chúng tơi tiến hành lây nhiễm PepYLCVNV thơng qua mơi giới truyền bệnh trung gian là bọ phấn Dựa trên mồi đặc hiệu và mồi chung, các phản ứng PCR đã được thực hiện trên một loạt các mẫu ớt thu tại miền Băc và mi ́ ền Trung Việt Nam nhằm phát hiện PepYLCV và begomovirrus khác. Lân đâu tiên phat hiên s ̀ ̀ ́ ̣ ự co măt cua ́ ̣ ̉ begomovirrus trên ớt tai miên Băc ̣ ̀ ́ Chúng tôi đã tiến hành xây dựng thành công cấu trúc xâm nhiễm của PepYLCVNV, phân tích đặc trưng phân tử của của PepYLCVNV ĐẶT VẤN ĐỀ Giới thiệu Chi Begomovirus chi lớn quan trọng họ Geminiviridae cả về số lượng lồi và bệnh do chúng gây ra với cây trồng. Begomovirus (được đặt tên từ Bean golden mosaic virus) là tên gọi chung chỉ các virus thuộc chi Begomovirus có phân virion (hạt virus) dạng hình cầu kép (hình chùy) và bộ gen DNA sợi vòng đơn, kích thước khoảng 2,7 kb, lan truyền trên đồng ruộng bằng bọ phấn (Bemisia tabaci) theo kiểu bền vững tuần hồn Begomovirus có thể có bộ gen đơn (gồm một phân tử DNAA) hoặc có gen kép (gồm hai phân tử DNAA và DNAB). Ở một số loại cây chỉ cần phân tử DNAA đã gây triệu chứng điển hình, còn ở một số loại cấy khác thì cần có cả phân tử DNAA và DNAB mới gây ra triệu chứng bệnh. Begomovirus gây bệnh trên các loại cây đều có các triệu chứng đặc trưng, điển hình là: cuốn lá (cong lại hình thìa); mép lá (đặc biệt ở lá non) biến vàng; lá nhỏ hẹp; cây nhiễm sớm còi cọc với tỷ lệ đậu quả rất thấp. Danh tính virus chỉ có thể được xác định dựa vào các phân tích phân tử Việt Nam chứng minh trung tâm đa dạng quan trọng begomovirus. Mặc dù vậy số lượng begomovirus xác định trên thực vật của Việt Nam vẫn còn ít chỉ gồm 19 lồi được phân lập từ nhiều lồi cây, trong đó có nhiều cây dại. (Green, Tsai et al., 2001), (Ha, 2007). Trên cây họ cà, đã có 6 begomovirus được phát hiện gây bệnh xoăn vàng lá cà chua tại Việt Nam. Tuy nhiên hiện vẫn chưa có cơng bố nào cho thấy sự có mặt của begomovirus trên ớt. Năm 2012, một loạt các mẫu ớt biểu hiện triệu chứng bệnh virus trên ớt đã được TTNC Bệnh cây Nhiệt đới (Trường ĐHNN Hà Nội) thu thập khắp cả nước. Các phân tích phân tử từ một mẫu virus phân lập đầu tiên từ ớt thu thập tại Đà Nẵng (mẫu VNP93) đã xác định được một loài begomovirus mới và virus này được đặt tên là Pepper yellow leaf curl Vietnam virus (PepYLCVNV) Các nghiên cứu sơ bộ tại TT NCBC NĐ cũng cho thấy virus này cũng nhiễm tự nhiên cả trên cây cà chua bị bệnh xoăn vang lá. Việc lần đầu tiên phát hiện được một begomovirus gây hại tự nhiên trên ớt Việt Nam có ý nghĩa quan trọng cả về mặt khoa học và thực tiễn vì cây cây ớt cũng như cây cà chua là các cây trồng quan trọng của Việt Nam Do PepYLCVNV là một virus mới nên phân bố cũng như đặc điểm sinh học, đặc biệt là phổ ký chủ của virus vẫn chưa được nghiên cứu Dựa trên cơ sở khoa học và thực tiễn trên, chúng tơi tiến hành thực hiện đề tài: “Phát hiện và đánh giá tính gây bệnh của Pepper yellow leaf curl Việt Nam virus” Mục tiêu và u cầu của đề tài Mục tiêu Xác định sự có mặt của PepLCVNV trên các mẫu ớt và cà chua thu thập tại miền Bắc và đánh giá tính gây bệnh