Khóa luận chuyên đề xây dựng tiêu chuẩn, Dược liệu Nhàu

Xây dựng tiêu chuẩn dược liệu Nhàu, Còn có tên là cây ngao, nhàu núi, giầu, noni,…Tên khoa học: Morinda citrifolia L. Cây Nhàu thuộc họ Cà phê , tác dụng của Nhàu Các tác giả Pháp Planta Med. 56 (1990) 430 nghiên cứu dịch nước rễ nhàu thí nghiệm trên chuột cho thấy có tác dụng giảm đau, an thần, gây ngủ. Nhân dân ta có dùng để sắc uống, để chữa đau lưng, chữa cao huyết áp. Quả Nhàu ăn với muối để làm thuốc điều kinh dễ tiêu, nhuận tràng, chữa cao huyết áp. Các nghiên cứu gần đây cho thấy Polysaccarid của quả có tác dụng kích thích miễn dịch phòng chống ung thư. Lá đắp chữa vết thương, mụn nhọt, làm chống lên sẹo, sắc uống chữa lỵ, chữa sốt và làm thuốc bổ. Ngoài cây Nhàu trong dân gian còn sử dụng một vài loài morida khác như dây đất, cây nhàu nước. Rễ nhàu nước dùng để trị giun sán. Ngoài ra rễ cây còn có đặc tính hạ huyết áp nhẹ. Yêu cầu chung cần đạt được tiêu chuẩn

TRƯỜNG ĐẠI HỌC TÂY ĐÔ

BỘ MÔN DƯỢC LIỆU – DƯỢC HỌC CỔ TRUYỀN

PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU DƯỢC LIỆU

XÂY DỰNG TIÊU CHUẨN

DƯỢC LIỆU NHÀU

Giảng viên hướng dẫn:

PGS.TS Trần Công Luận

ThS Đỗ Văn Mãi

DS Trì Kim Ngọc

SINH VIÊN THỰC HIỆN

Lê Nguyễn Thúy Hằng

Cần Thơ, năm 2018

MỤC LỤC

I ĐẶT VẤN ĐỀ 1

2.1 Tổng quan về dược liệu cây Nhàu 1

2.1.1 Tên gọi, vị trí phân loại 1

2.1.2 Mô tả cây 2

2.1.3 Phân bố và sinh thái 2

2.1.4 Bộ phận dùng và thu hái 3

2.1.5 Thành phần hóa học 3

2.1.7 Một số nghiên cứu về thành phần hóa học và hoạt tính sinh học 5

2.1.8 Tác dụng dược lý – tính vị, công dụng 6

2.1.9 Một số bài thuốc có dược liệu 7

2.2 Tiêu chuẩn chất lượng và phương pháp thử cho dược liệu 8

2.2.1 Nội dung của một tiêu chuẩn dược liệu 8

2.2.2 Yêu cầu chung cho một tiêu chuẩn dược liệu 9

Một tiêu chuẩn tốt cho dược liệu cần phải đáp ứng những yêu cầu sau: 9

2.2.3 Phương pháp khảo sát thực vật học 9

2.2.4 Phân tích sơ bộ thành phần hóa thực vật 10

III KẾT QUẢ THỰC NGHIỆM 14

3.1 Đặc điểm vi phẫu và soi bột 14

3.1.1 Cảm quan bột dược liệu 14

3.1.2 Vi phẫu 17

3.1.3 Soi bột 20

3.2 Phân tích sơ bột thành phần hóa thực vật 22

3.2.1 Chiết dịch chiết ether 22

3.2.2 Chiết dịch chiết cồn 25

3.3.3 Chiết dịch chiết nước 31

3.2.4 Định tính bằng sắc ký lớp mỏng 36

IV XÂY DỰNG TIÊU CHUẨN CHO DƯỢC LIỆU 38

4.1 Định danh 38

4.2 Mô tả bộ phận dùng 39

4.3 Đặc điểm vi phẫu – soi bột 39

4.3.1 Vi phẫu 39

4.3.2 Soi bột 39

4.4 Định tính 39

4.4.1 Thành phần hóa học 39

4.4.2 Sắc ký lớp mỏng 40

4.5 Độ ẩm 40

4.6 Bảo quản 40

4.7 Tính vị - công năng 40

4.7.1 Tính vị qui kinh 40

4.7.2 Công năng chủ trị 40

4.8 Cách dùng – liều dùng 40

V KẾT LUẬN 40

5.1 Thuyết minh tiêu chuẩn 40

5.1.1 Các chỉ tiêu kiểm nghiệm vi học 40

5.1.2 Chỉ tiêu định tính 41

5.1.3 Độ ẩm 41

5.1.4 Các chỉ tiêu khác 41

5.2 Kết luận 41

TÀI LIỆU THAM KHẢO 43

PHỤ LỤC 44

DANH MỤC CÁC KÍ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT

Kí hiệu chữ viết tắt Tiếng Anh Tiếng Việt

AO Antioxidant Trung hòa gốc tự doATP Adenosin triphosphat Năng lượng

FR Free Radical Gốc tự do

LDL Low-density lipoprotein Lipoprotein tỷ trọng thấp

MT-4 Tế bào nhạy cảm với suy

giảm miễn dịch ở người

NAA Naphthaleneacetic acid

DANH MỤC CÁC BẢNG

Bảng 1: Một số hoạt chất có hoạt tính sinh học trong cây Bảng 2: Giá trị Rf của các vết trên sắc ký

DANH MỤC CÁC HÌNH ẢNH

Danh mục hình Tran g Hình 3.1: Hình thái bên ngoài 16

Hình 3.2: Hình ảnh mặt cắt và vi phẫu của rễ Nhàu 18

Hình 3.3: Vi phẫu Lá, thân, rễ Nhàu 20

LỜI CẢM ƠN

Trước tiên nhóm chúng tôi xin chân thành cảm ơn Lãnh đạo Nhà trường,Phòng Đào tạo, quý Thầy, Cô giáo Trường Đại học Tây Đô đã tạo điều kiệncho nhóm trong suốt quá trình học tập tại trường, đồng thời hướng dẫn tận tìnhgiúp nhóm hoàn thành bài báo cáo này

Đặc biệt, nhóm xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành và sâu sắc tới ThầyTrần Công Luận, Thầy Đỗ Văn Mãi và Cô Trì Kim Ngọc đã tận tình giúp đỡ,hướng dẫn, chuyển tải những kiến thức, kinh nghiệm quý báu trong suốt 03tháng nghiên cứu tại trường

Do thời gian hạn chế và kinh nghiệm chưa nhiều, bài báo cáo khôngtránh khỏi những thiếu sót, những hạn chế về cả nội dung và hình thức Nhómrất mong nhận được những góp ý của quý Thầy, Cô

Cuối lời, xin chúc các Thầy, Cô luôn mạnh khỏe, hạnh phúc, công tác tốt

để đào tạo cho đất nước những dược sĩ đầy đủ năng lực chuyên môn, phẩmchất, đạo đức phục vụ cho nhân dân và cho đất nước

I ĐẶT VẤN ĐỀ

Trong y học cổ truyền, cây Nhàu từ lâu đã được sử dụng phổ biến với côngdụng nổi bật là bổ dưỡng Ngày nay, Nhàu còn được chứng minh với nhiều côngdụng như: Nhuận tràng, lợi tiểu, làm êm dịu thần kinh, trị cao huyết áp, chữa nhứcmỏi tay chân, đau lưng Ở Việt Nam, Nhàu được trồng phổ biến, là nguồn cung cấpnguyên liệu tạo ra các sản phẩm có hoạt tính sinh học có lợi cho sức khỏe conngười Đề tài này góp phần tìm hiểu rõ hơn về Nhàu, đặc biệt là rễ nhàu

Dược Liệu là rễ Nhàu, được thu hái ở: Huyện Bình Đại, tỉnh Bến Tre

II TỔNG QUAN

2.1 Tổng quan về dược liệu cây Nhàu

2.1.1 Tên gọi, vị trí phân loại

 Còn có tên là cây ngao, nhàu núi, giầu, noni,…

 Tên khoa học: Morinda citrifolia L

 Cây Nhàu thuộc họ Cà phê có vị trí phân loại như sau:

Giới thực vật (Plantae)

Giới thực vật (Plantae)

Bộ Gentianales

Họ Cà phê (Rubiaceae)

Chi Morinda

Loài M.citrifoliaAngiospermae Eudicots Asterids

2.1.2 Mô tả cây

- Cây gỗ nhỏ, mọc đứng

- Thân: Cây cao 4-8 m Thân, cành non mập, có 4 cạnh rõ, màu lục hoặc nâu

nhạt Cành non màu xanh, tiết diện vuông, có rãnh, nhẵn; cành già tiết diện tròn,màu nâu xám

- Lá: Lá mọc đối, hình bầu dục dài 12-30 cm, rộng 6-15 cm, mép uốn lượn, lá

màu xanh bóng đậm ở mặt trên, mặt dưới nhạt hơn Bìa lá hơi dợn sóng Gân láhình lông chim, nổi rõ ở mặt dưới, 6-7 cặp gân phụ Cuống lá 1-2 cm Lá kèm nằmgiữa 2 lá mọc đối, hình xoan, cao 1-1,5 cm, màu xanh nhạt

- Hoa: Cụm hoa là đầu hình tròn hay hơi bầu dục, ở ngoài nách lá Trục cụm

hoa hình trụ, màu xanh, nhẵn, dài 1-2 cm Đáy cụm hoa có 3 phiến hẹp, dài 5-8

mm Hoa đều, lưỡng tính, mẫu 5 Đài hoa là một gờ tròn Cánh hoa 5, ống trànghình phễu, màu xanh nhạt, cao 7-12 mm; bên trong có nhiều lông trắng; 5 thùy dàikhoảng 5-8 mm, màu trắng, hình bầu dục đầu nhọn, đỉnh có phụ bộ là một mấu nhỏcong vào trong Khi hoa nở các thùy cong xuống phía dưới; tiền khai van Nhị 5,bằng nhau, rời, gắn ở phần loe của ống tràng xen kẽ với các cánh hoa, chỉ nhị rấtngắn Bao phấn hình đầu tên, màu vàng nhạt, dài khoảng 4 mm; 2 ô, mở dọc,hướng trong, đính gốc Hạt phấn rời, hình hình cầu, màu vàng nhạt Lá noãn 2, ở vịtrí trước sau, bầu dưới, 2 ô, mỗi ô 1 noãn, đính trung trụ Vòi và đầu nhụy Vòinhụy dạng sợi màu xanh nhạt, dài 5 mm; 2 đầu nhụy dạng phiến mỏng, dài 3 mm,màu xanh Đĩa mật dày, hình khoen, màu vàng Cây ra hoa quanh năm, tập trungnhiều nhất vào khoảng tháng 11-2, cho quả vào khoảng tháng 3-5

- Quả: Quả hạch kép do bầu noãn và một phần lá đài của các hoa trên cụm hoa

dính nhau tạo thành Quả còn non màu xanh nhạt, dài 5-7 cm, rộng 3-4 cm Quả giàmàu ngà vàng, nhẵn bóng, mùi khai, trên quả còn vết tích các đĩa mật Quả thịt,hình trứng gồm nhiều quả hạch dính vào nhau, khi chín màu vàng, chứa cơm mềm,

ăn được

- Hạt: Hạt nhiều, hình bầu dục, một đầu nhọn, màu nâu đen.

