Mục đích: Nắm được quy trình trypsin tế bào Vero và tế bào MDCK.. chuyển môi trường, tế bào vào trong cabinet: xịt cồn các chai môi trường trước khi cho vào Cabinet.. Quan sát tế bào
Trang 1BÁO CÁO TRƯỞNG BỘ MÔN HÓA SINH- MIỄN DỊCH
V/v Kiến tập trypsin tế bào Vero và tế bào MDCK
1. Mục đích:
Nắm được quy trình trypsin tế bào Vero và tế bào MDCK
2. Thời gian, địa điểm:
- Thời gian: từ 23/4/2014
- Địa điểm : Phòng tế bào - bộ môn Hóa Sinh- Miễn dịch
3. Người thực hiện
- Học viên : BSTY Trần Thị Nhuận
- Người hướng dẫn: BSTY Phạm Thi Nga
4. Nội dung học tập
Trypsin tế bào Vero và tế bào MDCK
5. Cách tiến hành
5.1.Nguyên vật liệu
a. Tế bào:
♦ tế bào Vero P142 được mở giống vào ngày 14/ 04/ 2014
♦ tế bào MDCK
b. Môi trường, hóa chất, sinh phẩm:
MEM1x:
Đong 1 lượng nước bằng 5% tổng thể tích cần pha
VD pha 10L đong 500ml nước cất
Dùng máng để cân hóa chất, trước khi cân nên lau sạch máng
Cân Bột MEM: : 476,3 g 50L môi trường
cho vào bình đã có sẵn ít nước Không được lắc ngay sẽ đông vón
Tráng máng lắc đều với cục khuấy từ
Dùng máng khác cân NaHCO3 : 2,2 g/ 1L cho tiếp vào bình, tráng máng lắc đều
Bổ sung lượng nước sao cho đủ thể tích cần pha
Tiếp tục cho lên máy khuấy từ, lắc đều
lọc qua màng lọc 0.2µm
chỉnh pH về 7,2- 7,4 (= 6ml HCl 1N/ml)
Bổ sung Gentamycin sao cho được 50µg/ 1ml
MEM 10% FBS
Cứ 100 ml môi trường MEM1x thì bổ sung 10ml huyết thanh bào thai bò đã được làm ấm ở 560C
PBS- :
♦ Lấy 1 lượng nước cất 2x không quá 5%V cần sử dụng
♦ cân bột PBS bằng cân chân không (mPBS= 9,5500g/100ml)
♦ Cho PBS vừa cân vào chai nước cất 2x, tráng máng vừa cân PBS, lắc đều cho bột tan hết ( lắc bằng tay nếu lượng môi trường ít, lắc trên máy khuấy
từ nếu pha với 1 lượng lớn
Trang 2♦ Thêm nước cất vừa đủ lượng thể tích cần pha Tiếp tục lắc đều.
♦ Kiểm tra pH: có thể sử dụng máy đo pH hoặc giấy so màu
♦ Dùng pipet hút 1 ít dung dịch nhỏ lên giấy rồi so màu Dùng NaOH 1N hoặc HCl 1N để điều chỉnh pH của môi trường (pH = 7,2 – 7,4)
♦ San môi trường ra các chai Scott nhỏ vô trùng Đem hấp 1210C/15 phút
c. Dụng cụ an toàn sinh học
- Mũ, quần áo, khẩu trang, gang tay
- Chai xịt cồn 700
d. Dụng cụ hấp, sấy:
♦ Cốc đựng thủy tinh
♦ ống ly tâm 15
♦ chai nuôi tế bào T25
♦ khay đựng dụng cụ
♦ type 5ml, type 200µl
♦ hộp giấy
e. Máy móc, thiết bị
♦ Pipet 5ml
♦ Cabinet
♦ Máy ly tâm
♦ Tủ ấm CO2
♦ Tủ lạnh 40C, -300C 5.2.Các bước thực hiện:
Bước 1: cho môi trường về nhiệt độ phòng và vô trùng Cabinet
Chuyển môi trường về nhiệt độ phòng:
Mục đích: không làm ảnh hưởng tế bào vì nếu để nhiệt độ quá thấp sẽ gây chết tế bào
• MEM1x, MEM10%FBS, PBS- bảo quản trong tủ lạnh 40C
• Chuyển môi trường đang bảo quản trong tủ lạnh đưa ra ngoài để tan đông
Vô trùng Cabinet trong 15 phút:
+ Vặn chìa khóa tủ ở số 2, ấn nút UV lamp
+ đèn tử ngoại sáng, đồng thời xuất hiện tiếng kêu Để tắt tiếng kêu, ta ấn nút Stop Vô trùng tủ trong 15 phút
+ Sau 15 phút tắt đèn tử ngoại bằng cách ấn nút UV lamp và chìa khóa cabinet ở
vị trí số 0
Cách sử dụng cabinet:
+ Mở cánh cửa tủ cabinet ra
+ Vặn chìa khóa tủ về vị trí số 1, núm quạt gió sẽ tự động hoạt động (không cần
ấn nút FAN) Khi quạt gió hoạt động ấn nút biểu tượng đèn (bên cạnh núm FAN)
Tủ cấy có 2 màng lọc khí: khí qua màng lọc thì đèn sẽ bật xanh Chỉ được làm việc khi cả 2 đèn đều xanh
chuyển môi trường, tế bào vào trong cabinet: xịt cồn các chai môi trường trước khi cho vào Cabinet
Bước 2: quan sát tế bào trên KHV soi ngược
Trang 3 Mục đích: quan sát mức độ phát triển của tê bào, tỷ lệ tế bào bám đáy
