Nghiên cứu sử dụng gen coda làm chỉ thị chọn lọc vector chuyển gen mang tính an toàn sinh học

1 ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC NGHIÊN CỨU SỬ DỤNG GEN CODA LÀM CHỈ THỊ CHỌN LỌC VECTOR CHUYỂN GEN MANG TÍNH AN TỒN SINH HỌC NGUYỄN THỊ HÀ LUẬN VĂN THẠC SĨ: CÔNG NGHỆ SINH HỌC THÁI NGUYÊN NĂM 2015 MỤC LỤC Trang Lời cam đoan………………………………………………………… i Lời cảm ơn…………………………………………………………… ii Mục lục………………………………………………………………… iii Danh mục chữ viết tắt ký hiệu………………………………… vi Danh mục bảng………………………………………………………… vii Danh mục hình………………………………………………………… viii MỞ ĐẦU……………………………………………………………… 1 Tính cấp thiết đề tài…………………………………………… Mục tiêu nghiên cứu………………………………………………… 3 Nội dung nghiên cứu………………………………………………… CHƯƠNG I: TỔNG QUAN TÀI LIỆU……………………………… 1.1.Cây trồng biến đổi gen số phương pháp sử dụng chuyển gen thực vật 1.1.1 Chuyển gen trực tiếp súng bắn gen 1.1.2 Chuyển gen gián tiếp vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens 4 1.1.2.1 Giới thiệu vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens 1.1.2.2 Đặc điểm Ti-plasmid 1.1.2.3 Cơ chế chuyển gen vào thực vật 1.1.2.4 Các hệ thống vector sử dụng chuyển gen thực vật 1.2 Các gen sử dụng chọn lọc thị 1.2.1 Gen kháng kháng sinh………………………………………… 1.2.2 Gen kháng chất diệt cỏ………………………………………… 1.2.3 Gen chọn lọc mannose………………………………………… 1.2.4.Gen thị……………………………………………………… 1.3 Tổng quan nghiên cứu vector chuyển gen mang tính an tồn sinh học 1.3.1 Sự cần thiết nghiên cứu vector chuyển gen mang tính an tồn sinh học 1.3.2 Các gen/hệ thống chọn lọc thân thiện 1.3.3 Sự loại bỏ gen thị chọn lọc từ chuyển gen………… 1.4 Cơ sở khoa học sử dụng gen codA làm thị chọn lọc thực vật chuyển gen…………………………………………………… 1.4.1 Glycine betaine tnh chống chịu điều kiện môi trường bất lợi thực vật…………………………………………………………… 1.4.2 Giới thiệu gen codA sử dụng………………………………… 1.4.3 Các nghiên cứu chuyển gen codA nhằm tăng cường khả 9 10 10 11 11 12 15 17 17 18 chống chịu thực vật CHƯƠNG II: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Vật liệu nghiên cứu……………………………………………… 2.1.1 Các vật liệu thực vật…………………………………………… 2.1.2 Các chủng vi khuẩn, vector cặp mồi sử dụng……………… 2.1.3 Hóa chất, thiết bị………………………………………………… 2.1.3.1 Hóa chất 2.1.3.2 Thiết bị dụng cụ thí nghiệm 2.1.4 Thời gian địa điểm nghiên cứu 2.2 Phương pháp nghiên cứu………………………………………… 2.2.1 Phương pháp PCR (Polymerase Chain Reaction)……………… 2.2.2 Phương pháp điện di DNA gel agarose…………………… 2.2.3 Phương pháp tinh DNA từ gel agarose …………………… 2.2.4 Phương pháp xử lý ADN enzyme cắt giới hạn…………… 2.2.5 Phản ứng nối ghép gen………………………………………… 2.2.6 Phương pháp biến nạp vector tái tổ hợp vào tế bào khả biến E.coli…………………………………………………………………………… 2.2.7 Phương pháp tách chiết plasmid tái tổ hợp…………………… 2.2.8 Phương pháp biến nạp vector tái tổ hợp vào tế bào khả biến A.tumefaciens C58/PGV2260 xung điện………………………… 2.2.9 Phương pháp tạo thuốc chuyển gen……………………… 2.2.10 Kiểm tra biểu gen chuyển mức độ phiên mã kỹ thuật RT-PCR………………………………………………… 2.2.11 Đánh giá khả chịu nhiệt dòng thuốc K326 chuyển gen codA……………………………………………………… 2.2.12 Sàng lọc khả chịu mặn dòng thuốc chuyển gen in vitro…………………………………………………………………………… 2.2.13 Phương pháp tính tốn xử lý số liệu………………………… CHƯƠNG III: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN………………………… 3.1 Thiết kế vector chuyển gen pCAMBIA1301/HSP-codA mang gen codA…………………………………………………………………… 3.1.1 Thiết kế vector chuyển gen pCAMBIA1301/35S-codA mang gen codA hoạt động điều khiển promoter định 35S…… 3.1.2 Thiết kế vector pCAMBIA1301/HSP-codA mang gen codA hoạt động điều khiển promoter HSP 18.2 3.1.3 Kết loại bỏ gen chọn lọc hptII mã hóa cho hygromycin phosphotransferase khỏi vector pCAMBIA1301/HSP-codA………… 3.1.4 Tạo chủng Agrobacterium tumefaciens mang vector chuyển gen 3.2 Kết chuyển gen codA vào thuốc K326……………… 3.2.1 Chuyển cấu trúc pCAMBIA1301/HSP-codA vào thuốc thông qua vi khuẩn A tumefaciens………………………………………… 3.2.2 Sàng lọc khả chịu nhiệt dòng thuốc chuyển gen in vitro ………………………………………………………… 3.2.3.Phân tch dòng chuyển gen kỹ thuật PCR………… 19 22 22 22 22 23 23 24 24 24 24 25 26 27 27 28 28 30 30 32 35 35 35 36 36 38 39 41 43 44 44 45 47 3.2.4 Sàng lọc khả chịu mặn dòng thuốc chuyển gen in vitro………………………………………………………………………… 3.2.5 Phân