Ở Việt Nam thường mọc nhiều ở các tỉnh miền Nam và một số tỉnh miềnTrung

2.1.3 Phân bố và sinh thái

Phân bố và thu hái thấy nhiều ở miền Nam nước ta Cây mọc hoang và đượctrồng ở một số nơi miền Trung Theo Pételot có ở miền Bắc Mới đây đã tìm thấy ởvùng Quảng Bình, Quảng Trị, Thừa Thiên Huế Có thể trồng dễ dàng ở các tỉnh

miền Bắc nước ta Người ta dùng lá, quả, vỏ, rễ làm thuốc Rễ hay dùng nhất dướidạng phơi hay sấy khô Các bộ phận khác dùng tươi.

2.1.4 Bộ phận dùng và thu hái

- Rễ: Rễ, thu hái vào mùa đông Rễ phơi khô

- Thân: Thân được thu hoạch tươi,

- Quả: Quả thu hoạch vào mùa hạ

2.1.5 Thành phần hóa học

Vỏ rễ chứa các dẫn chất anthranoid: alizarin-1-methylether (I), methylether (II), soranjidiol (III), damnacanthol (IV), nordamnacanthal, morindon,rubiadin Người ta cũng đã phân lập được glycosid là moridin (=morindon (V)-primeverose)

rubiadin-1-OCH3

OH O

2.1.6 Một số hoạt chất có hoạt tính sinh học cao trong cây

Trong các nghiên cứu về thành phần và tác dụng của cây Nhàu, thì nghiên cứu

về Iridoids trong cây Nhàu là một điểm nhấn mới, một phát hiện mang tính đột

phá

Iridoids là các hợp chất có cấu trúc dạng Cyclopenta (C) pyran monoterpenoid,

có mặt trong nhiều loại dược thảo Riêng trong cây Nhàu và quả Nhàu có hàm

lượng rất cao (từ 0,15 đến trên 0,30 mg/ml) Iridoids được thực vật sản xuất ra như một cơ chế phòng vệ chống lại các tác nhân gây bệnh Iridoids có phổ tác dụng sinh

học rất rộng, có cấu trúc hóa học bền vững, không bị thay đổi khi tiếp xúc với oxy,

nhiệt độ và ánh sáng Đặc biệt, hoạt tính sinh học của Iridoids vẫn còn lưu giữ sau 2

năm sản xuất và có thể lâu hơn Trong cây Nhàu và quả Nhàu có 16 loại

Iridoids khác nhau Iridoids hầu như quyết định tác dụng sinh học của cây Nhàu.

Có một số tác dụng như: Bảo vệ thần kinh, chống ung thư, chống viêm, tăngcường miễn dịch, chống oxy hóa, tác dụng trên tim mạch, hạ đường huyết, khángkhuẩn, làm lành vết thương, kích thích sản xuất Collagen, tăng bài tiết mật, chống

dị ứng, chống trầm cảm, chống rối loạn tâm thần ở phụ nữ mạn kinh

Ngoài ra còn một số thành phần như sau:

ST

T Tên hoạt chất Tác dụng sinh học

1 Enzymes Bảo vệ chức năng và làm tăng năng lượng tế bào

2 Amino acid Tăng cường sửa chữa và đổi mới tế bào

3 Polysaccharides Tăng cường hệ thống miễn dịch bao gồm việc chống

lại virus, vi khuẩn và sự phát triển tế bào u bướu

4 Dietary Fibers Giúp phân di chuyển dễ dàng trong ruột và tác dụng

như Probiotics

5 Vitamin Phân giải các gốc tự do, duy trì thị lực và điều tiết

chức năng tế bào

6 Minerals

- Đảm bảo cân bằng kiềm-toan trong cơ thể

- Cung cấp các AO để trung hòa các chất FR

- Điều tiết sự cân bằng hormone và hệ thống men

7 Acid béo chuỗi ngắn Cung cấp ATP tại chỗ cho tế bào biểu bì đại tràng,

giúp chuyển hóa lipid dễ dàng

11 Alkaloides Xúc tác tế bào và giảm đau.

12 Flavonoids Tăng cường các AO, dự phòng oxy hóa LDL,

chống dị ứng, chống các mầm bệnh

13 Hợp chất Terpenoids Tăng đổi mới tế bào, chống nấm, chống vi khuẩn và

virus

Bảng 1: Một số hoạt chất có hoạt tính sinh học trong cây

*Chú thích: FR: Free Radical (gốc tự do)

AO: Antioxidant (Trung hòa gốc tự do)

2.1.7 Một số nghiên cứu về thành phần hóa học và hoạt tính sinh học

Các nghiên cứu của các nhà khoa học Việt Nam và thế giới tập trung về việcphân tích thành phần hóa học, ly trích, khảo sát dược tính của các hợp chất trong rễNhàu

2.1.7.1 Các nghiên cứu trong nước

Các nhà khoa học Việt Nam đã tiến hành nhiều công trình nghiên cứu về thànhphần hóa học và tính chất trị liệu của những chất chiết xuất từ rễ Nhàu từ nhiều nămqua:

 Năm 1954, bác sĩ Đặng Văn Hồ đã chứng minh dịch trích toàn phần từ rễNhàu có tác dụng làm hạ huyết áp (Youngken và cộng sự, 1960)

 Năm 2004, tác giả Nguyễn Ngọc Sương và cộng sự thuộc khoa Hóa, TrườngĐại Học Khoa Học Tự Nhiên đã cô lập một acid triterpen từ cao alcol của rễ cây

Nhàu, Morida citrifolia L Acid này được nhận danh là acid urosolic dựa trên các

dữ liệu phổ nghiệm

 Năm 1988, theo kết quả kiểm chứng của TS Đỗ Quốc Việt và cộng sự chothấy hai chất được phân lập từ rễ Nhàu là Damnacathal và Nordamnacathal có tácdụng gây độc ở hai dòng tế bào ung thư: dòng ung thư tế bào tiết sắc tố B16 và ungthư máu dòng L 1210

