Nghiên cứu đánh giá tác động của một số loại nano kim loại đến vi khuẩn cố định đạm rhizobium trên cây đậu tương

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN --- Nguyễn Quang Hùng NGHIÊN CỨU ĐÁNH GIÁ TÁC ĐỘNG CỦA MỘT SỐ NANO KIM LOẠI ĐẾN VI KHUẨN CỐ ĐỊNH ĐẠM RHIZOBIUM TRÊN CÂY ĐẬU TƯ

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN

-

Nguyễn Quang Hùng

NGHIÊN CỨU ĐÁNH GIÁ TÁC ĐỘNG CỦA MỘT SỐ NANO KIM LOẠI ĐẾN VI KHUẨN CỐ ĐỊNH ĐẠM

RHIZOBIUM TRÊN CÂY ĐẬU TƯƠNG

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC

Hà Nội – 2018

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN

-

Nguyễn Quang Hùng

NGHIÊN CỨU ĐÁNH GIÁ TÁC ĐỘNG CỦA MỘT SỐ NANO KIM LOẠI ĐẾN VI KHUẨN CỐ ĐỊNH ĐẠM

RHIZOBIUM TRÊN CÂY ĐẬU TƯƠNG

Chuyên nghành : Khoa học môi trường

Mã số : 60440301

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC

NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC:

TS PHAN THỊ HỒNG THẢO PGS.TS NGUYỄN KIỀU BĂNG TÂM

Hà Nội – 2018

LỜI CẢM ƠN Lời đầu tiên, tôi xin cảm ơn chân thành và sâu sắc nhất tới PGS.TS Nguyễn Kiều Băng Tâm (Khoa Môi trường – Đại học Khoa học Tự nhiên – ĐHQGHN), T.S Phan Thị Hồng Thảo (Viện Công nghệ Sinh học – Viện Hàn lâm Khoa học

và Công nghệ Viêt Nam), người cô mẫu mực đã tận tụy hướng dẫn và truyền đạt kiến thức cho tôi trong suốt quá trình thực hiện đề tài cũng như luôn quan tâm, động viên và giúp đỡ tôi trong cuộc sống Xin cảm ơn nguồn kinh phí từ dự án KHCN trọng điểm cấp Viện Hàn lâm KH và CN Việt Nam mã số

VAST.TĐ.NANO-NN/15-18 “ Nghiên cứu ứng dụng Công nghệ nano trong nông

nghiệp” do PGS.TS Nguyễn Hoài Châu làm chủ nhiệm

Tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành tới các thầy cô trong Khoa Môi trường, Trường Đại học Khoa học Tự nhiên, Đại học Quốc gia Hà Nội đã dành mọi tâm huyết giảng dạy, trang bị kiến thức cho chúng tôi trong suốt khóa học này

Tôi cũng xin gửi lời cảm ơn đến tập thể các anh, chị, em Phòng Vi sinh vật Đất, Viện Công nghệ Sinh học, Viện Hàn lâm Khoa học Công nghệ Việt Nam đã nhiệt tình cộng tác và giúp đỡ tôi trong suốt quá trình thực hiện đề tài này

Cuối cùng, tôi xin được gửi lời cảm ơn đến gia đình, bạn bè đã luôn ở bên động viên, và chia sẻ khó khăn giúp đỡ tôi trong quá trình học tập và thực hiện luận văn này

Hà Nội, ngày tháng năm 2018

Học viên cao học

Nguyễn Quang Hùng

MỤC LỤC

MỞ ĐẦU 1

Chương 1 TỔNG QUAN 3

1.1 Cây đậu tương và ứng dụng trong sản xuất nông nghiệp Việt Nam 3

1.1.1 Giới thiệu chung về cây đậu tương 3

1.1.2 Tình hình sản xuất và vai trò của cây đậu tương trong nông nghiệp 3

1.1.3 Những vấn đề trong sản xuất đậu tương ở Việt Nam 5

1.2 Quá trình chuyển hóa nitơ trong tự nhiên 7

1.2.1 Quá trình khoáng hóa 7

1.2.2 Quá trình phản nitrat hóa 8

1.2.3 Quá trình cố định nitơ phân tử 8

1.3 Tổng quan về vi khuẩn cố định nitơ 10

1.3.1 Vi khuẩn cố định nitơ cộng sinh Rhizobium 11

1.3.2 Vi khuẩn cố định nitơ tự do 12

1.4 Công nghệ nano và ứng dụng của công nghệ nano trong nông nghiệp 14

1.4.1 Tình hình nghiên cứu trên thế giới 14

1.4.2 Tình hình nghiên cứu tại Việt Nam 19

1.5 Ảnh hưởng của các hạt nano sắt, đồng, coban đến sinh trưởng và phát triển của cây đậu tương 20

1.5.1 Ảnh hưởng của coban 20

1.5.2 Ảnh hưởng của sắt 21

1.5.3 Ảnh hưởng của đồng 23

Chương 2 NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 25

2.1 Nội dung nghiên cứu 25

2.2 Đối tượng và địa điểm nghiên cứu 25

2.2.1 Đối tượng nghiên cứu 25

2.2.2 Địa điểm nghiên cứu 25

2.2.3 Thời gian nghiên cứu 26

2.2.4 Thiết bị và hóa chất nghiên cứu 26

2.3 Phương pháp nghiên cứu 26

2.3.1 Phương pháp phân lập 26

2.3.2 Phương pháp nghiên cứu đặc điểm sinh học 27

2.3.3 Phương pháp tách chiết DNA tổng số và nhân gen bằng phản ứng PCR 29

2.3.4 Phương pháp định danh chủng Rhizobium 29

2.3.5 Đánh giá tác động của nano Fe, Cu và Co đến sự sinh trưởng của chủng Rhizobium 30

2.3.6 Phương pháp xác định định lượng polysaccharide bằng UV-VIS 30

2.3.7.Đánh giá ảnh tác động của nano kim loại Fe, Cu, Co đến sinh trưởng phát triển của cây đậu tương trong phòng thí nghiệm nghiệm 31

2.3.8 Pháp xác định hoạt tính cố định nitơ của vi khuẩn nốt sần cây họ đậu 32

Chương 3 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 33

3.1 Nghiên cứu phân lập và mô tả một số chủng vi khuẩn cố định nitơ cộng sinh cây đậu tương Rhizobium sp ở Thanh Trì và Thanh Hóa 33

3.1.1 Phân lập chủng vi khuẩn cố định nitơ cộng sinh cây đậu tương tại khu vực Thanh Trì và Thanh Hóa 33

3.1.2 Mô tả một số đặc điểm sinh học của các chủng vi khuẩn đã phân lập 35

3.1.3 Đặc điểm sinh học của chủng TT14 và phân tích trình tự gen 16S- rDNA 39

3.1.4 Phân tích trình tự gen 16S - rDNA của chủng TT14 44

3.2 Kết quả đánh giá ảnh hưởng của các nồng nộ nano kim loại Fe, Cu, Co đến sinh trưởng và phát triển vi khuẩn cố định đạm Rhizobium trên cây đậu tương trong phòng thí nghiệm 46

3.2.1 Nghiên cứu ảnh hưởng của nano kim loại Fe đến khả năng sinh trưởng

và sinh polysaccharite của chủng vi khuẩn Sinorhizobium fredii TT14 46

3.2.2 Nghiên cứu ảnh hưởng của nano kim loại Cu đến khả năng sinh trưởng

và sinh polysaccharite của chủng vi khuẩn Sinorhizobium fredii TT14 49

3.2.3 Nghiên cứu ảnh hưởng của nano kim loại Co đến khả năng sinh trưởng

và sinh polysaccharite của chủng vi khuẩn Sinorhizobium fredii TT14 52

3.3 Ảnh hưởng của các nano kim loại đến khả năng sinh trưởng của cây đâu tượng trong điều kiện phòng thí nghiệm 54

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 59 TÀI LIỆU THAM KHẢO 61

DANH MỤC VIẾT TẮT

Từ viết tắt Viết đầy đủ

APO: Asiaa Productivity Organization

CTAB: Cetyl Trimethyl Ammonium Bromide DNA: Acid Deoxyribonucleic

PCR : Polymerase Chain Reaction

TAE : Tris Acetate EDTA

SEM: Scaning Lectron Microscope

SPT: Hạt siêu phân tán hay hạt nano

YEM-Fe-NP : Yeast Extract Mannitol Fe Nanoparticles YEM-Cu-NP : Yeast Extract Mannitol Cu Nanoparticles YEM-Co-NP : Yeast Extract Mannitol Co Nanoparticles YEMA-CR: Yeast Extract Mannitol Agar Congo Red

DANH MỤC BẢNG

Bảng 1.1 Tình hình sản xuất đậu tương ở Việt Nam giai đoạn 2011-2016 4

Bảng 3 1 Các chủng vi khuẩn phân lập trên môi trường YEMA-CR tại Thanh Trì và Thanh Hóa 33

Bảng 3 2 Một số đặc điểm sinh hóa các chủng vi khuẩn nốt sần đã phân lập tại Thanh Trì 36

Bảng 3 3 Một số đặc điểm sinh hóa các chủng vi khuẩn nốt sần đã phân lập tại Thanh Hóa 37

Bảng 3 4 Định danh các chủng phân lập 38

Bảng 3 5 Ảnh hưởng của nhiệt độ đến khả năng phát triển của chủng TT14 40

Bảng 3 6 Ảnh hưởng của nồng độ muối đến sinh trưởng của vi khuẩn TT14 41

Bảng 3 7 Đặc điểm sinh học của chủng TT14 42

Bảng 3 8 Mức độ tương đồng di truyền giữa chủng TT14 với các loài vi khuẩn có họ hàng gần dựa vào trình tự nucleotide của gen 16S rDNA 45

Bảng 3.9 Kết quả đo hoạt tính cố định nito của các mẫu trong điều kiện phòng thí nghiệm 58

DANH MỤC HÌNH

Hình 2 1 Đồ thị đường chuẩn glucose 31Hình 3 1 Một số hình ảnh phân lập từ nốt sần đậu tương ở Thanh Trì 34Hình 3 2 Một số hình ảnh phân lập từ nốt sần đậu tương ở Thanh Hóa 35Hình 3 3 Khả năng sinh trưởng nhanh và tạo axit trên môi trường YEM-BTB và MT Keto-lactose sau 48 giờ của vi khuẩn TT14 36Hình 3 5 Khuẩn lạc chủng TT14 trên môi trường YEMA-CR (a) và tế bào chủng TT14 bắt mầu Gram (-) (b) sau 24 giờ nuôi cấy 43Hình 3 6 Khả năng chuyển hóa nitrat thành nitrit (a) và không chuyển hóa gelatin (b) của vi khuẩn TT14 43Hình 3 7 Tế bào TT14 (x 3000 lần) (trái) và (x 10000) (phải) 44Hình 3 8 Điện di đồ sản phẩm PCR (1) và sản phẩm DNA tổng số (2) của TT14 trên gel agarose 1% M: thang chuẩn DNA 1Kb (Norgen) 45Hình 3 9 Ảnh hưởng của nano kim loại Fe ở các nồng độ khác nhau đến sinh

trưởng của vi khuẩn Sinorhizobium fredii TT14 47

Hình 3 10 Ảnh hưởng ở các nồng độ nano 100, 250 và 500 đến sinh trưởng của chủng vi khuẩn TT14 47Hình 3 11 Ảnh hưởng của nồng độ nano Fe đến sinh tổng hợp polysacharit ngoại bào của TT14 sau 96 giờ 48Hình 3 12 Ảnh hưởng của nano Fe ở nồng độ 250 ppm đến hình thái của tế bào vi khuẩn TT14 48Hình 3 13 Ảnh hưởng của nano kim loại Cu ở các nồng độ khác nhau đến sinh

trưởng của vi khuẩn Sinorhizobium fredii TT14 50

Hình 3 14 Ảnh hưởng của nồng độ nano Cu đến sinh tổng hợp polysacharit ngoại bào của TT14 sau 96 giờ 51Hình 3 15 Ảnh hưởng của nano Cu ở nồng độ 50 ppm đến hình thái của tế bào vi khuẩn TT14 51

Hình 3 16 Ảnh hưởng của nano kim loại Co ở các nồng độ khác nhau đến sinh

trưởng của vi khuẩn Sinorhizobium fredii TT14 52

Hình 3 17 Ảnh hưởng của nồng độ nano Co đến sinh tổng hợp polysacharit ngoại bào của TT14 sau 96 giờ 53

Hình 3 18 Ảnh hưởng của các nano kim loại đến sinh trưởng của cây đậu tương trong phòng thí nghiệm 54

Hình 3 19 Ảnh hưởng của nano kim loại và vi khuẩn cố định đạm TT14 đến sinh trưởng và số lượng nốt sần trên cây đậu tương 55

Hình 3.20 Đậu tương không xử lý nano: không bổ sung vi khuẩn (a), có bổ sung vi khuẩn T14 (b) 56

Hình 3.21 Đậu tương xử lý nano Fe 2 ppm và 250 ppm 56

Hình 3.22 Đậu tương xử lý nano Cu 2 ppm và 25 ppm 57

Hình 3.23 Đậu tương xử lý nano Co 2ppm và 100 ppm 57

MỞ ĐẦU

Hiện nay vấn đề ô nhiễm môi trường đất, nước, không khí đang trở thành mối quan tâm cấp thiết của toàn thế giới đòi hỏi nhân loại bảo vệ môi trường sống của chính mình Nền nông nghiệp hiện đại đang phải đối mặt với một thách thức lớn là mức độ sử dụng và giá cả phân bón ngày càng tăng với tốc độ chóng mặt Việt Nam là nước sản xuất nông nghiệp, hằng năm sử dụng một lượng lớn phân bón hóa học và thuốc bảo vệ thực vật nhằm nâng cao hiệu suất cây trồng Lượng tàn dư của các chất hóa học trong đất, trong các sản phẩm nông nghiệp là nguyên nhân làm ảnh hưởng nghiêm trọng đến môi trường sống và sức khỏe con người Vì vậy việc đưa ra nhưng biện pháp nâng cao năng suất, chất lượng cây trồng đồng thời góp phần bảo vệ môi trường cho một nền nông nghiệp sạch và bền vững là một đòi hỏi cần thiết

Cùng với sự phát triển của các nghành công nghệ cao như công nghệ thông tin, công nghệ sinh học là sự ra đời của một nghành công nghệ mới đó chính là công nghệ nano Hiện nay, vật liệu mới có cấu trúc nano đã trở thành một trong những vật liệu được sử dụng rộng rãi trong đời sống Loại vật liệu này có đặc tính khác biệt, thường vượt trội hơn so với các vật liệu thông thường ở hai đặc điểm chính: hiệu ứng bề mặt và hiệu ứng lượng tử Những đặc điểm này ảnh hưởng đến đặc tính hóa lý chung của các vật liệu nano và tạo ra các đặc tính mới chưa từng có ở các vật liệu khối Việc áp dụng công nghệ nano vào các ngành nông nghiệp và thực phẩm được đặt ra lần đầu tiên trong chương trình hành động của Bộ Nông nghiệp Hoa Kỳ vào tháng 9 năm 2003 và được dự đoán sẽ là công nghệ then chốt tạo ra thay đổi quan trọng trong các ngành này Trong những năm đầu tiên, việc áp dụng công nghệ nano trong sản xuất nông nghiệp chủ yếu được thực hiện qua các nghiên cứu trong phòng thí nghiệm, nhưng ngay sau đó nó đã bắt đầu và đang tiếp tục có ảnh hưởng đáng kể trong các lĩnh vực quan trọng như lai tạo các giống cây trồng mới, phát triển vật liệu chức năng mới và hệ thống phân phối thông minh cho hóa chất nông nghiệp như thuốc diệt cỏ, phân bón và thuốc trừ sâu, hệ thống thông minh cho chế biến thực phẩm, bao bì và các lĩnh vực khác như như khắc phục hậu quả của dư

lượng chất diệt cỏ và thuốc trừ sâu trong thực vật và đất, trong xử lý nước thải, quản

lý tài nguyên thiên nhiên và phát hiện sớm các mầm bệnh, các chất gây ô nhiễm trong cây trồng và thực phẩm Do khả năng ứng dụng kỳ diệu và sâu rộng của công nghệ nano mà hiện nay trên thế giới đang xảy ra một cuộc chạy đua sôi động

về việc nghiên cứu và phát triển ứng dụng công nghệ nano vào đời sống Công nghệ nano được xem như là cuộc cách mạng công nghiệp mới không chỉ ở các nước phát triển, mà còn ở cả các nước đang phát triển Công nghệ nano là một nghành công nghệ đang rất được các nhà khoa học quan tâm nghiên cứu, hứa hẹn sẽ mang lại những thành tựu to lớn, có tiềm năng trong việt giải quyết các bài toán về khoa học

và công nghệ như vấn đề năng lượng, bảo vệ sức khỏe con người, hạn chế lượng phân bón vi lượng kim loại, phục hồi môi trường, bảo vệ môi trường và phát triển nông nghiệp

Kinh nghiệm sử dụng phân bón vi lượng cho thấy các dạng muối của chúng thường phản ứng với một số tạp chất trong đất tạo thành các hợp chất khó tan, làm cho cây trồng khó hấp thu và tạo ra các phụ phẩm và tồn dư kim loại nặng trong đất

Sử dụng các nano kim loại thay thế phân bón vi lượng kim loại, kích thích tăng trưởng cho cây là một hướng nghiên cứu hiện nay được thế giới quan tâm

Trong nhiều năm gần đây, việc sử dụng các nano kim loại Cu, Fe, Co, cho tăng năng suất các loại cây trồng trong nông nghiệp đã được công bố Ở nước ta, cây đậu tương là một trong những cây lương thực quan trọng Cây đậu tương còn là cây cố định đạm nhờ các loại vi sinh vật cố định đạm trong đó quan trọng nhất là

các loài vi khuẩn Rhizobium tạo nốt sần trên cây đậu tương Để có thể ứng dụng các

nano kim loại hiệu quả trong tăng năng suất đậu tương, việc nghiên cứu tác động của chúng đến vi khuẩn cố định đạm là rất cần thiết nhằm tìm ra nồng độ thích hợp cho ứng dụng nano kim loại trong phát triển cây đậu tương

Xuất phát từ thực tế đó, chúng tôi tiến hành nghiên cứu đề tài: “Nghiên cứu

đánh giá tác động của một số nano kim loại đến vi khuẩn cố định đạm Rhizobium trên cây đậu tương”

Chương 1 TỔNG QUAN

1.1 Cây đậu tương và ứng dụng trong sản xuất nông nghiệp Việt Nam

1.1.1 Giới thiệu chung về cây đậu tương

Cây đậu tương thuộc bộ Fabaceae, họ Fabaceae, chi Glycine có tên khoa học

là Glycine Max (L) Merr, là một trong những loại cây trồng mà loài người đã biết sử

dụng và trồng trọt từ lâu đời, vì vậy nguồn gốc của cây đậu tương cũng sớm được xác minh Những bằng chứng về lịch sử, địa lý và khảo cổ học đều công nhận rằng đậu tương có nguyên sản ở châu Á và có nguồn gốc từ Trung Quốc Cây đậu tương được thuần hoá ở Trung Quốc qua nhiều triều đại tiền phong kiến và được đưa vào trồng trọt và khảo sát có thể trong triều đại Shang (năm 1700-1100 B.C) trước công nguyên [2]

Theo (Ngô Thế Dân và công sự, 1999) cả nước ta đã hình thành 7 vùng sản xuất đậu tương Trong đó, diện tích trồng đậu tương lớn nhất là vùng trung du miền núi phía Bắc chiếm 37,1% diện tích gieo trồng cả nước, tiếp theo là vùng đồng bằng sông Hồng với 27,21% diện tích Năng suất đậu tương cao nhất nước ta là vùng đồng bằng sông Cửu Long đạt bình quân 22,29 tạ/ha vụ Đông xuân và 29,71 tạ/ha vụ mùa Vùng trung du miền núi phía Bắc nơi có diện tích trồng đậu tương lớn nhất cả nước lại là nơi có năng suất thấp nhất, chỉ đạt trên 10 tạ/ha Theo (Lê Quốc Hưng, 2007), nước ta có tiềm tăng rất lớn để mở rộng diện tích trồng đậu tương ở cả 3 vụ Xuân,

hè và đông với diện tích có thể đạt 1,5 triệu ha, trong đó miền núi phía Bắc khoảng

400 nghìn ha [1]

1.1.2 Tình hình sản xuất và vai trò của cây đậu tương trong nông nghiệp

Ở Việt Nam, cây đậu tương đóng vai trò rất quan trọng trong cơ cấu cây trồng nông nghiệp và đặc biệt là ở các tỉnh miền núi phía Bắc Do đậu tương là loại cây ngắn ngày và có khả năng trồng trên nhiều loại đất khác nhau nên rất thích hợp làm cây trồng luân canh, xen canh, gối vụ với nhiều loại cây trồng khác nhau làm tăng hiệu quả sử dụng đất trong nông nghiệp Tuy nhiên, quy mô sản xuất đậu tương còn

nhỏ lẻ và chưa cạnh tranh được với các loại cây khác Diện tích trồng đậu tương đã được mở rộng từ năm 2011 nhưng năng suất và sản lượng còn thấp Năm 2013, tổng sản lượng đậu tương toàn quốc mới chỉ đạt 168,4 nghìn tấn đáp ứng khoảng 1/10 nhu cầu Năng suất tiếp theo (2014 và 2015) vẫn ở mức thấp Vì thiếu khả năng cạnh tranh, tới năm 2016, diện tích gieo trồng đậu tương đã bị giảm còn 94 nghìn

ha, sản lượng đạt 147,5 nghìn tấn, năng suất tăng nhẹ 8,2% so với năm 2015 (Bảng 1.1) Để bù đắp sự thiếu hụt về thực phẩm giàu protein trong nước, đồng thời đáp ứng nhu cầu ngày càng tăng mạnh của nghành công nghiệp thức ăn chăn nuôi và nuôi trồng thủy sản, Việt Nam phải nhập khẩu một lượng lớn bột đậu từ các nước khác Theo số liệu của Tổng cục Hải quan Việt Nam và USDA (United Stated Department of Agriculture), năm 2012 Việt Nam nhập 1289,9 nghìn tấn đậu tương (trị giá 777,3 triệu đô la Mỹ) Quí I/2013, Việt Nam nhập khẩu nguyên liệu thức ăn chăn nuôi trên 712 triệu USD, tăng gần 54% so với cùng kỳ năm 2012, trong đó những loại nguyên liệu thức ăn giàu đạm như đậu tương, khô dầu đậu tương phải nhập khẩu khoảng 70 – 80 % nhu cầu Theo ước tính gia trị nhập khẩu đậu tương 8 tháng đầu năm 2017 đạt hơn 1,1 triệu tấn và 509 triệu USD, tăng 17,9% về khối lượng và tăng 22,5 % về giá trị so với cùng kỳ năm 2016

Bảng 1.1 Tình hình sản xuất đậu tương ở Việt Nam giai đoạn 2011-2016

Năm Diện tích gieo trồng

(nghìn ha)

Năng suất (tấn/ha)

Tổng sản lượng (nghìn tấn)

Thành phần dinh dưỡng trong hạt đậu tương rất cao, với hàm lượng protein

từ 38 - 40%, lipit từ 15 - 20%, carbohydrat từ 15 - 16% và nhiều loại vitamin và muối khoáng quan trọng cho sự sống Hạt đậu tương là loại sản phẩm duy nhất

mà giá trị của nó được đánh giá đồng thời trên 2 thành phần là protein và lipit Protein của hạt đậu tương không những có hàm lượng cao mà còn có đầy đủ và cân đối các axit amin cần thiết Lipit của đậu tương chứa một tỷ lệ cao các axit béo chưa no (khoảng 60 -70%), có hệ số đồng hoá cao, mùi vị thơm như axit linoleic chiếm 52- 65%, axit oleic chiếm 25 - 36%, axit lonolenoic chiếm 2 - 3% Ngoài ra, trong hạt đậu tương còn có nhiều loại vitamin như vitamin PP, A,

C, E, D, K, đặc biệt là vitamin B1 và B2 [4]

1.1.3 Những vấn đề trong sản xuất đậu tương ở Việt Nam

Cũng như các nước sản xuất đậu tương trên thế giới, các yếu tố hạn chế đến sản xuất đậu tương ở Việt nam bao gồm 3 nhóm yếu tố là: Nhóm yếu tố kinh tế -

xã hội, nhóm yếu tố sinh học và nhóm yếu tố phi sinh học Yếu tố kinh tế - xã hội hạn chế sản xuất đậu tương do chính sách của nhà nước, thủy lợi, cung ứng giống, giá bán đậu tương và quan niệm của người dân về trồng cây đậu tương [3] Nhóm yếu tố sinh học hạn chế sản xuất đậu tương ở Việt Nam là sâu bệnh hại và thiếu giống cho năng suất cao thích hợp với từng vùng sinh thái Đậu tương là cây trồng

bị nhiều loài sâu bệnh hại Tại Việt Nam đã phát hiện ra trên 70 loại sâu hại thuộc

34 họ, 8 bộ và 17 loại bệnh Trong đó 12-13 loại sâu và 4-5 loại bệnh hại phổ biến ở nhiều vùng Đối với đậu tương, các loài sâu hại nguy hiểm nhất là giòi đục thân, sâu xanh, sâu đục quả, bọ xít, bọ nhảy, bọ trĩ, nhện [3]

Các loại bệnh phổ biến hại đậu tương là lở cổ rễ, gỉ sắt, sương mai, đốm chấm vi khuẩn, virus hại lá Trong các loại bệnh trên ở miền Bắc bệnh gỉ sắt thường gây hại nặng trong vụ Xuân Bệnh gỉ sắt đã được phát hiện, có mặt và gây thiệt hại trên tất cả các vùng trồng đậu tương trong cả nước, bệnh gây hại nặng làm năng suất đậu tương giảm tới 40 - 50% [2]

Nhóm các yếu tố phi sinh học ảnh hưởng đến sản xuất đậu tương ở nước ta chủ yếu là đất đai và điều kiện khí hậu bất thuận [3] Theo Văn Tất Tuyên và Nguyễn Thế Côn, năm 1995 cho biết: đối với đậu tương vụ Đông, nhiệt độ thấp ở giai đoạn sinh trưởng cuối đã kéo dài thời gian chín, làm giảm khối lượng hạt, thậm chí làm đậu tương không chín được

Về yếu tố đất và dinh dưỡng, ở nước ta nông dân chưa thực sự coi cây đậu tương là cây trồng chính, nên đậu tương thường được trồng trên đất bạc màu phần lớn nghèo dinh dưỡng đồng thời lại đầu tư thâm canh hạn chế nên chưa phát huy tiềm năng sẵn có của cây Có 16 nguyên tố cần thiết cho sinh trưởng và phát triển của cây đậu tương Trong đó, 3 nguyên tố Carbon (C), Hydro (H) và Oxy (O) là thành phần chủ yếu trong chất khô và được hấp thụ dưới dạng CO2, H2O và O2 tự

do trong không khí Những nguyên tố cần thiết khác là N, P, K, Ca, Mg, S, Fe,

Mn, Mo, Cu, B, Zn và Cl Bên cạnh đó Coban (Co) là nguyên tố cần thiết cho việc cố định đạm (N) và cũng được coi là nguyên tố cần thiết [3]

Trước đây, bón phân là biện pháp cần thiết để tăng năng suất cho cây đậu tương Ngày nay, việc sử dụng phân vô cơ nhiều và không hợp lý đã làm cho môi trường đất ngày càng xấu đi, môi trường bị ô nhiễm, không hiệu quả về mặt kinh tế Khi bón đạm, cây chỉ sử dụng 40 – 60 %, phần còn lại nằm trong đất và gây ô nhiễm đất Các nhà nghiên cứu về dinh dưỡng cây trồng thường nói đến ảnh hưởng của hàm lượng nitrat quá cao trong nông sản có thể gây ung thư Việc bón thúc đạm

sẽ làm cho hàm lượng nitrat tích lũy trên mặt đất và làm giảm chất lượng nước Khi bón đạm từ phân khoáng và phân hữu cơ thì sẽ có một lượng khí thải được đưa vào không khí Trước hết là khí NH3 làm ô nhiễm môi trường không khí, ngoài ra còn khí NO2 làm ảnh hưởng đến tầng ozon, thường số lượng khí N2O sản sinh ra từ phân bón là 15% Trong phân chuồng, phân bắc chưa hoại mục có chứa nhiều mầm bệnh cho người và gia súc và còn có thể gây hại cho rễ cây, vì vậy bón phân chuồng khi chưa hoại mục sẽ phản tác dụng

Đồng thời, trong nghiên cứu và trong thực tế đã cho thấy nhu cầu dinh dưỡng

vi lượng của cây đậu tương dù rất nhỏ những ảnh hưởng của chúng tới sinh trưởng

và phát triển của đậu tương lại rất lớn, không kém các nguyên tố dinh dưỡng đa lượng Các nguyên tố vi lượng giữ nhiều vai trò phức tạp trong dinh dưỡng của thực vật, nhưng hầu hết đều thực hiện các chức năng của hệ thống enzyme, giữ vai trò thiết yếu trong chuỗi phản ứng phức tạp của quang hợp và các quá trình trao đổi chất Sự thiếu vi lượng rất khó nhận biết do triệu chứng khác nhau, dễ lẫn với triệu chứng do bệnh hại, đặc biệt là do virus Nếu thiếu vi lượng, quá trình sinh trưởng và phát triển của cây bị ảnh hưởng lớn, gây tổn thương sinh lý nghiêm trọng trong cây, sức nảy mầm kém, rễ phát triển yếu, lá non bị vàng mất khả năng quang hợp, quả và hạt dễ bị biến dạng, kém chất lượng, nâng suất cây trồng giảm, sâu bệnh phát triển nhiều… Nhiều năm gần đây, nhu cầu bón phân vi lượng của nông dân trở thành thiết yếu đến mức có hàng ngàn sản phẩm phân bón trên thị trường đều phối trộn các loại vi lượng, chưa kể đến rất nhiều các loại phân bón vi lượng trong danh mục phân bón Việt Nam Tuy vậy, những nghiên cứu về phân bón vi lượng cho các loại cây trồng trên những loại đất khác nhau còn rất ít Vì vậy, khi bón nhiều phân vi lượng nhưng thiếu cơ sở khoa học không chỉ tăng chi phí sản xuất mà còn có nguy

cơ gây ngộ độc như tình trạng thừa Ze, Fe, B, Mn trên cây lúa, thừa B trên khoai lang, dưa chuột, dứa… đã làm thiệt hại lớn đến hiệu quả kinh tế và môi trường Hiện nay, đã có nhiều biện pháp được áp dụng để giải quyết những bài toán trên cho cây đậu tương như bón phân hợp lý, luân canh, xen canh giữa các loại cây trồng để phòng trừ sâu bệnh Tuy nhiên, năng suất đậu tương vẫn còn thấp khiến cho giá thành chưa cạnh tranh trên thị trường

1.2 Quá trình chuyển hóa nitơ trong tự nhiên

1.2.1 Quá trình khoáng hóa

Quá trình khoáng hóa là quá trình phân hủy xác hữu cơ dưới tác động của quần thể vi sinh vật thành các chất khoáng hòa tan hay các chất khí và tỏa nhiệt, tùy thuộc vào điều kiện khoáng hóa mà cho các sản phẩm khác nhau Giai đoạn này có

sự tham gia của các chủng vi sinh vật nitrat hóa như: Nitrosomonas và Nitrobacter

– những vi khuẩn tham gia vào quá trình oxy hóa những hợp chất chứa nitơ thành nitrat (NO3-), một dạng thích hợp để cho cây trồng dễ hấp thu

1.2.2 Quá trình phản nitrat hóa

Là quá trình phân hủy chuyển hóa hợp chất nitrat trong điều kiện yếm khí dưới tác dụng của vi sinh vật tao thành nitơ

1.2.3 Quá trình cố định nitơ phân tử

Quá trình này được thực hiện do các vi sinh vật cố định nitơ như Rhizobium sống cộng sinh ở rễ cây họ đậu hay Azotobacter sống tự do, sẽ biến đổi N2 trong không khí thành NH3, từ NH3 sẽ tổng hợp ra các chất chưa nitơ khác cung cấp cho cây trồng và đồng thời làm giàu thêm nitơ cho đất Để quá trình này xảy ra thì phải

có lực khử mạnh, ATP và thực hiện ở điều kiện kỵ khí (do chỉ trong điều kiện này enzyme nitrogenase mới hoạt động)

Hợp chất hữu cơ

NH4+

NO2-

Vi khuẩn amon hóa

Vi khuẩn nitrat hóa

Nitrosomonas Nitrobacter

Trong công nghiệp, nhờ các chất xúc tác nên năng lượng dùng cho phản ứng

cố định N2 được giảm nhiều, chỉ vào khoảng 16 – 20 Kcal/M, song lượng năng lượng vẫn còn lớn so với trong cơ thể sinh vật Tốc độ phản ứng nhanh chóng trong

tế bào sinh vật ở nhiệt độ thấp nhờ có hệ thống hydrogenase hoạt hóa H2 và nitrogenase hoạt hóa N2

Năm 1961 – 1962, người ta đã tách từ Clotridium pasteurrianum hai tiểu phần

hoạt hóa H2 và N2 Sau này người ta tìm thấy ở Azotobacter cũng có các tiểu phần

đó Trong quá trình hoạt hóa này có sự tham gia của 2 nguyên tố khoáng Mo và Fe Nguồn hydro để khử N2 có thể là hydro phân thử H2 Trong trường hợp này thì dưới tác dụng của hydrogenase, điện tử được truyền theo hệ thống:

Nguồn cho điện tử và hydro là axit pyruvic Đáng chú ý là trong quá trình chuyền điện tử có sự tham gia tích cực của feredoxine (Fd) Fd là cấu nối giữa 2 hệ enzymee hydrogenase và nitrogenase để cố định N2.

