140428 bao cao tong ket thang 4 nhuan TT

140428 -bao cao tong ket thang – nhuan TT BÁO CÁO TRƯỞNG BỘ MƠN HĨA SINH- MIỄN DỊCH V/v Kết học tập nuôi cấy tế bào từ 3/4/2014 đến 26/4/2014 MỤC LỤC Trang Phụ Lục 1: Hướng dẫn sử dụng máy móc, thiết bị 1.Máy hấp: Tủ sấy .5 Cân chân không .5 Kính hiển vi soi ngược Máy Ly tâm Cabinet Phụ Lục 2: Cách pha loại môi trường nuôi cấy tế bào .8 Quy trình chuẩn bị môi trường MEM1x .10 Huyết bào thai bò (FBS) 11 Phụ lục 3: Quy trình mở giống tế bào .12 1.Nguyên vật liệu .12 2.Các bước thực hiện: .13 Phụ lục 4: Quy trình cất giống tế bào .15 Nguyên vật liệu 15 2.Các bước thực hiện: .16 Phụ Lục 5: Quy trình tế bào Trypsin 19 Nguyên vật liệu 19 2.Các bước thực hiện: .21 Phụ lục 6: Quy trình ni cấy sơ phơi lớp (Đối với phôi) .23 1.NGUYÊN VẬT LIỆU 23 2.Các bước thực hiện: .25 Mục đích Nắm quy tắc phòng thí nghiệm Biết cách chuẩn bị dụng cụ Biết sử dụng máy móc, thiết bị phòng thí nghiệm Kiến tập ELISA cúm lợn, cất giống tế bào, trypsin tế bào, mở giống tế bào Biết cách nuôi cấy tế bào xơ phôi gà lớp 140428 -bao cao tong ket thang – nhuan TT Biết cách xử lý mẫu Swab, mẫu huyết Thời gian, địa điểm: Thời gian: 03/04/2014- 26/4/2014 Địa điểm : Phòng thí nghiệm- mơn Hóa Sinh- Miễn dịch Người thực Người thực hiện: BSTY Trần Thị Nhuận Người hướng dẫn: BSTY Phạm Thi Nga Nội dung học tập Kiến tập Quy trình cất giống tế bào lần (tế bào MDCK), quy trình mở giống tế bào lần ( Tế bào Vero,tế bào BHK-21), trypsin tế bào (tế bào MDCK, Tế bào Vero) Kiến tập quy trình ni cấy tế bào xơ phôi gà lớp lần Thực hành nuôi cấy tế bào xơ phôi gà lớp lần Thực hành xử lý mẫu Swab, mẫu huyết lấy từ địa phương: Thạch Thất, Chương Mỹ, Thường Tín, Đơng Anh Kiến tập làm phản ứng ELISA cúm lợn theo KIT Kết học tập Nắm quy trình: Cách sử dụng máy móc, thiết bị phòng thí nghiệm (Theo phụ lục 1) Cách pha môi trường nuôi cấy (Theo phụ lục 2) Quy trình mở giống tế bào (Theo phụ lục 3) Quy trình cất giống tế bào (Theo phụ lục 4) Quy trình trypsin tế bào (Theo phụ lục 5) Quy trình ni cấy xơ phơi gà môt lớp (Theo phụ lục 6) Những việc làm được: Nắm nguyên tắc an toàn sinh học phòng thí nghiệm Sử dụng thành thạo loại máy móc, thiết bị: Cabinet, nồi hấp,tủ sấy, máy ly tâm, máy khuấy từ, kính hiển vi soi ngược, máy ly tâm lạnh, máy Vortex, cân chân không, máy hút chân không 140428 -bao cao tong ket thang – nhuan TT Biết cách sử dụng pipet kênh Tự pha môi trường PBS-, lọc nước cất 2x Nắm bước quy trình mở giống tế bào, cất giống tế bào, trypsin tế bào nuôi cấy xơ phôi gà môt lớp Biết cách chọn trứng có phơi khỏe, mạch máu rõ ràng Chuẩn bị dụng cụ cho quy trình ni cấy Những việc chưa làm được: Thao tác sử dụng pipet chưa thành thạo, đầu pipet chạm vào thành ống fancol, chai mơi trường Sử dụng pipet đa kênh chưa thành thạo Thao tác mở nắp chai nuôi tế bào, ống fancol phải dùng hai tay Thao tác Cabinet: thao tác gần ngồi cửa Cabinet Thao tác q trình thực chưa dứt khốt, chưa bố trí thời gian cho bước thực hành: trình trypsin tế bào lâu, kiểm tra hình thái tế bào kính hiển vi lâu làm ảnh hưởng tới môi trường nuôi cấy tế bào 6.Kết luận Sau tháng theo học, nhận thấy thân học nhiều điều: từ văn hóa giao tiếp nơi cơng sở, đến kỹ thuật phòng thí nghiệm, tiếp thêm niềm đam mê tâm huyết với nghề, học cách bố trí, xếp cơng việc, sử dụng thời gian vào công việc cách hiệu Mong muốn tiếp tục theo học kỹ thuật, thực hành nhiều để tơi nâng cao chun mơn, đóng góp cho cơng ty sau Hà Nội, ngày 28 tháng năm 2014 Người thực Trần Thị Nhuận 140428 -bao cao tong ket thang – nhuan TT Phụ Lục 1: Hướng dẫn sử dụng máy móc, thiết bị Nguyên tắc: Trước sử dụng quan sát tình trạng hoạt động máy, sau sử dụng máy móc ghi vào sổ theo dõi 1.Máy hấp: Có loại máy hấp: Máy hấp chuyên hấp dụng cụ xử lý Máy hấp bẩn chuyên hấp dụng cụ, trang phục bảo hộ chưa qua xử lý Cấu tạo máy hấp: Đồng hồ thị áp suất Van áp suất Các nút điều chỉnh nhiệt độ, thời gian Bình xả nước, van xả nước Cách vệ sinh máy hấp: Sau hấp dụng cụ bẩn phải tiên hành rửa máy hấp Kiểm tra van xả áp suất Đảm bảo áp suất Tắt công tắc điện Lấy dụng cụ bẩn vừa hấp Xả máy Hòa nước xà phòng: dung chổi rửa rửa bên máy Xả nước hết xà phòng Vệ sinh bên ngồi máy hấp Thay nước bình xả nằm giới hạn cho phép Thao tác sử dụng máy hấp: Kiểm tra mực nước bình xả nước, giữ mực nước cho phép Lắp khay, giá sắt vào nồi hấp, đảm bảo lượng nước ngập khay 1-2 cm Cho giỏ đựng đồ hấp: dụng cụ hấp nên xếp tạo độ thơng thống, dụng cụ bao gói xếp trước, dụng cụ thủy tinh xếp lên Đóng cửa nồi hấp, khóa chặt van áp suất Bật cơng tắc cài đặt máy nút điều chỉnh nhiệt độ thời gian ( 1210C/30-45 phút) Ấn nút SET/ START Máy hấp hiển thị chế độ Sterile Muốn xem nhiệt độ máy hấp ấn nút CHECK HEAT 140428 -bao cao tong ket thang – nhuan TT Khi lấy đồ hấp khỏi máy hấp phải xả van xả áp đảm bảo áp suất mở máy hấp Tủ sấy Cách sử dụng tủ sấy: Bước 1: Trước mở tủ sấy phải tắt tủ sấy: ấn nút tắt công tắc máy Bước 2: Cho dụng cụ cần sấy vào tủ sấy, tùy dụng cụ mà sấy nhiệt độ khác nhau, hầu hết dụng cụ hấp 90-1000C/2-3 Bước 3: Đóng tủ sấy, bật cơng tắc máy cài đặt thời gian nhiệt độ Cách cài đẳt thời gian: Giữ nút RAM + TIME, đèn SET màu đỏ, đồng hồ hiển thị thời gian Giữ RAM sau TIME để chỉnh giảm thời gian Giữ RAM sau TEMP để tăng thời gian Sau ấn RAM, thời gian cài đặt Cách cài đặt nhiệt độ: Giữ nút RAM + TEMP, đèn SET màu đỏ, đồng hồ hiển thị nhiệt độ Giữ RAM sau TIME để chỉnh giảm nhiệt độ Giữ RAM sau TEMP để tăng nhiệt độ Sau ấn RAM, nhiệt độ cài đặt Bước 4: tủ sấy hoạt động, đèn chế độ heater Chú ý: Khi mở tủ sấy phải tắt công tắc để đảm bảo an toàn cho người sử dụng cung tránh hỏng tủ sấy Trước cho đồ vào sấy phải kiểm tra nhiệt độ thời gian, để trình hấp đảm bảo an toàn cho dụng cụ sấy khô Cân chân không Cách sử dụng: Bước 1: Cắm nguồn điện Bước 2: Cân hóa chất: 140428 -bao cao tong ket thang – nhuan TT Mở cửa cân, đưa máng vào để đựng vật cần cân Sau đóng cửa, ấn TARE, để đồng hồ thị 0.000 g Cân đủ lượng cần lấy, thao tác cẩn thận, cân xác số lượng cần dùng Bước 3: Tắt cân Ấn nút OFF để tắt máy Bước 4: Vệ sinh cân: Sau cân nguyên liệu xong cần vệ sinh cân Lau bề mặt cân Bước 5: Rút nguồn điện Để cân trạng thái nghỉ Kính hiển vi soi ngược Cấu tạo: Thị kính có độ phóng đại khác Vật kính Ốc vĩ cấp Ốc vi cấp Ốc điều chỉnh ánh sáng Cách sử dụng: Bước 1: Cắm nguồn điện Sử dụng nguồn điện 110V, cắm vào nguồn điện 110V, không cắm trực tiếp vào nguồn điện 220V gây hỏng máy, qua đổi điện Bước 2: Khởi động máy Bật công tắc đưa máy chế độ hoạt động Xoay ốc điều chỉnh độ sáng đèn lên tối đa Điều chỉnh độ sang đèn thông qua núm điều chỉnh nguồn sáng Bước 3: Soi kính Đặt chai ni tế bào buồng đếm tế bào lên khu vực soi Điều chỉnh ốc vĩ cấp lấy hình ảnh Sau điều chỉnh ốc vi cấp để chỉnh ảnh rõ nét Bước 4:Cho kính nghỉ Vặn núm điều chỉnh ánh sáng Tắt đèn Tắt công tắc nguồn 140428 -bao cao tong ket thang – nhuan TT Cho vật kính chế độ nghỉrút điện vệ sinh Kính hiển vi Máy Ly tâm Cấu tạo: Có Roto Roto 15ml với tốc độ ly tâm 3500 vòng/ phút Roto 50ml với tốc độ ly tâm vòng/phút Các nút điều chỉnh: Nút công tắc máy: ON, OFF Nút chế độ: HIGHT, LOW Đồng hồ thị tốc độ thời gian Nút điều chỉnh tốc độ Nút điều chỉnh thời gian Cách sử dụng: Máy ly tâm hoạt động dựa nguyên lý cân Bước 1: Cắm điện nguồn điện 220V Bước 2: Xếp mẫu vào ROTO Khi xếp mẫu phải đảm bảo mẫu cần ly tâm dạng đối xứng cân Dùng cân tiểu ly cần thiết Bước 3: Khởi động máy Đóng nắp máy ly tâm Ấn MAIN cho máy hoạt động Cài đặt vòng quay thời gian: Nếu ly tâm 2.500 vòng ấn HIGHT Điều chỉnh số vòng quay vặn nút speed, quan sát đồng hồ thị số vòng khoảng cần ly tâm Điều chỉnh thời gian: vặn nút TIME thị máy, chỉnh thời gian cần ly tâm Bước 4: Đưa máy trạng thái nghỉ, Ấn tắt MAIN, rút ổ điện Cabinet Trước sử dụng cabinet: trạng thái không hoạt động, chìa khóa cabinet vị trí số 0, cánh cửa tủ vị trí đóng Vơ trùng cabinet 15 phút trước sử dụng: 140428 -bao cao tong ket thang – nhuan TT Vặn chìa khóa tủ số 2, ấn nút UV lamp Đèn tử ngoại sáng, đồng thời xuất tiếng kêu Để tắt tiếng kêu, ta ấn nút Stop Vô trùng tủ 15 phút Sau 15 phút tắt đèn tử ngoại cách ấn nút UV lamp chìa khóa cabinet vị trí số Cách sử dụng cabinet: Mở cánh cửa tủ cabinet Vặn chìa khóa tủ vị trí số 1, núm quạt gió tự động hoạt động (khơng cần ấn nút FAN) Khi quạt gió hoạt động ấn nút biểu tượng đèn (bên cạnh núm FAN) Tủ cấy có màng lọc khí: khí qua màng lọc đèn bật xanh Chỉ làm việc đèn xanh Quá trình thao tác cabinet phải nhẹ nhàng, tránh đưa luồng khơng khí từ ngồi vào gây tạp nhiễm Vệ sinh cabinet sau sử dụng: Thu dọn sẽ, không để lại dụng cụ thí nghiệm cabinet Tắt quạt gió AS, vặn chìa khóa cabinet vị trí Đậy cánh cửa cabinet lại, vô trùng cabinet 15 phút (giống bước trên) Tắt cabinet hoàn toàn ( chìa khóa vị trí 0) Chú ý sử dụng cabinet: Trong q trình sử dụng cabinet, xuất tiếng kêu, để tắt tiếng kêu ấn nút Stop Không để nhiều dụng cụ Cabinet lúc làm việc sau làm việc Phụ Lục 2: Cách pha loại môi trường nuôi cấy tế bào Quy trình chuẩn bị nước cất 2x 1.1 Mục đích: dung môi để pha môi trường PBS-, MEM 1x 1.2 Nguyên vật liệu a Nước cất 2x b Vật liệu hấp vô trùng: STT Vật liệu Hệ thống lọc Satorius ( bình lọc, hệ thống dây gắn lọc) Màng lọc Cenlulose 0,22 µm Cốc định mức lít Chai Schott lít Số lượng 01 01 01 01 140428 -bao cao tong ket thang – nhuan TT c Máy móc: Máy hút chân không 1.3 Thao tác Bước 1: Thấm ướt màng lọc Màng lọc cenlulose 0,22 µm cách ngâm ngập màng lọc máng nước cất 2x Lắp màng lọc vào hệ thống lọc Satorius cho cân đối Bước 2: Nối hệ thống lọc với máy hút chân không Dùng dây gắn hệ thống lọc với đầu vào INLET máy hút chân không Dùng máy hút chân khơng hút hết khơng khí bình, tạo chênh lệch áp suất  nước từ nơi có áp suất cao đến nơi có áp suất thấp Bước 3: Lọc nước Cắm điện máy hút chân không, đổ nước cất 2x vào hệ thống lọc chân không Nước cất sau lọc vào chai Scott lít, khơng hấp nước cất q nhiều, hấp không vặn nút chai chặt gây nổ Bước 4: Bảo quản Sau hấp, nước cất 2x bảo quản nhiệt độ phòng Quy trình chuẩn bị PBS2.1 Mục đích: Là mơi trường để rửa tế bào chết nuôi cấy tế bào 2.2 Nguyên vật liệu pha PBS- lít a Nước cất 2x lọc hấp vơ trùng lít b Hóa chất: Hộp PBS bột 9,55 gam/1lit c Vật liệu hấp vô trùng: STT d Máy móc: Vật liệu Giấy lau Máng cân Đầu type 200µl Thìa cân Chai Schott lít Chai Schott 250ml Cốc định mức lít Số lượng 01 01 01 01 01 04 01 STT Vật liệu Cân chân không Giấy đo pH Số lượng 01 01 140428 -bao cao tong ket thang – nhuan TT Pipet 10-100 µl 01 2.3 Thao tác Bước 1: Chuẩn bị nước cất Lấy lượng nước cất 2x vô trùng 200- 300ml Bước 2: Cân PBS Dùng máng cân 9,55 gam