tích thuốc chuyển gen codA kỹ thuật RT-PCR KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ………………………………………… TÀI LIỆU THAM KHẢO…………………………………………… 48 49 51 52 MỞ ĐẦU Tính cấp thiết đề tài Cây trồng biến đổi gen (Genetcally Modified Crop - GMC) loại trồng lai tạo cách sử dụng kỹ thuật cơng nghệ sinh học đại, hay gọi kỹ thuật di truyền, công nghệ gen hay công nghệ DNA tái tổ hợp, chuyển gen chọn lọc để tạo trồng mang tính trạng mong muốn Về mặt chất, giống lai từ trước đến (hay gọi giống truyền thống) kết trình cải biến di truyền Điểm khác biệt giống lai truyền thống giống chuyển gen gen (DNA) chọn lọc cách xác dựa khoa học công nghệ đại, chuyển vào giống trồng để đem lại tính trạng mong muốn cách có kiểm sốt Việc sử dụng gen có khả chọn lọc kèm với gen đích kỹ thuật chuyển gen cần thiết nhằm tm lượng tế bào mang gen cần chuyển vô số tế bào không mang gen chuyển Thông thường gen chọn lọc dùng gen kháng lại kháng sinh hygromycin (hpt) kanamycin (nptII) kháng lại chất diệt cỏ phosphinothricin (bar) chlorosulfuron (als) Mặc dù, chưa có thí nghiệm đưa chứng gen chọn lọc kháng lại chất kháng sinh hay thuốc diệt cỏ sử dụng có nguy gây hại đến sức khỏe người vật ni có lo ngại độ an toàn với sức khỏe người ảnh hưởng đến đa dạng sinh học Vì vậy, năm gần có nghiên cứu liên quan đến việc sử dụng gen chọn lọc thay thế, không ảnh hưởng đến hoạt động sinh học tế bào thực vật hay gọi chọn lọc tích cực (positive selection) Trong trường hợp này, tế bào chuyển gen sử dụng số chất không độc hại mà điều kiện bình thường khơng thể sử dụng Việc thay gen chọn lọc gen có tnh chất tch cực, thân thiện với mơi trường vấn đề quan tâm nghiên cứu chuyển gen vào thực vật Glycine betaine (GB) proline biết đến chất đóng vai trò quan trọng q trình điều chỉnh áp suất thẩm thấu nội bào thực vật sống điều kiện bất lợi khô, hạn, lạnh… Trong tế bào thực vật, glycine betaine tổng hợp từ choline thông qua hai phản ứng liên tếp xúc tác choline monooxygenase (CMO) betain aldehyde dehydrogenase (BADH) Từ hiểu biết đường sinh tổng hợp glycine betaine proline sinh vật, với phát triển mãnh mẽ lĩnh vực công nghệ gen, đặc biệt kỹ thuật tạo trồng biến đổi gen Các nhà khoa học phân lập gen: codA (CODCholine oxidase), COX, BADH, betA (CDH), CMO, GSMT(glicine Sarcosine methyntransferase), SDMT (Sarcosine dimethylglucine methyltransferase), P5CS (Pyrroline -5-Carboxylate Synthetase) P5CR (Pyrroline -5-Carboxylate) từ nhiều nguồn khác nhau, mã hóa cho enzyme tham gia vào trình sinh tổng hợp GB proline Các gen thiết kế với promoter biểu đặc hiệu, mạnh chuyển thành cơng vào nhiều lồi trồng, loài trồng biến đổi gen tăng cường khả chống chịu điều kiện bất lợi môi trường Các kết công bố cho thấy: gen codA (COD), COX, BADH, betA (CDH), CMO, GSMT, SDMT, P5CS P5CR chuyển vào đối tượng Arabidopsis thaliana, Cây thuốc lá, lúa (Oryza sativa), cà chua, hồng, bạch đàn, cai be (Brassica juncea), bông, ngô giúp cho tăng cương kha chiu lanh, nhiêt độ cao, chịu măn băng giá codA gen mã hóa cho choline oxidase enzyme tham gia tổng hợp GB Trong chuyển gen, nhà khoa học sử dụng gen codA (COD) cho thấy chuyển gen có khả phát triển bình thường điều kiện bất lợi nóng, mặn, khô hạn xảy Với lý trên, tiến hành nghiên cứu đề tài “Nghiên cứu sử dụng gen codA làm thị chọn lọc tạo vector chuyển gen mang tính an tồn sinh học” Mục tiêu nghiên cứu Mục tiêu chung: Phát triển vector chuyển gen có gen chọn lọc codA phục vụ việc nâng cao hiệu chuyển gen tnh an toàn chuyển gen Mục tiêu cụ thể: - Tạo vector chuyển gen thực vật có gen chọn lọc gen codA - Đánh giá khả chọn lọc hiệu tạo chuyển gen sử dụng vector chuyển gen tạo có gen chọn lọc gen codA - Xây dựng quy trình tạo chuyển gen sử dụng vector chuyển gen gen chọn lọc codA mơ hình thuốc Nội dung nghiên cứu (1) Thiết kế vector chuyển gen mang gen codA thay cho gen chọn lọc (kháng kháng sinh) (2) Thử nghiệm tạo đánh giá khả tạo chuyển gen thông qua chọn lọc điều kiện chống chịu nhiệt độ cao, chịu mặn (3) Xây dựng quy trình chọn lọc tạo chuyển gen sử dụng vector chuyển gen gen chọn lọc codA mơ hình thuốc CHƯƠNG I: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Cây trồng biến đổi gen số phương pháp sử dụng chuyển gen thực vật Cây trồng biến đổi gen tạo phòng thí nghiệm cách thay đổi