Sự cố định N2 của vi khuẩn nốt sần có thể xảy ra theo sơ đồ phức tạp hơn Trong các nốt sần có một chất có bản chất HEM rất giống với hemoglobin trong máu gọi là leghemoglobin Nó dễ dàng liên kết với O2 để biến thành oxyhemoglobin Leghemoglobin chỉ được tạo nên khi vi khuẩn sống cộng sinh với

cây họ đậu, còn khi nuôi cấy tinh khiết các Rhizobium không tạo leghemoglobin và

không cố định được N2

Những nghiên cứu gần đây về quá trình cố định N2 cho thấy quá trình này đòi hỏi: (i) có sự tham gia của enzyme nitrogenase, (ii) Enzyme này hoạt động trong điều kiện yếm khí (có thể đây là nhân tố chìa khóa cho quá trình này), (iii) có lực khử mạnh với thế năng khử cao (NAD, NADP,…), (iv) có năng lượng ATP đủ và

có sự tham gia của nguyên tố vi lượng Nhóm hoạt động của enzyme nitrogenase có chứa Mo và Fe Vì vậy sử dụng Mo và Fe cho cây họ đậu tương thường có hiệu quả rất cao và (v) tiến hành trong điều kiện yếm khí Các chất khử là NADH2 và Fd cùng với năng lượng do hô hấp, quang hợp của cây chủ cung cấp Sự cố định N2 rất cần nhiều năng lượng, cần 16 ATP để khử 1 N2 NH3 tạo thành trong quá trình cố

định N2 được sử dụng dễ dàng vào quá trình amine hóa các cetoacid để tổng hợp một cách nhanh chóng các acid amine, từ đó tham gia vào tổng hợp protein và nhiều quá trình trao đổi chất khác

Phản ứng cố định nitơ được xúc tác bởi enzyme nitrogenase theo phương trình sau:

N2 + 8 H+ + 8 e- + 16 ATP → 2 NH3 + H2 + 16 ADP + 16 Pi

Như phương trình trên, nitrogenase xúc tác cho phản ứng N2 thành NH3trong sự hiện diện của ATP và chất khử như dithionite trong phòng thí nghiệm hay ferredoxin trong cơ thể sống Nitrogenase là một phức hệ enzyme được cấu tạo bởi

2 thành phần, một thành phần gọi là protein sắt – molypden (Mo – Fe protein) gọi là thành phần I, thành phần kia gọi là protein sắt (Fe protein), còn gọi là nitrogenase khử hay thành phần II Thành phần I và thành phần II rất mẫn cảm với oxy, vì vậy nên hoạt động cố định nitơ của vi sinh vật diễn ra trong điều kiện kỵ khí

1.3 Tổng quan về vi khuẩn cố định nitơ

Theo các nghiên cứu cho thấy muốn thu hoạch 12 tạ hạt trên mỗi hecta, cây trồng lấy đi khỏi đất khoảng 30 kg nitơ Theo thống kê hàng năm các sản phẩm nông nghiệp trên thế giới đã lấy đi khỏi đất 100 – 110 triệu tấn nitơ [7] Trong đó khi đó lượng phân nitơ hóa học hiện nay chỉ bù đắp được một phần lượng nitơ mà cây lấy đi khỏi đất, những tổn thất về nitơ được bù đắp bởi một quá trình sinh học đặc biệt gọi là quá trình cố định nitơ tự do vi sinh vật thực hiện, chúng có khả năng chuyển hóa nitơ phân tử trong không khí thành các hợp chất chứa nitơ và làm giàu thêm nguồn đạm trong đất, có thể xếp chúng vào hai nhóm lớn:

- Nhóm vi khuẩn cố định N tự do gồm:

+ Vi khuẩn cố định N tự do hiếu khí: Azotobacter và Beijerinskia sp

+ Vi khuẩn cố định N kỵ khí: Vi khuẩn thuộc nhóm Clostridium

- Nhóm vi khuẩn cố định N cộng sinh như cộng sinh với rễ cây họ đậu

Rhizobium …

1.3.1 Vi khuẩn cố định nitơ cộng sinh Rhizobium

Trong các hệ thống cố định nitơ sinh học, cố định nitơ cộng sinh giữa vi

khuẩn nốt sần (Rhizobium) và cây họ đậu là quan trọng nhất, ước tính đạt trên 80

triệu tấn mỗi năm, tương đương với lượng phân đạm vô cơ trên toàn thế giới sản xuất năm 1990 Trong hệ thống cố định nitơ sinh học này, mỗi nốt sần là một nhà máy phân đạm mini, trong đó cây chủ vừa là chỗ trú ngụ đồng thời cũng là nguồn cung cấp năng lượng cho quá trình cố định nitơ của vi khuẩn và nhận lại lượng đạm

từ quá trình cố định nitơ để cung cấp cho quá trình tổng hợp đạm trong thân, lá, hoa quả [7]

Vi khuẩn Rhizobium tồn tại trong đất, có thể xâm nhập vào các lông hút của

rễ cây bộ đậu và kích tác tạo thành nốt sần nên còn được goị vi khuẩn nó sần Giữa cây bộ đậu và vi khuẩn nốt sần hình thành mối quan hệ cộng sinh nghĩa là quan hệ

mà cả hai bên cần có nhau và dựa vào nhau để phát triển, trong đó vi khuẩn nốt sần tổng hợp đạm nitơ từ trong không khí cung cấp cho cây và ngược lại cây trồng cung cấp dinh dưỡng cần thiết để vi khuẩn nốt sần tồn tại và sinh trưởng

Hình dáng, kích thước, màu sắc và vị trí nốt sần trên cây rất khác nhau, phản ánh tình trạng liên kết giữa vi khuẩn nốt sần và hiệu quả cố định nitơ Căn cứ vào hiệu quả cố định nitơ, hai loại nốt sần được phân biệt, đó là nốt sần hữu hiệu và nốt sần vô hiệu

Dựa vào số lượng, kích thước và màu sắc thịt nốt sần, có thể đánh giá được hiệu quả của quá trình cố định nitơ của cây đậu tương và chủng vi khuẩn tương ứng

Rễ cây có mật độ nốt sần hữu hiệu cao, chứng tỏ khả năng cố định nitơ tự do của vi khuẩn nốt sần tốt

Vi khuẩn Rhizobium có trong đất, có thể xâm nhiễm vào rễ cây họ đậu tạo thành nốt sần cho nên còn gọi là vi khuẩn nốt sần Vi khuẩn Rhizobium thuộc

loại vi khuẩn hiếu khí, có dạng hình que, kích thước 0,5 ÷ 0,9 x 1,2 ÷ 3 micromet Khi còn non có khả năng di động nhờ tiêm mao, không sinh bào tử, sinh sản bằng cách phân bào

Dựa vào tốc độ phát triển trên môi trường đặc nhân tạo, người ta chia vi khuẩn nốt sần thành 2 loại:

+ Loại mọc nhanh như Rhizobium meliloti sống cộng sinh với cây linh lăng, cây hồ lơ ba (R Legusminosarum) với cây cỏ chẽ ba, đậu xanh, đậu hà lan, đậu

tằm… loại này có chu kỳ sinh trưởng 2 – 4 giờ Trên môi trường thạch đĩa tạo khuẩn lạc đường kính 2 – 4 mm sau 3 – 5 ngày nuôi cấy

+ Loại mọc chậm như Bradyrhizobium japonicum sống cộng sinh với cây đậu tương hay Bradyrhizobium sp (lupines) của cỏ lupin loại này có chu kỳ sinh

trưởng 6 – 8 giờ Khuẩn lạc hình thành trên môi trường thạch đĩa sau 5 – 7 ngày nuôi cấy Đường kính khuẩn lạc nhỏ không quá 1 mm

Vi khuẩn nốt sần thuộc loại vi khuẩn gram âm, phát triển tốt ở nhiệt độ 28 –

30°C, pH 6,5 – 7,0 Trên môi trường đặc, Rhizobium thường tạo khuẩn lạc tròn, lồi,

mép nhãn, bóng, nhày, đục không màu Chúng sử dụng nhiều nguồn đường khác nhau, một vài axit hữu cơ, thậm chí cả polisacarit làm nguồn cung cấp năng lượng

Vi khuẩn Rhizobium có thể phát triển trong môi trường nghèo đạm Nguồn đạm

thường là pepton, axit amin …

Vi khuẩn Rhizobium có thể đồng hóa photpho, kali, canxi và các nguyên tố

khác từ các hợp chất vô cơ và hữu cơ Một số nguyên tố vi lượng như: đồng, sắt, coban, mangan, bo, molipden cũng cần cho sự phát triển của chúng

Một số chủng Rhizobium có thể tự sản sinh được vitamin và chất kích thích sinh

trưởng, một số chủng khác lấy vitamin từ môi trường sống Trong công nghệ nuôi cấy

vi khuẩn Rhizobium dùng nước chiết men để cung cấp chất này cho chúng [8]

1.3.2 Vi khuẩn cố định nitơ tự do

1.3.2.1 Vi khuẩn cố định nitơ hiếu khí (Azotobacter)

Các loài Azotobacter thuộc loài vi sinh vật cố định nitơ hoạt động nhất Trong số loài Azotobacter đã được miêu tả thì các loài được nghiên cứu nhiều hơn

cả là Az chroococcum; Az agilis và Az vinelandii Az chroococcum là loài chủ yếu

đối với đất đồng cỏ Trong ao hồ thường gặp Az agilis Các loài nói trên khác nhau

ở đặc điểm sinh trưởng trên môi trường đặc, ở kích thước, hình thái, tế bào và một

số đặc điểm sinh lý học Az chroococcum tạo ra những khuẩn lạc nhầy, lồi hoặc

lan, lúc đầu không màu, sau đó biến thành màu nâu tối, thập trí đến đen nhưng

không làm nhuộm màu môi trường khuẩn lạc Đặc điểm của Az vinelandii và Az

agilis có khuẩn lạc trong, nhầy, sinh sắc tố huỳnh quang màu vàng – lục hoặc lam –

lục, sắc tố khuếch tán vào môi trường [19];[20];[25]

Khi còn non tế bào của Azotobacter có khả năng di động, hình que đầu tròn,

đứng riêng rẽ hay xếp thành từng đôi, đồng chất, tế bào chất nhuộm màu đồng đều

Chiều dài của tế bào thay đổi từ 2 – 3 µm đến 4 – 6 µm Các tế bào của Az agilis có

kích thước lớn nhất (5 – 6 µm) Dần các tế bào hình que chuyển thành hình cầu hay hình bầu dục lớn với đường kính lên tới 4 µm, hình dạng không cố định Khi có tiêm mao rụng đi và tế bào trở lên bất động, bọc bao nhầy, tế bào xuất hiện cấu tạo dạng hạt, các tế bài tròn có thể phủ lớp vỏ dày và chuyển thành kén

Tất cả các loài Azotobacter đều sống dị dưỡng Để dùng nguồn các bon, chúng

sử dụng nhiều nguồn hữu cơ khác nhau – monosaccarit, disaccarit, một số polysacarit nhiều rượu, các axit hữu cơ trong đó bao gồm cả các hợp chất thơm

Nguồn nitơ đối với Azotobacter không chỉ là nitơ phân tử mà còn là muối amon,

nitrat, nitrit, aminoaxit Tùy thuộc vào các hợp chất chứa nitơ có trong môi trường

mà quá trình cố định nitơ trong môi trường sẽ cố định nhiều hay ít Azotobacter có nhu cầu lớn đối với photpho và canxi Để cố định nitơ phân tử một cách mạnh mẽ

chúng cần có Mo và Bo Azotobacter nhận được năng lượng từ quá trình oxy hóa

các hợp chất hữu cơ thành CO2 và H2O [9]