Cách tiến hành:
Cách sử dụng KHV soi ngược: Cắm điện 220Vbật công tắc máymở đèn ở mức cao nhất điều chỉnh ốc vĩ cấp, ốc vi cấp để quan sát ảnh tế bào
Quan sát tế bào thấy:
• Tế bào Vero: tế bào hình thuôn dài, phủ kín bề mặt chai nuôi
• Tế bào MDCK: tế bào hình đa giác, nhỏ, xếp khít nhau, phủ kín bề mặt chai nuôi
Bước 3: Loại bỏ môi trường đang nuôi tế bào
Mục đích: loại bỏ tế bào chết
Cách tiến hành:
lắc nhẹ chai nuôi, lắc ngang chai
mở nắp chai, nghiêng chai về mặt không có tế bào
Dùng pipet lắp đầu type 5ml hút bỏ môi trường vào cốc thủy tinh đựng rác
Bước 4: Rửa tế bào
Mục đích: loại bỏ tế bào chết, huyết thanh và môi trường còn sót lại
Cách tiến hành:
Thêm vào chai nuôi tế bào 1 lượng PBS- để rửa tế bào (15ml PBS- vào chai nuôi T75, 5ml PBS- vào chai nuôi T25)
Lắc ngang chai nuôi, cầm nghiêng chai, hút bỏ PBS- vừa rửa
Rửa tiếp chai nuôi tế bào bằng PBS- một lần nữa
Chú ý khi xả PBS- vào gần miệng chai, không cho sâu quá, cho vào mặt không có tế bào bám dính, đầu pipet không được chạm vào thành chai
Bước 5: Trypsin tế bào
• Mục đích: tách tế bào ra khỏi đáy bình
• Cách tiến hành:
♦ Dùng pipet hút 3ml trypsin 1x cho vào chai T75, 1ml trypsin cho vào chai T25, xả trypsin vào mặt chai không có tế bào, nghiêng chai nhẹ nhàng để các
tế bào đồng pha cùng tách nhau
♦ Trypsin hoạt động tốt ở 370C cho vào tủ ấm
Đối với tế bào Vero: thời gian trypsin nhanh, không cần để trong tủ ấm, theo dõi sự tách tế bào trên kính hiển vi
Tế bào MDCK: để tủ ấm 25-30 phút Để khoảng 20 phút trong tủ ấm rồi mang xem sự tách tế bào trên kính hiển vi, nếu tế bào chưa tách nhau hoàn toàn thì để tiếp trong tủ ấm
♦ Thời gian Trypsin phụ thuộc vào :
Dòng tế bào: dòng tế bào liên kết lỏng lẻo thì Thời gian Trypsin nhanh hơn dòng tế bào liên kết chặt chẽ
Tình trạng tế bào: tế bào đang trong giai đoạn phát triển trypsin lâu hơn so với các tế bào già yếu, tế bào quá non
♦ Chú ý không được lắc chai nuôi TB
Bước 7: trung hòa trypsin bằng MEM10%FBS
Trang 4• Mục đích: dừng quá trình trypsin
• Cách tiến hành:
♦ Vỗ mạnh chai để tách hết các tế bào bám dính đáy bình (tránh làm môi trường bắn lên thành bình)
♦ ;Dùng pipet hút 7ml môi trường MEM10%FBS cho vào chai T75 nuôi MDCK, 2,5 ml môi trường MEM10%FBS cho vào chai T25 nuôi Tế bào Vero
để trung hòa trypsin
♦ Dùng pipet đảo đều môi trường, tưới đều lên mặt tế bào bám đáy, lắc đều nhiều lần để bong hết các tế bào bám dính đáy chai
♦ Chuyển hết huyễn dịch vào ống fancol 50ml (chú ý khi mở nắp ống không chạm tay vào miệng ống fancol) Đậy nắp, Bao dán paraffin, lắc nhẹ, đem ly tâm
Bước 8: Ly tâm
• Mục đích: thu cặn tế bào
• Cách tiến hành:
♦ Cho ống fancol chứa huyễn dịch đem ly tâm 700v/phút trong 10 phút
♦ Ly tâm xong, dung pipet hút hết dung dịch ở phía trên, giữ lại cặn tế bào (chú
ý không để đầu type chạm vào đáy ống có tế bào)
♦ Đánh tan cặn tế bào bằng cách: cọ mạnh đáy ống vào vùng thông khí
Bước 9: Đánh tan cặn tế bào
• Mục đích: Đánh tan cặn tế bào
• Cách tiến hành:
♦ Dùng pipet hút 7ml môi trường MEM10%FBS cho vào ống fancol vừa ly tâm
để đánh tan cặn tế bào.
♦ Dùng pipet đảo đều, cọ đáy ống vào vùng thông khí
Bước 10: Tráng sạch chai nuôi tế bào
• Mục đích: loại bỏ các tế bào, môi trường còn sót lại, tránh sự tạp nhiễm, chống nấm phát triển
• Cách tiến hành:
♦ Hút 15ml PBS- cho vào chai T75, 5 ml PBS- vào T25 vừa nuôi tế bào
♦ Lắc mạnh, rửa sạch chai
♦ Nghiêng chai để hút bỏ môi trường PBS- vừa rửa
Bước 11: Ra chai nuôi
• Mục đích: Tiếp tục nuôi tế bào, để tế bào nhân lên
• Cách tiến hành: