ỨNG DỤNG RAPD TRONG NGHIÊN CỨU SỰ LIÊN KẾT VỚI GENE KHÁNG BỆNH BẠC LÁ LÚA

ỨNG DỤNG RAPD TRONG NGHIÊN CỨU SỰ LIÊN KẾT VỚI GENE KHÁNG BỆNH BẠC LÁ LÚA (-) Các thị sinh học phân tử: ‐ RFLP: Đa hình chiều dài đoạn cắt giới hạn => Phức tạp , cồng kềnh, khó tự động hóa, tốn kém, nguy hiểm -AFLP: (Đa hình chiều dài đoạn DNA khuếch đại) Tạo nên đoạn cắt khác phân biệt phương pháp điện di => Giới hạn kích thước đoạn DNA, phức tạp tốn - RAPD: Đa hình đoạn DNA nhân ngẫu nhiên => Rẻ tiền, nhanh, dễ thực hiện, giúp xác định tính đa dạng sinh học II Ứng dụng RAPD nghiên cứu liên kết với gen kháng bệnh bạc lúa Phương pháp RAPD - Dùng để phân tích xác định mối quan hệ thân thuộc giống trồng hay cá thể, phục vụ lai tạo giống phân loại - Nguồn gen: Ngân hàng gene, giống lúa địa phương Đối tượng nghiên cứu 36 giống lúa có nguồn gốc, tính kháng khác với bệnh bạc Bộ môn Di truyền miễn dịch, viện khoa học Kỹ thuật Nông nghiệp Sử dụng primer ngẫu nhiên Các bước tiến hành: a Tạo thu Cây mạ: Hạt lúa ngâm, ủ cho nảy mầm Khi mạ 3-5 thật thu non non có sản phẩm trao đổi chất trở ngại cho khả hòa tan DNA thu b Tách chiết DNA tổng số: Theo phương pháp Egnin CS (1998) Quy trình :Thu 0,1- 0,2g lúa non, ghiền nhanh nitơ lỏng (đảm bảo mẫu nghiền triệt để, DNA thu có dạng sứa, có phân tử lượng cao, khơng đứt đoạn) đến mẫu có dạng bột mịn Pha đệm tách chiết AND: c Xác định hàm lượng độ tinh DNA Điện di: Chạy điện di 80V 30 phút Quang phổ: λ = 260nm 280nm Độ tinh DNA từ 1.8 đến xem mẫu c Xác định hàm lượng độ tinh DNA Hàm lượng tính đa hình (PIC) 36 giống lúa d Phân tích số liệu RAPD: Phản ứng PCR – RAPD +Mỗi ống phản ứng PCR có 25 µl +Trộn hỗn hợp +Tiến hành khuếch đại theo chu trình: o B1: 94oC phút o B2: 92oC phút o B3: 35oC phút o B4: 72oC phút o B5: 72oC 10 phút o B6: Giữ 4oC (B2-4 lặp lại 45 chu kì) + Điện di sản phẩm RAPD: Pha agarose 1,8% TAE 1X đun nóng => để nguội (600C) => khn gel có cài lược (30 phút) => rút lược => thêm đệm TAE 1X ngập gel 1mm => trộn 3µl thuốc nhuộm cho vào ống sản phẩm o o Không xuất phân đoạn DNA Xuất phân đoạn DNA Kết điện di sản phẩm RAPD Xác định hệ số di truyền tương đồng (Sij): Dice Sij= Jaccard SM Sij= Xác định hệ số di truyền tương đồng (Sij): Trong đó: - Sij: hệ số giống hai cá thể i j - a: Số phân đoạn DNA xuất i,j - b: Số phân đoạn DNA xuất i không xuất j - c: Số phân đoạn DNA không xuất i xuất j - d: Số phân đoạn DNA không xuất i j - Xác định hệ số di truyền tương đồng (Sij) Giá trị tương quan kiểu hình ‐ Lập đồ di truyền dựa vào giá trị tương quan kiểu hình: Đưa nhận xét kết luận ỨNG DỤNG RFLP TRONG NGHIÊN CỨU SỰ LIÊN KẾT VỚI GEN KHÁNG BỆNH BẠC LÁ LÚA Kỹ thuật RFLP Đa hình chiều dài đoạn cắt giới hạn (RFLP): Là kỹ thuật tìm trình tự DNA khác biệt Trong phân tích RFLP, DNA mẫu cắt thành đoạn nhỏ cách sử dụng enzyme cắt giới hạn (RE) để tạo đoạn DNA nhỏ sau điện di gel RFLP cơng nghệ nghiên cứu đa hình DNA đầu tiên, rẻ nên ứng dụng rộng rãi RFLP công cụ quan trọng lập hồ sơ di truyền, lập đồ hệ gene, định vị gene cho rối loạn di truyền, nguy mang bệnh, xét nghiệm phả hệ VẬT LIỆU & PHƯƠNG PHÁP Nguyên liệu thực vật • Dòng IR-BB1 mang gen kháng bệnh bạc Xa-1 từ Kogyoku • IR-BB3 mang gen khángXa-3 từ Chugoku45 • IR - BB4 mang gen kháng Xa-4 từ IR20 • IR24, Kogyoku, Chugoku45 IR20 sử dụng làm giống kiểm tra • Để phân tích mối liên hệ Xa-1, Xa-2 marker RFLP, tiến hành thử nghiệm quần thể F2 F3 (20 / dòng) lai từ giống nhạy cảm Kinmaze khơng có Xa-1 Xa-2 Te-tep kháng với Xa-1 Xa-2 Xa-1 giao kháng với chủng tộc gây bệnh Nhật Bản,và Xa-2 giao kháng với chủng tộc (Ezuka et al., 1975) Phân tích RFLP NIL Các điểm đánh dấu RFLP 151 đồ liên kết RFLP sử dụng (Saito ctv., 1991) Chín marker khác gọi Q1 đến Q9 sử dụng Những marker bắt nguồn từ thư viện gen lúa xây dựng với pUC19 IR24, tổng DNA vị trí nhiễm sắc thể khơng rõ Kiểu gen locus marker RFLP xác định cách lai tạo Southern DNA ly trích từ IR24, ba dòng gây bệnh thể cho phương pháp cethyl trimethyl amoni bromua (Ctab) (Murray Thompson, 1980) DNA phân cắt với năm enzyme giới hạn khác (BamHI, DraI, EcoRI, EcoRV HindIII) Phân tích liên kết: • DNA từ quần thể F2 lai tạo với bốn dòng RFLP: Npb102, 120, 197 235 đánh dấu ánh xạ nhiễm sắc thể số 4, Xa-1 Xa2 nằm nhiễm sắc thể số (Sakaguchi, 1967) • Ba kiểu gen đánh dấu RFLP phát quần thể F2: P1 (Kinmaze), F1 P2 (Te-tep) • Các dòng F3 thử nghiệm cho phản ứng bạc + Vi khuẩn sử dụng Xanthomonas oryzae pv chủng oryzae T7174 T7147, tương ứng với chủng đại diện gây bệnh chủng Nhật Bản để kiểm tra phân biệt Xa-1 Xa- Mỗi chủng vi khuẩn chuyển lên môi trường thạch khoai tây bán tổng hợp ủ 30 o C ngày Nuôi cấy cách cho sinh khối huyền phù vi khuẩn với nước cất nồng độ khoảng 10^9 tế bào / ml + Các sau gieo 31 ngày 54 ngày lây nhiễm với T7147 T7174, tương ứng, phương pháp cắt (Kauffman et al., 1973) Các dòng cấy đánh giá sau 10 ngày 14 ngày sau cấy phân thành ba loại: kháng, kháng vừa dễ mẫn cảm KẾT QUẢ & THẢO LUẬN ỨNG DỤNG RAPD NGHIÊN CỨU LIÊN KẾT BỆNH ĐẠO ÔN Ở LÚA GIỚI THIỆU KỸ THUẬT RAPD 2.1 Nguyên lý Kỹ thuật RAPD (Random Amplified Polymorphic DNA) dựa kỹ thuật PCR, cách sử dụng primer ngắn (khoảng - 10 nucleotide) Khi cá thể hoàn toàn giống nhau, sau thực phản