1.3.2.2 Vi khuẩn cố định nitơ ky khí

Nhiều loại thuộc giống Clostridium có khả năng cố định nitơ không khí: Cl

pastuerianum, Cl acetobutylicum, Cl felsineum Chúng thuộc một nhóm phân loại

nhưng khác nhau về đặc điểm hình thái sinh học và sinh lý sinh hóa học Cl

pasteurianum có khả năng đồng hóa nitơ phân tử mạnh mẽ nhất Tế bào là loại trực

khuẩn khá lớn, dài 1,5 – 8 µm và rộng 0,8 – 1,3 µm Anton Hartmann (2006), B-R Chandrasekar 2005 Đây là nhóm dị dưỡng hóa năng lượng hữu cơ, các nguồn hữu

cơ chúng sử dụng: monosaccarit, disaccarit và một số polysaccarit nhiều rượu, các axit hữu cơ trong đó bao gồm các hợp chất thơm

1.4 Công nghệ nano và ứng dụng của công nghệ nano trong nông nghiệp

Công nghệ nano có tiềm năng lớn trong việc cách mạng hóa nông nghiệp và

hệ thống thực phẩm bằng sự thay đổi cách thức thực phẩm được sản xuất, chế biến, bảo quản, đóng gói, vận chuyển và tiêu thụ Áp dụng những nguyên tắc cơ bản của công nghệ nano vào trong khoa học nông nghiệp nhằm mục đích phát triển những quy trình và sản phẩm, phân phối nguyên liệu đầu vào, thúc đẩy năng suất mùa vụ

mà không gây ảnh hưởng đến môi trường xung quanh Công nghệ nano ứng dụng trong nông nghiệp có tác dụng tăng cường hiệu quả sử dụng cho các yếu tố đầu vào như giống, phân bón, thuốc diệt cỏ, thuốc trừ sâu Công nghệ nano có thể mang đến lợi ích đột phá trong trồng trọt, chăn nuôi, quản lý chất thải nông nghiệp, đất đai và loại bỏ ô nhiễm nguồn nước Trong hầu hết các nước APO (Asiaa Productivity Organization – Tổ chức Năng suất Châu Á), việc ứng dụng công nghệ nano trong nông nghiệp là một phương pháp mới rất được quan tâm hiện nay

1.4.1 Tình hình nghiên cứu trên thế giới

Những thập kỷ gần đây trong chăn nuôi và trồng trọt ngày càng có xu hướng thay thế thành phần vi lượng dưới dạng muối vô cơ hoặc phức chelat bằng các chế phẩm thế hệ mới trên cơ sở các hạt nano Kết quả nghiên cứu ứng dụng vi lượng trông nông nghiệp trên thế giới đã chỉ ra rằng việc sử dụng trực tiếp muối kim loại hoặc phức chelat của chúng bị hạn chế bởi liều lượng tối đa cho phép và nguy cơ gây ô nhiễm đất và môi trường do phải sử dụng liều lượng cao [17]

Việc sử dụng các nguyên tố vi lượng dưới dạng hạt kích thước nano (dưới

100 nm) để đưa vào cây trồng đã bắt đầu được nghiên cứu Kết quả bước đầu cho thấy các chỉ số sinh lý, sinh hóa và năng suất của sản phẩm trồng trọt được tăng lên đáng kể so với các chế phẩm phân vi lượng dạng muối kim loại hoặc chelat của

chúng Một số công trình đề cập tới việc sử dụng các hạt oxit kim loại có kích thước nano để xử lý hạt giống hoặc làm phân bón lá [45];[47] Berahmand và cộng sự đã

sử dụng các hạt bạc kích thước nhỏ để kích thích tăng trưởng cho mầm cây ngô bằng cách phun tưới dung dịch keo bạc (kích thước ~20 nm) với lượng bạc 40 g/ha, cùng với sự trợ giúp của các thỏi nam châm cường độ 70 gaus được áp vào mỗi gốc cây non Kết quả thu hoạch cho thấy tỷ phần tổng khối lượng bắp tăng lên đến 41,3

% so với 32,4 % ở mẫu đối chứng, và hiệu suất thu hoạch 24,3 tấn/ha so với đối chứng 19,8 tấn/ha (khối lượng khô)

Lu và cộng sự, năm 2002 nghiên cứu tác dụng của hỗn hợp hạt SiO2 và TiO2làm tăng sức nảy mầm của hạt giống cây đậu [35] Afshar và cộng sự, năm 2010 theo dõi tác dụng của phân bón lá chứa các loại kim loại có kích thước nano đối với quá trình phát triển của cây đậu đũa trong điều kiện thời tiết khô hạn Zhu và cộng

sự khảo sát quá trình hấp thu, vận chuyển và tích lũy các hạt oxit sắt trong cây bí ngô [53] Sah và cộng sự khảo sát ảnh hưởng của các hạt kim loại lên sự nảy mầm của hạt xà lách và quần thể vi sinh vật trong đất trồng [47] Ảnh hưởng của các hạt

ZnO tới tốc độ phát triển của hạt giống Vigna radiata, Cieer arietinum và cây lạc đã

được nghiên cứu [48];[26] Theo đó, các ống cacbon siêu nhỏ đơn lớn (SWCNTS) hoạt động như một hệ vận chuyển thông minh trong cây và có thể xâm nhập qua cả lớp vỏ dầy của hạt giống để tác động lên quá trình nảy mầm và sinh trưởng của cây Trong nghiên cứu của Prasat và cộng sự sau khi củ lạc giống được xử lý bằng dung dịch huyền phù nano ZnO (kích thước hạt 25 nm), sản lượng lạc thu hoạch đã tăng 34% so với trường hợp xử lý bằng dung dịch sunfat Zn chelate hóa có cùng nồng độ là 1000 mg Zn/L Ngoài ra, các tác giả trên còn sử dụng dung dịch kẽm oxit và chelate sunfat kẽm để phun lên lá cây lạc với nồng độ ZnO và chelate kẽm tương ứng là 2 g/15 L và 30 g/15 L (tính theo nguyên tử Zn) Cơ chế tác dụng của các hạt ZnO lên quá trình phát triển của cây được cho là các hạt ZnO sau khi xâm nhập qua lớp vỏ của hạt giống đã thêm độ xốp mao quản trên lớp vỏ, dẫn đến làm tăng khả năng hấp thụ các chất dinh dưỡng

Savithramma và cộng sự đã nghiên cứu ảnh hưởng của các hạt nano bạc lên sự

nảy mầm của loài thực vật Borswellia ovalifoliolata là một loài thực vật đặc hữu

đang có nguy cơ bị tuyệt chủng Kết quả nghiên cứu cho thấy rằng nano bạc ở nồng

đồ 4 mg/l giúp tỷ lệ nảy mầm của hạt đạt trên 95%, nó đẩy nhanh tốc độ nảy mầm đồng thời giúp cho cây hút nước và dinh dưỡng thông qua vỏ hạt được thuận lợi hơn [48] Sahandi và cộng sự cũng sử dụng nano bạc ở mức 20 – 60 ppm để thay nitrat bạc, vì sử dụng nitrat bạc ở mức 100 – 300 ppm sẽ làm giảm sinh khối của thân và kích thước của hoa

Các nghiên cứu đã nêu trên cho thấy nồng độ hạt có kích thước nano được sử dụng để kích thích hạt giống nảy mầm hoặc làm phân bón lá thường còn tương đối cao, do đó có khả năng gây ô nhiễm cho đất trồng và để lại dư lượng sau cho những

vụ thu hoạch tiếp theo

Nhằm giảm thiểu tối đa ảnh hưởng của các chất vi lượng lên chất lượng canh tác, Churilov và cộng sự đã đề xuất một phương pháp hoàn toàn khác biệt, dựa trên việc sử dụng năng lượng bề mặt của các hạt kim loại siêu mịn (còn gọi là các hạt siêu phân tán – SPT, hay hạt nano) để kích thích quá trình nảy mầm của hạt giống trước khi gieo Cơ sở của phương pháp này là các hạt nano kim loại được xem như những hạt năng lượng, có khả năng tác động kích thích các tổ chức bên trong tế bào trong quá trình phát triển của thực vật hoặc động vật [44]; [32] Đối với thực vật –

đó là kích thích hạt giống trước khi gieo trồng, còn đối với động vật đó là kích thích các tâm hoạt động của các enzyme khác nhau [44] Cách tiếp cận đó cho phép sử dụng các liều lượng cực thấp của bột kim loại kích thước nano để kích thích hạt giống trước khi gieo trồng và sản phẩm nuôi truồng, sau đó được phun vào khẩu phần thức ăn chăn nuôi để tăng sản lượng và chất lượng sản phẩm thịt

Các hạt nano kim loại được duy trì dưới dạng siêu phân tán nhờ bức xạ sóng siêu âm có năng lượng bề mặt lớn với tính chất hóa – lý – sinh hết sức đặt biệt, khác

xa với khi kim loại ở khối lượng lớn Theo Pavlov và cộng sự [44], bột nano kim loại bình thường thực tế không thể hiện hoạt tính sinh học mà chỉ khi được siêu âm

trở thành hạt siêu phân tán trong dung dịch nước chúng mới có hoạt tính sinh học Tác dụng siêu âm làm xuất hiện các tác nhân có hoạt tính cao trong dung dịch nước, có khả năng tham gia trực tiếp vào các phản ứng diễn ra bên trong tế bào hoặc làm chất xúc tác cho các phản ứng đó Ví dụ, trong hệ dung dịch chứa các hat nano sắt kim loại, sau khi siêu âm có thể tìm thấy các thành phần có hoạt tính cao như Fe2+, Fe3+, O*, 1O2,

H2O2, HO*… Chính nhờ những thành phần có hoạt tính cao này có khả năng tác động kích thích các tổ chức bên trong tế bào của hạt trong quá trình nảy mầm Như vậy, xử

lý hạt giống trước khi gieo trồng bằng các hạt kim loại kích thước nano có thể làm tăng hàm lượng các chất có hoạt tính sinh học trong cây do chúng tham gia vào thành phần các enzyme hoặc hoạt hóa chúng Đồng thời, mức độ tiêu hao hạt siêu phân tán cực thấp, không vượt quá 80 mg đối với Feo và Cuo và 1000mg đối với Coo cho một ha đất trồng nên không để lại dư lượng trong đất sau mỗi vụ thu hoạch

Nhằm nâng cao sản lượng và chất lượng của hai loài cây ngô và cải dầu Churilov và cộng sự đã xử lý hạt giống của chúng với các hạt nano sắt kim loại SPT [17] Trong điều kiện trồng ngoài đồng ruộng độ ẩm tổng đất giữ vai trò hết sức quan trọng, vì vậy để có sản lượng thu hoạch cao trong điều kiện thời tiết bất thuận người ta phải chọn giống cây có khả năng chịu khô hạn tốt nhất Trong các thí nghiệm của mình, tác giả đã chọn giống ngô lai Katrina CB có khả năng chống chịu khô hạn kém nhất Sản lượng thu hoạch của giống ngô này trong điều kiện khô hạn

đã tăng 2 lần so với đối chứng Kết quả thu được trên cây cải dầu là diện tích và khối lượng lá của chúng tăng 27% và 28% tương ứng, tỷ lệ nở hoa tăng trên 50% so với đối chứng, hiệu quả kinh tế tăng trên 75% tong khi ở mẫu đối chứng là 39% Trong một nghiên cứu tác dụng của bột nano sắt lên sinh trưởng và phát triển của cây trồng đã được thực hiện bởi Churilov và cộng sự cho thấy sua khi xử lý hạt giống ngô bằng hạt nano kim loại, khả năng này mẩm của hạt tăng, nhờ vậy làm tăng năng suất thu hoạch từ 25,5 – 32,1 % so với đối chứng, đồng thời tăng một số hoạt chất sinh học lên đáng kể: axit ascorbic tăng từ 24 – 37%, carotene: 23 – 50 %, cacbohydrat: 25 – 50 %, trong khi hàm lượng của kim loại này trong đất không bị thay đổi

