Ảnh hưởng của môi trường nuôi thành thục và nồng độ tinh tới khả năng hình thành tiền nhân và sự phát triển của phôi lợn thụ tinh ống nghiệm

VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM VIỆN SINH THÁI VÀ TÀI NGUYÊN SINH VẬT - NGUYỄN THỊ HIỆP ẢNH HƢỞNG CỦA MÔI TRƢỜNG NUÔI THÀNH THỤC VÀ NỒNG ĐỘ TINH TỚI KHẢ NĂNG HÌNH THÀNH TIỀN NHÂN VÀ SỰ PHÁT TRIỂN CỦA PHÔI LỢN THU TINH ỐNG NGHIỆM Chuyên ngành: Động vật học Hà Nội - 2014 Số hóa Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan công trình nghiên cứu tơi thực hiện, số liệu luận văn trung thực xác Tôi xin cam đoan giúp đỡ cho việc thực luận văn đƣợc cảm ơn đầy đủ, thơng tn trích dẫn luận văn đƣợc rõ nguồn gốc Hà Nội, ngày 11 tháng 11 năm 2014 Tác giả luận văn Nguyễn Thị Hiệp Số hóa Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn LỜI CẢM ƠN! Tôi xin gửi lời cám ơn chân thành sâu sắc tới TS Nguyễn Việt Linh, chủ nhiệm đề tài, ngƣời thầy tận tình hƣớng dẫn, tạo điều kiện thuận lợi để tơi hồn thành luận văn Tơi xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành sâu sắc tới TS Bùi Xuân Nguyên, TS Nguyễn Thị Ƣớc, ngƣời thầy tận tnh dạy bảo, hƣớng dẫn công việc chuyên môn nhƣ kinh nghiệm sống Tôi xin gửi lời cám ơn chân thành tới tập thể cán nghiên cứu Phòng Cơng nghệ Phơi đặc biệt TS Nguyễn Văn Hạnh, Ths Nguyễn Thị Hồng, Ths Nguyễn Thị Nhung, CN Nguyễn Văn Lâm nhiệt tình giúp đỡ, ủng hộ góp ý để tơi hồn thành luận văn Luận văn đƣợc hoàn thành với tài trợ Quỹ Phát triển khoa học công nghệ quốc gia khuôn khổ đề tài “Nghiên cứu ảnh hƣởng giọt nỗn bào chất đơn tính lên hoạt hóa trứng phát triển phôi” mã số 106.12-2012.93 TS Nguyễn Việt Linh chủ nhiệm Tôi xin cảm ơn Viện Sinh thái Tài nguyên sinh vật tạo điều kiện thủ tục hành để tơi bảo vệ luận văn Cuối tơi xin gửi lời cám ơn tới gia đình, bạn bè, ngƣời sát cánh, ủng hộ tơi suốt q trình học tập thực luận văn Xin chân thành cảm ơn! Hà Nội, ngày Số hóa Trung tâm Học liệu – ĐHTN 11 tháng 11 năm 2014 http://www.lrc.tnu.edu.vn Học viên Số hóa Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn Nguyễn Thị Hiệp MỤC LỤC LỜI CAM ĐOAN i LỜI CẢM ƠN ii MỤC LỤC iii DANH MỤC BẢNG .v DANH MỤC HÌNH …vi DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT viii PHẦN I MỞ ĐẦU 1.1 Đặt vấn đề 1.2 Mục đích 1.3 Ý nghĩa PHẦN II TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1 Sự hình thành phát triển tế bào trứng lợn 2.1.1 Sự hình thành phát triển nang trứng 2.1.2 Sự hình thành phát triển tế bào trứng 2.1.3 Sự thành thục tế bào trứng 2.2 Thụ tnh ống nghiệm lợn 10 2.2.1 Nguyên lý thụ tinh ống nghiệm giai đoạn q trình thụ tinh Số hóa Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn 10 2.2.2 Sự thành thục tế bào trứng lợn ống nghiệm 13 2.2.3 Các yếu tố ảnh hƣởng tới kết thụ tinh ống nghiệm lợn 20 Số hóa Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn 2.3 Tình hình nghiên cứu nuôi thành thục, thụ tinh ống nghiệm (IVM/IVF) Việt Nam 26 PHẦN III ĐỐI TƢỢNG, NỘI DUNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 29 3.1 Đối tƣợng phạm vi nghiên cứu 29 3.2 Địa điểm thời gian tiến hành nghiên cứu 29 3.3 Nội dung nghiên cứu têu theo dõi 29 3.4 Phƣơng pháp nghiên cứu 32 3.4.1 Chuẩn bị môi trƣờng thu rửa buồng trứng 32 3.4.2 Phƣơng pháp thu, bảo quản vận chuyển buồng trứng 33 3.4.4 Phƣơng pháp phân loại chất lƣợng trứng 35 3.4.5 Phƣơng pháp đánh giá thành thục sau nuôi 37 3.4.6 Phƣơng pháp thụ tinh ống nghiệm (In vitro fertlization - IVF) 38 3.4.7 Phƣơng pháp đánh giá chất lƣợng phôi nang 42 3.4.8 Phƣơng pháp xử lý số liệu 43 PHẦN IV KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 43 4.1 Ảnh hƣởng môi trƣờng nuôi tới thành thục tế bào trứng lợn 44 4.2 Ảnh hƣởng môi trƣờng nuôi tới tỷ lệ thụ tnh tế bào trứng lợn 48 4.3 Ảnh hƣởng môi trƣờng nuôi thành thục tới phát triển phôi lợn thụ tnh ống nghiệm Số hóa Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn 50 4.4 Ảnh hƣởng nồng độ tinh tới kết thụ tinh ống nghiệm lợn 54 4.5 Ảnh hƣởng nồng độ tinh phát triển chất lƣợng phôi lợn 63 PHẦN V KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 70 Số hóa Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn 5.1 Kết luận 70 5.2 Đề nghị 71 DANH MỤC BẢNG Tên bảng Trang Bảng 4.1 Ảnh hƣởng môi trƣờng nuôi thành thục tới khả thành thục tế bào trứng lợn Bảng 4.2 Ảnh hƣởng môi trƣờng nuôi thành thục tới khả hình thành tiền nhân đực tế bào trứng lợn Bảng 4.3 Ảnh hƣởng môi trƣờng nuôi thành thục tới phát triển tếp theo tế bào trứng lợn Bảng 4.4 Ảnh hƣởng nồng độ tinh tới khả thụ tinh tinh trùng với trứng loại A Bảng 4.5 Ảnh hƣởng nồng độ tinh tới khả thụ tinh tinh trùng với trứng loại B1 Bảng 4.6 Ảnh hƣởng nồng độ tinh tới khả thụ tinh tinh trùng với trứng loại B2 Bảng 4.7 Ảnh hƣởng nồng độ tinh tới phát triển phôi lợn thụ tinh ống nghiệm với trứng loại A Bảng 4.8 Ảnh hƣởng nồng độ tinh tới phát triển phôi lợn thụ tinh ống nghiệm với trứng loại B1 Bảng 4.9 Ảnh hƣởng nồng độ tinh tới phát triển phôi lợn thụ tinh ống nghiệm với trứng loại B2 Số hóa Trung tâm Học liệu – ĐHTN 43 47 49 53 56 57 61 62 63 http://www.lrc.tnu.edu.vn DANH MỤC HÌNH Tên hình Trang Hình 2.1 Sự hình thành phát triển nang trứng lợn Hình 2.2 Cấu tạo tế bào trứng Hình Buồng trứng lợn lai kinh tế 33 Hình 3.2 Trứng lợn loại A, B1, B2 35 Hình 4.1 Trứng lợn giai đoạn GV (a) giai đoạn MI 44 Hình 4.2 Trứng lợn giai đoạn thành thục 45 Hình 4.3-a Tế bào trứng lợn thụ tinh bình thƣờng, 4.3-b Tế bào trứng 55 lợn đa thụ tnh Hình 4.4 Phơi giai đoạn tế bào (a) giai đoạn phôi dâu (b) 65 Hình 4.4 Phơi nang (Blastocyst) 66 Hình 4.5 Số tế bào/phơi nang 67 Số hóa Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn Trứng loại A, B1 đủ tiêu chuẩn sử dụng thụ tnh ống nghiệm lợn Trứng B2 không nên sử dụng thụ tinh ống nghiệm lợn 5.2 Đề nghị Nghiên cứu cải thiện mơi trƣờng ni trứng, góp phần nâng cao tỷ lệ hình thành phơi nang, chất lƣợng phơi nang Từ cung cấp nguồn nguyên liệu tế bào phôi nang đảm