Phân tích cấu trúc một số hợp chất trong cây Trứng Quốc ( Stixis Suaveolens Roxb, PierreCapparaceae)Phân tích cấu trúc một số hợp chất trong cây Trứng Quốc ( Stixis Suaveolens Roxb, PierreCapparaceae)Phân tích cấu trúc một số hợp chất trong cây Trứng Quốc ( Stixis Suaveolens Roxb, PierreCapparaceae)Phân tích cấu trúc một số hợp chất trong cây Trứng Quốc ( Stixis Suaveolens Roxb, PierreCapparaceae)Phân tích cấu trúc một số hợp chất trong cây Trứng Quốc ( Stixis Suaveolens Roxb, PierreCapparaceae)Phân tích cấu trúc một số hợp chất trong cây Trứng Quốc ( Stixis Suaveolens Roxb, PierreCapparaceae)Phân tích cấu trúc một số hợp chất trong cây Trứng Quốc ( Stixis Suaveolens Roxb, PierreCapparaceae)Phân tích cấu trúc một số hợp chất trong cây Trứng Quốc ( Stixis Suaveolens Roxb, PierreCapparaceae)Phân tích cấu trúc một số hợp chất trong cây Trứng Quốc ( Stixis Suaveolens Roxb, PierreCapparaceae)Phân tích cấu trúc một số hợp chất trong cây Trứng Quốc ( Stixis Suaveolens Roxb, PierreCapparaceae)Phân tích cấu trúc một số hợp chất trong cây Trứng Quốc ( Stixis Suaveolens Roxb, PierreCapparaceae)Phân tích cấu trúc một số hợp chất trong cây Trứng Quốc ( Stixis Suaveolens Roxb, PierreCapparaceae)
TỔNG QUAN
Tổng quan về cây Trứng quốc
Ngành: Ngành Ngọc Lan (Magnoliophyta)
Lớp: Lớp Ngọc Lan (Magnoliopsida)
Bộ: Bộ Màn Màn (Capparales)
Họ: Họ Màn Màn (Capparaceae)
Tên khác: Tiết xích, Mang nam ho, Dây con gỗ (Thổ), Ban quả đằng, Tôn nấm.
1.1.2 Vài nét về thực vật họ Màn Màn (Capparaceae)
Trên thế giới, họ Màn màn (Capparaceae Juss.) có khoảng 45 chi, 900 loài phân bố chủ yếu ở vùng nhiệt đới và cận nhiệt đới, một phần ở ôn đới, chủ yếu là vùng khô, nhất là Châu Phi Ở Việt Nam, họ Màn Màn có 7 chi với khoảng gần 60 loài Đây là một họ có số lượng loài tuy không lớn nhưng về mặt phân loại khá phức tạp và có ý nghĩa kinh tế về nhiều mặt như: phần lớn các loài trong họ được sử dụng làm thuốc, làm thức ăn (rau ăn, lấy quả) cho người và động vật, lấy gỗ, làm cảnh vì có hoa đẹp Bên cạnh đó, họ Màn màn còn có giá trị khoa học như được sử dụng nhiều trong nghiên cứu di truyền học, tế bào học…
Bảng 1.1: Danh mục các loài có giá trị trong họ Màn màn ở Việt Nam
T Tên khoa học Tên Việt Nam LT TP LG LC CD
1 Capparis flavicans Kurz Cáp vàng X X X
3 Capparis khuamak Gagnep Bạch hoa X
4 Capparis micracantha DC Cáp gai nhỏ X X
5 Capparis pyrifolia Lamk Cáp lá xá lị X X
6 Capparis sepiaria L Cáp hàng rào X
7 Capparis siamensis Kurz Cáp xiêm X
8 Capparis sikkimensis Kurz Bạch hoa X X
9 Capparis thorelii var. pranensis Gagnep Dây độc mộc ô X
11 Capparis versicolor Griff Hồng trâu X
12 Capparis zeylanica L Cáp gai đen X X
13 Cleome chelidonii L.f Màn màn hoa tím X
14 Cleome gynandra L Màn màn trắng X X X
15 Cleome speciosa Raf Màn màn đẹp X
16 Cleome spinosa Jacq Màn màn gai X
17 Cleome viscosa L Màn màn vàng X X X
18 Crateva magna (Lour.) DC Bún to X X X
19 Crateva religiosa Forst f Bún nước X X X X X
20 Crateva roxburghii R Br Mấm núi X X X
22 Niebuhria siamensis Kurz Chan chan X
23 Stixis fasciculata Gagnep Dây tấm cám X X
24 Stixis scandens Lour Mắc nam ngoa X
25 Stixis suaveolens Pierre Trứng cuốc X X X
Ghi chú: LT: làm thuốc; TP: thực phẩm (làm rau ăn, lấy quả); LG: lấy gỗ;
LC: làmcảnh; CDK: công dụng khác
1.1.3 Khái quát về Chi Trứng quốc – Stixis L Đặc điểm hình thái
Chi Trứng quốc là một chi nhỏ thuộc họ Màn màn Các loài trong chi này chủ yếu là cây bụi trườn hay leo, cành thường có lỗ vỏ Lá đơn mọc cách, không có lá kèm, nhẵn hay có lông, gân chính ở mặt trên thường nổi mụn nhỏ; cuống lá thường dày ở đỉnh Cụm hoa chùm ở nách lá hoặc chùm tập hợp thành chuỳ ở nách lá và ở đỉnh Đài gồm (5) 6 lá đài, xếp thành 2 vòng, hợp một phần ở gốc, có lông Không có cánh tràng Cuống nhị nhụy ngắn Nhị 15-50, các nhị ở ngoài thường ngắn hơn các nhị ở phía trong Cuống bầu thường dài bằng chỉ nhị Bầu nhẵn hay có lông; 3-4 ô, mỗi ô mang 4-10 noãn; vòi nhụy 1-4 Quả hạch, hình bầu dục, vỏ quả thường có nhiều vết đốm, đỉnh quả thường có vòi nhụy tồn tại. Hạt 1- 3, hình bầu dục.