Theo Kyцкиp và cộng sự, sau khi hạt ngô và hướng dương được xử lý với hạt

Co nano trước khi gieo trồng, sản lượng ngô tăng 24,4 % và hàm lượng vitamin A tăng 32,8 %, trong khi đối với hướng dương sản lượng hạt tăng 16,9 %, hàm lượng protein và dầu tăng tương ứng là 45% và 8,6 %

Việc đưa các thành phần như dolomit, zeolite, than hoạt tính vào đất để canh tác có thể làm giảm hàm lượng kim loại nặng trong cây trồng xuống 2-3 lần nhưng khối lượng cần đưa vào thường rất lớn, khoảng 20-40 tấn/ha, vì vậy gây ảnh hưởng đáng kể đến chất lượng đất Trong khi đó, nếu xử lý hạt giống trước khi gieo với các hạt sắt kim loại siêu mịn thì lượng kim loại nặng đi từ đất vào cây trồng được giảm tới 40% vì các hạt sắt có khả năng hấp thu mạnh trên lớp vỏ hạt giống, do đó cản trở kim loại nặng xâm nhập vào bên trong hạt giống

Xử lý hạt giống một số cây cho dầu như Brassica spp và Linum usitatissinum

L bằng các hạt Feo có kích thước nano ở liều lượng thấp, từ 10 ÷ 20 mg/ha, đã tăng sản lượng thu hoạch lên trên 4% Tuy nhiên, khi liều lượng hạt siêu mịn tăng lên trên 30 mg/ha thì quá trình nảy mầm bắt đầu bị ức chế và ảnh hưởng xấu đến quá trình phát triển của cây Riêng đối với cây dầu lành, ở liều lượng 60 mg/ha, sản lượng thu hoạch tăng lên đến 12% Hiệu quả tác động của các hạt kim loại siêu mịn đối với các loại cây cho dầu tăng lên mạnh mẽ nhất trong điều kiện khô hạn

Các hạt siêu phân tán có hoạt tính sinh học cao bao gồm các nguyên tố Fe, Co,

Cu, Zn, Mo, Mn và một số khác, trong đó 3 nguyên tố đầu có chức năng sinh học đặc biệt quan trọng đối với quá trình phát triển của sinh vật Những nghiên cứu trên đây cho thấy công nghệ nano có tiềm năng rất lớn trong nghành nông nghiệp Tuy nhiên, ảnh hưởng của nó đến môi trường và chất lượng của những sản phẩm nông nghiệp đang còn là vấn đề cần nghiên cứu kỹ hơn Vật liệu nano với kích thước nhỏ, dễ dàng tham gia vào các phản ứng hóa học có khả năng tạo ra các hợp chất mới với các tính chất chưa được biết Vì vậy, ngoài những đặc tính ưu việt của hạt nano thì tác động tiêu cực của chúng cũng phải được quan tâm nghiên cứu

Tuy có nhiều nghiên cứu khẳng định vai trò của các nano vi lượng đến năng suất cây trồng, nhưng cũng không ít quan ngại về ảnh hưởng của chủng đến khả năng sinh trưởng phát triển của cây [23]; [40]; [33]; [18] và vi sinh vật đất, vi khuẩn

Rhizobium, Bradyzhizobium … Sự có mặt của các hạt nano ZnO ảnh hưởng đến sự

tăng trưởng của của cây họ đậu ở các nồng độ nano khác nhau là khác nhau Hiệu quả tối đa được tìm thấy ở 20 ppm đối với cây đậu Vigna radiata và 1 ppm cho cây con (Cicer arietinum) Ngoài nồng độ này, tăng trưởng chồi, rễ của cây bị ức chế nhẹ dưới 5% [43] Ảnh hưởng của các nano ZnO và TiO cũng ảnh hưởng đến khả năng phát triển của cây họ đậu, khả năng cố định đạm của chúng và vi khuẩn cộng sinh cây họ đậu cũng được khảo sát Nano ZnO ở nồng độ thấp có tác dụng tốt tới khả năng cố định nitơ tuy nhiên nấu kéo dài thì tác dụng này giảm Ở nồng độ cao

10 ppm nano ZnO làm giảm hoạt động của nitrogenase của cây đậu tương [42] Khả

năng sống sót của vi khuẩn Bradyrhizobium japanicum trên hạt đậu tương cũng

được cải thiện khi có mặt của nano Fe ở điều kiện khô và ở nhiệt độ thấp Nano Fe

ở nồng độ 80 và 100 ppm không ảnh hưởng đến khả năng tồn tại của vi khuẩn [37]

1.4.2 Tình hình nghiên cứu tại Việt Nam

Các nguyên tố vi lượng, trong đó có Fe, Cu và Co đã được đưa vào ứng dụng rộng rãi trong chăn nuôi và trồng trọt, chủ yếu dưới các dạng muối vi lượng hoặc dưới dạng các phức chelate Trong trồng trọt, các nguyên tố vi lượng thường được bón vào đắt hoặc phun lên lá Tuy nhiên, cho đến nay chưa tìm thấy công bố nào sử dụng các kim loại kích thước nhỏ để điều hóa quá trình sinh tưởng của cây trồng Tại Viện Công nghệ môi trường (Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam), từ năm 2010 đã thực hiện những nghiên cứu thăm dò về tác dụng của các hạt kim loại kích thước nano đến quá trình nảy mầm và sinh trưởng của cây ngô Qua quá trình hợp tác với các nhà khoa học Nga, các cán bộ của viện CNMT đã nắm được những khâu mấu chốt trong xử lý hạt giống trước khi gieo So với đối chứng,

tỷ lệ nảy mầm tăng 14%, diện tích bề mặt lá tăng 22,2 %, khối lượng lá tăng 25%, khối lượng rễ tăng 27,3 %, độ dài rễ tăng 28,3 % và độ dài thân tăng 17,2 % Các kết quả thu được trên ngô cũng tương tự kết quả của nước ngoài

1.5 Ảnh hưởng của các hạt nano sắt, đồng, coban đến sinh trưởng và phát triển của cây đậu tương

1.5.1 Ảnh hưởng của coban

Nguyên tố coban có mặt trong các bộ phận khác nhau của cây với hàm lượng khác nhau, dao động trong khoảng 0,01 – 0,60 mg/kg sinh khối khô Phần coban lớn nhất tập trung trong rễ, sau đó là các bộ phận phía trên rễ như thân và lá, trong khi hàm lượng coban thấp nhất được tìm thấy trong hạt Coban được cây hấp thụ ít hơn

từ đất kiềm tính so với đất không kiềm Coban hỗ trợ quá trình tổng hợp diệp lục, hạn chế sự phân hủy của nó trong tối, kích thích quá trình phát triển của cây Coban tham gia vào quá trình trao đổi đạm do nó được tìm thấy nhiều trong các phức protein trong ty thể của tế bào Coban được coi là một yếu tố có lợi cho thực vật bậc cao mặc dù chưa tìm ra bằng chứng về vai trò trực tiếp của coban trong quá trình chuyển hóa của cây Ngoài ra coban còn là nguyên tố thiết yếu trong hoạt động quang hợp của thực vật bậc thấp thư vi tảo [24] Đối với các loại đậu, coban là một nguyên tố cần thiết cho sinh vật đặc biệt là vi sinh vật cố định nitơ trong khí quyển, thiếu hụt coban làm giảm hiệu qủa của sự cố định nitơ Riley và Dilworth cho thấy tầm quan trọng của coban trong sự tăng trưởng và phát triển của cây họ đậu chủ yếu

là do ảnh hưởng của coban lên hoạt động và số lượng của các chủng vi sinh vật cố

định nitơ trong khí quyển như Azotobacter và Nitrobacter

Việc đưa Co vào hỗn hợp dinh dưỡng đã tăng sản lượng hành, rau xà lách, cà chua, tăng lượng axit ascorbic tích lũy trong cây hành cũng đã được công bốSự có mặt của Coban cũng làm tăng hoạt tính của một số enzyme như catalaza, peroxydaza, polyphenoloxidaza (O’Connor, 1986)

Gad và cộng sự đã tiến hành nghiên cứu ảnh hưởng của coban lên sự sinh trưởng và năng suất của cây đậu tương ở các dải nồng độ từ 4 – 20 ppm lên lá Kết quả cho thấy coban là một yếu tố rất quan trọng đối với sự sinh trưởng của cây đậu tương, ở nồng độ 12 ppm coban giúp tăng số lượng và chất lượng dầu so với cây không được bổ sung coban Các chỉ tiêu về hình thái như số nhánh, số lá, chỉ

số diện tích lá, chiều dàn thân, rễ đều cao hơn so với đối chứng Ngoài ra coban còn phát huy tác dụng tốt khi gặp các điều kiện bất lợi của môi trường như nhiệt

độ cao, hạn hán và đất bị nhiễm mặn [39] Coban là một yếu tố cần thiết cho sự tổng hợp vitamin B1 ở trong dinh dưỡng của con người và động vật Theo tác giả, nồng độ coban cung cấp hằng ngày vào cơ thể con người có thể lên tới 8 ppm thông qua thức ăn và nước uống mà không có hại cho sức khỏe Kaliyamoorthy và cộng sự, nghiên cứu ảnh hưởng của sự có mặt của coban trong đất trồng đậu tương

ở các mức 50, 100, 150, 200, 250 mg/kg đất Kết quả cho thấy ở ngưỡng nhỏ hơn

50 mg/kg đất có bổ sung coban đã làm tăng số lượng nốt sần ở rễ đậu tương, là nơi

vi khuẩn nốt sần sống cộng sinh, đóng vai trò chính trong quá trình cố định đạm từ không khí cung cấp cho cây Nhưng khi nồng độ coban trong đất cao hơn mức 50 mg/kg đất sẽ làm ức chế sự sinh trưởng và phát triển của cây, giảm số lượng nốt sần và huyết sắc tố leg-haemoglobin Như vậy, tác động của coban cần phải được kiểm soát để phù hợp [29]

1.5.2 Ảnh hưởng của sắt

Sắt là một trong những nguyên tố thiết yếu cho sự tăng trưởng của thực vật và

có vai trò rất quan trọng trong hoạt động sống của cây Sắt là thành phần của một số protein đóng vai trò chìa khóa trong hệ thống enzymee của cây Đó là các enzymee catalase, peroxidase và một vài cytochrome, cytochrome có tác dụng đối với hô hấp của tế bào sống Ngoài ra, sắt còn cần thiết cho quá trình sinh tổng hợp và duy trì chất diệp lục tố trong cây, có vai trò chủ yếu trong sự chuyển hóa RNA và giữ vai trò quan trọng trong quá trình quang tổng hợp, làm giảm nồng độ NO2-, SO42- trong cây và tăng đồng hóa nitơ [10]

Trong cây trồng sắt tồn tại ở dạng axit hoặc ion và được hấp thụ qua hai con đường, hoặc là thông qua sắt hóa trị hai hoặc là ở dạng sắt chelate Hàm lượng sắt trong cây khác nhau rất đáng kể, tùy thuộc vào giống và tuổi của cây trồng Ví dụ, cây họ đậu sẽ có hàm lượng sắt cao hơn so với cỏ và cây trong các bộ phận già sẽ

có hàm lượng sắt cao hơn so với các bộ phận non Hàm lượng sắt trong cây trồng giao động trong khoảng 50 – 100 ppm Sắt là nguyên tố ít di động trong cây và khi

thiếu sắt, các bộ phận non của cây bị ảnh hưởng trước khi đó các bộ phận già của cây ít bị ảnh hưởng hơn Hàm lượng sắt cao nhất khi cây còn non sau đó giảm dần theo tuổi của cây Sắt trong cây bị ảnh hưởng bởi tương tác nhiều nguyên tố khác nhau Như hàm lượng lân, canxi, magie và kali cao sẽ hạn chế khả năng vận chuyển sắt trong cây Ngoài ra, Fe trong cây còn tương quan nghịch với các kim loại nặng như đồng, coban, crom, niken, và kẽm trong cây Mặc dù sắc là nguyên tố vi lượng không thể thiếu đối với cấy trồng nhưng hàm lượng sắt quá nhiều sẽ dẫn đến gây ngộ độc cho cây và nếu thiếu sắt quá trình sinh tổng hợp một số chất trong cây sẽ bị đình trệ, làm giảm khả năng hút kali, cây kém phát triển

