Khóa luận tốt nghiệp: Phát hiện và đánh giá tính gây bệnh của Pepper yellow leaf curl Việt Nam virus

Trong nghiên cứu này tiến hành nghiên cứu tập trung chủ yếu về begomovirus đó là Pepper yellow leaf curl Vietnam virus (PepYLCVNV) gây bệnh xoăn vàng lá trên ớt và cà chua.

HOC VIÊN NƠNG NGHIÊP VIÊT NAM ̣ ̣ ̣ ̣    KHOA NƠNG HOC ̣ KHĨA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐỀ TÀI    “Phát hiện và đánh giá tính gây bệnh của Pepper yellow leaf curl Việt   Nam virus ” Giảng viên hướng dẫn : TS.Hà Viết Cường Họ và tên : Ha Văn Dung ̀ ̃ Lớp : BVTVB­K55 Chun ngành : Bao vê th ̉ ̣ ực vâṭ Hà Nội­2014 LỜI CẢM ƠN Trong suốt q trình hồn thành báo cáo này ngồi những nỗ lực của bản  thân, tơi đã nhận được những sự giúp đỡ hết sức tận tình và q báu từ nhiều tập  thể và cá nhân Trước hết tơi xin được gửi lời cảm  ơn chân thành và sâu sắc nhất tới  thầy TS. Hà Viết Cường – Giám đốc trung tâm nghiên cứu bệnh cây nhiệt đới  – Trường Hoc viên nơng nghiêp Viêt Nam, Phó khoa Nơng h ̣ ̣ ̣ ̣ ọc và Ths. Trần Thị  Như Hoa ­ Phó giám đốc trung tâm nghiên cứu bệnh cây nhiệt đới đã trực tiếp   hướng dẫn, tận tình chỉ bảo và tạo mọi điều kiện để tơi hồn thành báo cáo Tơi xin gửi lời cảm  ơn chân thành nhất tới cán bộ  cơng nhân viên thuộc   Trung tâm nghiên cứu bệnh cây nhiệt đới – Trường Hoc viên nơng nghiêp Viêt ̣ ̣ ̣ ̣  Nam, đã nhiệt tình giúp đỡ tơi trong suốt q trình tơi thực tập tại Trung tâm Đồng thời tơi cũng xin chân thành cảm  ơn các Thầy giáo, Cơ giáo trong  bộ mơn bênh cây cũng nh ̣ ư các Thầy cơ trong khoa Nơng hoc,  ̣ Trường Hoc viên ̣ ̣   nơng nghiêp Viêt Nam ̣ ̣  đã nhiệt tình dạy dỗ, chỉ bảo cho tơi trong suốt thời gian   tơi học tập tại trường Cuối cùng tơi xin được chân thành cảm ơn những người thân, gia đình, bạn   bè đã hết lòng giúp đỡ, động viên tơi trong q trình học tập cũng như hồn thành   báo cáo này Một lần nữa tơi xin chân thành cảm ơn! Hà Nội, ngày 31 tháng 7 năm 2014      Sinh viên  Ha Văn Dung ̀ ̃ MUC LUC ̣ ̣ DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT Ký hiệu Từ viết tắt A. tumefaciens Agrobacterium tumefaciens AS Acetosyringone ATP Adenosine triphosphate Bb Base pair CP Capsid protein CTAB Cetryl Ammonium Bromide ddNTP Dideoxynucleoside  triphosphate DNA Deoxyribonucleic acid Dntp Deoxynucleoside triphosphate dsDNA Double strand DNA E.coli Escherichia coli EDTA Ethylene diamine tetra acetic acid ICTV International Committee on Taxonomy of Viruses IR Itergenic region Kb Kilo base LB Luria and Bertani ORF Open reading frame PCR Polymerase Chain Reaction RCA Rolling circle amplification RE Restriction enzyme Rep Replication protein RNA Ribonucleic acid Rnase Ribonuclease SDS Sodium Dodecyl Sulphate SsDNA Singe strand DNA TAE Tris – acetate – EDTA Taq Thermus aquatic Vir Virulence region β­ ME Beta­ Mercaptoethanol DANH MỤC BẢNG DANH MỤC HÌNH  TĨM TẮT Trong nghiên cứu này chúng tơi tiến hành nghiên cứu tập trung chủ yếu   về begomovirus đó là Pepper yellow leaf curl Vietnam virus (PepYLCVNV) gây  bệnh xoăn vàng lá trên ớt và ca chua.  ̀ Đánh giá đặc trưng sinh học bằng cách đánh giá tính gây bệnh thơng qua  Agrobacterium tumerfaciens (Agroinoculation),  đơng th ̀ ơì  chúng tơi tiến hành  lây nhiễm PepYLCVNV thơng qua mơi giới truyền bệnh trung gian là bọ phấn Dựa trên mồi đặc hiệu và mồi chung, các phản  ứng PCR đã được thực   hiện trên một loạt các mẫu ớt thu tại miền Băc và mi ́ ền Trung Việt Nam nhằm   phát hiện PepYLCV và begomovirrus khác. Lân đâu tiên phat hiên s ̀ ̀ ́ ̣ ự co măt cua ́ ̣ ̉   begomovirrus trên ớt tai miên Băc ̣ ̀ ́ Chúng tôi đã tiến hành xây dựng thành công cấu trúc xâm nhiễm của   PepYLCVNV, phân tích đặc trưng phân tử của của PepYLCVNV ĐẶT VẤN ĐỀ Giới thiệu Chi   Begomovirus     chi   lớn       quan   trọng       họ  Geminiviridae cả  về  số  lượng lồi và bệnh do chúng gây ra với cây trồng.  