2.1.7.2 Các nghiên cứu ngoài nước

 Tác dụng dược lý

Năm 1992, tác giả Umezawa và công sự đã ly trích một phức hợp từ rễ Nhàu cótên là 1-methoxy-2-foremyl-3-hydroxyanthraquinon có thể đàn áp sự xâm nhiễmcủa HIV lên các tế bào MT-4 mà không kìm hãm sự phát triển của tế bào

Năm 1993, Damnacantal được ly trích từ rễ Nhàu là một tác nhân kìm hãm

chức năng của gen ras-gen gây ung thư phổi, ruột kết, và tuyến tụy (Hiramatsu và

cộng sự, 1993)

Hơn nữa, trong công nghiệp dệt, Anthraquinon là một nhóm chất nhuộm tự

nhiên màu vàng hoặc đỏ có trong rễ nhiều loài Morida sp Chất nhuộm này được sử

dụng rộng rãi trong công nghiệp nhuộm vải ở nhiều nơi trên thế giới, đặc biệt làphía Bắc Thái Lan (Aobchey và cộng sự, 2002)

 Nghiên cứu in-vitro

Năm 2003, tác giả Stalman và cộng sự đã điều hòa sinh tổng hợp anthraquinon

trong nuôi cấy cây Nhàu (Morida citrifolia L.) Kết quả cho thấy, sự sinh tổng hợp

Anthraquinon ở cây Nhàu bị cản mạnh bởi 2,4-D nhưng không nhiều bởi NAA Cảhai auxin này đều ngăn cản sự tổng hợp isochorismat làm giảm tích lũyanthraquinon

Năm 2005, tác giả Komaraiaha và cộng sự đã tìm cách gia tăng sự tích lũy

anthraquinon trong nuôi cấy dịch treo Morinda citrifolia L Bằng cách thêm các

chất khơi mào (elicitor) và thay đổi hàm lượng đường trong môi trường nuôi cấy

- Không độc và không gây nghiện;

- Phong thấp, đau nhức xương khớp

2.1.8.2 Công dụng:

- Các tác giả Pháp [Planta Med 56 (1990) 430] nghiên cứu dịch nước rễ

nhàu thí nghiệm trên chuột cho thấy có tác dụng giảm đau, an thần, gây ngủ

- Nhân dân ta có dùng để sắc uống, để chữa đau lưng, chữa cao huyết áp

- Quả Nhàu ăn với muối để làm thuốc điều kinh dễ tiêu, nhuận tràng, chữacao huyết áp Các nghiên cứu gần đây cho thấy Polysaccarid của quả có tác dụngkích thích miễn dịch phòng chống ung thư

- Lá đắp chữa vết thương, mụn nhọt, làm chống lên sẹo, sắc uống chữa lỵ,chữa sốt và làm thuốc bổ

Ngoài cây Nhàu trong dân gian còn sử dụng một vài loài morida khác nhưdây đất, cây nhàu nước

Rễ nhàu nước dùng để trị giun sán Ngoài ra rễ cây còn có đặc tính hạ huyết

áp nhẹ

2.1.9 Một số bài thuốc có dược liệu

- Chữa nhức đầu kinh niên, đau nửa đầu:

Rễ nhàu 24 g, muồng trâu 12 g, cối xay 12 g, rau má 12 g, củ gấu (sao, tẩmđồng tiện) 0,8 g Đổ 500 ml nước, sắc còn 250 ml Chia làm 2 lần uống trong mộtngày, uống lúc thuốc còn nóng

- Chữa mất ngủ, suy nhược thần kinh, huyết áp cao:

Rễ nhàu 24 g, thảo quyết minh (sao thơm) 12 g, rau má 0,8 g, tổ phục linh 0,8 g,

vỏ bưởi 0,6 g, gừng sống 3 lát Đổ 500 ml nước, sắc còn 250 ml Chia làm 2 lầnuống trong 1 ngày, uống lúc thuốc còn nóng

- Chữa huyết áp cao:

Rễ Nhàu 30-40 g/ngày, sắc uống thay nước chè, sau 2 tuần là có kết quả, sau đógiảm bớt liều, uống liên tục 2, 3 tháng

- Nhức mỏi tay chân, đau lưng:

Quả Nhàu non thái mỏng sao khô, 300 g ngâm trong 2 lít rượu 30-40 độ sau 2tuần, uống ngày 2 lần, lần 1 ly con 30-40 ml

- Chữa lỵ, tiêu chảy, cảm sốt:

Lấy 3-6 lá Nhàu tươi rửa sạch, nấu với 500 ml nước còn 200 ml chia 2 lầnuống/ngày Uống liên tục 2-5 ngày

2.2 Tiêu chuẩn chất lượng và phương pháp thử cho dược liệu

2.2.1 Nội dung của một tiêu chuẩn dược liệu

Tiêu chuẩn của một dược liệu bao gồm nhiều chỉ tiêu khác nhau Tùy theo

trình độ phát triển khoa học của mỗi thời kì từng trong quốc gia, khu vực và đối vớitừng dược liệu cụ thể mà các nội dung về tiêu chuẩn, yêu cầu của những chỉ tiêu cóthể thay đổi

Các chuyên luận về nguyên liệu làm thuốc có nguồn gốc tự nhiên gồm các nộidung chủ yếu sau:

Định nghĩa: Tên thông dụng của dược liệu, tên khoa học của dược liệu, định

nghĩa về dược liệu, tên thông thường và tên khoa học của các loài cây cung cấpdược liệu đó

Đặc điểm cảm quan: Mô tả các đặc điểm hình thái, thể chất, màu sắc, mùi vị

của dược liệu

Đặc điểm của vi học: Mô tả các đặc điểm hiển vi của dược liệu, đặc điểm của

vi phẫu và bột dược liệu

Các hằng số vật lý: Yêu cầu về các chỉ số vật lý, hóa học của nguyên liệu

thường là các phần lấy ra từ nguyên liệu thực vật như chất béo tinh dầu nhựa sáp…thay thế cho các đặc điểm vi học và một phần các tiêu chuẩn thử tinh khiết của cácdược liệu là các cơ quan thực vật