ứng PCR – RAPD điều kiện tạo số lượng đoạn chiều dài đoạn tương ứng Trong phản ứng này, primer đơn gắn vào hai điểm khác hai mạch đơn đối diện DNA khn đoạn DNA nhân lên quan sát sau điện di Hình Nguyên lý kỹ thuật RAPD 2.2 Ứng dụng  Đánh giá đa dạng di truyền  Phân tích đa dạng di truyền nấm bệnh thực vật  Nhận diện thị phân tử 2.3 Ưu nhược điểm 2.3.1 Ưu điểm  Kỹ thuật RAPD dễ thực dễ thành công, thao tác đơn giản, chất lượng DNA khuôn không cần độ tinh cao  Thời gian thực nhanh, khả nhân cao  Chi phí thực thấp đồng thời khơng dùng chất phóng xạ độc hại 2.3.2 Nhược điểm  Có tính chất ngẫu nhiên nên sản phẩm PCR thường khơng thống  Cần phải có thiết bị điện toán để xử lý số liệu  Kỹ thuật RAPD có độ xác khơng cao ỨNG DỤNG RAPD TRONG PHÁT HIỆN GEN KHÁNG ĐẠO ÔN Ở LÚA 3.1 Vật liệu  Chủng phân lập 106 (JMB840610) Pyricularia oryzea  Giống lúa Tongil Hàn Quốc sử dụng làm đối chứng kháng bệnh đạo ôn  Giống CO39 sử dụng giống nhạy cảm với bệnh đạo ơn  Hai mồi với trình tự sau: F6: GGGAATTCGG H18: GAATCGGCCA 3.2 Cách tiến hành - Tạo quần thể từ phép lai giống lúa Tongil CO39 - Đánh giá khả kháng nhạy cảm với bệnh đạo ôn cách phun bào tử nấm bệnh với nồng độ x 104 bào tử ml phun lên - Trong trình sinh trưởng cây, mẫu lấy để chiết DNA để phân tích RAPD với mồi F6 H18 Bảng Thành phần phản ứng RAPD Thành phần Nồng độ Tris-Cl 10 mM KCl 50 mM MgCl2 mM Gelatin 0.001% dNTPs 100 µM Primer 0.4 µM DNA mẫu 40 ng Taq DNA polymerase unit Giai đoạn Chu trình Số chu kỳ nhiệt Biến tính 960C / 85s Bắt cặp 360C / 70s Kéo dài 740C / phút Giữ sản phẩm 40C 45 Bảng Chu trình nhiệt phản ứng RAPD - Các sản phẩm khuếch đại điện di gel agarose 1,8% quan sát với thuốc nhuộm ethidium bromide - Nếu có band xuất kháng mà khơng có nhạy cảm xác định gen band gen kháng bệnh đạo ơn 3.3 Kết Hình Kết điện di RAPD với mồi F6 Hình Kết điện di RAPD với mồi H18 3.4 Thảo luận kiến nghị Việc sử dụng phân tích RAPD phân lập hàng loạt dòng kháng đồng hợp tử nhạy cảm chiến lược hiệu cho việc tìm marker phân tử liên quan đến gen kháng bệnh đạo ôn lúa Sau phân tích RAPD nên thực thêm kỹ thuật khác RFLP để xác định vị trí - Những cá thể dị hợp tử với hai thị ART5 SC3 lựa chọn để chọn lọc cá thể tái tổ hợp - Sàng lọc cá thể tái tổ hợp từ cá thể dị hợp tử mang gen đích Sub1 tiến hành sử dụng thị cho đa hình nhiễm sắc thể số => 14 cá thể tái tổ hợp - 14 cá thể tái tổ hợp tiếp tục phân tích - Số liệu cá thể đưa vào phân tích chương trình Graphical Genotyper để lựa chọn cá thể có di truyền cao tiếp tục lai tạo hệ BC2F2 c) Quy tụ gen Sub1 vào giống AS996 hệ BC2F1 - Từ cá thể BC1F1 lựa chọn lai tạo quần thể hệ BC2F1 Tiến hành tách chiết DNA, làm phản ứng PCR với bước hệ BC1F1 Sau sàng lọc với 10 thị NST số chọn 17 cá thể tái tổ hợp Kết quả: -Cá thể có gen nhận gen cao 93,75 % cá thể số P442 -11 P442 -14 -Các cá thể P442-12, P422-3, P39-17, P39-25 có gen nhận gen 92,25% -P442-12, P422-3, P39-17, P39-25 chọn để lai tạo quần thể BC3F1 Tương tự với quần thể BC2F1 cho hệ BC3F1 với 445 cá thể Sử dụng hai thị ART5 SC3 hai thị liên kết chặt với gen Sub1 để lựa chọn cá thể mang gen Sub1 hệ BC3F1 - Xác định 124 cá thể dị hợp tử với hai thị mang gen Sub1 - Tiếp tục sàng lọc với thị NST số để tìm cá thể tái tổ hợp Sau sàng lọc từ 10 thị cho đa hình NST số với 124 cá thể Kết chọn 22 cá thể tái tổ hợp Những cá thể tiếp tục chọn lọc di truyền giống nhận gen Sử dụng 19 thị 11 nhiễm sắc thể lại - Số liệu cá thể đƣợc đƣa vào phân tích chƣơng trình Graphical Genotyper để lựa chọn cá thể BC3F1 Các cá thể mang gen đồng hợp tử mẹ nhiều đƣợc lựa chọn để lai cho lai tạo hệ BC4F1 IV Kết Đề nghị 1) Kết - Khảo sát đa hình hai giống bố mẹ AS996 x IR64Sub1 thu 53 thị đa hình tổng số 372 thị Xác định 11 cá thể mang gen Sub1 từ 22 cá thể F1 - Kết sàng lọc cá thể BC1F1 chọn lọc cá thể tái tổ hợp mang gen Sub1 chứa tối đa gen giống nhận gen từ 62,5%- 87,50% Cá thể có gen giống nhận gen cao 87,50% - Dòng BC2F1 chọn lọc cá thể tái tổ hợp mang gen Sub1 chứa gen giống nhận gen cao đạt 93,75 % - Dòng BC3F1 có di truyền nhận gen cao 100% alen từ AS996 tổng số thị phân tích 2) Đề nghị Các dòng BC4F1 BC3F2 tiếp tục nghiên cứu thị phân tử, đánh giá ngập nhân tạo, kết hợp với chọn giống truyền thống để tạo dòng AS996- Sub1 trồng vùng ngập nước, lũ lụt góp phần vào cơng tác chọn tạo giống lúa ứng phó với biến đổi khí hậu DEVELOPMENT OF SCAR MARKER FOR PHYTOPHTHORA RESISTANCE IN BLACK PEPPER (PIPER NIGRUM L.) • • • • • GIỚI THIỆU CHỈ THỊ SCAR Kỹ thuật SCAR kỹ thuật thị dựa vào PCR tạo phân đoạn DNA locus xác định sử dụng mồi nucleotide đặc thù SCAR tiến hành cách tách dòng sản phẩm PCR với mồi ngẫu nhiên sau đọc trình tự hai đầu đoạn tách dòng Dựa vào trình tự hai đầu để thiết kế cặp mồi với độ dài 15 đến 30 bp để nhân băng đơn với kích thước tương tự phân đoạn nhân dòng Sự đa hình xác định có mặt hay vắng mặt băng nhân xuất đa hình chiều dài đồng thời chuyển thị trội thành thị SCAR đồng trội Ưu điểm Sử dụng thị xác định mồi ngẫu nhiên (như RAPD, AFLP v.v.) khắc phục nhược điểm mẫn cảm với điều kiện phản ứng phản ứng với mồi ngẫu nhiên • • • • • • Kỹ thuật SCAR dùng để phân tích thư viện genome Xác định locus đặc thù Chọn giống nhờ thị phân tử Nhược