Trên thế giới, chi này hiện biết 7 loài phân bố ở Châu Á gồm Ấn Độ, Bhutan, Malaysia, Myanmar, Thái Lan, Trung quốc Ở Việt Nam, chi này hiện biết 3 loài và 1 phân loài, phân bố rải rác khắp cả nước, đặc biệt là ở vùng núi Tây Bắc.
Bảng 1.2: Phân loại các loài trong chi Trứng quốc.
Loài Phân bố Sinh học và sinh thái
Lai Châu, Sơn La, Hà Giang, Tuyên Quang, Bắc Cạn Còn có ở Ấn Độ,Bangladesh,Bhutan, Campuchia, Lào,
Mùa hoa từ tháng 4-5, mùa quả từ tháng 8-10 Mọc dại ở các trảng cây bụi, ven rừng, trong rừng thứ
Rễ trị ho, ho ra máu Lá dùng chữa đau mắt hoặc nấu nước uống thay chè.
Myaanmar, Nepals, sinh, dọc sông Hoa thơm Thái Lan, Trung Quốc suối, ở độ cao thường được đến1500m bán ở chợ Quả có thể ăn được.
Stixis hookeri Các tỉnh miền Nam, còn Mùa hoa tháng 1.
Pierre – có ở Lào, Campuchia, Mọc rải rác trong
Trứng cuốc Ấn Độ rừng thưa, đồi, bãi Ấn Độ hoang.
Stixis Lai Châu, Sơn La, Hà Mùa hoa chủ yếu Dịch lá dùng trị fasciculata Giang, Tuyên từ tháng 4-5, mùa đau mắt Quả có Gagnep – Quang,Cao Bằng, Bắc quả chủ yếu từ thể ăn được Dây tấm cám Cạn, Quảng Ninh, Phú tháng 8-11 Mọc
Thọ, Vĩnh Phúc, Gia rải rác trong rừng Lai, Khánh Hòa, Bình thưa, nơi sáng, ven
Phước, đường vùng đồi núi, ở độ cao đến 1000m.
Stixis Tuyên Quang, Quảng Mùa hoa từ tháng Rễ, thân, lá được scandens Ninh, Hải Dương, 12-6 (năm sau), dùng chữa đau
Lour – Mắc Quảng Trị, mùa quả từ tháng nhức gân, nam ngoa Kon Tum, Bình Thuận 8-10 Mọchoang xương, thấp
Còn có ở ẤnĐộ, trong rừng thưa, khớp Lá Myanmar, Lào ven rừng, trảng cây dùngchữa bệnh bụi vùng đồi núi về mắt
1.1.4 Giới thiệu về cây Trứng quốc - Stixis suaveolens (Roxb.) Pierre
Tên khoa học: Stixis suaveolens (Roxb.) Pierre
Tên thường gọi: Trứng quốc, Tôn nấm, Tiết xích, Mang nam ho, Dây con gỗ, Ban quả đằng.
Tên gọi khác: Roydisa suaveolens Roxb, Stixis suaveolens var. cochinchinensis Pierre, S flavescens Pierre.
Hình 1.1: Hình ảnh cây Trứng quốc. Đặc điểm thực vật
Cây bụi trườn hoặc leo Cuống lá dài 1,5-3cm; phiến lá hình bầu dục, hình thuôn, đôi khi hình trứng ngược, cỡ (10)15-28 (3,5)4-10cm, nhẵn; gốc lá nhọn hay tròn, chóp lá nhọn có mũi dài 0,5-1,5cm; gân bên 7-12 cặp Cụm hoa chùm ở nách lá, hiếm khi tập hợp thành cụm hoa chùy, dài 15-25cm, có lông Lá bắc hình thuôn hoặc hình tam giác, dài 3-6mm, có lông Đài hình bầu dục, hình trứng ngược, cỡ 4-6 (9) 2-3mm, hợp một phần ở gốc, có lông Cuống nhị nhụy dài 2mm, nhẵn Nhị (27-)40-50 (-80); chỉ nhị dài 4-6 (11)mm, có lông Cuống bầu dài 7 - 10mm, có lông Bầu hình bầu dục, hình trứng, nhẵn; 3-4 ô, cỡ 1,7-2,5
1,5mm; vòi nhụy 3-4, dài 0,7-1mm Quả hình bầu dục, chín có màu vàng, cỡ 3-5
2,5-4cm Hạt hình bầu dục, dài 1,8 - 2cm.
Cây Trứng quốc thường mọc dại ở các trảng cây bụi, ven rừng, trong rừng thứ sinh, dọc sông suối, ở độ cao đến 1500m Mùa hoa từ tháng 4 - 5, mùa quả từ tháng 8 -10.