Begomovirus (được đặt tên từ  Bean golden mosaic virus) là tên gọi chung chỉ  các virus thuộc chi Begomovirus có phân virion (hạt virus) dạng hình cầu kép   (hình chùy) và bộ gen DNA sợi vòng đơn, kích thước khoảng 2,7 kb, lan truyền   trên đồng ruộng bằng bọ phấn (Bemisia tabaci) theo kiểu bền vững tuần hồn Begomovirus có thể  có bộ  gen đơn (gồm một phân tử  DNA­A) hoặc có   gen kép (gồm hai phân tử  DNA­A và DNA­B).  Ở  một số  loại cây chỉ  cần  phân tử DNA­A đã gây triệu chứng điển hình, còn ở  một số  loại cấy khác thì  cần có cả phân tử DNA­A và DNA­B mới gây ra triệu chứng bệnh.  Begomovirus  gây bệnh trên các loại cây  đều có  các triệu chứng   đặc  trưng, điển hình là: cuốn lá (cong lại hình thìa); mép lá (đặc biệt ở lá non) biến  vàng; lá nhỏ hẹp; cây nhiễm sớm còi cọc với tỷ lệ đậu quả rất thấp. Danh tính   virus chỉ có thể được xác định dựa vào các phân tích phân tử  Việt   Nam     chứng   minh     trung   tâm   đa   dạng   quan   trọng     begomovirus. Mặc dù vậy số  lượng begomovirus xác định trên thực vật của  Việt Nam vẫn còn ít chỉ gồm 19 lồi được phân lập từ nhiều lồi cây, trong đó  có nhiều cây dại. (Green, Tsai et al., 2001), (Ha, 2007).  Trên cây họ cà, đã có 6 begomovirus được phát hiện gây bệnh xoăn vàng   lá cà chua tại Việt Nam. Tuy nhiên hiện vẫn chưa có cơng bố nào cho thấy sự  có mặt của begomovirus trên  ớt. Năm 2012, một loạt các mẫu  ớt biểu hiện  triệu chứng bệnh virus trên  ớt đã được TTNC Bệnh cây Nhiệt đới (Trường   ĐHNN Hà Nội) thu thập khắp cả  nước. Các phân tích phân tử  từ  một mẫu  virus phân lập đầu tiên từ   ớt thu thập tại Đà Nẵng (mẫu VNP93) đã xác định  được   một loài begomovirus mới và virus này được đặt tên là Pepper yellow   leaf curl Vietnam virus (PepYLCVNV)  Các nghiên cứu sơ  bộ  tại TT NCBC NĐ cũng cho thấy virus này cũng  nhiễm tự nhiên cả trên cây cà chua bị bệnh xoăn vang lá. Việc lần đầu tiên phát   hiện được một begomovirus gây hại tự  nhiên trên  ớt   Việt Nam có ý nghĩa   quan trọng cả về mặt khoa học và thực tiễn vì cây cây ớt cũng như cây cà chua   là các cây trồng quan trọng của Việt Nam  Do PepYLCVNV là một virus mới nên phân bố cũng như đặc điểm sinh  học, đặc biệt là phổ ký chủ của virus vẫn chưa được nghiên cứu Dựa trên cơ  sở khoa học và thực tiễn trên, chúng tơi tiến hành thực hiện   đề  tài:  “Phát hiện và đánh giá tính gây bệnh của Pepper yellow leaf curl   Việt Nam virus” Mục tiêu và u cầu của đề tài Mục tiêu Xác định sự có mặt của PepLCVNV trên các mẫu ớt và cà chua thu thập  tại miền Bắc và đánh giá tính gây bệnh của virus u cầu ­ Điều tra bệnh cuốn lá  ớt tại một số điểm trồng  ớt chính thuộc Hà Nội,  Hưng n ­ Thu thập mẫu bệnh trên ớt với triệu chứng cuốn lá điển hình ­ Phát hiện PepYLCVNV bằng PCR dùng mồi đặc hiệu trên các mẫu ớt và  cà chua thu thập trong nghiên cứu này và thu thập từ trước ­ Đánh giá tính gây bệnh của PepYLCVNV bằng lây nhiễm nhân tạo dùng  kỹ thuật agroinoculation trên cà chua, ớt và một số cây chỉ thị ­ Đánh giá tính gây bệnh của PepYLCVNV bằng lây nhiễm nhân tạo dùng  vector bọ phấn TỔNG QUAN TÀI LIỆU Tầm quan trọng của ớt va ca chua ̀ ̀ Cây   ơt́   là  môṭ   loaị   quả   cuả       thuôc̣   chi   Capsicum   cuả   họ   Cà  (Solanaceae). Ớt có nguồn gốc từ châu Mỹ, ngày nay nó được trồng khắp nơi  trên thế  giới và được sử  dụng làm gia vị, rau, và thuốc. Hiện nay, Ấn Đơ là ̣   nươc san xu ́ ̉ ất  ớt lớn nhất thế  giới với khoảng 1 triệu tấn mỗi năm, nơi chỉ  riêng Chợ Guntur (lớn nhất châu Á) có 1 triệu bao  ớt.  