Định tính: Các phản ứng hóa học, hay các phương pháp hóa lý được dùng để

xác định dược liệu

Thử tinh khiết: Mô tả một yêu cầu về độ tinh khiết của một dược liệu như là

tạp chất độ ẩm, độ tro…

Xác định hàm lượng: Phương pháp xác định hàm lượng hoạt chất hay một

nhóm hợp chất trong dược liệu, yêu cầu về hàm lượng cần đạt được của dược liệu

Chế biến: Một số dược liệu có nhiều cách chế biến khác nhau, Dược điển sẽ

quy định cách thức chế biến chính thức của dược liệu

2.2.2 Yêu cầu chung cho một tiêu chuẩn dược liệu

Một tiêu chuẩn dược liệu một khi được áp dụng sẽ có tính pháp lý không phạm

vi mà tiêu chuẩn ấy được chỉ định áp dụng Vì vậy khi xây dựng một tiêu chuẩn cầnphải cân nhắc kỹ lưỡng khả năng áp dụng thực tế của những yêu cầu hay giới hạn

đặt ra cho từng chỉ tiêu cho sát hợp với thực tế trong xu hướng phát triển và nângcao.

Yêu cầu chung cần đạt được của một tiêu chuẩn là:

- Xác định đúng dược liệu, phát hiện được những giả mạo, nhầm lẫn của dượcliệu

- Đánh giá đúng được chất lượng của dược liệu

- Đảm bảo được hiệu quả sử dụng và tính an toàn của dược liệu

Một tiêu chuẩn tốt cho dược liệu cần phải đáp ứng những yêu cầu sau:

- Tính đại diện: Đại diện cho phần lớn các mẫu dược liệu có thể thu được từ

cây thuốc

- Tính hiện đại: Áp dụng được những thành tựu khoa học công nghệ mới nhất

tiên tiến để đánh giá tốt hơn chất lượng của dược liệu

- Tính khả thi:

+ Các phương pháp mà chúng ta đề ra có thể được áp dụng được trong điềukiện cơ sở vật chất và hạ tầng hiện có của đa số các cơ sở áp dụng tiêu chuẩn đó + Các quy định cũng như giới hạn của các chỉ tiêu phải phù hợp với yêu cầnthực tế hiện nay

Việc xây dựng tiêu chuẩn và phương pháp kiểm nghiệm cho dược liệu là yêucầu bức thiết đặt ra đối với ngành y tế và cả những cơ sở sản xuất dược phẩm

2.2.3 Phương pháp khảo sát thực vật học

Mô tả định danh: Dựa vào hình dạng bên ngoài của mẫu tươi và mẫu khô

đồng thời sử dụng những tài liệu mô tả về hình thài thực vật của cây để làm căn cứđối chiếu và sơ bộ xác định loài cây cần khảo sát

Vi phẫu:

- Có thể dùng mẫu tươi hay khô Nếu là mẫu khô nên ngâm mềm trước khi cắt.

Mẫu được chọn phải chính xác, có tính đại diện, không quá già hoặc quá non (trừtrường hợp khảo sát cấu tạo sơ cấp phải chọn bộ phận non)

- Có thể cắt bằng tay với lưỡi lam hay bằng dụng cụ gọi là dao cắt cầm tay

(Microtome) Chọn các lát cắt (phần thức) thật mỏng và đều để dễ nhuộm Nếu mẫu

nhỏ thì cắt cả tiết diện, nếu mẫu có kích thước quá lớn thì cắt phần đại diện Nếumẫu cắt là lá thì thường lấy đoạn 1/3 gân giữa kể từ nơi tiếp giáp với cuống, và một

phần phiến lá ở 2 bên Nếu là thân thì thường cắt ở lóng Các bộ phận khác như hoa,quả, hạt, chọn nơi cắt tùy theo yêu cầu khảo sát.

- Có nhiều phương pháp và hóa chất để nhuộm tế bào thực vật, ở đây ta dùngphương pháp nhuộm kép son phèn – lục iod

+ Ngâm lát cắt vào dung dịch Javel từ 15-30 phút (cho đến khi thấy lát cắt trởnên trắng), rửa bằng nước cất nhiều lần

+ Ngâm lát cắt vào dung dịch Acid acetic 5% trong 5 phút để tẩy Javel còn sótlại Rửa bằng nước cất

+ Ngâm vào dung dịch son phèn – lục iod từ 10-15 phút Rửa bằng nước cấtđến khi dung dịch rửa hết màu

- Quan sát bằng kính hiển vi ở vật kính 4X, 10X, 40X và chụp lại trực tiếp quakính hiển vi

Soi bột:

- Lấy mẫu bộ phận dược liệu cần khảo sát, cắt nhỏ đem phơi khô hoặc sấy khô

ở nhiệt độ khoảng 60°C Đem tán nhỏ, nghiền nát hoặc dùng máy xay Rây qua rây

số 32 (rây mịn) Phần còn lại trên rây được tán hoặc xay và rây tiếp cho đến khi tất

cả dược liệu trở thành bột mịn (không được bỏ qua phần còn lại trên rây)

- Cho một giọt nước cất vào giữa phiến kính, dùng que sạch trộn đều bột, lấymột ít bột, cho vào giữa giọt nước cất, dùng một góc của lá kính khuấy nhẹ để phântán bột cho đều và đậy kính lại Lấy ngón tay trỏ di nhẹ trên lá kính để các phần tửcủa bột tách rời ra và phân tán đều Loại bỏ phần bột và nước thừa nằm phía ngoài

lá kính bằng giấy thấm, lau sạch mặt trên phiến kính và lá kính trước khi soi kínhhiển vi

- Quan sát bằng kính hiển vi ở vật kính 4X, 10X, 40X và chụp lại trực tiếp quakính hiển vi

2.2.4 Phân tích sơ bộ thành phần hóa thực vật

Quy trình chiết và định tính các nhóm hợp chất từ dược liệu bằng phương phápphân tích sơ bộ thành phần hóa học như sau:

Chuẩn bị các dịch chiết

2.2.4.1 Chiết dịch chiết ether

Chiết 10 g bột dược liệu trong 100 ml bằng ether ethylic/ ether dầu trong mộtbình nón đun cách thủy 20-30 phút, lọc Thu được dịch chiết ether và bã Chiết đếnkhi dịch chiết ether không còn để lại vết cắn khi cô cạn trên bếp cách thủy trongchén sứ

+ Xác định chất béo

Lấy vài giọt dịch chiết ether nhỏ lên cùng một chỗ trên một miếng giấy mỏng,

hơ hoặc sấy nhẹ cho bay hết dung môi (và hết mùi thơm nếu dịch chiết có tinh dầu).Nếu tại nơi nhỏ dịch chiết có vết trong mờ: Có chất béo

+ Xác định tinh dầu

Lấy khoảng 5 ml dịch chiết ether cho vào chén sứ, bốc hơi đến cạn Nếu cắn

có mùi thơm nhẹ, thêm vào cắn một ít cồn cao độ (TT) rồi lại bốc hơi đến cắn Cắn

có mùi thơm nhẹ đặc trưng: Có tinh dầu

+ Định tính Carotenoid

a Lấy khoảng 5 ml dịch chiết ether cho vào chén sứ, bốc hơi nhẹ đến cắn (vàhầu như không còn mùi thơm nếu dịch chiết có tinh dầu) Thêm vào vài giọt dungdịch SbCl3 (khan) bão hòa trong chlorofom (Thuốc thử Carr-Price) Dung dịch cómàu xanh sau đó chuyển thành màu đỏ: Có Carotenoid

b Lấy khoảng 5 ml dịch chiết ether cho vào chén sứ, bốc hơi nhẹ đến cắn (vàhầu như không có mùi thơm nếu dịch chiết có tinh dầu) Thêm vào cắn vài giọt

H2SO4 đậm đặc Dung dịch có màu xanh dương đậm hay màu xanh lục ngả sangmàu xanh dương: Có Carotenoid

+ Định tính Triterpenoid

Lấy khoảng 5 ml dịch chiết ether cho vào chén sứ, bốc hơi đến cắn Hòa tancắn với 0,5 ml anhydrid acetic rồi thêm vào dung dịch 0,5 ml chloroform Chuyểndung dịch vào một ống nghiệm nhỏ, khô Dùng pipet thêm cẩn thận 1-2 ml acidsulfuric đậm đặc lên thành ống nghiệm để nghiêng cho acid chảy xuống đáy ốngnghiệm Nơi tiếp xúc giữa 2 lớp dung dịch có màu đỏ nâu hay đỏ đến tím, lớp dungdịch phía trên dần dần chuyển thành màu xanh lục hay tím: Có triterpenoid tự do

2.2.4.2 Chiết dịch chiết cồn

Bã dược liệu được chiết tiếp trong 100 ml bằng cồn cao độ (hoặc methanol)trong bình nón đem đun cách thủy trong 20 phút Lọc thu được dịch chiết cồn và bã.Phần lớn dịch chiết cồn dùng để định tính trực tiếp các nhóm hợp chất

(Alkaloid, coumarin, glycosid tim, saponin).

Một phần dịch chiết được đem thủy phân để định tính các aglygon sau khithủy phân Lấy 15 ml dịch chiết cồn cho vào bình nón 100 ml, cho thêm 10 ml acidhydrocloric 10% và đun hồi lưu trên bếp cách thủy 30 phút, cô còn 50%, thêm vào

20 ml nước Để nguội cho vào bình lắng gạn và chiết bằng ether ethylic (15 ml x 3

lần) Dịch ether dùng để định tính các aglygon (Triterpenoid, coumarin,

anthraquinon).

+ Định tính Alkaloid

Lấy khoảng 5 ml dịch cồn cho vào chén sứ, bốc hơi đến cắn Hòa cắn trong

2-4 ml dung dịch acid hydrocloric 5% Chia dung dịch acid vào 2-4 ống nghiệm nhỏ.Định tính Alkaloid bằng thuốc thử: Mayer, Dragendorff và Bouchardat

So sánh kết quả với ống chứng không thuốc thử

+ Định tính Coumarin

Nhỏ vài giọt dịch chiết cồn lên miếng giấy lọc Bay hơi cồn cho đến khô, nhỏlên vết dịch chiết 1-2 giọt dung dịch KOH 10% trong cồn và sấy nhẹ cho đến khô.Che một nữa vết dịch chiết bằng một miếng kim loại và soi dưới đèn tử ngoại 365

nm Sau vài phút, lấy miếng kim loại che vết dịch chiết ra Nếu phần bị che cócường độ phát quang yếu hơn nhưng sau đó sáng dần lên cho đến khi có cường độtương đương: Có coumarin

+ Định tính Glycosid tim

Định tính vòng lacton 5 cạnh: Lấy 5 ml dịch chiết cồn cho vào chén sứ bốc hơiđến cắn Hòa cắn lại với 2 ml cồn, gạn dịch cồn vào 1 ống nghiệm nhỏ cho vào 2-3giọt dung dịch TT Baljet Nếu xuất hiện màu đỏ đậm: Có các glycosid tim

+ Định tính Saponin

Lấy 5 ml dịch chiết cồn cho vào chén sứ, cô đến cắn Hòa tan trong 5 ml cồn25% trên bếp cách thủy, lọc vào ống nghiệm Thêm 5 ml nước và lắc mạnh theochiều dọc ống Nếu có bọt bền: Có Saponin