bột PBS Bước 3: Pha PBS Cho PBS vừa cân vào chai nước cất 2x, tráng máng vừa cân PBS, lắc cho bột tan hết ( lắc máy khuấy từ pha với lượng lớn) Chuyển lượng môi trường vừa pha sang cốc định mức lít, cho thêm lượng nước cất đủ thể tích cần pha Chuyển tồn lít mơi trường từ cốc định mức sang chai Schott lít, lắc cho tan hết Bước 4: Kiểm tra pH Có thể sử dụng máy đo pH giấy đo pH Dùng pipet hút dung dịch nhỏ lên giấy đo pH Dùng NaOH 1N HCl 1N để điều chỉnh pH môi trường (pH = 7,2 – 7,4) Bước 5: Bảo quản Chia môi trường chai Schott nhỏ vô trùng Đem hấp 1210C/15 phút Để nguội Bảo quản 40C đến sử dụng Quy trình chuẩn bị mơi trường MEM1x 3.1 Mục đích: Là môi trường để tế bào sinh trưởng phát triển 3.2 Nguyên vật liệu pha MEM 1x lít a Nước cất 2x lọc hấp vô trùng lít b Hóa chất: NaHCO3……… 2,2g MEM bột…… 9,53g Gentamycin…….50µg c Vật liệu hấp vơ trùng: STT Vật liệu Giấy lau Số lượng 01 10 140428 -bao cao tong ket thang – nhuan TT Dùng pipet chuyển hết lượng huyễn dịch tế bào vừa đánh tan cặn có bổ sung 6ml MEM 10% vào chai ni T25 Lắc nhẹ nhàng chai nuôi Bước 7: Vệ sinh cabinet sau sử dụng Chuyển dụng cụ vừa thao tác khỏi cabinet Dùng giấy lau xịt cồn lau Cabinet Đóng cửa Cabinet, bật UV 30 phút Bước 8: Theo dõi phát triển tế bào Nuôi tế bào 370C, 5%CO2 Hàng ngày theo dõi tế bào kính hiển vi soi ngược Phụ lục 4: Quy trình cất giống tế bào Nguyên vật liệu a Tế bào phát triển, tỷ lệ bám đáy 100% (Thường sau 2-3 ngày trypsin) b Mơi trường, hóa chất, sinh phẩm: MEM1x: Thành phần: NaHCO3……………… 2,2g MEM bột…… 9,53g Gentamycin…………… 50µg Nước cất vơ trùng vừa đủ lít MEM 10% Thành phần: MEM1x……………….100ml FBS…………………….10ml FBS: Thành phần: PBS bột ………………… 9,55 gam Nước cất vô trùng vừa đủ …….1 lít Pha dung dịch cất giống Lượng dung dịch cất giống chiếm 50% cần pha 5ml dung dịch cất giống sau qua màng lọc 15 140428 -bao cao tong ket thang – nhuan TT Cách pha 6ml dung dịch cất giống 20% PBS, 20% DMSO: Lấy ống fancol 50ml vô trùng Dùng pipet hút 3,6 ml MEM10% Thay đầu type, hút tiếp 1,2ml PBS cho vào ống Cho tiếp vào ống 1,2ml DMSO Dùng xilanh, kim tiêm vô trùng hút hết dung dịch cất giống ống fancol, lắp xilanh vào đầu lọc 0.45, bơm qua lọc cho vào ống fancol Chú ý : không cho PBS sau cho DMSO, gây kết tủa c Dụng cụ an toàn sinh học Mũ, quần áo, trang, găng tay Chai xịt cồn 700 d.Dụng cụ hấp, sấy: STT Vật liệu Cốc đựng thủy tinh Ống ly tâm 15 Chai nuôi tế bào T25 Khay đựng dụng cụ Type 5ml Type 200µl ống Tube cất giống Cốc thủy tinh đựng rác Số lượng 01 01 01 01 01 (hộp) 01 (hộp) 01 01 e.Máy móc, thiết bị STT Vật liệu Pipet 5ml Cabinet Máy ly tâm Tủ ấm CO2 Tủ lạnh 40C Tủ lạnh -200C Tủ lạnh -800C Hộp đá khô Số lượng 01 01 01 01 01 01 01 01 2.Các bước thực hiện: Bước 1: Chuẩn bị Cabinet đưa môi trường nhiệt độ phòng Chuẩn bị Cabinet: Vơ trùng Cabinet 15 phút 16 140428 -bao cao tong ket thang – nhuan TT Chuyển mơi trường nhiệt độ phòng: Mục đích: khơng làm ảnh hưởng tế bào để nhiệt độ thấp gây chết tế bào MEM1x, MEM10%, PBS- bảo quản tủ lạnh 40C Chuyển môi trường bảo quản tủ lạnh đưa để tan đông Bước 2: Quan sát tế bào Mục đích: quan sát mức độ phát triển tê bào, tỷ lệ tế bào bám đáy Cách tiến hành: Khi tế bào phát triển tốt, tỉ lệ bám đáy 100% Bước 3:Loại bỏ mơi trường ni: Mục đích: loại bỏ tế bào chết Cách tiến hành: Lắc nhẹ chai nuôi, lắc ngang chai Mở nắp chai, nghiêng chai mặt khơng có tế bào Dùng pipet lắp đầu type 5ml hút bỏ môi trường vào cốc thủy tinh đựng rác Bước 4:Rửa PBSMục đích: loại bỏ tế bào chết, huyết mơi trường sót lại Cách tiến hành: Thêm vào bình ni PBS- vào chai ni (15ml/chai T75) Rửa lần PBS- Chú ý: Khi hút môi trường: thao tác khơng đưa khơng khí vào chai mơi trường cách ấn đầu pipet ngồi đưa đầu type vào hút môi trường Bước 5: Trypsin tế bào Mục đích: tách tế bào khỏi đáy bình Cách tiến hành: Dùng pipet hút 3ml trypsin 1x cho vào mặt chai khơng có tế bào, nghiêng chai nhẹ nhàng để tế bào đồng pha tách Quan sát tế bào sau trypsin kính hiển vi tế bào bắt đầu co tròn lại, tách rời tiến hành dừng trypsin Nếu tế bào chưa tách rời để tiếp tủ ấm 3-5 phút tế bào đồng pha Chú ý: Không lắc chai nuôi TB 17 140428 -bao cao tong ket thang – nhuan TT Bước 6: Trung hòa trypsin Mục đích: Dừng q trình trypsin Cách tiến hành: Vỗ mạnh chai để tế bào tách hồn tồn (tránh làm mơi trường bắn lên thành bình) Dùng pipet hút 7ml mơi trường MEM10%FBS cho vào chai ni để trung hòa trypsin Dùng pipet đảo môi trường, tưới lên mặt tế bào bám đáy, lắc nhiều lần để bong hết tế bào bám dính đáy chai Chuyển hết huyễn dịch vào ống fancol 50ml (chú ý mở nắp ống không chạm tay vào miệng ống fancol) Đậy nắp, Bao dán paraffin, lắc nhẹ, đem ly tâm Bước 7: Ly tâm đánh tan cặn Mục đích: thu cặn tế bào Cách tiến hành: Cho ống fancol chứa huyễn dịch đem ly tâm 700v/phút 10 phút Dùng pipet hút hết dung dịch phía trên, giữ lại cặn tế bào Hút 3ml môi trường MEM10% cho vào ống, dùng pipet đảo hoặcrầ nhẹ đáy ống vào mặt cabinet để đánh tan hoàn toàn cặn tế bào Chú ý : Khi hút không để đầu type chạm vào đáy ống có tế bào Bước 8: Đếm tế bào Mục đích: xác định lượng tế bào có 1ml huyễn dịch Cách tiến hành: Pha loãng tế bào 10 lần với MEM10%FBS : Hút 900µl mơi trường MEM10% cho vào ống eppendorf Cho vào 100µl huyễn dịch tế bào vào trộn Pha loãng huyễn dịch tế bào với thuốc nhuộm trypan blue theo hệ số pha loãng 2: cho vào ống eppendorf 100µl huyễn dịch tế bào vừa pha lỗng 10 lần với 100µl trypan blue Dùng pipet hút lượng huyễn dịch tế bào sau nhuộm nhỏ từ từ vào buồng đếm tế bào Đếm sô tế bào buồng đếm: 18 140428 -bao cao tong ket thang – nhuan TT Đếm tế bào góc, góc có 16 vng nhỏ, đếm số tế bào nằm khung 16 ô vuông nhỏ Đếm tế bào riêng lẻ đám tế bào Đếm theo hình zic zắc Đếm tế bào có kích thước tương đồng Không đếm tế bào chết bắt màu xanh, đếm tế bào sống Ước lượng số tế bào 1ml: số tế bào/1ml = (số tế bào đếm 4góc/4 )x x độ pha loãng tế bào x 104 Bước 9: Ra chai cất giống tế bào: Mục đích: Lưu giữ giống tế bào (106 cell/ tube) Cách tiến hành: Dùng pipet hút 1,5 ml huyễn dịch tế bào + 3,5 ml môi trường MEM10% FBS cho vào ống fancol chứa dung dịch cất giống vừa lọc Dùng pipet trộn môi trường, chia vào ống cất giống,mỗi ống cất 1ml Xoáy chặt nắp ống, bao dán paraffin Bước 10: Bảo quản tế bào Giữ ống giống hộp đá Sau chuyển sang tủ lạnh -200 C/ 2-3 Chuyển sang tủ -800 C Chuyển vào nitơ cần thiết Bước 11: Vệ sinh Cabinet sau sử dụng Chuyển dụng cụ vừa thao tác khỏi cabinet Dùng giấy lau xịt cồn lau Cabinet Đóng cửa Cabinet, bật UV 30 phút Phụ Lục 5: Quy trình tế bào Trypsin Nguyên vật liệu a Tế bào phát triển, tỷ lệ bám đáy 90-100% b Môi trường, hóa chất, sinh phẩm: MEM1x: 19 140428 -bao cao tong ket thang – nhuan TT Thành phần: NaHCO3……………… 2,2g MEM bột…… 9,53g Gentamycin…………… 50µg Nước cất vơ trùng vừa đủ lít MEM 10% Thành phần: MEM1x……………….100ml FBS…………………….10ml FBS: Thành phần: PBS bột ………………… 9,55 gam Nước cất vơ trùng vừa đủ …….1 lít c Dụng cụ an toàn sinh học Mũ, quần áo, trang, găng tay Chai xịt cồn 700 d.Dụng cụ hấp, sấy: STT Vật liệu Giá để ống nghiệm Hộp type 200µl Hộp type 5ml Ống Fancol 50ml