MỞ ĐẦU Các phương pháp phòng và trị bệnh ung thư hiện nay như phẫu thuật, xạ trị, hóa trị. Tuy nhiên các phương pháp này vẫn có những tác dụng phụ nhất định đối với bệnh nhân. Nhu cầu về dược chất kháng ung thư có khả năng phòng và trị bệnh đang rất lớn nhưng khả năng đáp ứng còn hạn chế [70, 71]. Các nhà khoa học, dược học đã và đang quan tâm nghiên cứu, tìm kiếm các loại dược chất mới. Trong đó nhóm flavone, isoflavone nói riêng là nhóm dược chất có nhiều trong thực vật với hoạt tính kháng oxi hóa, kháng ung thư, kháng viêm, … hiệu quả [45, 104]. Các nghiên cứu thực nghiệm trên thế giới và Việt Nam đã cung cấp một cơ sở dữ liệu quý giá về nguồn dược chất trong tự nhiên, nhưng các nghiên cứu thực nghiệm thuần túy còn nhiều hạn chế để tạo ra hợp chất có hoạt tính kháng ung thư hiệu quả, nhanh chóng, kinh tế [41, 42]. Các nghiên cứu lý thuyết trên thế giới nói chung, trong nước nói riêng về nhóm flavone và isoflavone có hoạt tính kháng ung thư cổ tử cung còn khá khiêm tốn [90, 103]. Nghiên cứu mối quan hệ cấu trúc - hoạt tính nhằm thiết kế các dẫn xuất flavone, isoflavone mới có hoạt tính được cải thiện; các nghiên cứu lý thuyết là rất cần thiết để thúc đẩy và làm tiền đề cho các nghiên cứu thực nghiệm, nhằm tìm kiếm các dược chất kháng ung thư hiệu quả [80, 90]. Trong nghiên cứu này, chúng tôi sử dụng các thông tin mô tả cấu trúc điện tích nguyên tử, độ dịch chuyển hóa học, tính chất hóa lý, tham số 2D và 3D của phân tử kết hợp các kỹ thuật phân tích hồi quy, mạng nơ ron, phân tích thành phần chính, giải thuật di truyền, bình phương cực tiểu riêng phần để xây dựng các mối quan hệ định lượng cấu trúc - hoạt tính (QSAR) [89]. Các flavonoid được xây dựng và tối ưu hóa bằng các phương pháp cơ học phân tử MM+. Các tham số mô tả phân tử 2D, 3D được sử dụng để xây dựng các mô hình đa biến như hồi quy tuyến tính đa biến (MLR), phân tích thành phần chính (PCR), bình phương cực tiểu riêng phần (PLS) và mạng nơ ron nhân tạo (ANN) [80, 90]. Xây dựng các mô hình QSAR nhằm xác định những yếu tố tham số mô tả phân tử ảnh hưởng đến tác dụng kháng ung thư cổ tử cung từ đó xác định hướng thiết kế phân tử mang lại hoạt tính cao hơn [86, 90, 103]. Trong nghiên này cũng đã tiến hành chiết tách và phân lập flavonoid từ gừng gió, đậu nành, tía tô, xa kê, actiso, một vài kỹ thuật phân tích hóa lý cũng được sử dụng để xác định cấu trúc phân tử các dẫn xuất flavonoid. Các phân tử flavonoid đã phân lập sẽ được dự báo hoạt tính, và sử dụng làm chất mẫu để thiết kế hợp chất mới có hoạt tính cao hơn. Từ các cơ sở trên, chúng tôi nghiên cứu đề tài “Thiết kế, sàng lọc một số dẫn xuất flavonoid và đánh giá hoạt tính gây độc lên dòng tế bào Hela dựa vào các tính toán hóa lượng tử”.
DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT ANOVA Phân tích phương sai ARE, % Giá trị tuyệt đối sai số tương đối Bond Liên kết Cal Tính tốn (Calculation) SKC Sắc kí cột COSY d Đỉnh đôi (doublet) dd Mũi đôi mũi đôi (duplet of duplet) DEPT Phổ DEPT (Distortionless Enhancement by Polarisation Transfer) DMSO Dimethyl sulfoxide (CH3)2S=O Exp Thực nghiệm (Experiment) EtOAc Ethyl acetate (CH3COOC2H5) EtOH Ethanol (C2H5OH) E-State Trạng thái điện tử (electrotopological state) GI50 H-1H (Correlation Spectroscopy) Nồng độ thuốc ức chế 50% phát triển tế bào gây ung thư (50% Growth Inhibition) pGI50 pGI50= -log(GI50) pGI50,exp Giá trị pGI50 thực nghiệm pGI50,pr Giá trị pGI50 dự đoán HMBC HSQC Phổ tương tác đa liên kết hai chiều dị hạt nhân (Heteronuclear Multiple Bond Vorrelation) Phổ tương tác hai chiều trực tiếp dị hạt nhân (heteronuclear single quantum coherence) HPV Vi rút u nhú người (Human Papillomavirus) IR Phổ hồng ngoại (Infrared Spectroscopy) iii LV Biến ẩn (Latent Variables) LogP Giá trị logarit hệ số phân tán Linear Tuyến tính m Mũi đa (multiplet) MM+ Phương pháp học phân tử MM MARE, % Giá trị trung bình ARE, % MSE Sai số trung bình bình phương (Mean Squared Error) MS Phổ khối (mass spectrometry) MetOH methanol (CH3OH) Nonlinear Phi tuyến tính NMR Phở cộng hưởng từ hạt nhân OD Phương pháp đo mật độ quang (Optical Density) PCA Phân tích thành phần (Principal Components Analysis) PCR Hồi qui thành phần (Principal Components Regression) PLS Bình phương cực tiểu riêng phần (Partial Least Squares) QSPR QSAR QESAR QSDAR QSSR Q2 Quan hệ định lượng cấu trúc - tính chất (Quantitative Structure - Property Relationship) Quan hệ định lượng cấu trúc - hoạt tính (Quantitative Structure - Activity Relationship) Quan hệ định lượng cấu trúc điện tử hoạt tính sinh học (Quantitative Electronic Structure - Activity Relationship) Quan hệ định lượng cấu trúc phổ NMR hoạt tính sinh học (Quantitative Spectrum Data - Activity Relationship) Quan hệ định lượng cấu trúc - cấu trúc (Quantitative Structure - Structure Relationship) Hệ số tương quan đánh giá chéo (Cross-validation correlation coefficient) R2tr Hệ số tương quan R2 luyện R2pr Hệ số tương quan R2 dự đoán iv R2ad R2hiệu chỉnh Rf Hệ số lưu giữ (Retention Factor) SAR Quan hệ cấu trúc hoạt tính (Structure - Activity Relationship) s Đỉnh đơn (singlet) SRB Sulforhodamine B SK Sắc ký SKLM Sắc ký lớp mỏng t Mũi ba (triplet) TCA Trichloroacetic acid UV Phổ UV (Ultraviolet Spectroscopy) J (Hz) Hằng số ghép (Hz) (Coupling constant Hz) H-NMR 13 C-NMR (ppm) QSARMLR (3.16) QSARMLR (3.17) QSARMLR (3.19) Phổ cộng hưởng từ hạt nhân proton (Hydrogen Nuclear Magnetic Resonance) Phổ cộng hưởng từ hạt nhân cacbon 13 (Carbon Nuclear Magnetic Resonance) Độ dịch chuyển hóa học (chemical shift) tính ppm QSARMLR phương trình 3.16 QSARMLR phương trình 3.17 QSARMLR phương trình 3.19 v DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 3.1 Năng lượng tối thiểu (kcal/mol) phân tử isoflavone (isofla-30) 63 Bảng 3.2 Tham số moment lưỡng cực (µ) flavonone isoflavone 65 Bảng 3.3 Ảnh hưởng loại biến độc lập đến giá trị R2tr 67 Bảng 3.4 Ảnh hưởng số biến độc lập đến giá trị R2tr, R2pr, SE 67 Bảng 3.5 Ảnh hưởng số nơ ron ẩn đến giá trị R2tr 68 Bảng 3.6 Ảnh hưởng cấu trúc mạng đến giá trị R2tr R2pr 68 Bảng 3.7 Ảnh hưởng hàm truyền đến giá trị R2tr R2pr 69 Bảng 3.8 Ảnh hưởng moment sai số luyện đến R2tr 69 Bảng 3.9 Các mơ hình tuyến tính QESARMLR (k = - 10) giá trị thống kê 71 Bảng 3.10 Giá trị thống kê mơ hình QESARMLR (với k = - 7) 72 Bảng 3.11 Giá trị thống kê giá trị đóng góp GMPmxi,% nguyên tử mơ hình QESARMLR (với k = – 7) 73 Bảng 3.12 pGI50 nhóm kiểm tra dự đốn từ mơ hình QESARMLR, QESARANN 75 Bảng 3.13 Các mơ hình QSDARMLR giá trị thống kê 76 Bảng 3.14 Giá trị thống kê, hệ số phần trăm đóng góp độ dịch chuyển hóa học i mơ hình QSDARMLR 77 Bảng 3.15 Hoạt tính pGI50,pr dẫn xuất kiểm tra giá trị ARE,% từ mô hình QSDARMLR (với k = 7) QSDARANN với kiến trúc I(7)-HL(2)-O(1) 79 Bảng 3.16 Mối tương quan hợp chất sử dụng mơ tả điện tích ngun tử 81 Bảng 3.17 Tính chất hóa lý hoạt tính kháng ung thư pGI 50 hợp chất nghiên cứu mơ hình QSSRMLR chất dùng để dự đoán 82 Bảng 3.18 Các mơ hình QSARMLR (k từ đến 10) với giá trị R2, R2pred MSE 86 Bảng 3.19 Các giá trị thống kê giá trị phần trăm đóng góp MPmxi,% GMPmxi,% tham số mô tả phân tử 2D 3D mô hình QSAR MLR (với k 8, 10) 87 Bảng 3.20 Hoạt tính sinh học pGI50 nhóm kiểm tra từ mơ hình QSARMLR (3.16) QSARANN(1) 90 Bảng 3.21 Các mơ hình QSARMLR (k từ đến 10) với giá trị R2, R2pred MSE 91 Bảng 3.22 Các giá trị thống kê phần trăm đóng góp MPmxi,%, GMPmxi,% tham số mô tả phân tử 2D, 3D mơ hình QSARMLR (với k 5, 6, 7) 92 Bảng 3.23 Hoạt tính sinh học pGI50 nhóm kiểm tra từ mơ hình QSARMLR (3.17), QSARPCR QSARPCA-ANN 95 Bảng 3.24 Các mơ hình QSARMLR với giá trị R2tr , SE R2pr tương ứng 97 Bảng 3.25 Các giá trị thống kê phần trăm đóng góp MPmxi,%, GMPmxi,% điện tích ngun tử mơ hình QSARMLR 99 Bảng 3.26 Hoạt tính pGI50 nhóm kiểm tra dự đốn từ mơ hình QSARMLR (3.19), QSARPLS (3.20) QSARANN(2) 100 Bảng 3.27 Phần trăm gây độc tế bào GI50 (µg/ml) mẫu khảo sát dòng tế bào Hela nồng độ khác 112 vi Bảng 3.28 Giá trị GI50 (µg/ml) pGI50 mẫu flavonoid khảo sát