+ Định tính khung Triterpenoid sau khi thủy phân

Lấy khoảng 5 ml dịch ether sau khi thủy phân cho vào chén sứ, bốc hơi đếncắn Hòa tan cắn 0,5 ml anhydric acetic rồi thêm vào dung dịch 0,5 ml chlorofom.Chuyển dung dịch vào ống nghiệm nhỏ khô Dùng pipet thêm cẩn thận 1-2 ml dungdịch H2SO4 đậm đặc theo thành ống nghiệm cho chảy xuống đáy ống nghiệm Nơitiếp xúc giữa hai lớp dung dịch có màu đỏ nâu hay đỏ đến tím, lớp dung dịch phíatrên lớp ngăn cách dần dần chuyển thành màu xanh lục hay tím: Có Triterpenoid

Nhỏ vài giọt dịch chiết ether sau khi thủy phân lên một miếng giấy lọc Bayhơi ether đến khô, nhỏ lên vết dịch chiết 1-2 giọt KOH 10% trong cồn và sấy nhẹđến khô Che một nữa vết dịch chiết bằng một miếng kim loại và soi dưới đèn tửngoại 365 nm Sau vài phút lấy miếng kim loại che dịch chiết ra Nếu phần bị che

có cường độ phát quang yếu hơn nhưng sau đó sáng dần lên cho đến khi có cường

độ tương đương: Có Coumarin

+ Định tính Anthraquinon

Lấy khoảng 5 ml dịch chiết ether sau khi thủy phân cô trên bếp cách thủy còn

2 ml rồi cho vào ống nghiệm nhỏ, khô Thêm vào ống nghiệm 1 ml dung dịchNaOH 10% và lắc kỹ Nếu lớp kiềm có màu từ hồng đến đỏ: Có Anthraquinon

2.2.4.3 Chiết dịch chiết nước

Lấy bã của dịch chiết cồn thêm vào 100 ml nước đun cách thủy trong 20 phút.Lọc, thu được dịch chiết nước

Phần lớn dịch chiết nước được dùng để định tính trực tiếp các nhóm chất.Một phần dịch chiết được thủy phân để định tính các aglygon sau khi thủyphân Lấy 15 ml dịch chiết nước cho vào bình nón 100 ml, thêm 10 ml acidhydroclorid 10% và đun hồi lưu trên bếp cách thủy 30 phút, để nguội, cho vào bìnhlắng gạn và chiết bằng ether ethylic (15 ml x 3 lần) Dịch ether dùng để định tínhcác aglygon

Xác định các nhóm hợp chất (Tannin, Saponin, Acid hữu cơ, hợp chất khử,

Polyuronid, Flav Anthocyanidin).

Xác định các chất tan trong dịch ether (Anthraquinon, Flavanoid- - pyron) + Định tính Tanin

Lấy 0,5 ml dịch chiết cho vào ống nghiệm nhỏ Thêm 2-3 giọt thuốc thử FeCl3

5%, lắc đều nếu dung dịch có màu xanh đen hay rêu: Có Polyphenol

Lấy 2 ml dịch chiết, thêm 5 giọt dung dịch gelatin – muối, lắc đều, so sánh vớidung dịch ban đầu Nếu có tủa bông trắng: Có Tanin

+ Định tính Saponin

Lấy khoảng 5 ml dịch nước cho vào 1 chén sứ, đun cách thủy đến cắn khô.Hòa cắn với 5 ml cồn 25% lọc vào ống nghiệm, pha loãng với 5 ml nước, lắc mạnh

theo chiều dọc của ống nghiệm trong 15 giây Nếu có cột bọt bền trong 15 phút: CóSaponin.

+ Định tính hợp chất khử

Lấy 5 ml dịch chiết cô cách thủy tới khô, hòa tan cắn trong cồn 25%, lọc Chodịch lọc vào ống nghiệm, thêm 0,5 ml dung dịch Fehling A và 0,5 ml dung dịchFehling B Đun cách thủy 5 phút Nếu có tủa đỏ gạch nặng lắng dưới đáy ốngnghiệm: Có các chất khử

+ Định tính các Acid hữu cơ

Lấy 2 ml dịch chiết cho vào một ống nghiệm Thêm vào dung dịch một ít tinhthể natri carbonat Nếu có các bọt khí sủi lên từ các tinh thể Na2CO3: Có Acid hữucơ

+ Định tính hợp chất Polyuronid

Nhỏ từng giọt 2 ml dịch chiết nước vào ống nghiệm có chứa 10 ml cồn 95%hoặc acton, nếu có nhiều tủa bông được tạo thành: Có các Polyuronid (gôm, pectin,chất nhầy )

+ Định tính Anthraquinon

Lấy khoảng 5 ml dịch chiết ether cô trên bếp cách thủy còn 2 ml rồi cho vào 1ống nghiệm nhỏ Thêm vào ống nghiệm 1 ml dung dịch NaOH 10% và lắc kỹ Nếulớp kiềm có màu từ hồng tới đỏ: Có Anthraquinon

+ Định tính Flavonoid

Lấy khoảng 5 ml dịch chiết ether cho vào chén sứ, bốc hơi đến cắn, hòa tanvào 2 ml cồn 95% và cho vào 1 ống nghiệm nhỏ Thêm vào dung dịch một ít bột

Mg kim loại và 0,5 ml HCl

III KẾT QUẢ THỰC NGHIỆM

3.1 Đặc điểm vi phẫu và soi bột

3.1.1 Cảm quan bột dược liệu

3.1.1.1 Hình thái

- Cây gỗ nhỏ, mọc đứng

- Thân: Cây cao 4-8 m Thân, cành non mập, có 4 cạnh rõ, màu lục hoặc nâu

nhạt Cành non màu xanh, tiết diện vuông, có rãnh, nhẵn; cành già tiết diện tròn,màu nâu xám

- Lá: Lá mọc đối, hình bầu dục dài 12-30 cm, rộng 6-15 cm, mép uốn lượn, lá

màu xanh bóng đậm ở mặt trên, mặt dưới nhạt hơn Bìa lá hơi dợn sóng Gân láhình lông chim, nổi rõ ở mặt dưới, 6-7 cặp gân phụ Cuống lá 1-2 cm Lá kèm nằmgiữa 2 lá mọc đối, hình xoan, cao 1-1,5 cm, màu xanh nhạt