Hiện nay, người dân thường bổ sung sắt cho cây trồng bằng cách bón sắt vô

cơ, phức sắt vào đất hoặc phun dung dịch sắt sunfat, phức sắt – chelate qua lá hoặc hòa tan phân sắt vào nước để tưới cho cây nhằm khắc phục tình trạng thiếu sắt ở cây Tuy nhiên, những cách này mang lại hiệu quả không cao vì sắt ở những dạng trên dễ bị chuyển hóa và để lại lượng tồn dư kim loại trong đất cao làm ô nhiễm đất, giảm độ phì của đất Do đó, các nhà khoa học đã bắt đầu nghiên cứu tác động của hạt nano sắt lên cây trồng để khắc phục vấn đề này

Omid và cộng sự đã tiến hành nghiên cứu cho thấy tác dụng vượt trội của nano sắt chelate trong tăng trưởng của cây cải xoong, làm tăng hoạt động của enzymee peroxidase và tinh dầu của cây cải xoong [41] Feizi và cộng sự khi nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ nano Fe2O3 và hạt Fe2O3 đối với sự tăng trưởng sớm của lúa mì đã tìm ra nồng độ 100 ppm của nano Fe2O3 làm tỷ lệ nảy mầm tăng cao nhất và cao hơn đối chứng 41 %, cho sinh khối rễ cao nhất và làm giảm thời gian nảy mầm trung bình của hạt 38,5 % so với đối chứng

Dhoke và cộng sự nghiên cứu ảnh hưởng của hạt nano oxit FeO lên sự tăng trưởng của đậu xanh bằng phương pháp phun lá Khi phun nano oxit sắt FeO có kích thước 100 nm với nồng độ 50 ppm đã có ảnh hưởng lớn tới sinh trưởng của đậu xanh, làm tăng sinh khối tươi của rễ 30,5 %, thân 50,44 % tăng sinh khối khô của rễ lên 68,16 %, của thân 47,61 % và chiều dài thân tăng 10,25 % so với đối chứng [21]

Liu và cộng sự cho rằng nano – Fe2O3 có thể thúc đẩy sự tăng trưởng và quang hợp của đậu phộng một cách đáng kể sau khi tiến hành nghiên cứu đánh giá tác dụng của nano oxit sắt khi phối hợp với phân bón hữu cơ và axit humic đối với

sự hấp thụ sắt và tăng trưởng của đậu phộng được thực hiện trên môi trường thạch anh – cát trong nhà kính Kết quả cho thấy chất diệp lục trong lá của đậu phộng tăng lên và nano – Fe2O3 khi phối hợp với các loại phân hữu cơ có thể cải thiện sự dịch chuyển của sắt trong cây trồng, làm sắt dễ di chuyển vào lá làm tăng đáng kể chất sắt trong lá [34]

1.5.3 Ảnh hưởng của đồng

Nguyên tố đồng cũng là một nguyên tố vi lượng rất cần thiết cho sự phát triển của cây, với hàm lượng dao động trong khoảng 3 – 15 mg/kg Vai trò sinh lý quan trọng bậc nhất của Cu là nó là thành phần chính trong phân tử ascorbinoxidaza Các hợp chất của đồng tham gia vào quá trình oxy hóa-khử, làm tăng cường độ hô hấp trao đổi protein và cacbon hydrat, tăng khả năng tích lũy tinh bột, axit ascorbic và làm giảm mức độ nhiễm bệnh của cây Bên trong cây, đồng tồn tại chủ yếu dưới dạng hóa trị hai, thường liên kết với các chất keo hữu cơ và vô cơ

và tạo phức bền vững với chất nguyên sinh và các thành phần protein trong đó Mặt khác, phần lớn lượng đồng (70%) tập trung trong lục lạp, ch phép dự đoán đồng có mặt trong các hệ enzymee của quá trình quang hợp

Theo Adhikari và cộng sự cho thấy ảnh hưởng lên các hạt nano kim loại bạc (NPAg, 35-40 nm) và đồng (NPCu, 2-3 nm) đến khả năng nảy mầm của hạt giống trên một số loại cây lương thực và rau quả xanh, bằng phương pháp phân tán đều các hạt nano trong nước với các nồng độ khác nhau, khi đó hạt nano đóng vai trò như các nguyên tố vi lượng cung cấp dinh dưỡng, khoáng để nâng cao năng suất cây trồng Hiệu ứng kích thích được biểu hiện rõ nhất ở khả năng chống chịu nấm bệnh và thời tiết, cũng như năng suất cây trồng với hàm lượng nano được sử dụng cực thấp: NPCu (10-17 mg/l) NPAg (10-13 mg/l) Kết quả thử nghiệm trên cây ngũ cốc cho thấy với nồng độ dung dịch nano Cu: 32x10-8 mg/l thì năng lực nảy mầm của hạt giống tăng 39,7 %

Mahajan và cộng sự nghiên cứu tác dụng của các hạt nano CuO (20 – 50 nm) lên quá trình nảy mầm và phát triển của cây đậu tương, đậu xanh ở các nồng độ khác nhau 0, 5, 15, 30, 45, 60, 100, 200, 400, 600, 800 mg/L Kết quả cho thấy nano CuO ảnh hưởng lên chiều dài thân, chiều dài rễ Sự tăng trưởng của cây đạt hiệu suất cao nhất tại nồng độ 100 ppm (NP) đối với cây đậu tương và 60 ppm (NP) đối với cây đậu xanh Kết quả nghiên cứu cũng cho thấy khả năng ức chế hoàn toàn cây đậu tương khi sử dụng nồng độ nano CuO tại các nồng độ: 800 ppm; 1000 ppm;

1500 ppm; 2000 ppm [43]

Tại Việt Nam, kết quả phân tích 1554 mẫu đất ở miền bắc cho thấy có đến 75% số mẫu có hàm lượng đồng tổng số 0,001–0,01 % Cu và 23% chưa 0,01–0,03

% Cu Một nghiên cứu khác của Nguyễn Vy và Trần Khải cho thấy các loại đất phù

sa song Thái Bình, chiêm trũng và chua mặn, mặn trung tính đều có hàm lượng đồng rất thấp, ở mức vệt Do vậy một biện pháp để nâng cao năng suất cây trồng là cung cấp đồng đủ cho cây trồng có thể sử dụng được Ở Việt Nam có nhiều nghiên cứu liên quan tới bón đồng vào trong đất Pham Đình Thái và cộng sự bón phân đồng vào trong đất đã làm tăng năng suất lúa 5 – 10 % (trên nền NPK thấp) và 11 –

16 % (trên nền NPK cao) Nghiên cứu về hiệu lực đồng, kẽm, bo với cây bắp cải của Đặng Văn Hồng cho kết quả bón phân đồng bằng cách ngâm hạt với dung dịch CuSO4 0,005 % và kẽm, bo đã làm tăng năng suất 13,9 % so với đối chứng Nguyễn Quang Vinh và cộng sự cho thấy ngâm hạt giống đậu xanh trong dung dịch CuSO4nồng độ 0,025 % trong 1 giờ đã làm tăng năng suất 39,5 % so với không xử lý

Chương 2 NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 Nội dung nghiên cứu

Để đạt được mục tiêu của đề tài cần nghiên cứu các nội dung sau:

- Phân lập các chủng vi khuẩn cố định đạm Rhizobium trên nốt sần rễ cây đậu

tương tại Hà Nội và Thanh Hóa Việt Nam

- Nghiên cứu đặc điểm sinh học và định danh một số chủng vi khuẩn cố định

đạm Rhizobium lựa chọn

- Nghiên cứu ảnh hưởng của nano kim loại Fe ở các nồng độ đến sinh trưởng và

sinh tổng hợp polysacarit của vi khuẩn Rhizobium phân lập trên cây đậu tương

- Nghiên cứu ảnh hưởng của nano kim loại Cu ở các nồng độ đến sinh trưởng và

sinh tổng hợp polysacarit của vi khuẩn Rhizobium phân lập trên cây đậu tương

- Nghiên cứu ảnh hưởng của nano kim loại Co ở các nồng độ đến sinh trưởng và sinh tổng hợp polysacarit của vi khuẩn Rhizobium phân lập trên cây đậu tương

- Nghiên cứu ảnh hưởng của các nano kim loại Fe, Cu và Co đến khả năng sinh trưởng của cây đâu tượng trong điều kiện phòng thí nghiệm

2.2 Đối tượng và địa điểm nghiên cứu

2.2.1 Đối tượng nghiên cứu

- Mẫu nốt rễ đậu tương được thu nhận từ Thanh trì, Hà Nội và Thanh Hóa

- Vật liệu nano Fe, Cu, Co có dạng hình cầu, có kích thước 20-40 nm Hiện tại cung cấp tại Viện Môi trường, Viện Hàn lâm Khoa học Công nghệ Việt Nam

- Giống đậu tương ĐT 26 cung cấp bởi Trung tâm Nghiên cứu và Phát triển Đậu đỗ, Viện Cây lương thực và Cây thực phẩm

2.2.2 Địa điểm nghiên cứu

Phòng thí nghiệm Vi sinh vật đất Viện Công nghệ Sinh học Viện Hàn lâm Khoa học Công nghệ Việt Nam

2.2.3 Thời gian nghiên cứu

Đề tài thực hiện từ tháng 11/2016 đến tháng 11/2017

2.2.4 Thiết bị và hóa chất nghiên cứu

Các hóa chất: Glucose (Merk, Đức), Manitol (Bio Basic, Canada), Cao nấm men (Merk, Đức) và các hoá chất thông dụng khác (Trung Quốc)…

- Thiết bị và dụng cụ nghiên cứu:

+ Đĩa petri, micropipette, ống nghiệm, que cấy,…

+ Box cấy vô trùng

+ Nồi khử trùng

+ Máy lắc

+ Máy quang phổ và một số thiết bị phòng thí nghiệm khác

2.3 Phương pháp nghiên cứu

2.3.1 Phương pháp phân lập

2.3.1.1 Phương pháp thu và bảo quản mẫu

Tại thời điểm cây đậu tương ra hoa rộ tại ruộng, tổng 7 mẫu (7 hốc) mỗi hốc

3 cây ngẫu nhiên vào 1 túi và đánh số Mỗi mẫu được ngâm vào 1 bình nước khác nhau, đến khi đất bám ở rễ được tách ra hoàn toàn, rửa lại mỗi mẫu 2 hoặc 3 lần bằng nước sao cho sạch hoàn toàn Nốt sần được tách khỏi rễ và bảo quản ở 4oC

2.3.1.2 Phương pháp khử trùng bề mặt nốt sần

Phương pháp khử trùng bề mặt theo Somasegaran và Hoben năm 1994 có cải tiến Khử trùng bề mặt nốt sần để loại bỏ các vi sinh vật trên bề mặt bằng cách ngâm vào các dung dịch rửa như Etanol 70% trong 30 giây và NaClO trong 30 giây (theo Somasegaran và Hoben năm 1994: Etanol 70% trong 1 phút và NaClO trong 3 phút) Cụ thể các bước khử trùng bề mặt như sau:

Lắc nốt sần trong 10 ml nước vô trùng 30 giây, hút bỏ dịch,

Bổ sung 5 ml Etanol 70%, lắc 30 giây, hút bỏ dịch,bổ sung 5 ml H2O, lắc 30 giây, hút bỏ dịch,bổ sung 5 ml NaClO, lắc 30 giây, hút bỏ dịch, bổ sung 5 ml H2O, lắc 30 giây, hút bỏ dịch,bổ sung 5 ml H2O, lắc 30 giây, hút bỏ dịch (lặp lại 3 lần)

2.3.1.3 Phương pháp phân lập vi khuẩn từ nốt sần đậu tương

Nốt sần đậu tương sau khi khử trùng bề mặt được nghiền trong H2O và pha loãng đến 10-5 Trang 100 µl các nồng độ 10-3,10-4 và 10-5 trên đĩa môi trường YEMA-CR Ủ các đĩa đã cấy vào 28°C và kiểm tra 24 giờ một lần để quan sát sự

phát triển của Rhizobia và vi khuẩn khác trên đĩa thạch Sau khi ủ trong 2-5 ngày ở

nhiệt độ 28°C, các khuẩn lạc đơn đã được chọn và làm sạch trên môi trường YEMA-CR

2.3.2 Phương pháp nghiên cứu đặc điểm sinh học

Hình thái khuẩn lạc của các chủng Rhizobium sp được kiểm tra trên môi

trường YEMA-CR và kiểm tra khả năng sinh trưởng nhanh hay chậm bằng thử nghiệm Bromothymol Blue theo Vincent (1970) Phản ứng nhuộm Gram được thực

hiện theo Somasegaran và Hoben (1994) Rhizobium sẽ sinh trưởng kém hoặc

không sinh trưởng trong 24 giờ (Gibbs and Shapton, 1968)

Thử nghiệm môi trường kiềm Hofer: Cấy chủng Sinorhizobium sp TT14 trong

môi trường kiềm Hofer (YEMA: 10g/l Mannitơl, 0.5g/l K2HPO4, 0.2g/l MgSO4, 0.1g/l NaCl, 0.5g/l yeast extract, 20g/l Agar, pH 11), Sau khi ủ 28ºC trong 72 giờ,

Rhizobium không mọc trên môi trường này (Hofer, 1935)

Thử nghiệm Keto-lactose: là thí nghiệm được sử dụng rộng rãi để phân biệt

Rhizobia với các vi khuẩn khác Chủng Sinorhizobium sp TT14 được nuôi trên

môi trường Keto-lactose (10g/l Lactose, 0.5g/l K2HPO4, 0.2g/l MgSO4, 0.2g/l NaCl, 1g/l Yeast Extract, 20/l Agar, pH 6.8-7) được ủ ở 28ºC trong 3-4 ngày Sau

đó đổ ngập thuốc thử Benedict và giữ ở nhiệt độ phòng trong 1-2 giờ Rhizobium không làm thay đổi màu sắc của dung dịch Benedict từ xanh sang vàng ở môi trường xung quanh khuẩn lạc [15]

Đánh giá khả năng sử dụng nguồn cacbon: Chủng Sinorhizobium sp TT14 được nuôi cấy trên môi trường YEMA thay nguồn đường D-Manitơl bằng các nguồn tương ứng: D-Glucose, L-Arabinose, D-Xylose, D-Manitơl, D-Fructose, D-Cellulose và Sucrose Kiểm tra sự sinh trưởng sau 3 ngày ở nhiệt độ 28ºC Môi

trường có D-Manitol được coi là đối chứng dương, môi trường không có đường là đối chứng âm

Đánh giá khả năng chịu mặn: Chủng Sinorhizobium sp TT14 được nuôi cấy

trên các môi trường YEM có chứa các nồng độ muối khác nhau (0.02% ,0.1%, 0.5%, 1.0%,1.5%, 2.0%, 2.5%, 5.0%,10%, 20% (w/v) NaCl Lắc 200 vòng/phút, ở 28ºC trong 24 giờ sau đó kiểm tra sự sinh trưởng (Hashem et al., 1998a)

Đánh giá khả năng sống ở môi trường acid và kiềm cao: Chủng

Sinorhizobium sp TT14 được nuôi cấy trên các môi trường YEM có pH khác nhau

(pH 3.0, 4.0, 5.0, 6.0, 7.0, 8.0, 9.0, 10.0) Lắc 200 vòng/phút, ở 28ºC trong 24 giờ sau đó kiểm tra sự sinh trưởng [13]

Đánh giá khả năng chịu nhiệt: Chủng Sinorhizobium sp TT14 được nuôi cấy

trên các môi trường YEMA ở các nhiệt độ 24ºC, 28ºC, 30ºC, 37ºC, 45ºC và 55ºC trong 72 đến 120 giờ và theo dõi sự sinh trưởng

Kiểm tra khả năng chuyển hóa nitrate thành nitrite: Chủng Sinorhizobium sp

TT14 được nuôi trong môi trường nitrate (5g/l Peptone, 3g/l Yeast Extract, 1g/l KNO3, pH 7.0) ở 30ºC, lắc 200 vòng/phút, sau 48 giờ, thử khả năng chuyển hóa bằng thuốc thử gồm acid Sulfanilic và Alpha-Naphthylamine Nếu dịch nuôi cấy chuyển sang màu đỏ là có sự chuyển hóa nitrate thành nitrite [49]

Kiểm tra khả năng phân hủy gelatin: để xác định khả năng sản xuất enzymee

gelatinase chủng Sinorhizobium sp TT14 được nuôi cấy trên môi trường dinh

dưỡng gelatin (5g/l Peptone, 3g/l beef extract, 12g/l gelatin), ở 30ºC, lắc 200 vòng/phút, sau 48 giờ Sau đó đặt ống nuôi cấy ở 4°C trong 30 phút, dịch nuôi cấy

có sản sinh enzyme gelatinase vẫn ở trạng thái lỏng và ngược lại [50]

Đánh giá khả năng phát huỳnh quang: được thực hiện bởi (King et al, 1954) [30] để xác định khả năng phát huỳnh quang của các chủng vi khuẩn Chủng

K2HPO4, 1.5g/l Glycerol, pH 7.0) ở 28oC trong 48 giờ Theo dõi dưới đèn U.V Thử

nghiệm này là một cách để xác định sự có mặt của vi khuẩn Pseudomonas [48]

2.3.3 Phương pháp tách chiết DNA tổng số và nhân gen bằng phản ứng PCR

Nuôi chủng Rhizobium trên môi trường YEMA-CR Sau 48h khuẩn lạc mọc

trên đĩa Bổ sung 5ml TE vào đĩa nuôi cấy, mix đều, thu toàn bộ sinh khối vào ống

Eppendorf (Một số chủng Rhizobium có màng polysaccarit phải phá màng bằng

cách ủ ở nhiệt độ 65oC trong 15 phút rồi đem ly tâm lạnh 4oC, 12.000 vòng/phút, loại bỏ dịch nhầy và thu sinh khối ở dưới đáy Nếu sinh khối vẫn còn màng polysaccarit, ủ 65oC thêm 15 phút rồi đem ly tâm lạnh 4oC, 12.000 vòng/phút, loại

bỏ dịch nhầy và thu sinh khối ở dưới đáy) Bổ sung 1ml TE, voltex, ly tâm 4oC, 12.000 vòng/phút trong 10 phút Loại bỏ dịch nổi (lặp lại 3 lần) Bổ sung 200 µl lyzozyme + 10µl protein K lắc đều trên máy lắc qua đêm Sau đó, ủ ở 65o

C trong 40 phút, cứ 10 phút invert đều 1 lần Sinh khối tan hết thành 1 thể đồng nhất Bổ sung 250µl SDS 20%, ủ ở 65oC trong 2 giờ, cứ 10 phút lấy ra invert đều Bổ sung dung dịch CTAB, ủ ở 65oC trong 3 phút sau đó đặt ngay đá 3 phút (lặp lại 3 lần) Bổ sung 250µl dung dịch CH3COONa 10%, Invert 5 phút Bổ sung thêm dung dịch (chloroform : isoamyl alcohol = 24 : 1) nồng độ 10%, tỷ lệ 1 : 1 với dung dịch Invert 30 phút Ly tâm lạnh ở 4oC, 12.000 vòng/phút trong 15 phút Hút dịch phân lớp phía trên chuyển sang ống ép mới Bổ sung isopropyl alcohol tỷ lệ 1:1 với dịch vừa hút, ủ trên đá hoặc tủ âm sâu 1 giờ, ly tâm 12.000 vòng/phút trong 10 phút, loại

bỏ dịch Bổ sung 500ml cồn 70%, ly tâm lạnh 12.000 vòng/phút trong15 phút Đổ dịch, quay khô sinh khối Bổ sung 10-50 µl H2O, thu được DNA tổng số Gen mã hóa 16S rRNA của chủng vi khuẩn được khuếch đại bằng phản ứng PCR từ DNA tổng số bằng cặp mồi 27f (5'-TAACACATGCAAGTCGAACG-3') và 1492r (5’-GGTTACCTTGTTACGACTT-3’) theo chu trình nhiệt: 94oC trong 5 phút, 30 chu trình (94oC trong 60 giây, 60oC trong 60 giây, 72oC trong 90 giây), 72o

C trong 10 phút, giữ mẫu ở 4oC

2.3.4 Phương pháp định danh chủng Rhizobium

Dựa vào các đặc điểm hình thái, đặc điểm sinh hóa và phân tích trình tự gen 16S rRNA Mức độ tương đồng gen 16S rDNA được phân tích dựa trên dữ liệu Ngân hàng gen của NCBI Độ tương đồng về trình tự được xác định và so sánh với

các trình tự khác được so sánh trên nhân hàng GenBank bằng BLAST

2.3.6 Phương pháp xác định định lượng polysaccharide bằng UV-VIS

Nguyên tắc: phương pháp quang phổ UV-VIS là phương pháp phân tích dựa trên việc đo độ hấp thụ bức xạ đơn sắc của dung dịch nghiên cứu ở bước sóng xác định trong vùng tử ngoại khả biến Đinh lượng polysaccharide dựa vào đặc tính tạo màu đặc trưng của các hợp chất thuộc polysaccharide với phenol trong môi trường

H2SO4 đặc sẽ cho ra màu vàng nhạt và đậm dần hơn

Cách tiến hành:

Vi khuẩn Sinorhizobium sp TT14 được nuôi trong môi trường YEM sau 32

giờ ở 30°C lắc 200 vòng/phút Ly tâm 12000 vòng/phút trong 20 phút, thu riêng phần dịch và sinh khối, Dùng pipet hút 1ml dung dịch nuôi cấy sau li tâm vào ống nghiệm chịu nhiệt và một mẫu trắng có chưa 1ml nước cất, một dãy chuẩn glucose được chuẩn bị cùng lúc có hàm lượng 20,40,60,70,80,90,100 μg glucose trong 1ml dung dịch

Để tất cả các ống đứng yên, thêm 1ml dung dịch phenol 5% lắc đều tất cả các ống Sau đó dùng pipet cho 5ml dung dịch acid sunfuric đậm đặc chảy theo thành ống nghiệm, lắc ống đồng thời để phản ứng xảy ra nhanh chống và đồng nhất Để yên trong 10 phút, lắc nhẹ và để trong bể ổn nhiệt ở 25-30ºC trong vòng 10 đến 20 phút trước khi đo