Hình 1.2: Ảnh quả và hoa cây Trứng quốc
Cây Trứng quốc được phân bố rải rác ở các tỉnh trên cả nước: Lai Châu (Phong Thổ), Sơn La (Mộc Châu), Hà Giang (Bắc Quang, Vị Xuyên), Tuyên Quang (Chiêm Hóa), Bắc Kạn (Ba Bể, Na Rì), Vĩnh Phúc (Mê Linh), Bắc Ninh,
Hà Nội(Ba Vì), Hòa Bình (Lương Sơn), Ninh Bình (Cúc Phương), Đà Nẵng (Đà Nẵng, Bà Nà), Quảng Nam (Nam Giang), Quảng Ngãi (Ba Tơ), Kon Tum (Đắk
Tô, Sa Thầy), Gia Lai (K’Bang), An Giang (TX Châu Đốc) Ngoài ra, cây Trứng Quốc còn được tìm thấy ở Ấn Độ, Bangladesh, Bhutan, Campuchia, Lào, Myaanmar,Nepals, Thái Lan, Trung quốc.
Hiện nay, trên thế giới cũng như trong nước chưa có một báo cáo nghiên cứu nào về thành phần hóa học cũng như hoạt tính sinh học của cây Trứng quốc.Tuy nhiên, nó lại được sử dụng rất rộng rãi trong y học dân gian Việt Nam Rễ của cây Trứng quốc trị ho, ho ra máu Lá dùng chữa đau mắt hoặc nấu nước uống thay chè.
Ngoài ra, cây này còn có tác dụng hạ men gan, lợi mật với bài thuốc: 5 gTrứng quốc, 5 g dứa dại sắc với 1 lít nước, ngày uống 2 lần.
Tổng quan các phương pháp phân tích để phân lập và xác định cấu trúc các hợp chất
Phương pháp chiết xuất là bao gồm cả việc chọn dung môi, dụng cụ và cách chiết Một phương pháp chiết xuất thích hợp chỉ có thể được hoạch định khi biết rõ thành phần của các chất cần biết trong cây ra Mỗi loại hợp chất có độ hòa tan khác nhau trong từng loại dung môi Vì vậy không thể có một phương pháp chiết xuất chung cho tất cả các dược liệu.
Phương pháp chiết có hai phương pháp chiết:
Phương pháp 1: Phương pháp chiết xuất nhằm mục đích nghiên cứu sơ bộ khi chưa biết rõ thành phần hóa học của dược liệu, dùng phương pháp cổ điển là sử dụng một dãy dung môi từ không phân cực đến phân cực mạnh để phân đoạn các hợp chất ra khỏi dược liệu Ví dụ: sử dụng dãy dung môi: ether dầu, ether, chloroform, cồn và cuối cùng là nước.
Phương pháp 2: Phương pháp chiết xuất khi cần chiết lấy toàn bộ thành phần trong dược liệu thì dung môi thích hợp nhất methanol hoặc ethanol (80%). Nhất là methanol được xem như là dung môi vạn năng, nó hòa tan được chất không phân cực đồng thời cũng có khả năng tạo dây nối hydro với các nhóm phân cực khác Dịch chiết với methanol thu được, đem loại hết dung môi thu được cao toàn phần chứa hầu hết hợp chất của dược liệu Khi cần tách phân đoạn các hợp chất trong cao thì sử dụng dung môi không hòa lẫn với nước và có độ phân cực từ yếu đến mạnh Ví dụ dãy dung môi: Ether dầu, ether, chloroform, ethyl axetate, n-buthanol.
Cách chiết có hai cách chiết: chiết ở nhiệt độ thường và chiết nóng.
Chiết ở nhiệt độ thường: Cách chiết thông thường là ngấm kiệt và ngâm phân đoạn.
Chiết nóng: Nếu dung môi là các chất bay hơi thì áp dụng cách chiết liên tục hoặc chiết hồi lưu, nếu dung môi là nước thì sắc đặc hoặc là hãm phân đoạn. Để thu hồi dung môi, sử dụng máy cô quay chân không dưới áp suất giảm cho hiệu suất cao.
1.2.2 Các phương pháp sắc ký
Phương pháp sắc ký lớp mỏng (TLC)
Sắc ký lớp mỏng là công cụ đắc lực trong nghiên cứu dược liệu vì đơn giản, ít tốn thiết bị và dung môi mà lại đạt hiệu quả cao.
Sắc ký lớp mỏng là kỹ thuật tách các chất được tiến hành khi cho pha động di chuyển qua pha tĩnh đã đặt sẵn hỗn hợp chất cần phân tích Pha tĩnh là chất hấp phụ được lựa chọn tùy theo yêu cầu phân tích, được trải mỏng đồng nhất và được cố định trên các phiến kính hoặc kim loại Pha động là một hệ dung môi đơn hoặc đa thành phần được trộn với nhau theo tỷ lệ nhất định tùy theo mục đích cụ thể Trong quá trình di chuyển qua lớp hấp phụ, các cấu tử trong hỗn hợp mẫu thử được di chuyển trên lớp mỏng theo hướng pha động, với những tốc độ khác nhau Kết quả, ta thu được một sắc ký đồ trên lớp mỏng. Đại lượng đặc trưng cho mức độ di chuyển của chất phân tích là hệ số di chuyển Rf được tính bằng tỷ lệ giữa khoảng dịch chuyển của chất thử và khoảng dịch chuyển của dung môi (Hình 2.2) Có nhiều yếu tố ảnh hưởng đến giá trị Rf.