từ thực nghiệm in vitro 113 Bảng 3.29 Hoạt tính pGI50 flavone isoflavone dự đoán từ mơ hình QESARMLR QESARANN 114 Bảng 3.30 Hoạt tính pGI50 flavone isoflavone thiết kế dự đốn từ mơ hình QSDAR MLR (M1) QSDARANN (M2) 116 Bảng 3.31 Tính chất hóa lý giá trị hoạt tính kháng ung thư pGI 50 nhóm dẫn xuất flavone isoflavone tương tự nghiên cứu từ mơ hình QSSRMLR 118 Bảng 3.32 Giá trị pGI50,pr từ mô hình QSSRMLR, QSEARMLR QSDARMLR 119 Bảng 3.33 Nhiệt độ nóng chảy thực nghiệm dự đốn từ mơ hình QSSRMLR dẫn xuất flavonoid chiết xuất 120 Bảng 3.34 Hoạt tính sinh học pGI50 hai hợp chất phân lập ZZL1, ZZL2 từ mơ hình QSARMLR (3.16) QSARANN(1) 121 Bảng 3.35 Hoạt tính GI50 (µM) 10 hợp chất nhận từ mơ hình QSAR ANN(1 122 Bảng 3.36 Hoạt tính sinh học pGI50 nhóm kiểm tra hai hợp chất phân lập luteolin daidzin từ mơ hình QSARMLR (3.18), QSARPCR QSARPCA-ANN 123 Bảng 3.37 Hoạt tính kháng ung thư pGI50 hợp chất dự đốn từ mơ hình QSARPCA-ANN ) 124 Bảng 3.38 Hoạt tính pGI50 nhóm kiểm tra dự đốn từ mơ hình QSARMLR (3.19), QSARPLS (3.20) QSARANN (2) 125 Bảng 3.39 Hoạt tính kháng ung thư pGI50 hợp chất thiết kế cách gắn nhóm vào vị trí C6, C3’ quercetin, dự đốn từ mơ hình QSARANN(2) 125 vii DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ Hình 1.1 Mối liên quan định lượng cấu trúc, tính chất, độ phản ứng, hoạt tính Hình 1.2 Giản đồ Venn mối liên quan định lượng cấu trúc tác dụng [93] Hình 1.3 Mơ hình hồi quy tuyến tính với (p = 2) [51, 66] 15 Hình 1.4 Hồi quy đa biến thường với p = 2, N = [51, 66] 18 Hình 1.5 Ý nghĩa hệ số hồi quy [51, 66] 19 Hình 1.6 Giải thích F-test [51, 66] 20 Hình 1.7 Hồi quy thành phần với p = 2, N = [52, 107] 24 Hình 1.8 Thành phần với p = [51, 106] 27 Hình 1.9 Hồi quy PLS với p = 2, N = [51, 106] 30 Hình 1.10 Sơ đồ giải thuật di truyền [10] 34 Hình 1.11 Chọn lựa hệ cha mẹ (Pk) theo phương pháp bánh xe lăn [76] 36 Hình 1.12 Chọn lựa hệ cha mẹ (Pk) theo phương pháp xếp hạng tuyến tính [76] 36 Hình 1.13 Tốn tử chéo đơn điểm [76] 37 Hình 1.14 Toán tử chéo hai điểm [76] 37 Hình 1.15 Hệ thống thần kinh sinh học tự nhiên 40 Hình 1.16 Hoạt động mạng thần kinh nhân tạo [50] 41 Hình 1.17 Cấu trúc mạng nơ ron [101] 42 Hình 1.18 Quá trình học mạng nơ ron [16] 43 Hình 1.19 Mơ hình tính tốn nơ ron [69, 77] 44 Hình 1.20 Cấu khung flavonoid quy ước đánh số [74] 47 Hình 1.21 Một số dẫn xuất flavonoid [20, 74] 47 Hình 2.1 Sơ đồ nghiên cứu tổng quát 51 Hình 2.2 Nguyên liệu sử dụng phân lập flavonoid [2] 54 Hình 2.3 Xây dựng mơ hình hồi quy đa biến 56 Hình 2.4 Quy trình phân lập dẫn xuất flavonoid [3, 59] 57 Hình 3.1 Sự giảm lượng phân tử theo mức gradient 64 Hình 3.2 Ảnh hưởng k đến R2 SE 67 Hình 3.3 