điểm Có tính ngẫu nhiên nên sản phẩm PCR thường không thống Có tính trội khó phân biệt gen lặn hay cá thể dị hợp tử II VẬT LIỆU & PHƯƠNG PHÁP Dòng nhạy cảm với P.capsici Dòng mang gen kháng P.capsici IISR-Subhakara (KS-27) thị RAPD IISR-Shakthi HP-780 HP-23 HP-1 C-1090 C-1095 Chỉ thị SCAR sử dụng 500 trồng từ 26 kiểu gen PHƯƠNG PHÁP • Sàng lọc mang gen kháng Phytophthora=>Ly trích DNA=>Chỉ thị RAPD=>Phát triển thị SCAR Sàng lọc mang gen kháng Phytophthora Sàng lọc phôi hồ tiêu kháng Phytophthora • Cây ni khay nhựa tỷ lệ nảy mầm hạt giống ghi lại cho dòng Chiều dài tổn thương 72h dao động từ 1-120mm Mức độ thâm nhập tính dựa vào thang số từ 0-4 0= không tổn thương, 1= tổn thương giới hạn bề mặt, 2= tỉ lệ thâm nhập lên đến 25%, 3= tỉ lệ thâm nhập lên đến 50%, 4= tỉ lệ thâm nhập 50% Chu trình nhiệt Giai đoạn Nhiệt độ Thời gian Biến tính 94 OC phút Hồi tính 58 OC phút Kéo dài 72 OC phút Hậu kéo dài 72 OC 10 phút Lặp lại 35 chu kì 30s 94oc Nhiệt độ hồi tính tối ưu hóa cho mồi scar III KẾT QUẢ SÀNG LỌC CÂY CON • Khoảng 34% hạt nảy mầm thu từ vườn ươm • Cây nhạy cảm với p.capsici bị chết sau tiêm bào tử động làm ngập đất 30 ngày • Những kháng khỏe mạnh không bị tổn thương Những bị chết có tỉ lệ từ 14% -100% sau hai lần làm ngập đất • Cây có chiều dài tổn thương 5mm số thâm nhập 1, xem kháng với P.capsici CHỈ THỊ RAPD • Vùng đa hình xuất all dòng mang gen kháng khơng xuất dòng nhạy cảm với p capsici Vị trí trình tự đặc hiệu (360 bp) xuất primer opa-01 sau rửa giải tạo dòng gel giải trình tự sang thị scar PHÁT TRIỂN VÀ THỬ NGHIỆM CHỈ THỊ SCAR Nhiệt độ hồi tính cài đặt sẵn 58 độ để tránh mồi bắt cặp khơng đặc hiệu đa hình giả Tiến hành qua lần PCR Trình tự xác định tạo dòng giải trình tự đới với vị trí đặc hiệu Scar primer khuếch đại trình tự DNA kháng vừa với Phyto Vùng khuếch đại 364 bp thu tất mang gen kháng kiểu gen nhạy cảm với phyto khơng khuếch đại mồi scar IV KẾT LUẬN & ĐỀ NGHỊ Kết luận Từ kết thu ta đưa số kết luận sau:  Về kết sàng lọc mang gen kháng phytophthora - Giai đoạn huyền phù bào tử động con: khoảng 34% hạt nảy mầm thu từ vườn ươm - Giai đoạn Tiêm vào gốc cành giâm: thu 11 giống xem kháng phyphthora  Về kết thị RAPD - IISR-Shakthi; HP-780; HP-23 C-1090; C-1095: dòng kháng vừa với phytophthora - Chỉ có primer tổng sơ 15 primer cho sản phẩm khuếch đại hầu hết giống tiêu - Kết bước đầu cho thấy primer có băng đa hình thị giúp nhận diện giống tiêu mang gen kháng phytophthora  Về kết phát triển thử nghiệm thị SCAR - primers MA1 and MA2 05-1103-15, 05-1103-22, 05-1103-14, 05-PR-III-07, 05-992-15, 05-861-04, 05-5271-03, 