bảo chất lƣợng phục vụ cho nghiên cứu tiếp theo, đặc biệt theo hƣớng y sinh Nghiên cứu cải tạo môi trƣờng để tận dụng đƣợc nguồn tế bào trứng B2 dồi Đây sở nghiên cứu bảo tồn loài động vật quí hiến, bảo tồn đa dạng sinh học ex situ TÀI LIỆU THAM KHẢO Tài liệu tiếng Việt Huỳnh Thị Lệ Duyên, Phan Kim Ngọc, Hồ Huỳnh Thùy Dƣơng, Nguyễn Quốc Đạt (2003), “Ứng dụng kỹ thuật thụ tinh ống nghiệm heo”, Báo cáo khoa học; Hội nghị cơng nghệ sinh học tồn quốc, Hà Nội, tr 639 642 Nguyễn Hữu Đức (2005) “Nghiên cứu nuôi thành thục thụ tinh ống nghiệm trứng bò nội Việt Nam”, Luận án tiến sĩ Nông nghiệp Trƣờng Đại học Nông nghiệp Hà Nội, Hà Nội Nguyễn Thị Phƣơng Hiền, (2007), Nghiên cứu ảnh hƣởng mùa vụ lên kết nuôi thành thục số động vật nuôi, Luận văn thạc sỹ Nông nghiệp, Trƣờng Đại học Nông nghiệp Hà Nội Nguyễn Mộng Hùng (1993) “Bài giảng sinh học phát triển”, Nhà xuất Khoa học Kỹ thuật, Hà nội Bùi Xuân Nguyên (2003), “Phát triển công nghệ phôi tế bào phôi Việt Nam”, Kỷ yếu viện công nghệ sinh học, Nxb Khoa học Kỹ thuật Hà Nội, tr 411 - 417 Nguyễn Thị Ứơc, Lê Văn Ty, Nguyễn Hữu Đức, Bùi Linh Chi, Nguyễn Trung Thành, Nguyễn Việt Linh, Nguyễn Văn Hạnh, Quản Xuân Hữu, Nguyễn Thùy Anh, Hoàng Nghĩa Sơn, Dƣơng Đình Long, Bùi Xuân Nguyên, (2003), “Sản xuất bê sữa thụ tinh ống nghiệm cấy phơi xác định giới tính, Tài liệu hội nghị Cơng nghệ sinh học toàn quốc, Nxb Khoa học Kỹ thuật Hà Nội, Tr 717- 719 Nguyễn Thị Ƣớc, Nguyễn Việt Linh, Nguyễn Văn Hạnh, Quản Xuân Hữu, Đặng Nguyễn Quang Thành, Trần Thị Thơm, Nguyễn Thị Mến, Bùi Linh Chi, Nguyễn Trung Thành, Dƣơng Đình Long, Nguyễn Khắc Tích, Phan Ngọc Minh, Bùi Xuân Nguyên, (2008) “Nghiên cứu sản xuất phôi lợn mini nội địa tổ hợp cơng nghệ ống nghiệm nhân vơ tính” Tạp chí cơng nghệ sinh học, 6(4A), tr 625-635 Tài liệu tiếng Anh Abeydeera L.R., Wang W.H., Cantley T.C., Prather R.S., Day B.N., (1998) Presence of betamercaptoethanol can increase the glutathione content of pig oocytes matured in vitro and the rate of blastocyst development afer in vitro fertilizaton Theriogenology 50, 747-756 Abeydeera LR (2001) In vitro fertlizaton and embryo development in pigs Reproduction (Suppl) 58:159–173 10.Abeydeera LR (2002) “In vitro producton of embryos in swine” Theriogenology 57(1):256-73 11.Abeydeera, L.R., Day, B.N., 1997 Fertilizaton and subsequent development in vitro of pig oocytes inseminated in a modified trisbuffered medium with frozen-thawed ejaculated spermatozoa Biol Reprod 57, 729–734 12.Agung B., Otoi T., Fuchimoto D-I., Senbon S., Onishi A and Nagai T (2013) In vitro Fertilization and Development of Porcine Oocytes Matured in Follicular Fluid Journal of Reproduction and Development 59 (2):103-1 triệu 13.Bing Y.Z., Rodriguez-Martnez H., Nagai T (2001), Effects of cysteamine, FSH, and estradiol-17β on in vitro maturation of porcine oocytes Theriogenology 55, 867-876 14.Black JL and Erickson BH (1968) Oogenesis and ovarian development in the