của virus u cầu Điều tra bệnh cuốn lá ớt tại một số điểm trồng ớt chính thuộc Hà Nội, Hưng n Thu thập mẫu bệnh trên ớt với triệu chứng cuốn lá điển hình Phát hiện PepYLCVNV bằng PCR dùng mồi đặc hiệu trên các mẫu ớt và cà chua thu thập trong nghiên cứu này và thu thập từ trước Đánh giá tính gây bệnh của PepYLCVNV bằng lây nhiễm nhân tạo dùng kỹ thuật agroinoculation trên cà chua, ớt và một số cây chỉ thị Đánh giá tính gây bệnh của PepYLCVNV bằng lây nhiễm nhân tạo dùng vector bọ phấn TỔNG QUAN TÀI LIỆU Tầm quan trọng của ớt va ca chua ̀ ̀ Cây ơt́ là môṭ loaị quả cuả thuôc̣ chi Capsicum cuả họ Cà (Solanaceae). Ớt có nguồn gốc từ châu Mỹ, ngày nay nó được trồng khắp nơi trên thế giới và được sử dụng làm gia vị, rau, và thuốc. Hiện nay, Ấn Đơ là ̣ nươc san xu ́ ̉ ất ớt lớn nhất thế giới với khoảng 1 triệu tấn mỗi năm, nơi chỉ riêng Chợ Guntur (lớn nhất châu Á) có 1 triệu bao ớt. Ở Viêt Nam, ̣ ơt la mơt ́ ̀ ̣ gia vi th ̣ ương xuyên co măt trong cac b ̀ ́ ̣ ́ ưa ăn, ngoai ra ̃ ̀ ơt con co rât nhiêu công ́ ̀ ́ ́ ̀ dung nh ̣ ư: cai thiên hê tiêu hoa, giam cân, ch ̉ ̣ ̣ ́ ̉ ưa bênh ung th ̃ ̣ ư, ngưa tai biên ̀ ́ mach, tăng s ̣ ức đê khang ̀ ́ Cà chua (S.lycopersicum) có nguồn gốc từ Nam Mỹ, nó được người Tây Ban Nha lan truyền tới Pilippine, Đơng Nam Á và tồn bộ Châu Á, cuối cùng là Châu Âu. Cà chua là lồi trái cây vườn phổ biến nhất ở Hoa Kỳ. Khoảng 150 triệu tấn cà chua đã được sản xuất ra trên Thế giới trong năm 2009. Trung Quốc là nước sản xuất cà chua lớn nhất, chiếm khoảng một phần tư sản lượng toàn cầu, tiếp theo Hoa Kỳ và Ấn Độ Các khu vực chế biến tại California chiếm 90% lượng sản xuất Mỹ và 35% lượng sản xuất thế giới (Hartz, Miyao et al., 1997). Cung nh ̃ ơt, ́ ở nươc ta ca chua la môt gia vi ́ ̀ ̀ ̣ ̣ hay co trong môi b ́ ̃ ữa ăn, bởi ca chua la môt th ̀ ̀ ̣ ực rất giàu : Nước (chiêm 93 đ ́ ến 95 % ), giàu ngun tố khống,và vitamine A, C, và E. Cà chua chín chứa nhiều sắc tố trong nhóm của caroténọdes, như βcarotène cho một hoạt chất tiền vitamine A rât co l ́ ́ ợi cho sưc khoe ́ ̉ Đặc điểm chung của Begomovirus Trong bốn chi của họ Geminiviradae, chi Begomovirus (được đặt tên từ Bean golden mosaic virus) là chi quan trọng nhất, cả về số lượng lồi (198 lồi vào năm 2010, website ICTV) cũng như các bệnh mà chúng gây ra trên cây trồng. Tất cả các begomovirus (tên gọi chỉ các virus thuộc chi Begomovirus) đều khơng truyền qua hạt giống nhưng lan truyền ngồi tự nhiên nhờ bọ phấn (Bemisia tabaci) theo kiểu bền vững tuần hồn (Fauquet and Stanley, 2005) Đặc điểm hình thái Đặc điểm hình thái chung của các Begomovirus đều có cấu trúc phân tử (virion) tương tự nhau bao gồm 2 hình cầu 20 mặt (icosahedron), mỗi mặt là 1 tam giác đều với số đơn vị tam giác (T) trên mỗi mặt bằng 1, nối với nhau để tạo ra phân tử hình cầu đa diện kép (gemini). Do nối với nhau nên 2 hình cầu này khơng hồn thiện dẫn tới trên mỗi hình cầu chỉ có 55 tiểu phần protein (protein vỏ) được xắp xếp thành 11 đơn vị hình thái, mỗi đơn vị gồm 5 tiểu phần protein (pentameric capsomer). Kết quả là tồn bộ phân tử có 110 tiểu phần và 22 