Ở  Viêt Nam,  ̣ ơt la mơt ́ ̀ ̣  gia vi th ̣ ương xuyên co măt trong cac b ̀ ́ ̣ ́ ưa ăn, ngoai ra  ̃ ̀ ơt con co rât nhiêu công ́ ̀ ́ ́ ̀   dung nh ̣ ư: cai thiên hê tiêu hoa, giam cân, ch ̉ ̣ ̣ ́ ̉ ưa bênh ung th ̃ ̣ ư, ngưa tai biên ̀ ́  mach, tăng s ̣ ức đê khang ̀ ́ Cà chua (S.lycopersicum) có nguồn gốc từ Nam Mỹ, nó được người Tây   Ban Nha lan truyền tới Pilippine, Đơng Nam Á và tồn bộ Châu Á, cuối cùng là  Châu Âu. Cà chua là lồi trái cây vườn phổ biến nhất  ở Hoa Kỳ. Khoảng 150  triệu tấn cà chua đã được sản xuất ra trên Thế  giới trong năm 2009. Trung  Quốc là nước sản xuất cà chua lớn nhất, chiếm khoảng một phần tư  sản   lượng   toàn   cầu,   tiếp   theo     Hoa   Kỳ   và Ấn   Độ   Các   khu   vực   chế   biến  tại California chiếm 90% lượng sản xuất   Mỹ  và 35% lượng sản xuất thế  giới (Hartz, Miyao et al., 1997). Cung nh ̃   ơt,  ́ ở  nươc ta ca chua la môt gia vi ́ ̀ ̀ ̣ ̣  hay co trong môi b ́ ̃ ữa ăn, bởi ca chua la môt th ̀ ̀ ̣ ực rất giàu : Nước (chiêm 93 đ ́ ến   95 % ), giàu ngun tố khống,và vitamine A, C, và E. Cà chua chín chứa nhiều  sắc tố  trong nhóm của caroténọdes, như  β­carotène cho một hoạt chất tiền  vitamine A rât co l ́ ́ ợi cho sưc khoe ́ ̉ Đặc điểm chung của Begomovirus Trong bốn chi của họ  Geminiviradae, chi Begomovirus (được đặt tên từ  Bean golden mosaic virus) là chi quan trọng nhất, cả về số lượng lồi (198 lồi  vào năm 2010, website ICTV) cũng như  các bệnh mà chúng gây ra trên cây  trồng. Tất cả  các begomovirus (tên gọi chỉ  các virus thuộc chi Begomovirus)  đều khơng truyền qua hạt giống nhưng lan truyền ngồi tự nhiên nhờ bọ phấn  (Bemisia tabaci) theo kiểu bền vững tuần hồn (Fauquet and Stanley, 2005) Đặc điểm hình thái Đặc điểm hình thái chung của các Begomovirus đều có cấu trúc phân tử  (virion) tương tự nhau bao gồm 2 hình cầu 20 mặt (icosahedron), mỗi mặt là 1   tam giác đều với số đơn vị tam giác (T) trên mỗi mặt bằng 1, nối với nhau để  tạo ra phân tử  hình cầu đa diện kép (gemini). Do nối với nhau nên 2 hình cầu  này khơng hồn thiện dẫn tới trên mỗi hình cầu chỉ  có 55 tiểu phần protein   (protein vỏ) được xắp xếp thành 11 đơn vị  hình thái, mỗi đơn vị  gồm 5 tiểu   phần protein (pentameric capsomer). Kết quả  là tồn bộ  phân tử  có 110 tiểu   phần và 22 đơn vị  hình thái (Gafni and Yedidya, 2003), (Zhang, Cheng et al.,  2001) Hình 2.1 Hình thái của begomovirus (Nguồn ảnh:  www.ncbi.nlm.nih.gov)  Cấu trúc genome của Begomovirus Begomovirus  là virus   thực vật có bộ  gen DNA sợi vòng đơn có kích  thước khoảng 2,6­ 2,8 kb. Chúng hoặc có bộ gen kép (bipartite) gồm 2 phân tử  DNA gọi là DNA­A và DNA­B hoặc có bộ gen đơn (monopartite) tương đương  DNA­A (Ha, 2007) Kết quả  tìm kiếm trực tuyến cho thấy đoạn trình tự  virus của plasmid   VNP1500­20 là DNA­B và gần gũi nhất với DNA­B của Tomato yellow leaf  curl Kanchanaburi virus với mức đồng nhất trình tự 89% (bảng 4.16) Các mức đồng nhất trình tự    trên  khá thấp  và chưa đủ  để  kết luận  danh tính virus Bảng 4.16. Kết quả tìm kiếm virus gần gũi nhất trên Ngân hàng gen  (Genbank) dùng trình tự thu đượ c của mẫu virus VNP1500 Virus gần gũi Ngân hàng gen* Mã Ngân hàng gen Phần trăm đoạn so sánh (%) Mức đồng trình tự (%0 Pepper leaf curl Malaysia virus (Malaysia), DNA-A AF414287 100 88 Erectites yellow mosaic virus (Việt Nam), DNA-A DQ641698 97 89 Pepper leaf curl virus (Thái Lan), DNA-A AF134484 100 97 Tomato yellow leaf curl Kanchanaburi virus (Thái Lan, isolate E4), DNA-B KF446664 93 89 Tomato yellow leaf curl Kanchanaburi virus (Thái Lan, isolate