cấu trúc gen chúng Người ta dùng kĩ thuật di truyền để thêm vào nhiều gen vào gen trồng Hiện có nhiều phương pháp chuyển gen thực vật nghiên cứu thành công nhiều đối tượng giống trồng như: chuyển gen thông qua A.tumefaciens, chuyển gen trực tiếp hóa chất, xung điện, súng bắn gen, chuyển gen vi tiêm, chuyển gen qua ống phấn, chuyển gen ủ dung dịch hạt khô với dung dịch DNA… Hai phương pháp chuyển gen thành công chuyển gen trực tiếp súng bắn gen chuyển gen gián tiếp thông qua vi khuẩn A.tumefaciens 1.1.1 Chuyển gen trực tiếp súng bắn gen Chuyển gen trực tếp súng bắn gen phương pháp đưa gen ngoại lai vào tế bào chủ, kỹ thuật sử dụng viên đạn vàng (hoặc Vonfam) kích thước hiển vi (0.55um) có tỷ trọng cao để đạt gia tốc cao xuyên qua vỏ màng tế bào, đưa lớp DNA bọc tếp cận với máy di truyền tế bào Phương pháp chuyển gen súng bắn gen áp dụng với đối tượng mà việc chuyển gen A.tumefaciens khó thực (do khơng mẫn cảm với A.tumefaciens) hay khả tái sinh (khi chuyển gen vào tế bào trần) Phương pháp áp dụng thành công cho nhiều loại trồng, đặc biệt thực vật mầm lúa mì ngô Phương pháp chuyển gen súng bắn gen sử dụng rộng rãi sau phương pháp chuyển gen qua vi khuẩn A.tumefaciens với ưu điểm áp dụng với hầu hết loại mô tế bào, chuyển DNA ngoại lai vào tế bào nhanh, dễ sử dụng với quy trình đơn giản, số lượng lớn mẫu xử lý thời gian ngắn, vecto thiết kế đơn giản, khơng đòi hỏi trình tự DNA cho đoạn T-DNA chuyển gen A.tumefaciens, cần lượng nhỏ plasmid DNA, biểu gen tạm thời quan sát sau vài ngày Tuy nhiên có nhược điểm nhiều vào tế bào lúc, gây khó khăn cho việc phân tích chọn lọc sau này, hiệu chuyển gen thấp chi phí lại cao 33 1.1.2 Chuyển gen gián tiếp vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens 1.1.2.1 Giới thiệu vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens Agrobacterium lồi vi khuẩn đất, có khả chuyển đoạn DNA từ vào tế bào thực vật Có nhiều cách phân loại Agrobacterium, phương pháp phổ biến dựa vào triệu chứng gây bệnh loại chủ Chi Agrobacterium có lồi sau: A tumefaciens: gây bệnh khối u hình chóp thân; A.rhizogenes: gây bệnh rễ tơ (hairy root); A.rubi: gây khối u lồi dâu đất, mâm xơi; A.radiobacter: coi lồi khơng gây độc chúng sản sinh kháng sinh đặc trưng (agrocin 84) ngăn cản tác hại lồi Agrobacterium kể Trong đó, chủng A.tumefaciens A.rhizogenes sử dụng phổ biến chuyển gen vào thực vật Theo chế tự nhiên, hai lồi có khả xâm nhiễm qua vết thương hầu hết loài thực vật hai mầm số lồi thực vật mầm, kết gây khối u hay hình thành rễ tơ Về sau, người ta xác định tế bào dạng hoang dại A.tumefaciens có chứa loại plasmid đặc biệt gọi Ti-plasmid (Tumor-inducing plasmid), ccn A.rhizogenes chứa plasmid cảm ứng tạo rễ tơ gọi Ri-plasmid (Root-inducing plasmid) Ti Ri plasmid chứa đoạn DNA chuyển sang tế bào chủ theo chế tự nhiên (T-DNA: Transferred-DNA) Do đó, Agrobacterium hệ thống chuyển gen tự nhiên Bằng cách cải biến cắt bỏ gen gây khối u rễ tơ, cài xen vào vùng T-DNA gen đích, gen chuyển gắn vào hệ gen tế bào thực vật dễ dàng Những phát có ý nghĩa quan trọng cho đời phương pháp chuyển gen vào thực vật nhờ vi khuẩn Agrobacterium 74 10 1.1.2.2 Đặc điểm Ti-plasmid Ti plasmid - phân tử DNA mạch vòng, sợi kép có trọng lượng phân tử 35% so với trọng lượng phân tử nhiễm sắc thể vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens Ti plasmid có kích thước khoảng 200 kb, tế bào chúng tồn đơn vị chép độc lập gồm vùng tương đồng: Vùng T-DNA (transfer-DNA) giới hạn vùng biên phải (right border) vùng biên trái (left border) chuyển sang tế bào thực vật Tại có hai hệ gen: hệ gen gây khối u onc (oncogenic) gồm gen hoạt động sản sinh lượng lớn chất kích thích sinh trưởng auxin, cytokinin tạo thành khối u thực vật; hệ gen mã hoá số enzym điều khiển trình tổng hợp dẫn suất axit amin hay đường, gọi opin Vùng liên quan đến tái (origin of replication) Vùng liên quan đến tếp hợp (Conjugative transfer) Vùng virulance chứa gen vir, giữ vai trò quan trọng việc chuyển T-DNA vào hệ gen nhân tế bào thực vật 21 Hình 1.1 Sơ đồ cấu trúc Ti-plasmid vi khuẩn A Tumefaciens 90 Phương pháp chuyển gen thông qua A.tumefaciens ứng dụng rộng rãi để chuyển hay nhiều gen vào trồng nhờ đặc tính ưu việt hệ thống chuyển gen này: giúp tạo trồng có tính bền vững cao; chuyển đoạn DNA