Giá trị đóng góp trung bình tồn cục GMPmxi 72 Hình 3.4 Mối tương quan hợp chất: a) sử dụng điện tích; b) sử dụng tính chất hóa lý 81 Hình 3.5 Quan hệ tính chất hóa lý dự đốn liệu thực nghiệm 85 Hình 3.6 a) Hồi quy tuyến tính đa biến b) giá trị pGI50 pGI50,pred flavonoid nhóm kiểm tra 88 Hình 3.7 Tính chất thành phần tương quan giá trị pGI 50 94 Hình 3.8 Cấu trúc phân tử CSL1, C12H20O11 102 Hình 3.9 Cấu trúc phân tử AIL1, C15H10O7 103 Hình 3.10 Cấu trúc POL1, C15H10O6 104 Hình 3.11 Cấu trúc phân tử GML1, C21H20O9 106 Hình 3.12 Cấu trúc phân tử daidzin dạng elipxoit với xác xuất 50% 107 viii Hình 3.13 Cấu trúc phân tử ZZL1, C16H12O6 108 Hình 3.14 Cấu trúc phân tử ZZL1 dạng elipxoit với xác xuất 50% 109 Hình 3.15 Cấu trúc phân tử ZZL2 (C25H24O12) 110 Hình 3.16 Hoạt tính pGI50,pr dự đốn từ mơ hình tuyến tính QESARMLR flavone, isoflavone chất mẫu 113 Hình 3.17 Cấu trúc dược chất nghể (Polygonum hydropiper) [2] 117 Hình 3.18 Cấu trúc dược chất hoàng cầm (Scutellaria baicalensis) [2] 117 Hình 3.19 Các giá trị pGI50 hợp chất với hợp chất mẫu a) ZZL1, b) ZZL2 122 Hình 3.20 So sánh giá trị pGI50 năm flavonoid với chất mẫu a) POL1; b) GML1 123 Hình 3.21 So sánh giá trị pGI50 năm flavonoid với chất mẫu a) AIL1; b) CSL1 126 ix MỤC LỤC LỜI CAM ĐOAN i LỜI CẢM ƠN ii DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT iii DANH MỤC CÁC BẢNG vi DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ viii MỤC LỤC x MỞ ĐẦU CHƯƠNG TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 BỆNH UNG THƯ CỔ TỬ CUNG 1.1.1 Các nguyên nhân gây ung thư 1.1.2 Điều trị 1.1.3 Phòng ngừa 1.2 LIÊN HỆ GIỮA CẤU TRÚC VÀ HOẠT TÍNH 1.3 TÍNH TỐN THƠNG TIN CẤU TRÚC 1.3.1 Cơ học phân tử 1.3.2 Cơ học lượng tử 1.3.3 Phương pháp bán thực nghiệm 11 1.4 CÁC MƠ HÌNH TỐN HỌC 12 1.4.1 Hồi quy đa biến 12 1.4.2 Hồi quy thành phần 22 1.4.3 Bình phương tối thiểu riêng phần 25 1.4.4 Giải thuật di truyền 31 1.4.5 Mạng thần kinh nhân tạo (ANN) 39 1.4.5.1 Khái niệm 39 1.4.5.2 Cấu trúc mạng 40 1.4.6 Thống kê đánh giá mơ hình 45 1.4.7 Tính tốn đóng góp tham số 46 1.5 HỢP CHẤT FLAVONOID 46 1.5.1 Giới thiệu chung 46 1.5.2 Phân loại dẫn xuất flavonoid 47 x 1.5.3 Phân bố flavonoid tự nhiên 48 1.5.4 Hoạt tính sinh học flavonoid 48 1.6 PHÂN LẬP VÀ XÁC ĐỊNH CẤU TRÚC FLAVONOID 50 1.6.1 Phân lập flavonoid 50 1.6.2 Xác định cấu trúc flavonoid 50 1.6.3 Thử hoạt tính in vitro flavonoid tự nhiên 50 CHƯƠNG NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 51 2.1 SƠ ĐỒ NGHIÊN CỨU 51 2.2 CƠ SỞ DỮ LIỆU, NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP 52 2.2.1 Xây dựng sở liệu thông tin phân tử 52 2.2.2 Nguyên liệu phương pháp 52 2.2.2.1 Phần mềm