- Hoa: Cụm hoa là đầu hình tròn hay hơi bầu dục, ở ngoài nách lá Trục cụm

hoa hình trụ, màu xanh, nhẵn, dài 1-2 cm Đáy cụm hoa có 3 phiến hẹp, dài 5-8 mm.Hoa đều, lưỡng tính, mẫu 5 Đài hoa là một gờ tròn Cánh hoa 5, ống tràng hìnhphễu, màu xanh nhạt, cao 7-12 mm; bên trong có nhiều lông trắng; 5 thùy dàikhoảng 5-8 mm, màu trắng, hình bầu dục đầu nhọn, đỉnh có phụ bộ là một mấu nhỏcong vào trong Khi hoa nở các thùy cong xuống phía dưới; tiền khai van Nhị 5,bằng nhau, rời, gắn ở phần loe của ống tràng xen kẽ với các cánh hoa, chỉ nhị rấtngắn Bao phấn hình đầu tên, màu vàng nhạt, dài khoảng 4 mm; 2 ô, mở dọc, hướngtrong, đính gốc Hạt phấn rời, hình hình cầu, màu vàng nhạt Lá noãn 2, ở vị trítrước sau, bầu dưới, 2 ô, mỗi ô 1 noãn, đính trung trụ Vòi và đầu nhụy Vòi nhụydạng sợi màu xanh nhạt, dài 5 mm; 2 đầu nhụy dạng phiến mỏng, dài 3 mm, màuxanh Đĩa mật dày, hình khoen, màu vàng Cây ra hoa quanh năm, tập trung nhiềunhất vào khoảng tháng 11-2, cho quả vào khoảng tháng 3-5

- Quả: Quả hạch kép do bầu noãn và một phần lá đài của các hoa trên cụm hoa

dính nhau tạo thành Quả còn non màu xanh nhạt, dài 5-7 cm, rộng 3-4 cm Quả giàmàu ngà vàng, nhẵn bóng, mùi khai, trên quả còn vết tích các đĩa mật Quả thịt,hình trứng gồm nhiều quả hạch dính vào nhau, khi chín màu vàng, chứa cơm mềm,

ăn được

- Hạt: Hạt nhiều, hình bầu dục, một đầu nhọn, màu nâu đen.

Thân Nhàu Lá Nhàu

Hình 3.1: Hình thái bên ngoài

3.1.1.2 Thể chất, màu sắc, mùi vị của Rễ Nhàu

- Thể chất: Vỏ rễ bên ngoài sần sùi, cứng

- Màu sắc: Vỏ rễ và bên trong rễ có màu vàng sẫm

- Mùi vị: Có mùi đặc trưng của Nhàu, không có vị

3.1.2 Vi phẫu

Rễ

Mặt cắt ngang rễ hình tròn, từ ngoài vào trong có: Lớp bần gồm 2-3 hàng tếbào hình chữ nhật xếp thành dãy đồng tâm Mô mềm gồm những tế bào thành mỏnghình nhiều cạnh không đều Trong mô mềm có tế bào chứa tinh thể calci oxalat hìnhkim và có những đám sợi Libe tạo thành vòng bao quanh gỗ Tầng phát sinh libe-

gỗ, mạch gỗ nằm rải rác trong mô gỗ

Thân

Vi phẫu thân hình vuông, biểu bì có lớp cutin dày Mô dày góc (thân non) haytròn (thân già) 4-5 lớp tế bào, liên tục quanh thân Mô mềm vỏ đạo, tế bào hình bầudục nằm ngang Gỗ 2 khá nhiều, mạch gỗ to, mô mềm gỗ hóa sợi từng cụm, tế bàocủa tia gỗ khá rộng, thường xếp thành một dãy Gỗ 1 rõ, mô mềm tủy phía dưới gỗ

1 thường bị hóa mô cứng, vùng phía trong vách tế bào vẫn còn cellulose Tinh thểcalci oxalat hình kim tập trung thành bó trong mô mềm vỏ, mô mềm tủy và libe 2

Lá

Gân giữa: Biểu bì trên hơi lồi; tế bào kích thước nhỏ, cutin mỏng Mô dày trònvới các tế bào hình đa giác khoảng 4-5 lớp nằm sát lớp biểu bì Tế bào mô mềm đạohình tròn, khá đều, vách mỏng Hệ thống dẫn hình vòng cung, gỗ ở trên và libe ởdưới; Biểu bì dưới lồi nhiều Phiến lá: Tế bào biểu bì khá to; cutin răng cưa Mômềm giậu chiếm phân nửa chiều dày thịt lá, gồm 1-3 lớp tế bào ngắn; rải rác có một

số tế bào khá dài, bên trong chưa tinh thể calci oxalat hình kim xếp dày đặc Mômềm khuyết với những tế bào gần tròn xếp chừa những khuyết nhỏ, rải rác trong

mô mềm khuyết cũng có tinh thể calci oxalat hình kim

Hình 3.2: Hình ảnh mặt cắt và vi phẫu của rễ Nhàu

- Bằng phương pháp nhuộm kép son phèn - lục iod, ta có các bước như sau:+ Ngâm lát cắt vào dung dịch Javel từ 15 – 30 phút (cho đến khi thấy lát cắttrở nên trắng), rửa bằng nước cất nhiều lần

+ Ngâm lát cắt vào dung dịch acid acetic 1% - 3% trong 5 phút để tẩy Javelcòn sót lại Rửa bằng nước cất

+ Ngâm vào dung dịch son phèn – lục iod từ 10 – 15 phút Rửa bằng nước cấtđến khi dung dịch rửa hết màu

+ Quan sát bằng kính hiển vi ở vật kính 4X, 10X, 40X và chụp lại trực tiếpqua kính hiển vi