Hình 1.3: Cách tính giá trị R f
Các bước trong kỹ thuật sắc ký lớp mỏng (Hình 2.2):
Chuẩn bị bản mỏng: Bản mỏng trước khi dùng phải hoạt hóa trong tủ sấy và sấy ở 105-110°C trong một giờ Để nguội và bảo quản trong bình hút ẩm. Dùng bút chì mềm kẻ bản mỏng Vạch đường chấm chất phân tích (cách mép dưới của bản mỏng 1,2 cm), đường giới hạn di chuyển của dung môi (cách mép trên của bản mỏng 0,8 cm) và đánh dấu vị trí chấm chất (các vết chấm cách nhau 0,5 cm và cách hai bờ bên của bản mỏng ít nhất 1 cm).
Chấm chất phân tích lên bản mỏng: Dùng ống mao quản hoặc micropipet chấm chất lên các vị trí đã đánh dấu Các vết chấm phải nhỏ, lượng chất phải đồng đều, không quá lớn dễ kéo vết hoặc chồng vết, cũng không quá nhỏ khó hiện vết bằng thuốc thử.
Triển khai sắc ký: Bình triển khai thường là bình thủy tinh, có nắp đậy kín và đáy phải bằng Lót giấy lọc xung quanh thành trong của bình Pha hệ dung môi với tỷ lệ thích hợp và vừa đủ, rót vào bình triển khai Lắc rồi để giấy lọc thấm đều dung môi Đặt bản mỏng gần như thẳng đứng với bình triển khai, các vết chấm phải ở trên bề mặt của lớp dung môi triển khai Đậy kín bình và để yên ở nhiệt độ không đổi Khi dung môi chạy đến đường giới hạn, lấy bản mỏng ra khỏi bình và sấy khô bản mỏng rồi hiện vết.
Hiện vết trên bản mỏng: Có thể hiện vết bằng cách soi UV (bước sóng
254 và 365 nm) hoặc phun thuốc thử (thuốc thử dùng trong đồ án là Ce(SO4)2).
Hình 1.4: Các bước tiến hành sắc ký bản mỏng.
Hiện nay, chủ yếu sử dụng bản mỏng tráng sẵn silica gel Merck 60 F254,kích thước 20×20 cm, dày 0,2 mm.
Phương pháp sắc ký cột (CC)
Sắc ký cột là một dạng của sắc ký bản mỏng Trong sắc ký cột, chất hấp phụ pha tĩnh được nhồi trong các ống hình trụ gọi là “cột” Nhờ vậy mà có thể triển khai nhiều hệ dung môi khác nhau từ phân cực yếu đến mạnh.
Giống như sắc ký lớp mỏng, phương pháp này cũng dựa vào độ phân cực của các chất, những chất có ái lực lớn hơn đối với chất hấp phụ sẽ ra khỏi cột chậm hơn và những chất có ái lực yếu hơn sẽ ra khỏi cột nhanh hơn trong quá trình sắc ký Sự tách trong cột xảy ra chủ yếu theo cơ chế hấp phụ hoặc phân bố tùy theo tính chất của chất được sử dụng làm cột.
Kỹ thuật sắc ký cột (Hình 2.3):
Chuẩn bị chất hấp phụ và cột: Silicagel phải được hoạt hóa ở 120°C trong 4 giờ trước khi đưa lên cột Cột sắc ký phải là một khối đồng nhất, phải thật khô và lắp thẳng đứng trên một giá cố định vững chắc.
Nhồi cột: Chất hấp phụ phải được phân tán đồng đều trong cột Có 2 cách nhồi cột: nhồi khô và nhồi ướt với dung môi Sau khi đưa chất hấp phụ lên cột, rót dung môi vào cột và để chạy liên tục một thời gian để ổn định cột và không được để khô dung môi trong cột.
Đưa chất cần phân tách lên cột: Phải đưa chất lên cột sao cho chất phân tán thành một lớp mỏng đồng đều trên mặt cột bằng phẳng Có nhiều cách đưa chất lên cột: phương pháp dùng đĩa giấy, cho thẳng dung dịch chất cần phân tách lên cột, trộn chất cần phân tách với một lượng chất hấp phụ…
Rửa cột: Tùy theo chất hấp phụ dùng và yêu cầu tốc độ chảy của cột mà áp dụng cách rửa cột bằng áp suất thường hoặc áp xuất nén Hứng dịch chảy ra ở đáy cột theo phân đoạn, theo thời gian hoặc bằng ống nghiệm cùng thể tích.
Hình 1.5: Các bước tiến hành sắc ký cột (CC)
1.2.3 Các phương pháp phân tích xác định cấu trúc các chất phân lập được
Vật liệu nghiên cứu
2.1.1 Đối tượng nghiên cứu Đối tượng nghiên cứu là thân và lá của cây Trứng quốc (Stixis suaveolens (Roxb.) Pierre) được sử dụng phổ biến trong y học cổ truyền Việt Nam Mẫu được thu hái vào tháng 3 năm 2017 tại Phú Lương, Thái Nguyên và được giám định bởi PGS.TS Trần Văn Ơn, Trường Đại học Dược Hà Nội,và lưu tiêu bản tại Trung tâm nghiên cứu xuất sắc liên ngành nghiên cứu về lĩnh vực các HCTN giữa Việt Anh – Anh Quốc – Viện Hóa học - Viện Hàn Lâm Khoa học & Công nghệ Việt Nam.
Hình 2.1 Hình ảnh tiêu bản của cây Trứng quốc
-Các dung môi: n-hexane,dichloromethane, ethylacetate, acetone, methanol.
- Sắc ký lớp mỏng (TCL) được tiến hành trên bản mỏng tráng sẵn Silica gel60 Merck F254 cỡ hạt 0,063-0,2 mm,… Quan sát bản mỏng dưới ánh sáng tử ngoạiở 2 bước sóng λ= 254 nm và 365 nm.
-Sắc ký cột (CC) sử dụng Silica gel Merck cỡ hạt 40-60 àm.
-Sắc ký cột (CC) với pha tĩnh là Sephadex LH-20.
2.1.3 Các thiết bị, dụng cụ thí nghiệm:
- Bình tam giác (100 ml, 250 ml, 500 ml, 1000 ml, 2000 ml ).
- Bình cầu (100 ml, 250 ml, 500 ml, 1000 ml ).
-Bình đựng dung môi (500 ml, 1 lít, 2 lít, 5 lít, 10 lít).
-Bình ngâm chiết nguyên liệu (50 lít).
-Bình thủy tinh (25 ml, 50 ml, 100 ml ).
- Ống đong ( 5 ml, 10 ml, 50 ml, 250 ml,…).
-Các loại phễu chiết, pipet, ống hút chia độ.
-Máy cô quay chân không Buchi Rotavapor R – 210
-Bản sắc ký lớp mỏng silicagel Merck 60 F254 dày 0,2 mm
-Bình triển khai bản mỏng
-Máy đo phổ cộng hưởng từ hạt nhân: Bruker Avance AM500FT-NMR
-Máy đo phổ khối: ESI-MS: AGILENT 1100LC-MSD
-Máy đo phổ hồng ngoại: 670-FTIR NICOLET-NEXUS
1 Thu thập mẫu lớn cây Trứng quốc (Stixis Suaveolens (Roxb) Pierre) để tiến hành nghiên cứu.
2 Phân tích cấu trúc các hợp chất hữu cơ bằng các phương pháp hóa lí hiện đại như: phổ cộng hưởng từ hạt nhân (NMR) , phổ hồng ngoại IR; phổ khối lượng MS
2.3.1 Phương pháp xử lý và ngâm chiết mẫu thực vật
Cân 3,0 kg cây trứng quốc được xay nhỏ Ngâm ngập trong metanol 60 0 trong 72 giờ ở nhiệt độ phòng sau đó tiến hành lọc thu lấy dịch chiết (tiến hành
03 lần ) đem quay cất thu được cặn MeOH tổng Cặn MeOH tổng được phân bố lại trong hỗn hợp nước, sau đó chiết với dung môi n-hexan/3 lần, thu phần dịch n-hexan để cất loại dung môi thu được cặn n-hexan TQH (15g) và dịch nước còn lại Tiếp theo, dịch nước còn lại được chiết với diclometan 3 lần, thu lấy phần dịch diclometan, cất loại dung môi thu được cặn diclometan TQD (9 g) Tiếp theo, dịch nước còn lại được chiết với ethyl acetat 3 lần, thu lấy phần dịch etylacetat, cất loại dung môi thu được cặn etyl acetat TQE (11 g) Từ dịch nước còn lại quay cất thu được (50g)
Bảng 2.1 Hiệu suất chiết các phần chiết STT Phần chiết Khối lượng (g) Hiệu suất (%)
Dịch chiết n-hexan TQ Dịch chiết TQ
Cặn chiết etyl acetat (TQE 11g)
Dịch chiết diclomethan TQ Dịch chiết TQ
Quá trình ngâm chiết cây Trứng quốc được trình bày trong Sơ đồ 1
Cô quay loại dung môi
Dịch nước còn lại Dịch chiết etyl acetat
Cô quay loại dung môi
Sơ đồ 2.1 Quy trình chiết mẫu cây Trứng Quốc.
2.3.2 Phương pháp phân lập các hợp chất tự nhiên
Từ11g cặn chiết ethyl axetate, lấy ra khoảng vài mg cho vào ống nghiệm, đem hòa tan bằng dichloromethane Tiến hành chấm khảo sát bằng sắc kí lớp mỏng với các hệ dung môi Cuối cùng, ta lựa chọn hệ dung môi dicholromethane
– methanol cho quá trình rửa giải.
Cặn chiết ethyl axetate được hòa tan trong dung môi dichloromethane rồi bổ sung 45g silicagel Tiếp đó, đem cô quay thu được cặn bột để chạy cột.
Các thông số chạy cột:
Lượng silica gel dùng tẩm: 29g silicagel.
Lượng silica gel dùng chạy cột: 300g (kích thước hạt silicalgel 0.04- 0.63 mm)
Đường kính cột: 70 mm, chiều cao cột: 300 mm.
Thể tích mỗi lần hứng: 100ml
Quá trình chạy cột được thực hiện với hệ dung môi dichloromethane – methanol với gradient nồng độ thay thay đổi từ 100 – 0 đến 0 – 100.