đơn vị hình thái (Gafni and Yedidya, 2003), (Zhang, Cheng et al., 2001) Hình 2.1 Hình thái của begomovirus (Nguồn ảnh: www.ncbi.nlm.nih.gov) Cấu trúc genome của Begomovirus Begomovirus là virus thực vật có bộ gen DNA sợi vòng đơn có kích thước khoảng 2,6 2,8 kb. Chúng hoặc có bộ gen kép (bipartite) gồm 2 phân tử DNA gọi là DNAA và DNAB hoặc có bộ gen đơn (monopartite) tương đương DNAA (Ha, 2007) Kết quả tìm kiếm trực tuyến cho thấy đoạn trình tự virus của plasmid VNP150020 là DNAB và gần gũi nhất với DNAB của Tomato yellow leaf curl Kanchanaburi virus với mức đồng nhất trình tự 89% (bảng 4.16) Các mức đồng nhất trình tự trên khá thấp và chưa đủ để kết luận danh tính virus Bảng 4.16. Kết quả tìm kiếm virus gần gũi nhất trên Ngân hàng gen (Genbank) dùng trình tự thu đượ c của mẫu virus VNP1500 Virus gần gũi Ngân hàng gen* Mã Ngân hàng gen Phần trăm đoạn so sánh (%) Mức đồng trình tự (%0 Pepper leaf curl Malaysia virus (Malaysia), DNA-A AF414287 100 88 Erectites yellow mosaic virus (Việt Nam), DNA-A DQ641698 97 89 Pepper leaf curl virus (Thái Lan), DNA-A AF134484 100 97 Tomato yellow leaf curl Kanchanaburi virus (Thái Lan, isolate E4), DNA-B KF446664 93 89 Tomato yellow leaf curl Kanchanaburi virus (Thái Lan, isolate P4), DNA-B KF446672 93 89 Tomato yellow leaf curl Kanchanaburi virus (Thái Lan, isolate P3), DNA-B KF446670 93 89 Plasmid giải trình tự VNP1500-1 (DNA-A) VNP1500-20 Tên virus (nguồn gốc), loại phân tử gen * Chỉ trình bày 3 virus gần gũi nhất dung phần mềm tìm kiếm trực tuyến BLAST tại NCBI So sánh trình tự với PepYLCVNV Do DNAA của mẫu virus VNP1500 ln có phản ứng PCR dương tính với mồi đặc hiệu của PepYLCVNV. Bộ gen của virus này vẫn chưa được gửi trên Ngân hàng gen nên chúng tơi đã tiến hành so sánh trình tự của mẫu virus VNP1500 với PepYLCVNV (VNP93). Trình tự của các virus gần gũi trên Ngân hàng gen như: PepLCV, TYLCKaV và ErYV cũng được sử dụng trong phân tích. Kết quả so sánh được trình bày ở bảng 4.17 Kết quả so sánh cho thấy cả 2 phân tử DNAA và DNAB của mẫu VNP1500 có mức đồng trình tự cao (>90%) đối với virus PeYLCVNV (mẫu VNP93). Mặc dù danh tính chính xác của virus chỉ có thể được xác định dựa trên trình tự tồn bộ bộ gen nhưng mức đồng nhất cao ở trên cho thấy mẫu VNP1500 chính là PepYLCVNV Kết quả này cho thấy PepLCVNV có phân bố khá rộng, ít nhất ở các tỉnh miền Trung và miền nam nước ta Bảng 4.17. So sánh đoạn trình tự thu đượ c của mẫu virus VNP1500 v ới PepYLCVNV (VNP93) và các gần gũi nhất trên Ngân hàng gen Mức đồng trình tự (%)* Loại phân tử genome Virus so sánh VNP1500-1 DNA-A PepYLCVNV (VNP93, Việt nam, DNA-A) 90.9 PepLCV (AF414287, Malaysia, DNA-A) 87.8 PepLCV (AF134484, Thái Lan, DNA-A) 86.3 EYMV (DQ641698, Việt Nam, DNA-A) 86.9 TYLCKaV (AF511529, Thai Lan, DNA-A) 71.7 VNP1500-20 PepYLCVNV (VNP93, Việt nam, DNA-B) 92.5 TYLCKaV (AF511528, Thái Lan, DNA-B) 86.6 DNA-B * Chỉ tính trên đoạn trình tự thu được của mẫu VNP1500 (1697 nts của plasmid VNP15001 và 1396 nts của plasmid VNP150020) Kêt qua kiêm tra mơt sơ loai virus gây hai trên ́ ̉ ̉ ̣ ́ ̣ ̣ ớt thu thâp t ̣ ại miền Bắc và miền Trung giai đoan 20122013 ̣ Kiểm tra virus gây hai thu thâp ngoai đông t ̣ ̣ ̀ ̀ ư cac đia điêm điêu tra giai đo ̀ ́ ̣ ̉ ̀ ạn 20122013 băng ph ̀ ương phap ELISA ́ Nhăm xac đinh nguyên nhân gây bênh do virus gây hai trên ̀ ́ ̣ ̣ ̣ ơt , chung tôi ́ ́ tiên hanh thu thâp mâu bênh co triêu ch ́ ̀ ̣ ̃ ̣ ́ ̣ ứng điên hinh đ ̉ ̀ ược thu thâp t ̣ ừ cac đia ́ ̣ điêm điêu tra. Mâu bênh thu đ ̉ ̀ ̃ ̣ ược lam khô va bao quan băng silicagel. Đ ̀ ̀ ̉ ̉ ̀ ể kiểm tra các mẫu có triệu chứng thu được, chúng tơi tiến hành kiểm tra bằng phản ứng ELISA trực tiếp (DAS – ELISA). Ngn khang hut thanh s ̀ ́ ́ ử dung la ̣ ̀ khang huyêt thanh ́ ́ Chilli Veinal mottle Virus (ChiVMV), đây là potyvirus phổ biến trên ơt t ́ ại Việt Nam. Tông sô 28 m ̉ ́ ẫu co triêu ch ́ ̣ ứng virus thu thâp đ ̣ ược trong qua trinh điêu tra ngoai đông ruông đa đ ́ ̀ ̀ ̀ ̀ ̣ ̃ ược kiêm tra ELISA, trong đo cac ̉ ́ ́ mâu đ ̃ ược kêt luân la d ́ ̣ ̀ ương tinh khi co tri sô ELISA l ́ ́ ̣ ́ ớn gâp đôi tri sô ELISA ́ ̣ ́ cua đôi chung âm (cây khoe). Kêt qua đ ̉ ́ ́ ̉ ́ ̉ ược thê hiên ̉ ̣ ở bang 4.1, hinh 4.1.1 ̉ ̀ Kết quả bảng 4.1 và hình 4.32 và hình 4.33 cho thấy: Kết quả kiểm tra cho thấy có 12/28 mẫu bị nhiễm ChiVMV (chiếm 54.55%). Điều đó, cho thây chung ChiVMV la virus quan trong đơi v ́ ̉ ̀ ̣ ́ ới cây ớt taị Viêt Nam. ̣ Bảng 4.18. K ết quả ki ểm tra ELISA các mẫu ớt thu đượ c tại Việt Nam giai đoạn 20122013 STT ChiVMV Ký hiệu Triệu chứng Địa điểm VNP96 Cuốn lá, khảm Tuy Loan ́ Đa Năng ̀ ̃ 0.874 + VNP120 Kham ̉ Thai Binh ́ ̀ 2.717 + VNP179 Cuốn lá, khảm Cam Lộ Quang Tri ̉ ̣ 0.162 OD 0.156 KL – – VNP192 Kham ̉ Cam Đươ ̀ng Lao Cai ̀ VNP217 Khảm Co Noi ̀ ̀ Sơn La 0.244 + VNP237 Cuốn lá,khảm Cô Phuc ̉ ́ Yên Baí 0.146 – VNP251 Cuốn lá,khảm Chiêng ̀ SinhSơn La 0.923 + VNP291 Kham ̉ vang, la ̀ ́ nhỏ Vinh ̃ Tươ ̀ng Vinh Phuc ̃ ́ 1.642 + VNP300 Xoăn vang ̀ lá Soc S ́ ơn Ha Nôi ̀ ̣ 0.150 – VNP306 Khảm vàng Yên Thế Băc Giang ́ 0.180 – 11 VNP313 Châu Khảm vàng ThanhAn ̀ Giang 0.161 – 12 VNP453 Khảm vàng Vinh Bao ̃ ̉ Hai Phong ̉ ̀ 2.174 + 13 VNP535 Khảm Hoa An ̀ Cao Băng ̀ 0.144 – VNP558 Chợ Mới Khảm vàng Băc Kan ́ ̣ 15 VNP626 Kham ̉ Tuy Loan ́ Đa Năng ̀ ̃ 0.151 16 VNP632 Khảm vàng Tuy Loan ́ Đa Năng ̀ ̃ 0.623 + 17 VNP634 Khảm vàng Điên Ban ̣ ̀ 0.673 Quang Nam ̉ + 18 VNP649 Khảm vàng Phu Cat ̀ ́ Binh Đinh ̀ ̣ 1.058 + Kham ̉ Thanh BinhĐông ̀ ̀ 2.160 Thap ́ + 1.844 + >3 + 10 14 19 VNP683 0.158 – – 20 VNP706 Kham vang ̉ ̀ Châu ThanhAn ̀ Giang 21 VNP716 Kham ̉ Yên Thế Băc Giang ́ Kham ̉ Binh Thuy ̀ ̉ 0.145 Cân Th ̀ – Không bi ̣ bênh ̣ TTBCNĐ ĐHNNHN – Không bi ̣ bênh ̣ TTBCNĐ ĐHNNHN 22 23 24 VNP785 Đối chứng (–) Đối chứng (–) 0.162 0.160 – 25 Đối chứng (–) Không bi ̣ bênh ̣ TTBCNĐ ĐHNNHN 0.172 26 Đối chứng (+) Khảm vàng, la ́ nhỏ TTBCNĐ ĐHNNHN >3 + 27 Đối chứng (+) Khảm vàng, la ́ nhỏ TTBCNĐ ĐHNNHN >3 + 28 Đối chứng (+) Khảm vàng, la ́ nhỏ TTBCNĐ ĐHNNHN >3 + – Số mẫu + 12 Tỷ lệ mẫu + 54.55% Ghi chú: OD: Mật độ quang học đo bước sóng 405 nm; KL: Kết luận; ( ) : Cây khơng nhiễm bệnh; (+): Cây nhiêm bênh ̃ ̣ 2 × trị số trung bình giá trị ở giếng