prenatal pig Anatomical Record 161 45–56 15.Clark, S.G., Haubert, K., Beebe, D.J., Ferguson, C.E., Wheeler, M.B., (2005) “Reduction of polyspermic penetraton using biomimetc microfluidic technology during in vitro fertilizaton” Lab Chip 5, 1229– 1232 16.Ding J., Clarke N., Nagai T., Moor R.M., 1992 Protein and nuclear changes in pigs at fertilizaton Mol Reprod Dev 31: 287-296 17.Funahashi H, 2005 Effect of beta-mercaptoethanol during in vitro fertilization procedures on sperm penetraton into porcine oocytes and the early development in vitro Reproducton 130, 889-898 18.Funahashi H, Romar R, 2004 Reduction of the incidence of polyspermic penetraton into porcine oocytes by pretreatment of fresh spermatozoa with adenosine and a transient co-incubation of the gametes with caffeine Reproduction 128, 789-800 19.Funahashi H., Nagai T., 2001 Regulation of in vitro penetration of frozen-thawed boar spermatozoa by caffeine and adenosine Mol Reprod Dev 58, 424-431 20.Gosden RG and Telfer EE (1987) Numbers of follicles and oocytes in mammalian ovaries and their allometric relatonships Journal of Zoology London 211 169–175 21.Grupen C.G., Nagashima H., Nottle M.B., 1995 Cysteamine enhances in vitro development of porcine oocytes matured and fertilized in vitro Biol Reprod 53, 173-178 22.Hunter M G (2000) Oocyte maturation and ovum quality in pigs Journals of Reproduction and Fertility 5, 122–130 23.Hunter RHF, (1990) Fertilization of pig eggs in vivo and in vitro J Reprod Fertl (Suppl) 40:211–226 24.Karja NWK Nuclear Matureation of Porcine oocytes in vitro: Effect of the Cumulus-Oocyte Complexes Quality Indoneisan Journal of Biotechnology December, 2008 Vol.13, No.2, pp.1078-1084 25.Kątska-Książkiewicz L (2006) Pig embryo producton by in vitromaturaton and fertilization of ovarian oocytes A review Journal of Animal and Feed Sciences 15: 525–542 26.Kay E and Brian D (2003) In vitro fertilization, second edition, Cambridge university press 27.Kikuchi K, Naito K, Daen FP, Izaike Y and Toyoda Y (1995) Histone H1kinase activity during in vitro fertilization of pig follicular oocytes matured in vitro Theriogenology 43523–532 28.Kikuchi K, Onishi A, Kashiwazaki N, Iwamoto M, Noguchi J, Kaneko H, Akita T, Nagai T (2002) “Successful piglet producton after transfer of blastocysts produced by a modified in vitro system” Biol Reprod 66(4):1033-41 29.Kikuchi K., Kashiwazaki N., Noguchi J., Shimada A., Takahashi R., Hirabayashi M., Shino M., Ueda M., and Kaneko H (1999) Developmental Competence, after Transfer to Recipients, of Porcine Oocytes Matured, Fertilized, and Cultured In Vitro Biology of reproduction 60, 336–340 30.Leibfried – Rutledge M.L., Critser E.S., Eyestone W.H., Northey D.L., and First (1986), “Developmental potental of bovine oocytes matured in vitro or in vivo” Theriogenology, 25 (1), 164 31.Leibfried L and First NL (1979) Characterization of bovine follocular oocytes and their ability