05-1319-18, 05-1080-01 : dòng kháng vừa - HP-780-16, 05-1319-18, 05- PRIII-7, 05-1080-1: dòng kháng vừa Đề nghị Tiếp tục khảo sát thêm nhiều primer nhiều mẫu để có kết xác Từ đó, tìm thị liên kết với tính trạng tốt giống ANALYSIS OF GENETIC DIVERSITY IN Piper nigrum L USING RAPD MARKERS Kỹ thuật RAPD (Random amplified polymorphic DNA) - Là phương pháp phân tích đa dạng DNA khuyếch đại ngẫu nhiên - Dựa kỹ thuật PCR - Sử dụng primer ngắn (~ 10 nucleotide) biết trước trình tự - Sản phẩm RAPD phân tích cách điện di gel agaose - Về mặt kỹ thuật, RAPD thực theo bước sau: Ưu điểm Về mặt kỹ thuật: - Khơng đòi hỏi biết trước trình tự DNA đối tượng nghiên cứu - Cần lượng DNA ban đầu - Thao tac đơn giản, khơng đòi hỏi kỹ thuật cao Về mặt kinh tế: - Chi phí thấp - Thường sử dụng kết hợp với kỹ thật cao khác để đánh giá đa dạng di truyền - Khơng sử dụng đồng vị phóng xạ => an tồn Khuyết điểm - Độ xác khơng cao khơng ổn định - Không phân biệt thể đồng hợp tử dị hợp tử - Tính lặp lại không cao primer ngẫu nhiên - Phụ thuộc vào điều kiện phản ứng PCR Ứng dụng - - Đánh giá đa dạng di truyền: áp dụng đối tượng (cà phê, bắp,…) - - Nhận diện thị phân tử - - Áp dụng xây dụng đồ gene Giống hồ tiêu sử dụng nghiên cứu Trong đó, 13 giống có nguồn gốc địa phương, giống P nigrum cải tiến loài hoang dại (P longum P colubrinum) - - 24 primer chọn lọc tạo 372 marker RAPD với nhiều kích thước 22 accession P.nigum, accession P colubrinum P longum Năm marker diện tất accession, dựa vào đa hình Kỹ thuật RAPD dùng để tìm mối quan hệ loài Piper cần áp dụng việc quản lý nguồn gen việc chọn lọc hỗ trợ cho sinh học phân tử CHỦ ĐỀ: MỤC ĐÍCH CHỌN GIỐNG NHỜ DẤU CHUẨN PHÂN TỬ ỨNG DỤNG CỦA MAS (MARKER ASSISTED SELECTION) ĐỐI VỚI TÍNH CHỐNG CHỊU LẠNH I NỘI DUNG A Mục đích dấu chuẩn phân tử chọn giống B Ứng dụng MAS tính chống chịu lạnh A MỤC ĐÍCH CỦA DẤU CHUẨN PHÂN TỬ TRONG CHỌN GIỐNG Tổng quát dấu chuẩn phân tử (Molecular marker) Các dấu hiệu, đặc trưng có tính phân biệt cá thể Phân biệt khơng dựa hình thái bên ngồi mà dựa khác biệt trình tự gene sinh vật Các đoạn DNA ngắn biết vị trí nhiễm sắc thể, đoạn DNA liên kết chặt với tính trạng khảo sát (Liên kết chặt có nghĩa q trình sinh sản, thị phân tử ln di truyền kèm với tính trạng khảo sát cho hệ con.) Mục đích dấu chuẩn phân tử • Nâng cao hiệu công tác chọn giống, làm giảm bớt thời gian chi phí cần thiết để tạo giống trồng với tính trạng mong muốn • Phát kiểu gene locus phân tử phát giai đoạn mức độ nào: tế bào, mơ hay tồn thể • Đa dạng nhiều số lượng thị phân tử, số lượng thị hình thái hạn chế • Hạn chế hiệu ứng