đối chứng âm + độ lệch chuẩn=0.178 Hình 4.22. Kết quả ELISA phát hiện ChiVMV Kiểm tra virus gây hai thu thâp ngoai đơng t ̣ ̣ ̀ ̀ ư cac đia điêm điêu tra giai đo ̀ ́ ̣ ̉ ̀ ạn 20122013 băng p ̀ han ̉ ưng PCR ́ Kết quả kiêm tra ELISA cho th ̉ ấy, nhiều mẫu với triệu chứng rất điển hình như khảm vàng tồn bộ diện tích lá, cuốn lá, biến dạng lá… lại khơng dương với virus ChiVMV. Chính vì thế chúng tơi nghi ngờ các mẫu trên có thể nhiễm begomovirus. Vì vậy, chúng tơi chon mơt sơ mâu âm v ̣ ̣ ́ ̃ ới virus ChiVMV, cung v ̀ ơi mơt sơ mâu nghi ng ́ ̣ ́ ̃ ờ nhiễm begomovirus đa thu thâp đ ̃ ̣ ược đê kiêm tra ̉ ̉ PCR Tất cả các mẫu đều được chiết DNA tổng số bằng CTAB và phan ̉ ưng ́ PCR sử dụng căp môi chung BegoA – For1/BegoA – Rev1. Kêt qua đ ̣ ̀ ́ ̉ ược trinh ̀ bay trong bang (4.2) va hình 4.1.2 ̀ ̉ ̀ Kết quả kiểm tra cho thấy, trong 12 mâu kiêm tra đa phat hiên thây 8 mâu ̃ ̉ ̃ ́ ̣ ́ ̃ phan ̉ ưng PCR d ́ ương (+), tưc la cây nhiêm bênh, chiêm ty lê 66,67% ́ ̀ ̃ ̣ ́ ̉ ̣ Cac mâu co phan ́ ̃ ́ ̉ ưng d ́ ương vơi căp môi chung BegoA – For1/BegoA – ́ ̣ ̀ Rev1 tao cac băng đ ̣ ́ ơn trên ban gel, trung kích th ̉ ̀ ước sản phẩm băng điện di mong muốn là ~1.2 kb, mẫu đối chứng dương có phản ứng. Như vây, kêt qua ̣ ́ ̉ kiêm tra đa xac nhân s ̉ ̃ ́ ̣ ự co măt cua ́ ̣ ̉ begomovirus trong 12 mâu ̃ ơt kiêm tra ́ ̉ Bảng 4.19. Kết quả kiểm tra các mẫu ớt bằng PCR sử dụng cặp m ồi BegoA – For1 va BegoA – Rev1 ̀ STT Mẫ u VNP4 VNP179 Triêu ̣ chứng Cuốn lá, khảm Khảm vang ̀ Địa điểm Kêt qua ́ ̉ PCR FAVRI + Cam Lô – ̣ Quang ̉ + Trị VNP192 Khảm Cam đươ ̀ng – Lao Cai ̀ – VNP234 Kham ̉ Cô Phuc – ̉ ́ Yên Baí – VNP246 Xoăn lá Chiêng Sinh ̀ – Sơn La + VNP300 Kham vang ̉ ̀ Soc S ́ ơn – Ha Nôi ̀ ̣ – VNP306 Khảm Yên Thê – ́ Băc Giang ́ + VNP456 Sang gân ́ Quynh Phu ̀ ̣ – Thai Binh ́ ̀ – VNP459 Sang gân t ́ ư ̀ Quynh Phu ̀ ̣ cuông ́ – Thai Binh ́ ̀ – 10 VNP535 Kham ̉ 11 VNP558 12 VNP961 Hoa An – ̀ Cao Băng ̀ – Kham nhăn ̉ Chợ Mới – Băc Kan ́ ̣ – Kham, biên ̉ ́ vang ̀ An dươ ng – Hai Phong ̉ ̀ – Sô mâu d ́ ̃ ươ ng/tông sô mâu th ̉ ́ ̃ ử Ty lê(%) ̉ ̣ Ghi chu: (+) Cây nhiêm virus, (–) Cây không nhiêm virus ́ ̃ ̃ 8/12 66,67 Hình 4.23. Triệu chứng của Begomovirus gây hại trên ớt tại Đà Năng ̃ Hình 4.24. Kiểm tra PCR các mẫu ớt bằng cặp mồi cặp mồi BegoA – For1 va BegoA – Rev1 ̀ Marker H2O VNP4 VNP179 VNP192 VNP234 VNP246 VNP300 VNP306VNP456 VNP459 VNP538 VNP558 VNP9611 (ladder: 1kb) Từ kêt qua trên, chung tôi nhân thây 2 mâu bênh ́ ̉ ́ ̣ ́ ̃ ̣ ở miên Băc phan ̀ ́ ̉ ứng PCR dương: VNP246 va VNP306. Vi ̀ ̀begomovirus chưa tưng xuât hiên tai miên ̀ ́ ̣ ̣ ̀ Băc, do đo chung tôi tiên hanh kiêm tra PCR ́ ́ ́ ́ ̀ ̉ trên 2 mâu nay thêm 1 l ̃ ̀ ần nữa. Kêt́ qua trinh bay bang (4.3) va hình 4.1.3 ̉ ̀ ̀ ̉ ̀ Bảng 4.20. Kết quả kiểm tra 2 mẫu ớt bằng PCR sử dụng cặp m ồi BegoA – For1 va BegoA – Rev1 ̀ STT Mẫ u Triêu ̣ chứng Địa điểm Kêt qua ́ ̉ PCR VNP246 Xoăn lá Chiêng Sinh ̀ – Sơn La – VNP306 Khảm Yên Thê – ́ Băc Giang ́ + Sô mâu d ́ ̃ ươ ng/tông sô mâu th ̉ ́ ̃ ử 1/2 Ty lê(%) ̉ ̣ 50 Ghi chu: (+) Cây nhiêm virus, (–) Cây khơng nhiêm virus ́ ̃ ̃ Hình 4.24. Kiểm tra PCR 2 mẫu ớt thu ở miền Bắc bằng cặp mồi cặp mồi BegoA – For1 va BegoA – Rev1 ̀ MarkerH2OVNP4VNP179 (ladder: 1kb) KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ Kết luận Đã phục hồi 2 dòng vi khuẩn A. tumerfaciens mang cấu trúc xâm nhiễm của PepYLCVNV là ATVNP935411 và ATVNP93581 Đã lây nhiễm PepYLCVNV bằng agroinoculation trên các giống: ca chua Hơng ̀ ̀ Lan (T20), ơt Hiêm Lai F1207, va cac cây chi thi ́ ̉ ̀ ́ ̉ ̣ Đã lây nhiễm PepYLCVNV bằng bọ phấn (B. tabaci) trên các giống: ca chua ̀ Hơng Lan (T20), ca tim GS505, ̀ ̀ ́ ơt Hiêm lai F1207. Kêt qua cho thây giơng thí ́ ̉ ́ ̉ ́ ́ nghiệm đều biểu hiện triệu chứng bệnh vơi t ́ ỷ lệ 100% nhiễm bệnh khi lây nhiễm bằng bọ phấn Xây dựng thành cơng cấu trúc xâm nhiễm của PepYLCVNV bằng kỹ thuật RCA (rolling circle amplification) Đã giải trình tự tồn bộ bộ gen gồm 2 thành phần DNAA và DNAB của mẫu virus gây bệnh trên cây ớt thu tại Đơng Thap (m ̀ ́ ẫu VNP1500) Đa kiêm tra PCR v ̃ ̉ ơi căp môi chung đê phat hiên ́ ̣ ̀ ̉ ́ ̣ begomovirus trên cac mâu ́ ̃ ớt thu thâp tai miên Băc va miên Nam Viêt Nam. Kêt qua cho thây co 2/12 (16.7%) ̣ ̣ ̀ ́ ̀ ̀ ̣ ́ ̉ ́ ́ mâũ ơt́ thu taị miên ̀ Băć và 6/12 (50%) mâu ̃ ớt thu taị miên ̀ Trung nhiêm ̃ begomovirus Kiến nghị Tiếp tục tối ưu hóa phương pháp lây nhiễm nhân tạo sử dụng vi khuẩn Agrobacterium tumerfaciens (Agroinoculation) đối với PepYLCVNV nhằm đánh giá được tính gây bệnh của PepYLCVNV Sử dụng cấu trúc xâm nhiễm PepYLCVNV mới thiết kế để đánh giá tính gây bệnh của PepYLCVNV Đánh giá tính gây bệnh của begomovirus gây bệnh trên ớt bằng kỹ thuật Agroinoculation Tiêp tuc đánh gia đa d ́ ̣ ạng của begomovirus trên ớt tại Việt Nam Lân đâu tiên phat hiên virus begomovirus trên ̀ ̀ ́ ̣ ớt ở miên Băc nên cân kiêm ̀ ́ ̀ ̉ tra lai ̣ TÀI LIỆU THAM KHẢO TÀI LIỆU TIẾNG VIỆT Hà Viết Cường (2010), Cơng nghệ sinh học trong bệnh cây Hà Viết Cường (2012), Virus thực vật, Phytoplasma và Viroid . NXB Đại học Nơng nghiệp Vũ Triệu Mân (2003), Chẩn đốn nhanh bệnh hại thực vật, NXB Nơng Nghiệp Vũ Triệu Mân – Lê Lương Tề chủ biên (2001). Giáo trình Bệnh cây Nơng Nghiệp. NXB Nơng Nghiệp Lê Lương Tề, Vũ Triệu Mân (1999), Bệnh vi khuẩn và virus hại cây trồng NXB Giáo dục, Hà Nội Nguyễn Thị Hà Uyên (2012). Xác định và đánh giá khả năng gây bệnh của một số begomovirus trên cây cà chua bằng phương pháp lây nhiễm nhân tạo dùng vi khuẩn Agrobacterium tumerfaciens TAI LIÊU TIÊNG ANH ̀ ̣ ́ (1990) "High efficiency transformation of< i> Escherichia coli with plasmids." Gene 96(1): 2328 Briddon (2003). "Cotton leaf curl disease, a multicomponent begomovirus complex." Molecular Plant Pathology 4(6): 427434 Doyle (1987). "A rapid DNA isolation procedure for small quantities of fresh leaf tissue." Phytochem bull 19: 1115 Fauquet and Stanley (2005) "Revising the way we conceive and name viruses below the species level: a review of geminivirus taxonomy calls for new standardized isolate descriptors." Archives of virology 150(10): 2151 2179 Fauquet, et al. (2008). "Geminivirus strain demarcation and nomenclature." Archives of