invitro J Anim Sci (48): 76-86 32.Li YH., Ma W., Li M., Hou Y, Jiao LH., Wang WH., (2003) “Reduced Polyspermic Penetration in Porcine Oocytes Inseminated in a New In vitro Fertilization (IVF) System: Straw IVF” Biology of reproducton 69, pp 1580–1585 33.Liu R.H et al, (2003) “Maturation of porcine oocytes after cooling at the germinal vesicle stage” Zygote, 11; 299-305 34.Long C R., Dobrinsky J R., Johnson L A., 1999 “In vitro production of pig embryo: Comparision of culture media and boars” Theriogenology, vol 31; 1375 - 1388 35.Marchal R., Feugang J.M., Pereau C., Venturi E., Terqui M., Mermillod P., 2001 Meiotic and developmental competence of prepubertal and adult swine oocytes Theriogenology 56, 17-29 36.Margot Alves Nunes Dode, Charles Graves (2001) Influence of hormones and follicular fluid on maturation of pig oocytes Ciênca Rural, Santa Maria, 31 (1), p.99-104 37.Mattioli M., Bacci M.L., Galeati G., Seren E., 1989 Developmental competence of pig oocytes matured and fertilized in vitro Theriogenology 31, 1201-1207 38.McGaughey RW, Montgomery DH and Richter JD (1979) Germinal vesicle configuration and patterns of polypeptide synthesis of porcine oocytes from antral follicles of different size as related to their competence for spontaneous maturaton, Journal of Experimental Zoology 209 239–252 39.Melanie Anna Bagg (2007) Factors affecting the developmental competence of pig oocytes matured in vitro Ph.D thesis in Medicine 40.Meurens, F., Summerfield, A., Nauwynck, H., Saif, L., Gerdts, V (2012) The pig: a model for human infectious diseases Trends in Microbiology 20 (1) 41.Mtango N.R., Varisanga M.D, Juan D.Y., Wongrisekeao P and Suzuki T (2002) Development to Blastocyst Stage of Pig Oocytes Matured, Fertilized and Electroactivated In vitro Arch Tierz., Dummerstorf 45 6, 547-556 42.Nagai T, (1996) In vitro maturaton and fertilization of pig oocytes Animal Reproduction Science 42, 153–163 43.Nagai T (2001) The improvement of in vitro maturation systems for bovine and porcine oocytes Theriogenology 55, 1291-1301 44.Nguyen B X., et al (2006) “Current status and Trends of animal reproductive biotechnology in Viet Nam” Embryo Transfer Newsleter, V24, No2: 5-10 45.Nguyen VIET LINH, Thanh Quang DANG-NGUYEN, Bui Xuan NGUYEN, Noburu MANABE and Takashi NAGAI (2009), Effect of Cystein During In vitro Maturation of Porcine Oocytes Under Low Oxygen Tension On Their Subsequent In vitro Fertilization and Development J.Reprod Dev 55 (2008) 594-598 46.Perreault, S.D., Barbu, R.R and Slott, V.L (1988) Importance of glutathione in the acquisition and maintenance of sperm nuclear decondensing activity in maturing hamster oocytes Dev Biol., 125, 181186 47.Qian Y.; Shi W.Q., Ding J.T., Fan B.Q and Fuku Y.; “Effect of follicle size on Cumulus - Expansion, In vitro fertilizaton and development of porcine follicular oocytes” Journal of Reproduction and Development Vol 47, No 3, 2001; 145 – 152 