Chai nuôi cấy tế bào T75 Số lượng 01 01 01 01 02 e.Máy móc, thiết bị STT Vật liệu Pipet 5ml Pipet 10 - 100µl Cabinet Máy ly tâm Tủ ấm CO2 Tủ lạnh 40C Tủ lạnh -200C Kính hiển vi Bộ buồng đếm tế bào Số lượng 01 01 01 01 01 01 01 01 01 20 140428 -bao cao tong ket thang – nhuan TT 2.Các bước thực hiện: Bước 1: Chuẩn bị Cabinet đưa môi trường nhiệt độ phòng Chuẩn bị Cabinet: Vơ trùng Cabinet 15 phút Chuyển môi trường nhiệt độ phòng: Mục đích: khơng làm ảnh hưởng tế bào để nhiệt độ thấp gây chết tế bào MEM1x, MEM10%, PBS- bảo quản tủ lạnh 40C Chuyển môi trường bảo quản tủ lạnh đưa ngồi để tan đơng Bước 2: Quan sát tế bào Mục đích: Quan sát mức độ phát triển tế bào, tỷ lệ bám đáy Cách quan sát: Quan sát màu sắc môi trường, độ đục trong, tỷ lệ tế bào bám đáy Khi quan sát kính hiển vi thấy tế bào bám đáy 90 – 100% tiến hành trypsin tế bào Bước 3: Loại bỏ môi trường ni tế bào Mục đích: loại bỏ tế bào chết Cách tiến hành: Lắc nhẹ chai nuôi, lắc ngang chai Mở nắp chai, nghiêng chai mặt tế bào Dùng pipet lắp đầu type 5ml hút bỏ môi trường vào cốc thủy tinh đựng rác Bước 4: Rửa tế bào Mục đích: loại bỏ tế bào chết, huyết mơi trường sót lại Cách tiến hành: Cho vào chai nuôi tế bào lượng PBS- để rửa tế bào (15ml PBS- vào chai nuôi T75, 5ml PBS- vào chai nuôi T25) Lắc ngang chai nuôi, cầm nghiêng chai, hút bỏ PBS- vừa rửa Rửa tiếp chai nuôi tế bào PBS- lần Chú ý : cho PBS- nên để đầu type vào gần miệng chai, không cho sâu quá, cho vào mặt khơng có tế bào bám dính, đầu pipet khơng chạm vào thành chai Bước 5: Trypsin tế bào 21 140428 -bao cao tong ket thang – nhuan TT Mục đích: tách tế bào khỏi đáy bình Cách tiến hành: Dùng pipet hút 3ml trypsin 1x cho vào chai T75, 1ml trypsin cho vào chai T25 Cho trypsin vào mặt chai khơng có tế bào, nghiêng chai nhẹ nhàng để tế bào đồng pha tách Thời gian trypsin từ -45 phút Chú ý : Khơng lắc chai ni TB Bước 6: Trung hòa trypsin Mục đích: dừng q trình trypsin Cách tiến hành: Vỗ mạnh chai để tách hết tế bào bám dính đáy bình (tránh làm mơi trường bắn lên thành bình) Dùng pipet hút 7ml mơi trường MEM10%FBS cho vào chai T75, 2,5 ml môi trường MEM10%FBS cho vào chai T25 ni để trung hòa trypsin Dùng pipet đảo môi trường, tưới lên mặt tế bào bám đáy, lắc nhiều lần để bong hết tế bào bám dính đáy chai Chuyển hết huyễn dịch vào ống fancol 50ml (chú ý mở nắp ống không chạm tay vào miệng ống fancol) Đậy nắp, Bao dán paraffin, lắc nhẹ, đem ly tâm Bước 7: Ly tâm Mục đích: thu cặn tế bào Cách tiến hành: Cho ống fancol chứa huyễn dịch đem ly tâm 700v/phút 10 phút Ly tâm xong, dùng pipet hút hết dung dịch phía trên, giữ lại cặn tế bào Đánh tan cặn tế bào cách: Rà mạnh đáy ống vào Cabinet dùng pipet đảo Chú ý: Trước ly tâm, ống ly tâm phải đóng chặt nút bao dán paraffin Khi hút bỏ môi trường, tránh để đầu type chạm vào cặn tế bào Bước 8: Cân mơi trường Mục đích: Đánh tan cặn tế bào 22 140428 -bao cao tong ket thang – nhuan TT Cách tiến hành: Dùng pipet hút 7ml môi trường MEM10% cho vào ống fancol vừa ly tâm để đánh tan cặn tế bào Dùng pipet đảo rà mạnh vào cabinet Bước 9: Tráng chai ni tế bào Mục đích: loại bỏ tế bào, mơi trường sót lại, tránh tạp nhiễm, chống nấm phát triển Cách tiến hành: Hút 15ml PBS- cho vào chai T75, 5ml PBS- vào T25 vừa nuôi tế bào Lắc mạnh, rửa chai Nghiêng chai để hút bỏ môi trường PBS- vừa rửa Bước 10: Ra chai ni Mục đích: Tiếp tục ni tế bào, để tế bào nhân lên Cách tiến hành: Dùng pipet hút 6ml MEM10% cho vào T25, 20ml MEM10% cho vào chai T75 Dùng pipet lấy 1ml huyễn dịch cho vào chai nuôi Lắc nhẹ nhàng để tế bào trải khắp mặt đáy chai nuôi Bước 11: Vệ sinh cabinet sau sử dụng Thu dọn rác, Chuyển dụng cụ vừa thao tác khỏi cabinet Dùng giấy lau xịt cồn lau Cabinet Đóng cửa Cabinet, bật UV 30 phút Bước 12: Theo dõi phát triển tế bào Nuôi tế bào tủ ấm 370C, 5% CO2 Hằng ngày quan sát tế bào phát triển đáy chai ni kính hiển vi soi ngược Phụ lục 6: Quy trình ni cấy sơ phơi lớp (Đối với phơi) 1.NGUN VẬT LIỆU a.Trứng gà có phơi: 10-11 ngày tuổi Phơi khỏe mạnh, có nhiều mạch máu b Mơi trường, hóa chất, sinh phẩm: 23 140428 -bao cao tong ket thang – nhuan TT MEM1x: Thành phần: NaHCO3……………… 2,2g MEM bột…… 9,53g Gentamycin…………… 50µg Nước cất vơ trùng vừa đủ lít MEM 10% Thành phần: MEM1x……………….100ml FBS…………………….10ml FBS: Thành phần: PBS bột ………………… 9,55 gam Nước cất vơ trùng vừa đủ …….1 lít Trypan blue 0,4% Trypsin –EDTA bảo quản -200C c Dụng cụ an toàn sinh học Mũ, quần áo, trang, găng tay Chai xịt cồn 700 d.Dụng cụ hấp, sấy: STT Vật liệu Giá để ống nghiệm Hộp type 200µl Hộp type 5ml Ống Fancol 50ml Chai nuôi cấy tế bào T25 Số lượng 01 01 01 01 01 e.Máy móc, thiết bị STT Vật liệu Pipet 5ml Pipet 10 - 100µl Cabinet Máy ly tâm Tủ ấm CO2 Tủ lạnh 40C Số lượng 01 01 01 01 01 01 24 140428 -bao cao tong ket thang – nhuan TT Tủ lạnh -200C Kính hiển vi Bộ buồng đếm tế bào 01 01 01 2.Các bước thực hiện: Bước 1: Chuẩn bị Cabinet đưa mơi trường nhiệt độ phòng Chuẩn bị Cabinet: Vô trùng Cabinet 15 phút Chuyển môi trường nhiệt độ phòng: Mục đích: khơng làm ảnh hưởng tế bào để nhiệt độ thấp gây chết tế bào MEM1x, MEM10%, PBS- bảo quản tủ lạnh 40C Chuyển môi trường bảo quản tủ lạnh đưa ngồi để tan đơng Bước 2: Soi trứng để chọn phơi Mục đích: chọn trứng có phơi khỏe Cách tiến hành: Chọn trứng có phơi khỏe, mạch máu rõ ràng, phôi 9-11 ngày tuổi, tốt trứng 10 ngày tuổi Bước 3: Chuyển môi trường, dụng cụ cần thiết vào Cabinet Cho cacbinet trạng thái hoạt động Xịt cồn trứng, chai môi trường đưa nhiệt độ phòng trước đó, dụng cụ trước cho vào Cabinet Sắp xếp Cabinet cho gọn gang để thuận tiện thao tác Bước 4: Chia PBS- cốc đong Mục đích: rửa phơi Cách tiến hành: Đổ mơi trường PBS- vào cốc đong thủy tinh , 40 ml/ phôi Bước 5: Xử lý phơi Mục đích: lấy phơi, cắt nhỏ phôi Cách tiến hành: Sát trùng vỏ trứng vùng buồng cồn 70 Dùng pank làm vỡ vỏ trứng 25 140428 -bao cao tong ket thang – nhuan TT Dùng kéo cắt vỏ trứng xung quanh buồng Dùng pank gắp bỏ lớp màng nhung niệu Nhấc phôi cho vào cốc thủy tinh chuẩn bị sẵn PBSDùng pank kẹp phôi, lắc lắc lại nhiều lần PBS Chuyển phôi sang đĩa lồng pettri Tay trái cầm pank giữ phôi, tay phải dùng kéo cắt bỏ đầu phôi, hai chân, cánh, mổ bụng loại bỏ hết nội tạng Nhấc thân phơi vào cốc thủy tinh có PBS- rửa máu lần Chuyển phôi sang đĩa pettri khác, dùng pank nhẹ nhàng ép phôi để loại bỏ hết máu Dùng kéo cắt nhỏ phôi (không cắt phôi nhỏ) Chuyển phôi cắt nhỏ cho vào cốc thủy tinh có sẵn cục khuấy từ Bước 6: Trypsin tách tế bào phơi Mục đích: Tách tế bào phôi Cách tiến hành: Cho 15 ml PBS- 5ml trypsin cho vào cốc thủy tinh chứa phôi cục khuấy từ Hút 50µl kháng sinh Gentamycin cho tiếp vào cốc Đậy nắp giấy bạc, dùng tay lắc cốc Đem khuấy từ nhiệt độ phòng, khuấy với tốc độ vừa phải, vừa khuấy vừa kiểm tra độ đục huyễn dịch Khi thấy huyễn dịch đục, phôi đánh tan, cặn huyễn dịch thấy mẩu xương chân, xương đùi, xương cánh, xương cột sống dừng khuấy từ lại ( 13-15 phút) Chú ý: Quyết định thời gian trypsin tách tế bào cách quan sát trình khuấy từ đến huyễn dịch chuyển từ trạng thái sang đục Khi định dừng q trình trypsin Bước 7: Trung hòa trypsin MEM10% Mục đích: dừng q trình trypsin tách tế bào Cách tiến hành: Dùng micropipette hút 5ml môi trường MEM10%FBS cho vào cốc thủy tinh chứa phôi vừa khuấy từ để trung hòa lượng trypsin Lắc cốc 26 140428 -bao cao tong ket thang – nhuan TT Đem lọc Cho phễu lên ống fancol 50 vừa chuẩn bị Lọc huyễn dịch tế bào màng lọc lớp vải gạc, loại bỏ cặn Chú ý: Mở bao gói phễu hấp, sấy tiệt trùng, tránh chạm tay vào thân phễu màng lọc miệng phễu Bước 8: Ly tâm Mục đích: thu lấy cặn tế bào Cách tiến hành: Ống fancol chứa huyễn dịch tế bào vừa lọc đem bao kín nắp paraffin, cho lên máy ly tâm với tốc độ 700 vòng/phút, 10 phút Dùng pipet hút hết phần dung dịch phía bỏ đi, giữ lại cặn tế bào Dùng pipet hút 3ml môi trường MEM10%FBS cho vào ống fancol 15 Dùng pipet hút lấy cặn tế bào cho vào ống môi trường Đánh tan cặn cách dùng pipet trộn cọ đáy ống vào Cabinet Chú ý: Sau ly tâm xong, lấy ống cho vào Cabinet phải xịt cồn, ý không lắc làm tan cặn tế bào đáy ống Chú ý thao tác cẩn thận tránh hút hồng cầu Bước 9: Đếm tế bào Mục đích: định lượng số tế bào có 1ml huyễn dịch Cách tiến hành: Pha lỗng tế bào: hút 900µl mơi trường MEM10% 100µl huyễn dịch tế bào cho vào ống eppendorf, dùng pipet trộn Pha huyễn dịch tế bào với thuốc nhuộm: hút 100µl huyễn dịch tế bào pha lỗngcho vào ống eppendorf với 100µl thuốc nhuộm trypan blue, trộn Dùng pipet hút lượng tế bào nhuộm nhỏ từ từ lên cạnh buồng đếm Cách đếm tế bào: Đếm tế bào góc lớn, góc lớn có 16 vng nhỏ, đếm theo hình zic zắc Khơng đếm tế bào chết bắt màu xanh Đếm tế bào có hình tròn nhỏ, màu trắng, có kích thước tương đồng nhau, khơng đếm tế bào có kích thước nhỏ hơn, khơng đếm hồng cầu ( tế bào hình thon dài có nhân trông giống mắt mèo) Ước lượng số tế bào có 1ml huyễn dịch: 27 140428 -bao cao tong ket thang – nhuan TT X = (tổng số tế bào đếm /4 ) x độ pha loãng tế bào x x 104 Tính tốn lượng huyễn dịch tế bào môi trường nuôi cấy để chai 6ml / chai T25, 20ml/ T75 Bước 10: Ra chai Mục đích: ni tế bào sơ phơi chai T25 Cách tiến hành: Cho môi trường vào chai ni T25: nới lỏng nắp chai ni, lòng bàn tay trái ôm lấy mặt đáy chai mà tế bào bám dính, ngón út ngón áp út ơm lấy thân chai, ngón ngón trỏ tay trái để mở nắp chai Tay phải cầm pipet hút môi trường cho vào chai nuôi Chú ý đầu type chạm vào mặt chai tế bào bám dính, khơng để mơi trường huyễn dịch bắn lên thành chai mặt không ni tế bào Dùng pipet 10-100µl hút lượng huyễn dịch tế bào mơi trường MEM10% tính tốn trước cho vào chai ni Dùng tay lắc ngang chai nuôi nhẹ nhàng để huyễn dịch tế bào trộn vào môi trường Bước 11: Vệ sinh cabinet sau sử dụng Thu dọn rác, Chuyển dụng cụ vừa thao tác khỏi cabinet Dùng giấy lau xịt cồn lau Cabinet Đóng cửa Cabinet, bật UV 30 phút Bước 12: Theo dõi phát triển tế bào Nuôi tủ ấm 370C, 5% CO2 Hàng ngày theo dõi phát triển tế bào Quan sát màu mơi trường, độ đục, quan sát hình thái tế bào kính hiển vi soi ngược 28 140428 -bao cao tong ket thang – nhuan TT 29 .. . 140 428 -bao cao tong ket thang – nhuan TT Biết cách xử lý mẫu Swab, mẫu huyết Thời gian, địa điểm: Thời gian: 03/ 04/ 20 14- 26 /4/ 20 14 Địa điểm : Phòng thí nghiệm-... e.Máy móc, thiết bị STT Vật liệu Pipet 5ml Pipet 10 - 100µl Cabinet Máy ly tâm Tủ ấm CO2 Tủ lạnh 40 C Số lượng 01 01 01 01 01 01 24 140 428 -bao cao tong ket thang – nhuan TT Tủ lạnh -200C Kính... STT Vật liệu Hệ thống lọc Satorius ( bình lọc, hệ thống dây gắn lọc) Màng lọc Cenlulose 0,22 µm Cốc định mức lít Chai Schott lít Số lượng 01 01 01 01 140 428 -bao cao tong ket thang – nhuan TT