Nghiên cứu xây dựng quy trình tổng hợp 2 (curcumin o yl)ethyldihydrophosphat

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI NGUYỄN THỊ TRÂM NGHIÊN CỨU XÂY DỰNG QUY TRÌNH TỔNG HỢP 2-(CURCUMIN-O-YL)ETHYL DIHYDROPHOSPHAT LUẬN VĂN THẠC SĨ DƯỢC HỌC HÀ NỘI 2018 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI NGUYỄN THỊ TRÂM NGHIÊN CỨU XÂY DỰNG QUY TRÌNH TỔNG HỢP 2-(CURCUMIN-O-YL)ETHYL DIHYDROPHOSPHAT LUẬN VĂN THẠC SĨ DƯỢC HỌC CHUYÊN NGÀNH CÔNG NGHỆ DƯỢC PHẨM VÀ BÀO CHẾ MÃ SỐ 8720202 Người hướng dẫn khoa học: TS Nguyễn Văn Hải PGS TS Nguyễn Đình Luyện HÀ NỘI 2018 LỜI CẢM ƠN Để hoàn thành luận văn này, suốt thời gian thực đề tài, nhận giúp đỡ tận tình thầy giáo, gia đình bạn bè Trước hết, tơi xin bày tỏ lòng kính trọng biết ơn sâu sắc tới TS Nguyễn Văn Hải PGS TS Nguyễn Đình Luyện, hai thầy trực tiếp bảo hướng dẫn tôi, truyền đạt cho kiến thức, kinh nghiệm q báu, giúp tơi có định hướng tốt việc nghiên cứu hoàn thành đề tài cách tốt Tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành đến thầy cô Bộ môn Công nghiệp Dược – Tổng hợp hóa dược hết lòng giúp đỡ, tạo điều kiện thuận lợi cho tiến hành nghiên cứu đề tài Tôi xin cảm ơn Ban Giám hiệu nhà trường toàn thể thầy cô giáo trường Đại học Dược Hà Nội ln tạo điều kiện cho tơi suốt q trình học tập nhà trường Trong trình thực luận văn nhận giúp đỡ cán thuộc phòng Thử nghiệm sinh học – Viện công nghệ sinh học, Viện Hàn lâm khoa học cơng nghệ Việt Nam; cán khoa Hóa – trường Đại học Khoa học tự nhiên, Đại học Quốc gia Hà Nội; cán Viện Thực phẩm chức năng, xin chân thành cảm ơn Và cuối cùng, cho tơi bày tỏ lòng biết ơn đặc biệt tới gia đình, người thân bạn bè ln sát cánh, động viên, chăm lo cho sống nghiệp Hà Nội, ngày tháng năm 2018 Học viên Nguyễn Thị Trâm MỤC LỤC DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT DANH MỤC CÁC BẢNG, BIỂU DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ ĐẶT VẤN ĐỀ Chương TỔNG QUAN 1.1 Khái quát chung Curcumin 1.1.1 Cấu trúc phân tử Curcumin 1.1.2 Tính chất lý hóa 1.1.3 Tính chất dược lý curcumin 1.2 Một số hướng biến đổi hóa học cải thiện độ tan hoạt tính curcumin 1.3 Tiền thuốc phosphat nghiên cứu phát triển thuốc curcumin 12 Chương ĐỐI TƯỢNG, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 18 2.1 Nguyên liệu - hóa chất 18 2.2 Dụng cụ - thiết bị 19 2.3 Nội dung nghiên cứu 20 2.4 Phương pháp nghiên cứu 20 2.4.1 Quy trình tổng hợp, tinh chế sản phẩm 20 2.4.2 Kiểm tra sơ độ tinh khiết 21 2.4.3 Xác định cấu trúc hóa học 21 Chương KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 22 3.1 Quy trình tổng hợp 22 3.1.1 Tổng hợp dẫn chất mono-O-(2-hydroxyethyl)-curcumin (LH-1) 22 3.1.2 Tổng hợp dẫn chất 2-(curcumin-O-yl)ethyl dihydrophosphat (LH2)…… 31 3.2 Xác định cấu trúc 36 3.2.1 Kết phân tích phổ LH-1 36 3.2.2 Kết phân tích phổ LH-2 40 Chương BÀN LUẬN 43 4.1 Về quy trình tổng hợp 43 4.1.2 Về tổng hợp dẫn chất mono-O-(2-hydroxyethyl)-curcumin (LH-1) ………………………………………………………………………… 43 4.1.2 Về tổng hợp dẫn chất 2-(curcumin-O-yl)ethyl dihydrophosphat (LH-2) 46 4.2 Về xác định cấu trúc sản phẩm 48 4.2.1 Về xác định cấu trúc LH-1 48 4.2.2 Về xác định cấu trúc LH-2 50 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 52 TÀI LIỆU THAM KHẢO 55 PHỤ LỤC DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT 13 C-NMR H-NMR AR CTCT CTPT DMSO DPPH đvC HIV IC50 LH-1 LH-2 L-NMMA logP MS MTT Rf SC50 SKLM T°nc Hela Cộng hưởng từ hạt nhân carbon 13 (Carbon 13 nuclear magnetic resonance) Phổ cộng hưởng từ hạt nhân proton (proton nuclear magnetic resonance spectroscopy) Thuốc thử tinh khiết phân tích (Analytical reagent) Cơng thức cấu tạo Cơng thức phân tử Dimethyl sulfoxid 1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl Đơn vị carbon Virus gây suy giảm miễn dịch người (Human immunodeficiency virus) Nồng độ ức chế 50% đối tượng thử (Inhibition concentration at 50%) mono-O-(2-hydroxyethyl)-curcumin 2-(curcumin-O-yl)ethyl dihydrophosphat NG-methyl-L-arginin acetat Hệ số phân bố dầu nước Phổ khối lượng (Mass spectrometry) 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyl tetrazoli bromid Hệ số lưu giữ (Retention factor) Nồng độ trung hòa 50% gốc tự (Scavenging concentration at 50%) Sắc ký lớp mỏng Nhiệt độ nóng chảy Tế bào ung thư tử cung người (human cervix carcinoma) DANH MỤC CÁC BẢNG, BIỂU Bảng 1.1 Sơ lược số hướng biến đổi cấu trúc cải thiện độ tan hoạt tính curcumin Bảng 2.1 Danh mục nguyên liệu - hóa chất 18 Bảng 2.2 Danh mục thiết bị, dụng cụ thí nghiệm 19 Bảng 3.1 Kết khảo sát tỷ lệ mol 2-bromoethanol : curcumin 25 Bảng 3.2 Kết khảo sát nhiệt độ phản ứng tạo LH-1 25 Bảng 3.3 Kết khảo sát dung môi phản ứng tạo LH-1 26 Bảng 3.4 Kết khảo sát xúc tác phản ứng tạo LH-1 27 Bảng 3.5 Kết khảo sát nồng độ tác nhân phản ứng tạo LH-1 27 Bảng 3.6 Kết tổng hợp LH-1 quy mô g/mẻ 31 Bảng 3.7 Kết khảo sát tỷ lệ mol POCl3 : LH-1 32 Bảng 3.8 Kết khảo sát nhiệt độ, thời gian phản ứng tạo LH-2 33 Bảng 3.9 Kết tổng hợp LH-2 quy mô 2g/mẻ 36 Bảng 3.10 Kết phân tích phổ khối lượng (CH3OH) LH-1 37 Bảng 3.11 Kết phân tích phổ IR (KBr) LH-1 37 Bảng 3.12 Kết phân tích phổ 1H-NMR (500 MHz, CD3OD) LH-1 38 Bảng 3.13 Kết phân tích phổ 13C-NMR (500 MHz, CD3OD) LH-1 39 Bảng 3.14 Kết phân tích phổ khối lượng (CH3OH) LH-2 40 Bảng 3.15 Kết phân tích phổ IR (KBr) LH-2 40 Bảng 3.16 Kết phân tích phổ 1H-NMR (500 MHz, DMSO) LH-2 41 Bảng 3.17 Kết phân tích phổ 13C-NMR (DMSO-d6) LH-2 42 DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ Hình 1.1 Cơng thức cấu tạo curcumin Hình 1.2 Các dạng tồn curcumin theo pH dung dịch Hình 1.3 Sự phân hủy curcumin mơi trường kiềm Hình 1.4 Sự phân hủy curcumin tác dụng ánh sáng Hình 1.5 Cơ chế dọn gốc tự curcumin Hình 1.6 Các vị trí biến đổi cấu trúc curcumin Hình 1.7 Cơng thức số dẫn chất curcumin 10 Hình 1.8 Sơ đồ tổng hợp dẫn chất monoalkyl hóa từ curcumin theo tác giả Hoàng Dung 12 Hình 1.9 Cơ chế giải phóng thuốc mẹ từ tiền thuốc 13 Hình 1.10 Tiền thuốc phosphat Lopinavir Ritonavir 14 Hình 1.11 Tiền thuốc phosphat propofol 14 Hình 1.12 Tiền thuốc phosphat dẫn chất benzimidazol 15 Hình 1.13 Tiền thuốc α-6-chloro-2-(methylthio)-5-(naphthalen-1-yloxy)1H-benzo[d]imidazol 15 Hình 1.14 Tiền thuốc chalcon 16 Hình 1.15 Cấu tạo curcumin-O-yl dihydrophosphat 16 Hình 1.16 Sơ đồ tổng hợp 2-(curcumin-O-yl)ethyl dihydrophosphat (LH-2)17 Hình 2.1 Sơ đồ tổng hợp LH-1 LH-2 20 Hình 3.1 Sơ đồ phản ứng tổng hợp LH-1 22 Hình 3.2 Sơ đồ quy trình tổng hợp LH-1 quy mơ g/mẻ 30 Hình 3.3 Sơ đồ phản ứng tổng hợp LH-2 phosphoryl clorid 31 Hình 3.4 Sơ đồ quy trình tổng hợp LH-2 quy mô g/mẻ 35 Hình 4.1 Các sản phẩm phụ phản ứng tạo LH-1 43 Hình 4.2 Vết sản phẩm sắc ký lớp mỏng 44 Hình 4.3 Nguyên lý phản ứng trình tinh chế LH-1 45 Hình 4.4 Cơ chế phản ứng phosphoryl hóa tác nhân POCl3 46 Hình 4.5 Dạng hỗ biến ceto-enol LH-1 48 ĐẶT VẤN ĐỀ Curcumin (diferuloylmethan, (1E,6E)-1,7-bis(4’-hydroxy-3’- methoxyphenyl)-1,6-heptadien-3,5-dion) hợp chất đóng vai trò chủ đạo tác dụng chữa bệnh củ nghệ (Curcuma longa L.) - dược liệu dùng lâu đời y học cổ truyền nhiều nước giới, Ấn Độ, Trung Quốc nước Đông Nam Á [33] Hiện nay, curcumin ngày giành quan tâm đặc biệt nhà nghiên cứu thuốc đại nhờ hoạt tính sinh học đa dạng (phòng hỗ trợ điều trị ung thư, chống oxy hóa, chống viêm, kháng khuẩn…) với chế tác dụng đa đích, độ an tồn cao, khơng gây tác dụng phụ không độc đến liều g/kg thể trọng [3], [31] Nhược điểm curcumin sinh khả dụng thấp (dưới 1%) hấp thu kém, chuyển hóa đào thải nhanh khỏi thể Một yếu tố lý-hóa quan trọng ảnh hưởng đến điều độ tan curcumin Tạo tiền thuốc hướng quan trọng cải thiện độ tan, sinh khả dụng dược tính khác thuốc gốc (thuốc mẹ) Các nghiên cứu tiền thuốc ra, gắn thêm nhóm phosphat, độ tan sinh khả dụng số chất tăng lên đáng kể, chẳng hạn, tiền thuốc oxyethylphosphat ritonavir có độ tan cao gấp 600 lần so với ritonavir, tiền thuốc ethyl dioxy phosphat propofol có độ ổn định tăng, độ tan nước cao propofol gấp 70 lần sử dụng đường tiêm, tedizolid phosphat cải thiện độ tan thuốc mẹ tedizolid làm tăng sinh khả dụng đường uống [12] [22] [23] [32] Cách tiếp cận tác giả L Ding cộng phát triển phân tử curcumin năm 2015 cách phosphoryl hóa trực tiếp nhóm –OH phenol curcumin thu số dẫn chất phosphat dẫn chất monophosphat curmumin curcumin-O-yl dihydrophosphat thể hoạt tính ức chế mạnh tế bào HeLa (IC50 = 6,78 µM) so với curcumin (IC50 =17,67 µM) [13] Các nghiên cứu chế tác dụng chứng minh rằng, hoạt tính sinh học curcumin chế chính: chống oxy hóa chống viêm Phân tích mối liên quan chế với cấu trúc phân tử hợp chất khung curcumin cho thấy, cần thiết phải có mặt nhóm β-diceton, OH phenol methoxy để trì hoạt tính Kết gần Nhóm nghiên cứu chúng tơi 2-hydroxyethyl hóa curcumin cho thấy, khả chống oxy hóa sản phẩm monoalkyl hóa O-(2hydroxyethyl)-curcumin tốt, với SC50 59,50 μM (tốt vitamin C) [5] Tuy nhiên, việc tổng hợp dẫn chất gặp nhiều khó khăn, q trình tinh chế phải sử dụng đến sắc ký điều chế sắc ký cột [5] [10] Trên sở đó, chúng tơi lựa chọn biến đổi nhóm OH phenol curcumin, giữ lại nhóm OH phenol cấu trúc β-diceton nhóm methoxy; lựa chọn ethylenoxy làm cầu nối với nhóm thân nước phosphat Đề tài “Nghiên cứu xây dựng quy trình tổng hợp 2-(curcumin-O-yl)ethyl dihydrophosphat” thực với mục tiêu: Xây dựng quy trình tổng dihydrophosphat từ curcumin quy mô g/mẻ hợp 2-(curcumin-O-yl)ethyl 7' CH O O 2' 3' 1' O 8' 7'' CH OH 2'' 3'' 4'' 6' 4' 5' O 1'' 5'' OH 9' OH Phụ lục Phổ cộng hưởng từ hạt nhân proton (1H-NMR) LH-1 7' CH O O 2' 3' 1' O 8' 7'' CH OH 2'' 3'' 4'' 6' 4' 5' O 1'' 5'' OH 9' OH Phụ lục Phổ cộng hưởng từ hạt nhân proton (1H-NMR) LH-1 7' CH O O 2' 3' 1' O 8' 7'' CH OH 2'' 3'' 4'' 6' 4' 5' O 1'' 5'' OH 9' OH Phụ lục Phổ cộng hưởng từ hạt nhân proton (1H-NMR) LH-1 7' CH O O 2' 3' 1' O 8' 7'' CH OH 2'' 3'' 5' 9' 4'' 6' 4' 5'' C23H24O7 O 1'' OH M=412,44 OH Phụ lục Phổ cộng hưởng từ hạt nhân carbon 13 (13C-NMR) LH-1 7' CH O O 2' 3' 1' O 8' 7'' CH OH 2'' 3'' 5' 9' 4'' 6' 4' 5'' C23H24O7 O 1'' OH M=412,44 OH Phụ lục Phổ cộng hưởng từ hạt nhân carbon 13 (13C-NMR) LH-1 7' CH O O 2' 3' 1' O 8' 7'' CH OH 2'' 3'' 5' 9' 4'' 6' 4' 5'' C23H24O7 O 1'' OH M=412,44 OH Phụ lục Phổ cộng hưởng từ hạt nhân carbon 13 (13C-NMR) LH-1 7' CH O O 2' 3' 1' O 8' 7'' CH OH 2'' 3'' 5' 9' 4'' 6' 4' 5'' C23H24O7 O 1'' OH M=412,44 OH Phụ lục Phổ cộng hưởng từ hạt nhân carbon 13 (13C-NMR) LH-1 7' CH O O 2' 3' 1' O P 8' O OH OH 9' O 7'' CH OH 2'' 3'' 4'' 6' 4' 5' 5'' C23H25O10P O 1'' M=492,4 Phụ lục Phổ khối lượng MS LH-2 OH Phụ lục Phổ hồng ngoại IR LH-2 7' CH O O 2' 3' 1' O P 8' O OH OH 9' O 7'' CH OH 2'' 3'' 4'' 6' 4' 5' 5'' C23H25O10P O 1'' OH M=492,4 Phụ lục Phổ cộng hưởng từ hạt nhân proton (1H-NMR) LH-2 7' CH O O 2' 3' 1' O P 8' O OH OH 9' O 7'' CH OH 2'' 3'' 4'' 6' 4' 5' 5'' C23H25O10P O 1'' OH M=492,4 Phụ lục Phổ cộng hưởng từ hạt nhân proton (1H-NMR) LH-2 7' CH O O 2' 3' 1' O P 8' O OH OH 9' O 7'' CH OH 2'' 3'' 4'' 6' 4' 5' 5'' C23H25O10P O 1'' OH M=492,4 Phụ lục Phổ cộng hưởng từ hạt nhân proton (1H-NMR) LH-2 7' CH O O 2' 3' 1' O P 8' O OH OH 9' O 7'' CH OH 2'' 3'' 4'' 6' 4' 5' 5'' C23H25O10P O 1'' OH M=492,4 Phụ lục Phổ cộng hưởng từ hạt nhân carbon 13 (13C-NMR) LH-2 7' CH O O 2' 3' 1' O P 8' O OH OH 9' O 7'' CH OH 2'' 3'' 4'' 6' 4' 5' 5'' C23H25O10P O 1'' OH M=492,4 Phụ lục Phổ cộng hưởng từ hạt nhân carbon 13 (13C-NMR) LH-2 7' CH O O 2' 3' 1' O P 8' O OH OH 9' O 7'' CH OH 2'' 3'' 4'' 6' 4' 5' 5'' C23H25O10P O 1'' OH M=492,4 Phụ lục Phổ cộng hưởng từ hạt nhân carbon 13 (13C-NMR) LH-2 ... OCH3 HO HO OCH3 O O 4a O H3CO HO OH HO OH HO O O HO O 4b O OH HO OH OH OH O H3CO HO O O H3CO OCH3 O HO OH 5a O OCH3 O H3 CCOO N O OCH HO O OH OCH3 O H 3CO OH H3CO HO O OCH3 O OH2 Cu H3CO HO OH O. .. vivo) [7] O H3C O O O O O H2N H3C O 1a: R=H (Glycin) 1b: R=CH(CH3 )2 (Valin) O CH3 O ONa NaO O O OCH3 O O O O O H3CO OCH3 HO O ONa O H3CO n O CH3 O ONa R O O NH2 O O O R O O OH O O O O O H3CO OCH3... Hình 2. 1) O O O H3CO OCH3 BrCH2CH2OH HO C21H2 0O6 OH K2CO3/Aceton O H3CO OCH3 O OH C23H2 4O7 OH M=4 12, 44 M=368,38 LH-1 Curcumin O O H3CO LH-1 POCl3 /pyridin /H 2O (2: 1 :2) O Acetonitril, 0 -2 C OCH3 O