Theo dõi quá trình rửa giải bằng sắc ký lớp mỏng phân tích (TLC) với các hệdung môi thích hợp Các ống nghiệm hiện vết giống nhau trên sắc ký lớp mỏng được gom lại thành phân đoạn lớn, cô quay loại dung môi thu được 20 phân đoạn chính.
Thể tích (ml) Dichloromethane - Methanol
2.3.3 Phân lập phân đoạn TCE.3 (ống 6 9)
Từ phân đoạn 3 khảo sát sắc ký lớp mỏng và tiến hành chạy cột tinh với hệ dung môi n – hexane và ethyl axetate.
Các thông số chạy cột:
Lượng silica gel dùng chạy cột: 30g Kích thước hạt 0.04 – 0.063 mm.
Đường kính cột: 20 mm, chiều cao cột: 600 mm.
Chuẩn bị chất chạy cột: Lấy 156 mg cặn hòa tan hoàn toàn bằng dichloromethane và tẩm với 260 mg silicagel kích thước 0.04 – 0.063 mm Cô quay chân không loại dung môi đến khô.
Chuẩn bị cột: Chọn cột có đường kính 25 mm, dài 600 mm, có van khóa.
Rửa sạch, tráng cột bằng acetone và sấy khô Lót dưới đáy cột một ít bông.
Chuẩn bị silicagel nhồi cột theo phương pháp nhồi ướt: Cân khoảng 30g silicagel cỡ hạt 0.04-0,063 mm Hoạt hóa lượng silicagel trên bằng cách sấy ở 110 – 120°C trong 1 – 2 giờ Ngâm silicagel đã hoạt hóa đến trương nở hoàn toàn trong n - hexane Trong quá trình ngâm, dùng đũa thủy tinh khuấy liên tục để đuổi bọt khí và tăng độ đồng đều.
Nhồi cột: Dựng cột thẳng đứng Rót từ từ hỗn dịch silicagel vào cột, vừa rót vừa gõ nhẹ để đuổi bọt khí và tăng độ đồng đều Mở van khóa cho dung môi chảy và silicagel sẽ lắng tự nhiên xuống đáy cột Khi dung môi chảy gần hết trong cột thì tiếp tục rót hỗn dịch silicagel vào cột Lặp lại đến khi đổ hết hỗn dịch silicagel vào cột Lượng dung môi hứng được lại tiếp tục được đổ lên cột và cho chảy liên tục Chạy ổn định cột một thời gian trước khi đưa chất lên cột Khi dung môi cách bề mặt chất hấp phụ 1 – 2 cm, khóa van, gõ cho phẳng bề mặt cột Rải chất đã được tẩm silicagel thành một lớp đều đặn trên mặt cột.
Chạy cột: Tiến hành rửa giải bằng hệ dung môi n-hexane – ethyl axetate.
Quá trình chạy cột được thể hiện trong bảng sau:
Hệ dung môi n -hexane – ethyl axetate
Thể tích n -hexane – ethyl axetate
Trong quá trình chạy cột tiến hành khảo sát sắc ký lớp mỏng thu được 10 phân đoạn như bảng trên.
Phân đoạn TCE.3.4 có khối lượng 37mg, khảo sát trên sắc kí bản mỏng thấy chỉ có môt cấu tử chính Lượng chất này được đem sắc ký côt tinh với hệ dung môi n-hexane - ethyl axetate = 25 : 1 (H:E = 25:1), thu được 14 mg chất kết
100% CH2Cl2 Phân đoạn TCE.1 n-hexane – ethyl axetate = 25:1, 15:1, 10:1
- Sắc kí cột - Sắc kí cột H:E = 25:1 H:E = 30:1
- Sắc kí cột H:E = 10:1 beta-sitosterol
(6mg) tinh dạng bột vô đinh hình màu trắng, kí hiệu là TCE3a.
Phân đoạn TCE.3.8 chỉ có môt cấu tử chính trên sắc ký bản mỏng, sắc ký cột tinh với hệ dung môi n-hexane – ethyl axetate = 10 : 1 (H:E = 10:1) để rửa chất màu thu được 6 mg chất sạch, kí hiệu TCE15a.
Quy trình phân lập các chất từ cặn etyl axetat được trình bày ở sơ đồ 2:
Sơ đồ 2.2: Quy trình phân lập các chất từ cặn ethyl axetate.
Hằng số vật lý và các dữ kiện phổ của các chất phân lập được
2.4.1 Hợp chất beta-sitosterol (TCE4A)
Chất β-sitosterol: Tinh thể hình kim màu trắng, đnc 135-136 o C.
1 H-NMR (CDCl3): δ (ppm) 0,68 (3H, s, 18-CH3), 0,93 (3H, d, J = 6,5 Hz, 21-CH3), 0,81 (3H, d, J = 6,8 Hz, 26-CH3), 0,84 (3H, d, J = 6,8 Hz, 27-CH3), 0,84 (3H, t, J = 7,4 Hz, 29-CH3), 1,00 (3H, s, 19-CH3), 3,53 (1H, tt, J = 4,8 Hz, 11,0
TCE3a (14mg): chất rắn màu trắng, tan trong CDCl3, CTPT: C20H40O
1 H-NMR (CDCl3, 500 MHz), δ (ppm): 0.84 (9H, d, J = 6.6 Hz); 0.87
TCE15a: chất rắn màu trắng, đnc 286-287 o C, tan trong DMSO.