có kích thước tương đối lớn vào thực vật mà không cần thiết bị hệ thống nuôi cấy phức tạp; số copy gen chuyển Bùi Thị Thu Hương đồng tác giả thành công nghiên cứu thiết kế vector tái tổ hợp mang gen mã hóa choline oxidase, tham gia vào sinh tổng hợp glycine betain (codA) Ngoài ra, vùng T-DNA cua vector đươc thiết kế chứa gen thị Glucuronidase (Gus) gen hygromycin phosphotransferase giúp lựa chọn chuyển gen dễ dàng Cấu trúc vector tái tổ hợp đa đươc chuyển vào vi khuẩn A tumefacien công va bươc đầu tao đươc thuốc la chuyên gen co kha chiu măn Năm 2013, Bùi Văn Thắng đồng tác giả chuyển thành cơng cấu trúc gen TP-codA codA vào dòng thuốc K326 xoan ta Các dòng chuyển gen có sinh tổng hợp tích luỹ Glycine betain cao nên tăng cường khả chịu mặn, hạn dòng chuyển gen so với đối chứng 5, 6 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ KẾT LUẬN: - Đã thiết kế thành công vector chuyển gen pCAMBIA1301/HSP-codA loại bỏ gen chọn lọc kháng sinh hptII tạo chủng Agrobacterium tumefaciens C58/pGV2260 chứa vector chuyển gen pCAMBIA1301/HSP- codA - Đã chuyển thành công cấu trúc pCAMBIA1301/HSP-codA vào thuốc thông qua Agrobacterium tumefaciens - Đã đánh giá chọn lọc dòng thuốc chuyển gen điều kiện nhiệt độ cao chống chịu mặn Đây sở khoa học cho việc sử dụng gen codA có khả thay cho gen kháng kháng sinh sử dụng cho chọn lọc mô/tế bào thực vật chuyển gen ĐỀ NGHỊ: - Chọn lọc thuốc chuyển gen mang cấu trúc pCAMBIA1301/HSPcodA với điều kiện khác chịu nóng chịu hạn - Chuyển cấu trúc pCAMBIA1301/HSP-codA vào đối tượng thực vật khác TÀI LIỆU THAM KHẢO Tiếng Việt Lê Trần Bình, Hồ Hữu Nhị, Lê Thị Muội (1997), Công nghệ sinh học thực vật cải tiến giống trồng, NXB Nông nghiệp, tr 107 Lê Trần Bình, Lê Thị Muội (1999), Phân lập gen chọn dòng chống chịu ngoại cảnh bất lợi lúa, NXB Đại học quốc gia, Hà Nội Bùi Thị Thu Hương, Hồ Thị Hương, Bùi Văn Thắng, Lê Văn Sơn, Lê Trần Bình (2013), “Thiết kế vector có vùng Ti-DNA mang gen codA số cấu trúc hỗ trợ chọn lọc chuyển gen”, Tạp chí Sinh học, 35(4), tr 504-510 Nguyễn Đức Thành (2000), Nuôi cấy mô tế bào thực vật - nghiên cứu ứng dụng, NXB Nông nghiệp, Hà Nội Bùi Văn Thắng, Lê Văn Sơn, Chu Hoàng Hà (2013a), “Chuyển gen codA mã hóa choline oxidase vào Xoan ta (Melia azedarach L.) tăng cường khă chịu hạn”, Tạp chí Khoa học & Cơng nghệ Lâm nghiệp, 2, tr 3-10 Bùi Văn Thắng, Lê Văn Sơn, Chu Hoàng Hà (2013b), “Nghiên cứu tạo thuốc (Nicotiana tabacum L.) chuyển gen codA mã hóa choline oxidase tăng cường khả chịu mặn ”, Báo cáo khoa học, Hội nghị Khoa học CNSH toàn quốc, tr 10591063 Bùi Văn Thắng (2014), Nghiên cứu tăng cường khả chống chịu hạn mặn Xoan ta (Melia azedarach L.) chuyển gen, Luận án tiến sỹ, Viện Công nghệ sinh học Tiếng Anh Ahmad R, Kim YH, Kim MD, Phung MN, Chung WI, Lee HS, et al (2008), “Development of selecton marker-free transgenic potato plants with enhanced tolerance to oxidatve stress”, J Plant Biol, 5, pp 401– 407 Alia, Hayashi H, Sakamoto A, Murata N (1998b), “Enhancement of the tolerance of Arabidopsis to high temperatures by genetic engineering of the synthesis of glycinebetaine”, Plant J 16, pp 155–161 10.Alia, Kondo Y, Sakamoto A, Nonaka H, Hayashi H, Pardha Saradhi P, Chen THH, Murata N (1999), “Enhanced tolerance to light stress of transgenic Arabidopsis plants that express the codA gene for a bacterial choline oxidase” Plant Mol Biol 40, pp 279-288 11.Aragao FJL, Sarokin L, Vianna GR, Rech EL (2000), “Selection of transgenic meristematc cells utilizing a herbicidal molecule results in the recovery of fertile transgenic soybean [Glycine max (L.) Merril] plants at a high frequency”, Theor Appl Genet, 101, pp 1–6 12.Arumugam N, Gupta V, Jagannath A, Mukhopadhyay A, Pradhan AK, Burma PK, et al (2007), “A passage through in vitro culture leads to efficient production of markerfree transgenic plants in Brassica juncea using the Cre-loxP system”, Transgenic Res, 16, pp 703–12 13.Avonce N, Leyman B, Mascorro-Gallardo JO, Van Dijck P, Thevelein JM, Iturriaga G (2004), “The Arabidopsis trehalose-6-P synthase AtTPS1 gene is a regulator of glucose, abscisic acid and stress signaling”, Plant Physiol, 136, pp 3649–3659 14 Bai X, Wang Q, Chu C (2008), “Excision of a selective marker in transgenic rice using a novel Cre/ loxP system controlled by a floral specific promoter”, Transgenic Res, 17, pp 1035–1043 15 Bhatnagar M, Prasad K, Bhatnagar-Mathur P, Narasu ML, Waliyar F, Sharma KK (2010), “An efficient method for the production of marker- free transgenic plants of peanut (Arachis hypogaea L.)”, Plant Cell Rep, 29, pp 495–502 16 Breitler JC, Meynard D, Van Boxtel J, Royer M, Bonnot F, Cambillau L, et al (2004), “A novel two TDNA binary vector allows efficient generation of marker-free transgenic plants in three elite cultvars of rice (Oryza sativa L.)”, Transgenic Res, 13, pp 271–287 17.Chen THH, Murata N (2002), “Enhancement of tolerance to abiotic stress by metabolic engineering of betaines and other compatible solutes”, Curr Opin Plant Biol 5, pp 250–257 18.Cohen SN, Chang ACY, Hsu L (1972), “Nonchromosomal antbiotic resistance in bacteria: Genetic transformaton of Escherichia coli by R- factor DNA”, Proc Nat Acad Sci U.S.A, 69, pp 2110 19.Cuellar W, Gaudin A, Solorzano D, Casas A, Nopo L, Chudalayandi P, et al (2006), “Self-excision of the antibiotc resistance gene nptII using a heat inducible Cre–loxP system from transgenic potato”, Plant Mol Biol, 62, pp 71–82 20 Daniell H, Muthukumar B, Lee SB (2001), “Marker-free transgenic plants: engineering the chloroplast genome without the use of antbiotic selecton”, Curr Genet, 39, pp 109–116 21.De la Riva GA, Gonzalez-Cabrera J, Vazquez-Padron R, and Ayra-Pardo C (1998), “Agrobacterium tumefaciens: A natural tool for plant transformaton”, Electron J Biotechnol, 1, pp 1-16 22 De Veten N, Wolters AM, Raemakers K, Meer I, Stege RT, et al (2003), “A transformation method for obtaining marker-free plants of a cross-pollinating and vegetatively propagated crop”, Nat Biotechnol, 21, pp 439–442 23 Endo S, Kasahara T, Sugita K, Matsunaga E, Ebinuma H (2001), “The isopentyl transferase gene is effective as a selectable marker gene for plant transformaton in tobacco (Nicotiana tabacum cv Petite havana SR1)”, Plant Cell Rep, 20, pp 60–66 24 Erikson O, Hertzberg M, Näsholm T (2004), “A conditional marker gene allowing both positive and negative selecton in plants”, Nat Biotechnol, 22, pp 455– 458 25 Erikson O, Hertzberg M, Näsholm T (2005), “The dsdA gene from Escherichia coli provides a novel selectable marker for plant transformaton”, Plant Mol Biol, 57, pp 425–433 26 Everard JD, Cantini C, Grumet R, Plummer J, Loescher WH (1997), “Molecular cloning of mannose 6-phosphate reductase and its developmental expression in celery”, Plant Physiol, 113, pp 1427–1735 27.Gelvin SB (2003), “Agrobacterium-Mediated Plant Transformation: the Biology behind the “Gene-Jockeying” Tool”, Microbiology and Molecular Biology Reviews, 67(1), pp 16-37 28 Haldrup A, Petersen SG, Okkels FT (1998), “Positive selection: a plant selecton priciple based on xylose isomerase, an enzyme used in the food industry”, Plant cell Rep, 18, pp 76–81 29 Hayashi H, Alia, Mustardy L, Deshnium P, Ida M, Murata N (1997), “Transfor maton of Arabidopsis thaliana with the CODA gene for choline oxidase; accumulation of glycinebetaine and enhanced tolerance to salt and cold stress”, Plant J, 12 (1), pp 133-142+_1 30 Hayashi H, Alia, Sakamoto A, Nonaka H, Chen THH, Murata N (1998), “Enhanced germination under high salt conditions of seeds of transgenic Arabidopsis with a bacterial gene (codA) for choline oxidase”, J Plant Res, 111, pp 357– 362 31 He PM, Zhang DB, Liang WQ, Yao QH, Zhang RX (2001), “Expression of Choline Oxidase Gene (CODA) Enhances salt tolerance of the tobacco”, Sheng Wu Hua Xue Yu Sheng Wu Wu Li Xue Bao, 33 (5), pp 519-524 32 Helmer G, Casadaban M, Bevan M, Kayes L, Chilton MD (1984), “A new chimeric gene as a marker for plant transformaton: the expression of Escherichia coli βgalactosidase in sunflower and tobacco cells”, Nat Biotechnol, 2, pp 520–527 33 Hiei Y, Ohta S, Komari T, Kumasho T (1994), “Efficient transformaton of rice (Oryza sativa L.) mediated by Agrobacterium and sequence analysis of the boundaries the T-DNA”, The Plant J, pp 271282 34.Huang J, Hirji R, Adam L, Rozwadowski KL, Hammerlindl JK, Keller WA, Selvaraj G (2000), “Genetc engineering of glycinebetaine production toward enhancing stress tolerance in plants: metabolic limitatons”, Plant Physiol 122, pp 747–756 35 Huang S, Gilbertson LA, Adams TH, Malloy KP, Reisenbigler EK, Birr DH, et al (2004), “Generation of marker-free transgenic maize by regular two-border Agrobacterium transformaton vectors”, Transgenic Res, 13, pp 451–461 36 Jacob S, Veluthambi K (2002), “Generation of selection marker-free transgenic plants by cotransformaton of a cointegrate vector T-DNA and a binary vector T-DNA in one Agrobacterium strain”, Plant Sci, 163, pp 801–806 37 Jia H, Liao M, Verbelen JP, Vissenberg K (2007), “Direct creation of marker-free tobacco plants from agroinfiltrated leaf discs”, Plant Cell Rep, 26, pp 1961–1965 38 Jin WZ, Duan RJ, Zhang F, Chen SY, Wu YR, Wu P (2003), “Applicaton of Ac/Ds transposon system to genetate marker gene free transgenic plants in rice”, Sheng Wu Gong Cheng Xue Bao, 19, pp 668– 673 39 Joersbo M, Donaldson I, Kreiberg J, Petersen SG, Brunsetedt J, Okkels FT (1998), “Analysis of Mannose selecton used for transformaton of sugar beet”, Mol Breed 4, pp 111-117 40 Kondrak M, van der Meer IM, Banfalvi Z (2006), “Generation of marker- and backbone-free transgenic potatoes by site-specific recombination and a bifunctional marker gene in a non-regular one- border Agrobacterium transformation vector”, Transgenic Res, 15, pp 729–737 41 Kopertekh L, Schulze K, Frolov A, Strack D, Broer I, Schiemann J (2010), “Cremediated seedspecific transgene excision in tobacco”, Plant Mol Biol, 72, pp 597– 605 42 Kumar S, Arul L, Talwar D (2010), “Generation of marker-free Bt transgenic indica rice and evaluaton of its yellow stem borer resistance”, J Appl Genet, 51, pp 243–257 43 Li Z, Xing A, Moon BP, Burgoyne SA, Guida AD, Liang H, et al (2007), “A Cre/loxP-mediated self activating gene excision system to produce marker gene free transgenic soybean plants”, Plant Mol Biol, 65, pp 329–341 44 Li B, Li N, Duan X, Wei A, Yang A, Zhang J (2010), “Generation of marker-free transgenic maize with improved salt tolerance using the FLP/FRT recombination system”, J Biotechnol, 145, pp 206–213 45 Li S, Li F, Wang J, Zhang W, Meng Q, Chen T H, Yang Y (2011), “Glycinebetaine enhances the tolerance of tomato plants to high temperature during germination of seeds and growth of seedlings”, Plant Cell Environ, 34 (11), pp 1931 – 1942+1 46 Lopez-Juez E, Jarvis RP, Takeuchi A, Page AM, Choury J (1998), “New Arabidopsis cue mutants suggest a close connection between plastid- and phytochrome-regulaton of nuclear gene expression”, Plant Physiol, 118, pp 803– 815 47.Luo K, Zheng X, Chen Y, Xiao Y, Zhao D, McAvoy R, et al (2006), “The maize Knotted1 gene is an effective positve selectable marker gene for Agrobacteriummediated tobacco transformation”, Plant Cell Rep, 25, pp 403–409 48 Luo K, Sun M, Deng W, Xu S (2008), “Excision of selectable marker gene from transgenic tobacco using the GM-gene-deletor system regulated by a heat-inducible promoter”, Biotechnol Lett, 30, pp 1295– 1302 49.Manimaran P, Ramkumar G, Sakthivel K, Sundaram RM, Madhav MS, Balachandran SM (2011), “Suitability of non-lethal marker and marker- free systems for development of transgenic crop plants: Present status and future prospects”, Biotechnology Advances, 29, pp 703–714 50 Matsunaga E, Nanto K, Oishi M, Ebinuma H, Morishita Y, Sakurai N, Shimada T (2012), “Agrobacterium – mediated transformaton of Eucalyptus globubus using explant with shoot apex with introducton of bactetial choline oxidase gene to enhance salt tolerance”, Plant Cell Rep, 31 (1), pp 225-235 51 Mentewab A, Stewart Jr CN (2005), “Overexpression of an Arabidopsis thaliana ABC transporter confers kanamycin resistance to transgenic plants”, Nat Biotechnol, 23, pp 1177–1180 52 Miles JS, and Guest JR (1984), “Nucleotide sequence and transcriptonal start point of the phosphomanose isomerase gene (manA) of Escherichia coli”, Gene, 32, pp 41 – 48 53.Mohanty A, Kathuria H, Ferjani A, Sakamoto A, Mohanty P, Murata N, Tyagi AK (2002), “Transgenics of an elite indica rice variety Pusa Basmati harbouring the codA gene are highly tolerant to stress” Theor Appl Genel, 106 (1), pp 51-57 54 Nishimura A, Ashikari M, Lin S, Takashi T, Angeles ER, Yamamoto T, et al (2005), “Isolaton of a rice regeneration quanttatve trait loci