P4), DNA-B KF446672 93 89 Tomato yellow leaf curl Kanchanaburi virus (Thái Lan, isolate P3), DNA-B KF446670 93 89 Plasmid giải trình tự VNP1500-1 (DNA-A) VNP1500-20 Tên virus (nguồn gốc), loại phân tử gen * Chỉ trình bày 3 virus gần gũi nhất dung phần mềm tìm kiếm trực tuyến  BLAST tại NCBI So sánh trình tự với PepYLCVNV Do DNA­A của mẫu virus VNP1500 ln có phản  ứng PCR dương tính   với mồi đặc hiệu của PepYLCVNV. Bộ gen của virus này vẫn chưa được gửi   trên Ngân hàng gen nên chúng tơi đã tiến hành so sánh trình tự  của mẫu virus   VNP1500 với PepYLCVNV (VNP93). Trình tự của các virus gần gũi trên Ngân  hàng gen như: PepLCV, TYLCKaV và ErYV cũng được sử  dụng trong phân  tích. Kết quả so sánh được trình bày ở bảng 4.17 Kết quả  so sánh cho thấy cả  2 phân tử  DNA­A và DNA­B của mẫu   VNP1500     có   mức   đồng     trình   tự     cao   (>90%)   đối   với   virus   PeYLCVNV (mẫu VNP93). Mặc dù danh tính chính xác của virus chỉ  có thể  được xác định dựa trên trình tự  tồn bộ  bộ  gen nhưng mức đồng nhất cao  ở  trên cho thấy mẫu VNP1500 chính là PepYLCVNV Kết quả này cho thấy PepLCVNV có phân bố khá rộng, ít nhất ở các tỉnh  miền Trung và miền nam nước ta Bảng 4.17. So sánh đoạn trình tự thu đượ c của mẫu virus VNP1500 v ới  PepYLCVNV (VNP93) và các gần gũi nhất trên Ngân hàng gen Mức đồng trình tự (%)* Loại phân tử genome Virus so sánh VNP1500-1 DNA-A PepYLCVNV (VNP93, Việt nam, DNA-A) 90.9 PepLCV (AF414287, Malaysia, DNA-A) 87.8 PepLCV (AF134484, Thái Lan, DNA-A) 86.3 EYMV (DQ641698, Việt Nam, DNA-A) 86.9 TYLCKaV (AF511529, Thai Lan, DNA-A) 71.7 VNP1500-20 PepYLCVNV (VNP93, Việt nam, DNA-B) 92.5 TYLCKaV (AF511528, Thái Lan, DNA-B) 86.6 DNA-B * Chỉ tính trên đoạn trình tự thu được của mẫu VNP1500 (1697 nts của plasmid  VNP1500­1 và 1396 nts của plasmid VNP1500­20) Kêt qua kiêm tra mơt sơ loai virus gây hai trên  ́ ̉ ̉ ̣ ́ ̣ ̣ ớt thu thâp t ̣ ại miền Bắc và  miền Trung giai đoan 2012­2013 ̣ Kiểm tra virus gây hai thu thâp ngoai đông t ̣ ̣ ̀ ̀ ư cac đia điêm điêu tra giai đo ̀ ́ ̣ ̉ ̀ ạn  2012­2013 băng ph ̀ ương phap ELISA ́ Nhăm xac đinh nguyên nhân gây bênh do virus gây hai trên  ̀ ́ ̣ ̣ ̣ ơt , chung tôi ́ ́   tiên hanh thu thâp mâu bênh co triêu ch ́ ̀ ̣ ̃ ̣ ́ ̣ ứng điên hinh đ ̉ ̀ ược thu thâp t ̣ ừ cac đia ́ ̣   điêm điêu tra. Mâu bênh thu đ ̉ ̀ ̃ ̣ ược lam khô va bao quan băng silicagel. Đ ̀ ̀ ̉ ̉ ̀ ể kiểm   tra các mẫu có triệu chứng thu được, chúng tơi tiến hành kiểm tra bằng phản   ứng ELISA trực tiếp (DAS – ELISA). Ngn khang hut thanh s ̀ ́ ́ ử  dung la ̣ ̀  khang huyêt thanh ́ ́  Chilli Veinal mottle Virus  (ChiVMV), đây là  potyvirus  phổ  biến trên ơt t ́ ại Việt Nam. Tông sô 28 m ̉ ́ ẫu co triêu ch ́ ̣ ứng virus thu thâp đ ̣ ược  trong qua trinh điêu tra ngoai đông ruông đa đ ́ ̀ ̀ ̀ ̀ ̣ ̃ ược kiêm tra ELISA, trong đo cac ̉ ́ ́  mâu đ ̃ ược kêt luân la d ́ ̣ ̀ ương tinh khi co tri sô ELISA l ́ ́ ̣ ́ ớn gâp đôi tri sô ELISA ́ ̣ ́   cua đôi chung âm (cây khoe). Kêt qua đ ̉ ́ ́ ̉ ́ ̉ ược thê hiên  ̉ ̣ ở bang 4.1, hinh 4.1.1 ̉ ̀ Kết quả bảng 4.1 và hình 4.32 và hình 4.33 cho thấy:  Kết quả  kiểm tra cho thấy có 12/28 mẫu bị  nhiễm ChiVMV (chiếm   54.55%). Điều đó, cho thây chung ChiVMV la virus quan trong đơi v ́ ̉ ̀ ̣ ́ ới cây ớt taị   Viêt Nam.  ̣ Bảng 4.18. K ết quả ki ểm tra ELISA các mẫu ớt thu đượ c  tại Việt Nam giai đoạn 2012­2013 STT ChiVMV Ký hiệu Triệu  chứng Địa điểm VNP96 Cuốn lá,  khảm Tuy Loan­ ́ Đa Năng ̀ ̃ 0.874 + VNP120 Kham  ̉ Thai Binh ́ ̀ 2.717 + VNP179 Cuốn lá,  khảm Cam Lô­̣ Quang Tri ̉ ̣ 0.162 OD 0.156 KL – – VNP192 Kham ̉ Cam  Đươ ̀ng­ Lao Cai ̀ VNP217 Khảm Co Noi­ ̀ ̀ Sơn La 0.244 + VNP237 Cuốn  lá,khảm Cô Phuc­ ̉ ́ Yên Baí 0.146 – VNP251 Cuốn  lá,khảm Chiêng  ̀ Sinh­Sơn  La 0.923 + VNP291 Kham  ̉ vang, la  ̀ ́ nhỏ Vinh  ̃ Tươ ̀ng­ Vinh Phuc ̃ ́ 1.642 + VNP300 Xoăn vang  ̀ lá Soc S ́ ơn­ Ha Nôi ̀ ̣ 0.150 – VNP306 Khảm vàng Yên Thê­́ Băc Giang ́ 0.180 – 11 VNP313 Châu  Khảm vàng Thanh­An  ̀ Giang 0.161 – 12 VNP453 Khảm vàng Vinh Bao­ ̃ ̉ Hai Phong ̉ ̀ 2.174 + 13 VNP535 Khảm Hoa An­ ̀ Cao Băng ̀ 0.144 – VNP558 Chợ  Mới­ Khảm vàng Băc Kan ́ ̣ 15 VNP626 Kham ̉ Tuy Loan­ ́ Đa Năng ̀ ̃ 0.151 16 VNP632 Khảm vàng Tuy Loan­ ́ Đa Năng ̀ ̃ 0.623 + 17 VNP634 Khảm vàng Điên Ban­ ̣ ̀ 0.673 Quang Nam ̉ + 18 VNP649 Khảm vàng Phu Cat­ ̀ ́ Binh Đinh ̀ ̣ 1.058 + Kham ̉ Thanh  Binh­Đông  ̀ ̀ 2.160 Thap ́ + 1.844 + >3 + 10 14 19 VNP683 0.158 – – 20 VNP706 Kham vang ̉ ̀ Châu  Thanh­An  ̀ Giang 21 VNP716 Kham ̉ Yên Thê­́ Băc Giang ́ Kham ̉ Binh Thuy­ ̀ ̉ 0.145 Cân Th ̀ – Không bi ̣ bênh ̣ TTBCNĐ­  ĐHNNHN – Không bi ̣ bênh ̣ TTBCNĐ­  ĐHNNHN 22 23 24 VNP785 Đối chứng  (–)  Đối chứng  (–) 0.162 0.160 – 25 Đối chứng  (–) Không bi ̣ bênh ̣ TTBCNĐ­  ĐHNNHN 0.172 26 Đối chứng  (+)  Khảm  vàng, la ́ nhỏ TTBCNĐ­  ĐHNNHN >3 + 27 Đối chứng  (+)  Khảm  vàng, la ́ nhỏ TTBCNĐ­  ĐHNNHN >3 + 28 Đối chứng  (+) Khảm  vàng, la ́ nhỏ TTBCNĐ­  ĐHNNHN >3 + – Số mẫu + 12 Tỷ lệ mẫu + 54.55% Ghi chú: OD: Mật độ quang học đo bước sóng 405 nm;  KL: Kết luận; ( ­) : Cây khơng nhiễm bệnh; (+): Cây nhiêm bênh ̃ ̣ 2 ×  trị số trung bình giá trị ở giếng đối chứng âm + độ lệch chuẩn=0.178 Hình 4.22. Kết quả ELISA phát hiện ChiVMV Kiểm tra virus gây hai thu thâp ngoai đơng t ̣ ̣ ̀ ̀ ư cac đia điêm điêu tra giai đo ̀ ́ ̣ ̉ ̀ ạn  2012­2013 băng p ̀ han  ̉ ưng PCR ́ Kết quả  kiêm tra ELISA cho th ̉ ấy, nhiều mẫu với triệu chứng rất điển   hình như  khảm vàng tồn bộ  diện tích lá, cuốn lá, biến dạng lá… lại khơng  dương với virus ChiVMV. Chính vì thế chúng tơi nghi ngờ các mẫu trên có thể  nhiễm begomovirus. Vì vậy, chúng tơi chon mơt sơ mâu âm v ̣ ̣ ́ ̃ ới virus ChiVMV,   cung v ̀ ơi mơt sơ mâu nghi ng ́ ̣ ́ ̃ ờ nhiễm begomovirus đa thu thâp đ ̃ ̣ ược đê kiêm tra ̉ ̉   PCR Tất cả các mẫu đều được chiết DNA tổng số bằng CTAB và phan  ̉ ưng ́   PCR sử dụng căp môi chung BegoA – For1/BegoA – Rev1. Kêt qua đ ̣ ̀ ́ ̉ ược trinh ̀   bay trong bang (4.2) va hình 4.1.2 ̀ ̉ ̀ Kết quả kiểm tra cho thấy, trong 12 mâu kiêm tra đa phat hiên thây 8 mâu ̃ ̉ ̃ ́ ̣ ́ ̃  phan  ̉ ưng PCR d ́ ương (+), tưc la cây nhiêm bênh, chiêm ty lê 66,67% ́ ̀ ̃ ̣ ́ ̉ ̣ Cac mâu co phan  ́ ̃ ́ ̉ ưng d ́ ương vơi căp môi chung BegoA – For1/BegoA – ́ ̣ ̀   Rev1 tao cac băng đ ̣ ́ ơn trên ban gel, trung kích th ̉ ̀ ước sản phẩm băng điện di   mong muốn là ~1.2 kb, mẫu đối chứng dương có phản  ứng. Như vây, kêt qua ̣ ́ ̉  kiêm tra đa xac nhân s ̉ ̃ ́ ̣ ự co măt cua  ́ ̣ ̉ begomovirus trong 12 mâu  ̃ ơt kiêm tra ́ ̉ Bảng 4.19. Kết quả kiểm tra các mẫu ớt bằng PCR sử dụng cặp m ồi  BegoA – For1 va BegoA – Rev1 ̀ STT Mẫ u VNP4 VNP179 Triêu ̣   chứng Cuốn lá,  khảm Khảm vang ̀ Địa điểm Kêt qua ́ ̉  PCR FAVRI +  Cam Lô – ̣   Quang  ̉ +  Trị VNP192 Khảm Cam đươ ̀ng  – Lao Cai ̀ – VNP234 Kham ̉ Cô Phuc – ̉ ́   Yên Baí – VNP246 Xoăn lá Chiêng Sinh ̀   – Sơn La +  VNP300 Kham vang ̉ ̀ Soc S ́ ơn –  Ha Nôi ̀ ̣ – VNP306 Khảm  Yên Thê – ́   Băc Giang ́ +  VNP456 Sang gân ́ Quynh Phu ̀ ̣  – Thai Binh ́ ̀ – VNP459 Sang gân t ́ ư ̀ Quynh Phu ̀ ̣  cuông ́ – Thai Binh ́ ̀ – 10 VNP535 Kham ̉ 11 VNP558 12 VNP961 Hoa An – ̀   Cao Băng ̀ – Kham nhăn ̉ Chợ  Mới –  Băc Kan ́ ̣ – Kham, biên  ̉ ́ vang ̀ An dươ ng –  Hai Phong ̉ ̀ – Sô mâu d ́ ̃ ươ ng/tông sô mâu th ̉ ́ ̃ ử Ty lê(%) ̉ ̣ Ghi chu: (+) Cây nhiêm virus,  (–) Cây không nhiêm virus  ́ ̃ ̃ 8/12 66,67 Hình 4.23. Triệu chứng của Begomovirus gây hại trên ớt tại Đà Năng ̃   Hình 4.24. Kiểm tra PCR các mẫu ớt bằng cặp mồi cặp mồi BegoA –  For1 va BegoA – Rev1 ̀ Marker H2O VNP4 VNP179 VNP192 VNP234 VNP246 VNP300 VNP306VNP456 VNP459 VNP538 VNP558 VNP9611 (ladder: 1kb) Từ kêt qua trên, chung tôi nhân thây 2 mâu bênh  ́ ̉ ́ ̣ ́ ̃ ̣ ở  miên Băc phan  ̀ ́ ̉ ứng   PCR dương: VNP246 va VNP306. Vi  ̀ ̀begomovirus chưa tưng xuât hiên tai miên ̀ ́ ̣ ̣ ̀  Băc, do đo chung tôi tiên hanh kiêm tra PCR  ́ ́ ́ ́ ̀ ̉ trên 2 mâu nay thêm 1 l ̃ ̀ ần nữa. Kêt́  qua trinh bay bang (4.3) va hình 4.1.3 ̉ ̀ ̀ ̉ ̀ Bảng 4.20. Kết quả kiểm tra  2 mẫu ớt  bằng PCR sử dụng cặp m ồi  BegoA – For1 va BegoA – Rev1 ̀ STT Mẫ u Triêu ̣   chứng Địa điểm Kêt qua ́ ̉  PCR VNP246 Xoăn lá Chiêng Sinh ̀   – Sơn La –  VNP306 Khảm  Yên Thê – ́   Băc Giang ́ +  Sô mâu d ́ ̃ ươ ng/tông sô mâu th ̉ ́ ̃ ử 1/2 Ty lê(%) ̉ ̣ 50 Ghi chu: (+) Cây nhiêm virus,  (–) Cây khơng nhiêm virus  ́ ̃ ̃ Hình 4.24. Kiểm tra PCR 2 mẫu ớt thu ở miền Bắc bằng cặp mồi  cặp mồi BegoA – For1 va BegoA – Rev1 ̀ MarkerH2OVNP4VNP179 (ladder: 1kb) KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ Kết luận Đã phục hồi 2 dòng vi khuẩn  A. tumerfaciens  mang cấu trúc xâm nhiễm của  PepYLCVNV là AT­VNP93­5­4­11 và AT­VNP93­5­8­1 Đã lây nhiễm PepYLCVNV bằng agroinoculation trên các giống: ca chua Hơng ̀ ̀   Lan (T20), ơt Hiêm Lai F1­207, va cac cây chi thi ́ ̉ ̀ ́ ̉ ̣ Đã lây nhiễm PepYLCVNV bằng bọ  phấn  (B. tabaci) trên các giống: ca chua ̀   Hơng Lan (T20), ca tim GS505,  ̀ ̀ ́ ơt Hiêm lai F1­207. Kêt qua cho thây giơng thí ́ ̉ ́ ̉ ́ ́   nghiệm đều biểu hiện triệu chứng bệnh vơi t ́ ỷ  lệ  100% nhiễm bệnh khi lây  nhiễm bằng bọ phấn Xây dựng thành cơng cấu trúc xâm nhiễm của PepYLCVNV bằng kỹ  thuật   RCA (rolling circle amplification) Đã giải trình tự tồn bộ bộ gen gồm 2 thành phần DNA­A và DNA­B của mẫu  virus gây bệnh trên cây ớt thu tại Đơng Thap (m ̀ ́ ẫu VNP1500) Đa kiêm tra PCR v ̃ ̉ ơi căp môi chung đê phat hiên  ́ ̣ ̀ ̉ ́ ̣ begomovirus trên cac mâu  ́ ̃ ớt  thu thâp tai miên Băc va miên Nam Viêt Nam. Kêt qua cho thây co 2/12 (16.7%) ̣ ̣ ̀ ́ ̀ ̀ ̣ ́ ̉ ́ ́   mâũ   ơt́   thu   taị   miên ̀   Băć   và  6/12   (50%)   mâu ̃   ớt   thu   taị   miên ̀   Trung   nhiêm ̃   begomovirus Kiến nghị Tiếp tục tối  ưu hóa phương pháp lây nhiễm nhân tạo sử dụng vi khuẩn  Agrobacterium   tumerfaciens   (Agroinoculation)   đối   với   PepYLCVNV  nhằm đánh giá được tính gây bệnh của PepYLCVNV Sử  dụng cấu trúc xâm nhiễm   PepYLCVNV mới thiết kế  để  đánh giá   tính gây bệnh của PepYLCVNV Đánh giá tính gây bệnh của begomovirus gây bệnh trên ớt bằng kỹ thuật   Agroinoculation Tiêp tuc đánh gia đa d ́ ̣ ạng của begomovirus trên ớt tại Việt Nam Lân đâu tiên phat hiên virus begomovirus trên  ̀ ̀ ́ ̣ ớt ở miên Băc nên cân kiêm ̀ ́ ̀ ̉   tra lai ̣ TÀI LIỆU THAM KHẢO TÀI LIỆU TIẾNG VIỆT Hà Viết Cường (2010), Cơng nghệ sinh học trong bệnh cây Hà Viết Cường (2012), Virus thực vật, Phytoplasma và Viroid . NXB Đại   học Nơng nghiệp Vũ Triệu Mân (2003),  Chẩn đốn nhanh bệnh hại thực vật,   NXB Nơng  Nghiệp Vũ Triệu Mân – Lê Lương Tề chủ biên (2001). Giáo trình Bệnh cây Nơng  Nghiệp. NXB Nơng Nghiệp Lê Lương Tề, Vũ Triệu Mân (1999), Bệnh vi khuẩn và virus hại cây trồng   NXB Giáo dục, Hà Nội Nguyễn Thị Hà Uyên (2012). Xác định  và đánh giá khả năng gây bệnh của   một số  begomovirus  trên cây cà chua bằng phương pháp lây nhiễm nhân  tạo dùng vi khuẩn Agrobacterium tumerfaciens TAI LIÊU TIÊNG ANH ̀ ̣ ́ (1990)   "High   efficiency   transformation   of<   i>   Escherichia   coli   with  plasmids." Gene 96(1): 23­28 Briddon (2003). "Cotton leaf curl disease, a multicomponent begomovirus  complex." Molecular Plant Pathology 4(6): 427­434 Doyle (1987). "A rapid DNA isolation procedure for small quantities of fresh  leaf tissue." Phytochem bull 19: 11­15 Fauquet   and   Stanley   (2005)   "Revising   the   way   we   conceive   and   name  viruses below the species level: a review of geminivirus taxonomy calls for  new standardized isolate descriptors."  Archives of virology  150(10): 2151­ 2179 Fauquet, et al. (2008). "Geminivirus strain demarcation and nomenclature."  Archives of virology 153(4): 783­821 Ferreira,   et   al   (2008)   "One­step   cloning   approach   for   construction   of  agroinfectious begomovirus clones."  Journal of virological methods  147(2):  351­354 Fujii,  et  al  (2006).  "Error­prone  rolling  circle  amplification: the  simplest  random mutagenesis protocol." Nature protocols 1(5): 2493­2497 Gafni and Yedidya (2003). "Tomato yellow leaf curl virus, the intracellular  dynamics of a plant DNA virus." Molecular plant pathology 4(1): 9­15 Ghanim   and   Czosnek   (2000)   "Tomato   yellow   leaf   curl   geminivirus  (TYLCV­Is)   is   transmitted   among   whiteflies   (Bemisia   tabaci)   in   a   sex­ related manner." Journal of Virology 74(10): 4738­4745 10.Green   (1991)  Characteristics   and   control   of   viruses   infecting   peppers:   a  literature review, Asian Vegetable Research and Development Center 11 Green   and   Kim   (1991)  Characteristics   and   control   of   viruses   infecting  peppers:   a   literature   review,   Asian   Vegetable   Research   and   Development  Center 12.Green,   et   al   (2001)   "Molecular   characterization   of   begomoviruses  associated with leafcurl diseases of tomato in Bangladesh, Laos, Malaysia,  Myanmar, and Vietnam." Plant Disease 85(12): 1286­1286 13.Gutierrez,   et   al   (2004)   "Geminivirus   DNA   replication   and   cell   cycle  interactions." Veterinary microbiology 98(2): 111­119 14 Ha (2007). "Detection and identification of potyviruses and geminiviruses in  Vietnam." 15.Ha (2008). "Molecular characterization of begomoviruses and DNA satellites  from Vietnam: additional evidence that the New World geminiviruses were  present in the Old World prior to continental separation." Journal of General  Virology 89(1): 312­326 16.Ha, et al. (2008). "Molecular characterization of begomoviruses and DNA  satellites   from   Vietnam:   additional   evidence   that   the   New   World  geminiviruses were present in the Old World prior to continental separation."  Journal of General Virology 89(1): 312­326 17 Haible,   D.,   et   al   (2006)   "Rolling   circle   amplification   revolutionizes  diagnosis and genomics of geminiviruses."  Journal of virological methods  135(1): 9­16 18 Harrison and Robinson (2005). "Another quarter century of great progress in  understanding the biological properties of plant viruses."  Annals of applied  biology 146(1): 15­37 19.Hartz, T., et al. (1997). Processing tomato production in California, UCANR  Publications 20.Hofgen   and   Willmitzer   (1988)   "Storage   of   competent   cells   for  Agrobacterium transformation." Nucleic Acids Research 16(20): 9877­9877 21 Inoue­Nagata,   et   al   (2004)   "A   simple   method   for   cloning   the   complete  begomovirus   genome   using   the   bacteriophage   φ29   DNA   polymerase."   Journal of virological methods 116(2): 209­211 22.Kheyr­Pour, et al. (1991). "Tomato yellow leaf curl virus from sardinia is a  whitefly­transmitted   monoparatite   geminivirus."  Nucleic   Acids   Research  19(24): 6763­6769 23.Knierim   and   Maiss   (2007)   "Application   of   Phi29   DNA   polymerase   in  identification and full­length clone inoculation of tomato yellow leaf curl  Thailand virus and tobacco leaf curl Thailand virus."  Archives of virology  152(5): 941­954 24.Moriones   and   Navas­Castillo   (2000)   "Tomato   yellow   leaf   curl   virus,   an  emerging   virus   complex   causing   epidemics   worldwide."  Virus   Research  71(1): 123­134 25.Murugan and Uthamasamy (2001). "Dispersal behaviour of cotton whitefly  Bemisia tabaci  (Genn.) under  cotton based gardenland agro ecosystem of  Coimbatore,   Tamil   Nadu."  MADRAS   AGRICULTURAL   JOURNAL  88(1/3): 1­6 26.Navot,   N.,   et   al   (1991)   "Tomato   yellow   leaf   curl   virus:   a   whitefly­ transmitted geminivirus with a single genomic component." Virology 185(1):  151­161 27 Padidam,   et   al   (1999)   "Possible   emergence   of   new   geminiviruses   by  frequent recombination." Virology 265(2): 218­225 28.Picó, et al. (1996). "Viral diseases causing the greatest economic losses to the  tomato crop. II. The Tomato yellow  leaf  curl virus—A  review."  Scientia  Horticulturae 67(3): 151­196 29.Picó, B., et al. (1996). "Viral diseases causing the greatest economic losses to  the tomato crop. II. The Tomato yellow leaf curl virus—a review." Scientia  Horticulturae 67(3): 151­196 30.Rybicki   (1994)   "A   phylogenetic   and   evolutionary   justification   for   three  genera of Geminiviridae." Archives of Virology 139(1­2): 49­77 31 Sambrook,   et   al   (1989)   "Extraction   and   purification   of   plasmid   DNA."  Molecular cloning: a laboratory manual 1: 1.21­21.52 32.Wang, et al. (1993). "A simple method of preparing plant samples for PCR."  Nucleic Acids Res 21(17): 4153­4154 33.Wang, T. C., et al. (1994). "Mammary hyperplasia and carcinoma in MMTV­ cyclin D1 transgenic mice." 34.Wu, et al. (2008). "A simplified method of constructing infectious clones of  begomovirus employing limited restriction enzyme digestion of products of  rolling circle amplification." Journal of virological methods 147(2): 355­359 35.Wyant, et al. (2011). "The genomes of four novel begomoviruses and a new  Sida   micrantha   mosaic   virus   strain   from   Bolivian   weeds."  Archives   of  virology 156(2): 347­352 36.Zhang,   et   al   (2001)   "Movement   proteins   (BC1   and   BV1)   of   Abutilon  mosaic geminivirus are cotransported in and between cells of sink but not of  source leaves as detected by green fluorescent protein tagging."  Virology  290(2): 249­260 CÁC TRANG WEB  http://www.avrdc.org   http://www.basic.northwestern.edu/biotools/oligocalc.html   http://wcrc.confex.com   http://www.informaworld.com   http://www.ncbi.nlm.nih.gov/  ... Dựa trên cơ  sở khoa học và thực tiễn trên, chúng tơi tiến hành thực hiện   đề  tài:   Phát hiện và đánh giá tính gây bệnh của Pepper yellow leaf curl   Việt Nam virus Mục tiêu và u cầu của đề tài Mục tiêu Xác định sự có mặt của PepLCVNV trên các mẫu ớt và cà chua thu thập ... Trong nghiên cứu này chúng tơi tiến hành nghiên cứu tập trung chủ yếu   về begomovirus đó là Pepper yellow leaf curl Vietnam virus (PepYLCVNV) gây bệnh xoăn vàng lá trên ớt và ca chua.  ̀ Đánh giá đặc trưng sinh học bằng cách đánh giá tính gây bệnh thơng qua ... được sự có mặt của begomovirus cụ thể là 2 virus Tomato yellow leaf curl virus (TYLCVNV) và  Tomato leaf curl Vietnam virus (ToLCVV) trên  ớt. Tuy nhiên  hiện tại  Việt Nam lại chưa có nhiều nghiên cứu về  xác định thành phần  bệnh virus hại ớt nói chung và Begomovirus hại ớt nói riêng