virology 153(4): 783821 Ferreira, et al (2008) "Onestep cloning approach for construction of agroinfectious begomovirus clones." Journal of virological methods 147(2): 351354 Fujii, et al (2006). "Errorprone rolling circle amplification: the simplest random mutagenesis protocol." Nature protocols 1(5): 24932497 Gafni and Yedidya (2003). "Tomato yellow leaf curl virus, the intracellular dynamics of a plant DNA virus." Molecular plant pathology 4(1): 915 Ghanim and Czosnek (2000) "Tomato yellow leaf curl geminivirus (TYLCVIs) is transmitted among whiteflies (Bemisia tabaci) in a sex related manner." Journal of Virology 74(10): 47384745 10.Green (1991) Characteristics and control of viruses infecting peppers: a literature review, Asian Vegetable Research and Development Center 11 Green and Kim (1991) Characteristics and control of viruses infecting peppers: a literature review, Asian Vegetable Research and Development Center 12.Green, et al (2001) "Molecular characterization of begomoviruses associated with leafcurl diseases of tomato in Bangladesh, Laos, Malaysia, Myanmar, and Vietnam." Plant Disease 85(12): 12861286 13.Gutierrez, et al (2004) "Geminivirus DNA replication and cell cycle interactions." Veterinary microbiology 98(2): 111119 14 Ha (2007). "Detection and identification of potyviruses and geminiviruses in Vietnam." 15.Ha (2008). "Molecular characterization of begomoviruses and DNA satellites from Vietnam: additional evidence that the New World geminiviruses were present in the Old World prior to continental separation." Journal of General Virology 89(1): 312326 16.Ha, et al. (2008). "Molecular characterization of begomoviruses and DNA satellites from Vietnam: additional evidence that the New World geminiviruses were present in the Old World prior to continental separation." Journal of General Virology 89(1): 312326 17 Haible, D., et al (2006) "Rolling circle amplification revolutionizes diagnosis and genomics of geminiviruses." Journal of virological methods 135(1): 916 18 Harrison and Robinson (2005). "Another quarter century of great progress in understanding the biological properties of plant viruses." Annals of applied biology 146(1): 1537 19.Hartz, T., et al. (1997). Processing tomato production in California, UCANR Publications 20.Hofgen and Willmitzer (1988) "Storage of competent cells for Agrobacterium transformation." Nucleic Acids Research 16(20): 98779877 21 InoueNagata, et al (2004) "A simple method for cloning the complete begomovirus genome using the bacteriophage φ29 DNA polymerase." Journal of virological methods 116(2): 209211 22.KheyrPour, et al. (1991). "Tomato yellow leaf curl virus from sardinia is a whiteflytransmitted monoparatite geminivirus." Nucleic Acids Research 19(24): 67636769 23.Knierim and Maiss (2007) "Application of Phi29 DNA polymerase in identification and fulllength clone inoculation of tomato yellow leaf curl Thailand virus and tobacco leaf curl Thailand virus." Archives of virology 152(5): 941954 24.Moriones and NavasCastillo (2000) "Tomato yellow