gene and its application to transformation systems”, Proc Natl Acad Sci, 102, pp 11940–11944 55 Ow DW, Wood KV, DeLuca M, De Wet JR, Helinski DR, Howell SH (1986), “Transient and stable expression of the firefly luciferase gene in plant cells and transgenic plants”, Science, 234, pp 856–859 56 Park EJ, Jeknic Z, Sakamoto A, DeNoma J, Yuwansiri R, Murata N, Chen THH (2004) “Genetic engineering of glycinebetaine synthesis in tomato protects seeds, plants, and flowers from chilling damage”, Plant J 40, pp 474–487 57 Park EJ, Jeknic´ Z, Pino MT, Murata N, Chen THH (2007a), “Glycinebetaine accumulation is more effectve in chloroplasts than in the cytosol for protecting transgenic tomato plants against abiotic stress”, Plant Cell Environ, 30, pp 994– 1005 58.Papageorgiou GC, Murata N (1995), “The unusually strong stabilizing effects of glycine betaine on the structure and function of the oxygen- evolving Photosystem II complex”, Photosynth Res, 44, pp 243–252 59.Prakash SN, Bhojaraja R, Shivbachan SK, Hari Priya GG, Nagraj TK, Prasad V, et al (2009), “Marker-free transgenic corn plant production through co-bombardment”, Plant Cell Rep, 28, pp 1655–1668 60.Rajeswaran R, Sunitha S, Shivaprasad PV, Pooggin MM, Hohn T, Veluthambi K (2007), “The Mungbean yellow mosaic begomovirus transcriptonal activator protein transactvates the viral promoter-driven transgene and causes toxicity in transgenic tobacco”, Mol Plant Microbe Interact, 20, pp 1545–1554 61.Ramanarao MV, Veluthambi K (2010), “Selectable marker elimination in the T0 generaton by Agrobacterium-mediated co-transformaton involving Mungbean yellow mosaic virus TrAP as a non-conditonal negatve selectable marker and bar for transient positive selection”, Plant Cell Rep, 29, pp 473–483 62.Rathinasbapathi B, Fouad WM, Sigua CA (2001), “b-Alanine betaine synthesis in the Plumbaginaceae Purification and haracterization of a trifunctional, S-adenosyl-Lmethionine-dependent N-ethyltransferase from Limonium latfoliumleaves”, Plant Physiol, 126, pp 1241-1249 63.Saelim L, Phansiri S, Suksangpanomrung M, Netrphan S, Narangajavana J (2009), “Evaluation of a morphological marker selection and excision system to generate marker-free transgenic cassava plants”, Plant Cell Rep, 28, pp 445–455 64.Sakamoto A, Alia, Murata N (1998), “Metabolic engineering of rice leading to biosynthesis of glycinebetaine and tolerance to salt and cold.”, Plant Mol Bio, l38, pp 1011–1019 65.Sakamoto A, Murata N (2000), “Genetc engineering of glycinebetaine synthesis in plants: current status and implications for enhancement of stress tolerance”, J Exp Bot, 51, pp 81–88 66.Sakamoto, A and Murata, N (2002), “The role of glycine betaine in the protection of plants from stress: clues from transgenic plants”, Plant, Cell & Environment, 25, pp 163–171 67.Schaart JG, Krens FA, Pelgrom KT, Mendes O, Rouwendal GJ (2004), “Effectve production of marker-free transgenic strawberry plants using inducible site-specific recombination and a bifunctional selectable marker gene”, Plant Biotechnol J, 2, pp 233–240 68.Sengupta S, Chakraborti D, Mondal HA, Das S (2010), “Selectable antbiotc resistance marker gene-free transgenic rice harbouring the garlic leaf lectin gene exhibits resistance to sap-sucking plant hoppers”, Plant Cell Rep, 29, pp 261–271 69.Shichiri M, Hoshikawa C, Nakamori S, Takagi H (2001), “A novel acetyltransferase found in Saccharomyces cerevisiae Σ1278b that detoxifies a proline analogue, azetdine-2- carboxylic acid”, J Biol Chem, 276, 41998–42002 70.Sreekala C, Wu L, Gu K, Wang D, Tian D, Yin Z (2005), “Excision of a selectable marker in transgenic rice (Oryza sativa L.) using a chemically regulated Cre/loxP system”, Plant Cell Rep, 24, pp 86–94 71.Sripriya R, Raghupathy V, Veluthambi K (2008), “Generation of selectable markerfree sheath blight resistant transgenic rice plants by efficient co-transformaton of a cointegrate vector T-DNA and a binary vector T-DNA in one Agrobacterium tumefaciens strain”, Plant Cell Rep, 27, pp 1635–1644 72.Stougaard J.