48.Sasithorn P., Theerawat T., Panida C., Mongkol T (2011) Improvement of Normal Fertilizaton Rate and Embryo Development by Reduction of Sperm: Oocyte ratio during In vitroFertilization in Pig Thai J Vet Med 41(1): 71-77 49.Singh B., Meng L., Rutledge J.M., Armstrong D.T., 1997 Effects of epidermal growth factor and follicle stimulatng hormone during in vitro maturation on cytoplasmic maturation of porcine oocytes Mol Reprod Dev 46, 401-407 50.Spinaci M et al (2008), “Effects of epigallocatechin-3-gallate (EGCG) on in vitro maturaton and fertlization of porcine oocytes” Theriogenology (69) 877-885 51.Suzuki H., Saito Y., Kagawa N., and Yang X (2003) In vitro Fertilization and Polyspermy in the Pig: Factors Affecting Fertilization Rates and Cytoskeletal Reorganization of the Oocyte Microscopy Research and Technique 61:327–334 52.Vatzias G., Hagen, D.R., (1999) “Effects of porcine follicular fluid and oviduct-conditioned media on maturaton and fertilizaton of porcine Số hóa Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn oocytes in vitro” Biol Reprod 60, pp 42–48 Số hóa Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn 53.Wang W H., L Abeydeera R., Cantley T C and Day B N.(1997) Effects of Oocyte maturation media on development of pig embryos produced by in vitro fertilization Journal of Reproducton and Fertility 111, 101-108 54.Yanagimachi R 1994 “Mammalian fertilization” In E Knobil and J D Neill (eds.), “The Physiology of Reproducton”, 2nd Ed Raven Press, New York 55.Yoshida, M., Ishigaki, K., Pursel, V.G., 1992 Effect of maturation media on male pronucleus formaton in pig oocytes matured in vitro Mol Reprod Dev 31, 68–71 56.Yoshioka K., Suzuki C., Itoh S., Kikuchi K., Iwamura S., Rodriguez- Martinez H., (2003) Production of piglets derived from in vitro-produced blastocysts fertilized and cultured in chemically defined media: effects of theophylline, adenosine, and cysteine during in vitro fertilization Biol Reprod 69, 2092-2099 57.Zăhan M., V Miclea, C Man, Ileana Miclea, I (2006) Roman The Influence Of Sperm Concentration On Swine In vitro Fertilization Buletinul USAMV-CN, 63, ISSN 1454-2382 58.http://ibbio.pbworks.com/f/1317538698/oocyte.jpg 59.http://www.repropedia.org/sites/repropedia/files/oocyte-final.jpg Số hóa Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn ... 4.1 Ảnh hƣởng môi trƣờng nuôi thành thục tới khả thành thục tế bào trứng lợn Bảng 4.2 Ảnh hƣởng môi trƣờng nuôi thành thục tới khả hình thành tiền nhân đực tế bào trứng lợn Bảng 4.3 Ảnh hƣởng môi. .. trƣờng nuôi thành thục tới phát triển tếp theo tế bào trứng lợn Bảng 4.4 Ảnh hƣởng nồng độ tinh tới khả thụ tinh tinh trùng với trứng loại A Bảng 4.5 Ảnh hƣởng nồng độ tinh tới khả thụ tinh tinh... 4.6 Ảnh hƣởng nồng độ tinh tới khả thụ tinh tinh trùng với trứng loại B2 Bảng 4.7 Ảnh hƣởng nồng độ tinh tới phát triển phôi lợn thụ tinh ống nghiệm với trứng loại A Bảng 4.8 Ảnh hƣởng nồng độ tinh