lấn át làm sai lệch việc đánh giá cá thể phân ly quần thể phân ly làm tăng độ xác MAS (Marker Assisted Selection) Chọn lọc dựa thị phân tử (Marker Assisted Selection – MAS) sử dụng thị DNA liên kết chặt với locus mục tiêu để thay cho chọn lọc đánh giá kiểu hình Ưu nhược điểm sử dụng thị phân tử chọn giống 4.1 Ưu điểm  Đơn giản so với chọn lọc dựa kiểu hình Đặc biệt tính trạng mà phải cần nhiều lao động q trình chọn lọc Có thể tiết kiệm thời gian tiết kiệm diện tích đồng ruộng thí nghiệm  Có thể chọn lọc giai đoạn non Rất quan trọng cho tính trạng chất lượng hạt Có thể chọn lọc trước cấy lúa  Tăng độ tin cậy Khơng bị ảnh hưởng mơi trường Có thể phân biệt dạng đồng hợp tử dị hợp tử chọn lọc cá thể đơn lẻ 4.2 Nhược điểm MAS có chi phí cao so với phương pháp truyền thống Dễ bị tạp nhiễm marker gen mục tiêu dẫn đến dương tính giả B ỨNG DỤNG CỦA MAS ĐỐI VỚI TÍNH CHỐNG CHỊU LẠNH I Giới thiệu Khả chống chịu nhiệt độ thấp thực vật giai đoạn sinh sản mục tiêu quan trọng chọn giống để cải thiện giống lúa vùng ôn đới cao nguyên vùng nhiệt đới cận nhiệt đới Silewah giống gạo từ Indonesia, chịu lạnh Mục đích nghiên cứu: Phân tích vị trí nhiễm sắc thể gen chịu lạnh thuộc giống Silewah xác định trình tự nhiễm sắc thể chuyển từ Silewah vào Norin PL8 Vật liệu: Giống lúa: Silewah, Hokkai 241 Norin-PL8 Norin –PL8 dòng B3F6 chịu lạnh cực tốt tạo từ lai Hokkai 241 Silewah quy trình tương tự lai hồi giao → Phân tích kiểu gen 92 dòng B1F5 từ lai giống Kirara 397/ Norin-PL8 /Kirara 397 → Phân tích QTLs Phương pháp 2.2 Đánh giá khả chịu lạnh • Khả chịu lạnh 92 dòng B1F5 thử nghiệm theo phương pháp tưới nước lạnh (19oC) • Sau hạt chín, khả chịu lạnh dòng B1F5 đánh giá dựa khả phát triển 15 hạt từ ba giống lúa 2.3 Phân tích QTL • Đối với marker RFLP, 92 dòng B1F5 chia thành ba kiểu gen (các dòng Kirara397, dòng hetero-type dòng Norin-PL8) dựa mẫu RFLP Giá trị trung bình khả nảy mầm hạt giống kiểu gen so sánh t-test III Kết luận Phân tích RFLP Đánh giá khả chịu lạnh ... thay với mồi liên kết với thị STS Bước 5: Chọn dòng lúa mang gene kháng bệnh đạo ơn thị phân tử Chọn dòng lúa mang hai gene kháng bệnh đạo ôn dựa vào thị RM3431 liên kết với gen Piz RM144 liên kết. .. nhận xét kết luận ỨNG DỤNG RFLP TRONG NGHIÊN CỨU SỰ LIÊN KẾT VỚI GEN KHÁNG BỆNH BẠC LÁ LÚA Kỹ thuật RFLP Đa hình chiều dài đoạn cắt giới hạn (RFLP): Là kỹ thuật tìm trình tự DNA khác biệt Trong. .. ôn ỨNG DỤNG SSR TRONG LIÊN KẾT GEN KHÁNG ĐẠO ÔN Ở LÚA III Ứng dụng SSR nghiên cứu gen kháng bệnh đạo ôn  Khái niệm: SSR( simple sequence repeats): chuỗi lặp lại đơn giản, thực phản ứng PCR với