(1993), “Substrate-dependent negatve selection in plants using a bacterial cytosine deaminase gene”, Plant J, 3, pp 755–761 73.Sulpice R, Tsukaya H, Nonaka H, Mustardy L, Chen TH, Mutara N (2003), “Enhanced formaton of flowers in salt-stresed Arabidopsis after genetic engineering of the synthesis of glycine betaine”, Plant J, 36 (2), pp 165-176 74.Tinland B, Schoumacher F, Gloeckler V, Bravo AM, Angel M, and Hohn B (1996), “The Agrobacterium tumefaciens virulence D2 protein is responsible for precise integraton of T-DNA into the plant genome”, EMBO Journal 14, pp 35853595 75.Tsai FY, Brotherton JE, Widholm JM (2005), “Overexpression of the feedbackinsensitive anthranilate synthase gene in tobacco causes tryptophan accumulation”, Plant Cell Rep, 23, pp 548–556 76.Verweire D, Verleyen K, De Buck S, Claeys M, Angenon G (2007), “Marker-free transgenic plants through genetcally programmed auto- excision”, Plant Physiol, 145, pp 1220–1231 77.Waditee R, Bhuiyan MN, Rai V, Aoki K, Tanaka Y, Hibino T (2005), “Genes for direct methylation of glycine provide high levels of glycinebetaine and abiotic stress tolerance in Synechococcus and Arabidopsis”, Proc Natl Acad Sci USA, 102, pp 1318– 1323 78.Wang Y, Chen B, Hu Y, Li J, Lin Z (2005), “Inducible excision of selectable marker gene from transgenic plants by the cre/lox site-specific recombination system”, Transgenic Res, 14, pp 605–614 79.Wang F, Zeng B, Sun Z, Zhu C (2010), “Relationship between proline and Hg21induced oxidatve stress in a tolerant rice mutant”, Arch Environ Contam Toxicol, 56, pp 723–731 80 Wyn Jones RG (1984), “Phytochemical aspects of osmotc adaptaton”, Recent Adv Phytochem, 18, pp 55–78 81.Woo HJ, Cho HS, Lim SH, Shin KS, Lee SM, Lee KJ, et al (2009), “Auto-excision of selectable marker genes from transgenic tobacco via a stress inducible FLP/FRT site-specific recombination system”, Transgenic Res, 18, pp 455–465 82 Xia ZH, Li XB, Chen CY, Fan HK, Jiang GH, Zhu LH, et al (2006), “Generation of selectable markerfree and vector backbone sequence-free Xa21 transgenic rice”, Sheng Wu Gong Cheng Xue Bao, 22, pp 204– 210 83.Yang WJ, Rich PJ, Axtell JD, Wood KV, Bonham CC, Ejeta G, Mickelbart MV, Rhodes D (2003), “Genotypic variation for glycine betaine in sorghum”, Crop Sci, 43, pp 162-169 84.Yang A, Su Q, An L (2009), “Ovary-drip transformation: a simple method for directly generating vector- and marker-free transgenic maize (Zea mays L.) with a linear GFP cassette transformaton”, Planta, 229, pp 793–801 85.Ye GN, Colburn S, Xu CW, Hajdukiewicz PTJ, Staub JM (2003), “Persistance of unselected transgenic DNA during a plastd transformaton and segregation approach to herbicide resistance”, Plant Physiol, 33, pp 402–440 86.Ye XG, Qin H (2007), “Obtaining marker-free transgenic soybean plants with optimal frequency by constructing three T-DNAs binary vector”, Sheng Wu Gong Cheng Xue Bao, 23, pp 138–144 87.Yu X, Kikuchi A, Matsunaga E, Morishita Y, Nanto K, et al (2009), “Establishment of the evaluation system of salt tolerance on transgenic woody plants in the special netted-house”, Plant Biotechnol, 26, pp 135–141 88.Zhang Y, Li H, Ouyang B, Lu Y, Ye Z (2006), “Chemical-induced autoexcision of selectable markers in elite tomato plants transformed with a gene conferring resistance to lepidopteran insects”, Biotechnol Lett, 28, pp 1247–1253 89.Zhang Y, Liu H, Li B, Zhang JT, Li Y, Zhang H (2009), “Generation of selectable markerfree transgenic tomato resistant to drought, cold and oxidatve stress using the Cre/loxP DNA excision system”, Transgenic Res, 18, 607–619 Internett: 90.http://www.cambia.org/daisy/AgroTran/g1/843.html 91.http:// www.snapgene.com/plasmid/plant_vectors/pCAMBIA1301 92.http:// www.snapgene.com/resources/plasmid/plant_vectors/pBI121 93.http:// www.syngentabiotech.com/biotech/pmi_technology.aspx ... hành nghiên cứu đề tài Nghiên cứu sử dụng gen codA làm thị chọn lọc tạo vector chuyển gen mang tính an toàn sinh học Mục tiêu nghiên cứu Mục tiêu chung: Phát triển vector chuyển gen có gen chọn. .. vector chuyển gen mang tính an tồn sinh học 1.3.2 Các gen/ hệ thống chọn lọc thân thiện 1.3.3 Sự loại bỏ gen thị chọn lọc từ chuyển gen ……… 1.4 Cơ sở khoa học sử dụng gen codA làm thị. .. sử dụng vector chuyển gen tạo có gen chọn lọc gen codA - Xây dựng quy trình tạo chuyển gen sử dụng vector chuyển gen gen chọn lọc codA mơ hình thuốc Nội dung nghiên cứu (1) Thiết kế vector chuyển