ứng dụng 52 2.2.2.2 Hóa chất, thiết bị 52 2.2.2.3 Nguyên liệu 53 2.3 NGHIÊN CỨU LÝ THUYẾT 54 2.3.1 Phương pháp tính tốn thơng tin cấu trúc 54 2.3.1.1 Cơ học phân tử 54 2.3.1.2 Hóa lượng tử 54 2.3.1.3 Các tham số cấu trúc 55 2.3.2 Xây dựng mơ hình QSAR 55 2.4 SÀNG LỌC, PHÂN LẬP FLAVONOID TỰ NHIÊN 56 2.4.1 Phân lập hợp chất flavonoid 56 2.4.2 Xác định cấu trúc hóa học hợp chất flavonoid 58 2.4.2.1 Phương pháp phổ cộng hưởng từ hạt nhân 58 2.4.2.2 Đo nhiễu xạ tia X đơn tinh thể 59 2.4.3 Kỹ thuật thử hoạt tính in vitro 59 2.4.3.1 Nguyên tắc phương pháp Sulforhodamine B 59 2.4.3.2 Nuôi cấy tế bào 60 2.4.3.3 Nhuộm SRB 61 2.4.3.4 Xử lý kết 61 2.4.3.5 Xác định GI50 61 2.5 THIẾT KẾ VÀ DỰ BÁO HOẠT TÍNH CỦA FLAVONOID 62 CHƯƠNG KẾT QUẢ & THẢO LUẬN 63 xi 3.1 NGHIÊN CỨU LÝ THUYẾT 63 3.1.1 Tính tốn thông tin cấu trúc 63 3.1.1.1 Khảo sát phương pháp học phân tử 63 3.1.1.2 Khảo sát phương pháp hóa lượng tử 64 3.1.2 Tham số cấu trúc tính chất phân tử 65 3.1.2.1 Điện tích 65 3.1.2.2 Phổ 13C-NMR, 15O-NMR độ dịch chuyển hóa học 66 3.1.2.3 Tham số hóa lý 66 3.1.2.4 Tham số hình học 2D, 3D 66 3.2 XÂY DỰNG MÔ HÌNH QSAR 66 3.2.1 Khảo sát biến số mơ hình 66 3.2.2 Xây dựng mơ hình QESAR 70 3.2.2.1 Mơ hình tuyến tính QESARMLR 70 3.2.2.2 Mơ hình mạng thần kinh QESAR ANN 74 3.2.2.3 Kiểm tra khả dự đoán 75 3.2.3 Xây dựng mô hình QSDAR 75 3.2.3.1 Mơ hình tuyến tính QSDARMLR 75 3.2.3.2 Mơ hình mạng thần kinh QSDARANN 78 3.2.3.3 Kiểm tra khả dự đoán 78 3.2.4 Xây dựng mơ hình QSSRMLR 79 3.2.4.1 Nguyên tắc xây dựng 79 3.2.4.2 Tính tốn tham số hóa lý 80 3.2.4.3 Xây dựng mơ hình 80 3.2.4.4 Kiểm tra khả dự đoán 84 3.2.5 Xây dựng mơ hình QSARMLR (3.16) QSARANN(1) 85 3.2.5.1 Dữ liệu 85 3.2.5.2 Xây dựng mơ hình QSARMLR (3.16) 85 3.2.5.3 Xây dựng mô hình QSARANN(1) 89 3.2.5.4 Khả dự đoán mơ hình QSAR MLR (3.16) QSARANN(1) 90 3.2.6 Xây dựng mơ hình QSARMLR (3.17), QSARPCR (3.18) QSARPCA-ANN 91 3.2.6.1 Dữ liệu 91 3.2.6.2 Xây dựng mơ hình QSARMLR (3.17), QSARPCR (3.18) 91 3.2.6.3 Xây dựng mô hình QSARPCA-ANN 94 3.2.6.4 Khả dự đoán mơ hình 95 xii ... Thiết kế, sàng lọc số dẫn xuất flavonoid đánh giá hoạt tính gây độc lên dòng tế bào Hela dựa vào tính tốn hóa lượng tử Mục tiêu luận án Tính tốn, sàng lọc tham số mơ tả phân tử gồm: tham số. .. actiso, vài kỹ thuật phân tích hóa lý sử dụng để xác định cấu trúc phân tử dẫn xuất flavonoid Các phân tử flavonoid phân lập dự báo hoạt tính, sử dụng làm chất mẫu để thiết kế hợp chất có hoạt tính. .. tích, độ dịch chuyển hóa học, tính chất hóa lý, tham số 2D, 3D dẫn xuất flavonoid Xây dựng mơ hình quan hệ cấu trúc – hoạt tính có khả dự đốn hoạt tính kháng ung thư dẫn xuất flavone isoflavone