leaf curl virus, an emerging virus complex causing epidemics worldwide." Virus Research 71(1): 123134 25.Murugan and Uthamasamy (2001). "Dispersal behaviour of cotton whitefly Bemisia tabaci (Genn.) under cotton based gardenland agro ecosystem of Coimbatore, Tamil Nadu." MADRAS AGRICULTURAL JOURNAL 88(1/3): 16 26.Navot, N., et al (1991) "Tomato yellow leaf curl virus: a whitefly transmitted geminivirus with a single genomic component." Virology 185(1): 151161 27 Padidam, et al (1999) "Possible emergence of new geminiviruses by frequent recombination." Virology 265(2): 218225 28.Picó, et al. (1996). "Viral diseases causing the greatest economic losses to the tomato crop. II. The Tomato yellow leaf curl virus—A review." Scientia Horticulturae 67(3): 151196 29.Picó, B., et al. (1996). "Viral diseases causing the greatest economic losses to the tomato crop. II. The Tomato yellow leaf curl virus—a review." Scientia Horticulturae 67(3): 151196 30.Rybicki (1994) "A phylogenetic and evolutionary justification for three genera of Geminiviridae." Archives of Virology 139(12): 4977 31 Sambrook, et al (1989) "Extraction and purification of plasmid DNA." Molecular cloning: a laboratory manual 1: 1.2121.52 32.Wang, et al. (1993). "A simple method of preparing plant samples for PCR." Nucleic Acids Res 21(17): 41534154 33.Wang, T. C., et al. (1994). "Mammary hyperplasia and carcinoma in MMTV cyclin D1 transgenic mice." 34.Wu, et al. (2008). "A simplified method of constructing infectious clones of begomovirus employing limited restriction enzyme digestion of products of rolling circle amplification." Journal of virological methods 147(2): 355359 35.Wyant, et al. (2011). "The genomes of four novel begomoviruses and a new Sida micrantha mosaic virus strain from Bolivian weeds." Archives of virology 156(2): 347352 36.Zhang, et al (2001) "Movement proteins (BC1 and BV1) of Abutilon mosaic geminivirus are cotransported in and between cells of sink but not of source leaves as detected by green fluorescent protein tagging." Virology 290(2): 249260 CÁC TRANG WEB http://www.avrdc.org http://www.basic.northwestern.edu/biotools/oligocalc.html http://wcrc.confex.com http://www.informaworld.com http://www.ncbi.nlm.nih.gov/ ... Dựa trên cơ sở khoa học và thực tiễn trên, chúng tơi tiến hành thực hiện đề tài: Phát hiện và đánh giá tính gây bệnh của Pepper yellow leaf curl Việt Nam virus Mục tiêu và u cầu của đề tài Mục tiêu Xác định sự có mặt của PepLCVNV trên các mẫu ớt và cà chua thu thập ... Trong nghiên cứu này chúng tơi tiến hành nghiên cứu tập trung chủ yếu về begomovirus đó là Pepper yellow leaf curl Vietnam virus (PepYLCVNV) gây bệnh xoăn vàng lá trên ớt và ca chua. ̀ Đánh giá đặc trưng sinh học bằng cách đánh giá tính gây bệnh thơng qua ... được sự có mặt của begomovirus cụ thể là 2 virus Tomato yellow leaf curl virus (TYLCVNV) và Tomato leaf curl Vietnam virus (ToLCVV) trên ớt. Tuy nhiên hiện tại Việt Nam lại chưa có nhiều nghiên cứu về xác định thành phần bệnh virus hại ớt nói chung và Begomovirus hại ớt nói riêng