1 H-NMR (DMSO- d 6 , 500MHz), δ (ppm): 5.3 (1H, bs, H-6); 1.2 (3H, s,
TCE3B: chất rắn màu trắng.
1 H-NMR (DMSO- d 6 , 500MHz), δ (ppm):7,61 (1H, d, J=8Hz), 7,43 (1H, d, J=8Hz), 7,21(1H, t, J=8Hz), 7,07 (1H, t, J=8Hz),7,51ppm (1H, s), 4,42 (2H, d, J= 5,5Hz), 4.03ppm (3H,s),,2,22 ppm (3H,s).
Phổ ESI-MS m/z: 251,0845 [M+H] + Công thức phân tử C12H14N2O2S.
KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
Phân tích cấu trúc hóa học của hợp chất :beta-sitosterol (TCE4A)
Chất TCE4A: dạng tinh thể hình kim, màu trắng, đnc ở 135-136 o C.
Phổ 1 H NMR xuất hiện tín hiệu cộng hưởng của một proton dạng olephine
[δH 5,34 (1H, brd, J= 5,0 Hz, H-6) và của 6 nhóm methyl trong đó có 2 nhóm cộng hưởng dưới dạng singlet [δH 0,68 (3H, s, H-18) và 1,00 (3H, s, H-19)] và 4 nhóm cộng hưởng dạng doublet [δH 0,81 (3H, d, J= 7,0 Hz, H-27); 0,83 (3H, d, J= 7,0
Hz, H-26); 0,85 (3H, d, J= 7,5 Hz, H-29); 0,92 (3H, d, J= 6,5 Hz, H-21)] Tín hiệu cộng hưởng của một nhóm hydroxymethin xuất hiện dưới dạng multiplet [δH 3,52 (1H, m, H-3)] Ngoài ra còn có tín hiệu cộng hưởng của proton của các nhóm metin và methylen khác ở vùng trường cao [δH 1,04-2,31].
Hình 3.1 Phổ 1 H NMR của TCE4A
Trên phổ 13 C NMR của 1 có tín hiệu cộng hưởng của 29 nguyên tử cacbon bao gồm một liên kết đôi [δC 121,73 (C-6); 140,77 (C-5)], 6 nhóm metyl [δC
11,87 nhóm methin, 11 nhóm methylen và 2 cacbon bậc bốn Sự có mặt của một liên kết đôi, 2 nhóm methyl bậc 2 và 2 cacbon bậc bốn trong phân tử 1 cho biết chất này có chứa khung steroit và được nhận định có thể là β-sitosterol.
Hình 3.2 Phổ 13 C NMR của TCE4A
Hình 3.3 Phổ DEPT của TCE4A
Số liệu phổ 13 C NMR của TCE4A được so sánh với các giá trị tương ứng đã được công bố của hợp chất β-sitosterol [3].Sự phù hợp về số liệu phổ NMR giữa hai hợp chất (bảng 2) cho phép khẳng định cấu trúc của TCE4A là β- sitosterol β-sitosterol là chất sterol phổ biến nhất trong các loài thực vật bậc cao.
Bảng 3.1 Số liệu phổ NMR của TCE4A
1 a Đo trong CDCl 3 , b 125MHz, c 500MHz, C # của β-sitosterol [3].
TLTK: Firouz Matloubi Moghaddam, Mahdi Moridi Farimani, Sabah Salahvarzi, and Gholamreza Amin(2007)., Chemical Constituents of Dichloromethane Extract of Cultivated Satureja khuzistanica, Evid Based
Phân tích cấu trúc hóa học của hợp chất: (TCE3A) (Phytol)
Trên phổ 1 H-NMR cho thấy proton của nhóm CH gắn với nối đôi cũng được nhận biết qua tín hiệu δH = 5.4 ppm (1H, t).Tín hiệu δH = 4.15ppm (2H, d) cho thấy sự hiện diện của 2 proton tại vị trí H2-1 của nhóm CH2 gắn với nguyên tử oxy Tín hiệu δH = 1.99ppm (2H, t) đặc trưng cho nhóm CH2 tại vị trí H2-4 bên cạnh liên kết đôi Một tín hiệu singlet tại δH = 1.66ppm (3H,s) đặc trưng cho proton của nhóm CH3 tại vị trí H3-20 4 nhóm CH3 còn lại được thể hiện trên tín hiệu δH
Dải tín hiệu 1.0 – 1.53 (19H, m) thể hiện các proton của 6 nhóm CH2 và 3 nhóm
CH tại các vị trí còn lại.
Hình 3.4 Phổ 1 H-NMR của chất TCE3a
Dựa vào phổ DEPT cùng phổ 13 C-NMR cho thấy sự có mặt của 20 nguyên tử carbon với những đặc trưng bao gồm: 1 carbon bậc 4 tại δC 140.3 ppm chỉ ra sự xuất hiện của nối đôi, 5 nhóm CH3 cho tín hiệu carbon δC từ 16.2 đến22.7 ppm, 4 nhóm CH có trong đó có 1 nhóm CH gắn với nối đôi tại δC123.1 ppm và 3 nhóm CH còn lại có tín hiệu δCtừ 29.7 đến 32.8 ppm 10 nguyên tử carbon còn lại gồm 9 nhóm CH2 cho tín hiệu δC24.5 đến 39.9 ppm và 1 nhóm CH2 gắn với nguyên tử oxy tại δC 59.5 ppm Phân tích trên gợi ý TCE3a có cấu trúc của 1 diterpene mạch thẳng chứa 1 nối đôi và 1 nhóm hydroxy.
Hình 3.5 Phổ DEPT và 13 C-NMR của chất TCE3a.
Từ các đặc điểm phổ trên và so sánh với tài liệu tham khảo có thể kết luận TCE3a chính là chất phytol [TLTK]
Hình 3.6 Công thức hóa học của hợp chất Phytol
Bảng 3.2.Dữ liệu phổ 13 C-NMR và 1 H-NMR của TCE3aso sánh với phytol trong dung môi CDCl 3
TCE3a Phytol [TLTK] δC (ppm), (CDCl3, 125MHz) δH (ppm), (CDCl3, 500MHz) δC (ppm), (CDCl3,125 MHz) δH (ppm), (CDCl3,500MH z)
Phân tích cấu trúc hóa học của hợp chất:(TCE15a) (daucosterol)
Nhìn trên phổ 1 H-NMR ta thấy các tín hiệu từ 2.87 đến 4.21 ppm đặc trưng cho các proton vòng đường Tín hiệu δ = 4.21 ppm (1H, d, J=7.8Hz,) là proton anomeric của gốc đường là 1doublet có J lớn (7.8 Hz) chứng tỏ gốc đường liên kết beta với aglycon Tiếp tục xem xét phổ phần aglycon, ta thấy hai tín hiệu singlet của 2 nhóm metyl tại 0.95 ppm (3H, s) và 0.65 ppm (3H, s) H-19 và H-18, cùng với đó là tín hiệu δH = 5.3 ppm (1H, bs) chỉ ra proton của nhóm
CH nối đôi tại vị trí H-6 Những tín hiệu này đặc trưng cho khung sterol.
Hình 3.7 Phổ 1H-NMR giãn rộng của TCE15a. Điều này càng được khẳng định hơn trên phổ 13 C-NMR với 35 tín hiệu carbon, gồm 6 carbon gốc đường và 29 carbon của sterol Trong đó,2 tín hiệuδC
= 140.42 ppm và 121.16 ppm cho thấy sự có mặt của nối đôi tại vị trí C-5, C-6.Sáu tín hiệu carbon từ 70.8 ppm đến 100.76 ppm thể hiện cho năm nhóm CH của gốc đường cùng với nhóm CH2 ở vị trí C-6’.
Hình3.8 Phổ 13C-NMR giãn rộng của TCE15a.
Từ các đặc điểm trên khẳng định TCE15a có cấu trúc gồm 1 khung sterol và 1 gốc đường So sánh TLC với chất chuẩn đã có và số liệu trong tài liệu tham khảo có thể kết luận TCE15a là chất daucosterol.
Hình 3.9 Công thức hóa học của chất daucosterol.
Bảng 3.3.Dữ liệu phổ 13 C-NMR và 1 H-NMR của TCE15a so sánh với daucosterol trong dung môi DMSO.
(DMSO, 500MHz) δC (ppm), (CDCl3, 125MHz) δH (ppm),
3.4 Phân tích cấu trúc hóa học của hợp chất: (TCE3B)
Trên phổ 1 H-NMR cho thấy sự xuất hiện tín hiệu của 4 proton vòng thơm tại các vị trí δH(ppm) 7,61 (1H, d, J=8Hz), 7,43 (1H, d, J=8Hz), 7,21(1H, t,J=8Hz), 7,07 (1H, t, J=8Hz) Tín hiệu của một proton olefin ở dạng singlet dao động tại vị trí δH = 7,51ppm (1H, s), tín hiệu của 1 nhóm metylen ở dạng duplet dao động tại vị trí δH = 4,42 ppm (2H, d, J= 5,5Hz) Ngoài ra trên phổ 1 H-NMR con cho thấy sự xuất hiện của hai tín hiệu singlet của nhóm metyl dao động tại các vị trí δH = 4.03ppm (3H,s) và δH = 2,22 ppm (3H,s).
Hình3.10 Phổ 1H-NMR giãn rộng của TCE3b.
Trên phổ 13 C-NMR và phổ DEPT của hợp chất TCE3b cho thấy sự có mặt của 12 nguyên tử carbon với những đặc trưng bao gồm: 1 carbon bậc 4 tại δC
165.98 ppm chỉ ra sự xuất hiện của nhóm cacbonyl, 6 tín hiệu của cacbon thơm có độ dịch chuyểnδC từ 119.33 đến 131.89 ppm, 2 tín hiệu của cacbon olefin tại vị trí δC108,89 ppm và 108,15 ppm Tín hiệu cacbon của hai nhóm metyl ở vị trí δC65.75 ppm và 11.50 ppm
Hình 3 11 Phổ 13 C-NMR của chất TCE3b.
Hình 3.12 Phổ 13 C-NMR của chất TCE3b.
Hình 3.13 Phổ DEPT của chất TCE3b.
Trên phổ khối phân giải cao xuất hiện píc ion giả phân tử m/z 251,0845 [M+H] + phù hợp với công thức C12H14N2O2S.
Hình 3.14 Phổ khối của chất TCE3b
Kết hợp các đặc điểm phổ của 1 H-NMR, 13 C-NMR, MS ở trên có thể dự đoán hợp chất TCE3b có công thức cấu tạo như sau:
Hình 3.15 Công thức hóa học của hợp chất TCE3b