Tiểu luận HỆ ENZYM PECTINASE

Cácenzyme VSV ngoại bào này đóng một vai trò rất quan trọng trong quá trình gây bệnh ởthực vật, gây ra sự phân hủy mô của thành tế bào, làm mềm và làm mục mô thực vật.. Cơ chế để methyl

từ vi sinh vật, trong đó có nhiều loại đã được thu nhận với độ thuần khiết cao Xúc tácenzyme có nhiều ưu điểm hơn hẳn xúc tác thông thường như cường lực xúc tác lớn, tính đặchiệu cao, không độc, có thể tác dụng trong điều kiện nhẹ nhàng, đơn giản Hơn nữa có thểsản xuất enzyme từ các nguyên liệu giá rẻ nhưng đem lại hiệu quả kinh tế cao, nhờ v ậy việcứng dụng enzyme rộng rãi trong các ngành công nghiệp nhẹ, công nghiệp thực phẩm, nôngnghiệp, y học và nghiên cứu khoa học đã nhanh chóng có những bước tiến dài vàngày càng

có nhiều triển vọng tốt đẹp

Enzyme pectinase là enzyme xúc tác sự phân hủy của các polymer pectin Sự phânhủy pectin trong tự nhiên thường xảy ra khi trái cây chín Những enzyme này vì vậy có mộtvai trò hết sức quan trọng trong quá trình bảo quản trái cây và rau quả Việc kiểm soát cácenzyme này trong cà chua chuyển gen là một ví dụ điển hình trong việc ứng dụng RNA đối

mã để thao tác sự biểu hiện gen Enzyme pectinase cũng được ứng dụng nhiều trong quátrình chế biến thực phẩm, đặc biệt là khả năng làm trong nước quả

Phần I HỆ ENZYM PECTINASE

I Cơ chất pectin

Pectin là hợp chất cao phân tử mạch thẳng có cấu tạo từ sự kết hợp của các acidgalacturonic qua các liên kết –-1,4 glucoside Tùy thuộc nguồn pectin mà pectin có khốilượng phân tử 800000-200000 Pectin hoà tan trong nước, ammoniac, dung dịch kiềm,carbonate natri và trong glycerine nóng Độ hoà tan của pectin trong nước tăng lên khimức độ ester hoá trong phân tử pectin tăng và khi khối lượng phân tử pectin giảm

Pectin là tên chung được gọi cho các hỗn hợp chứa các thành phần rất khácnhau, trong đó pectinic acid là thành phần chủ yếu Các pectin tự nhiên định vị trongthành phần của tế bào có thể liên kết với các cấu trúc polyssacharide và protein để tạothành các protopectim không tan Có thể phân hủy để làm pectin tan trong nước bằngcách đun nóng pectin trong môi trường acid Vì thế, các pectin tan thu nhận được là kếtquả của sự phân hủy phân tử pectin không tan và chúng không đồng dạng với nhau

Trong thực vật, pectin tồn tại dưới ba dạng: pectin hoà tan, pectin acid vàprotopectin

Pectin hoà tan là ester methylic của acid polygalacturonic pectin, trong tự nhiên

có khoảng 2/3 số nhóm carboxyl của polygalacturonic acid được ester hoá bằngmethanol Pectin được ester hoá cao sẽ tạo gel đặc trong dung dịch acid và trong dungdịch đường có nồng độ 65% Enzyme pectinase tác động lên các hợp chất pectin có khốilượng phân tử khác nhau và cấu trúc hóa học không đồng dạng Cấu trúc hoá học cơ bảncủa pectin là - D - galacturonan hay – D -galacturonoglycan, mạch thẳng có cấu tạo từcác đơn vị D - galactopyranosyluronic acid (liên kết theo kiểu -1,4) Mặt khác, mức độoxy hoá trong các phân tử polymer này cũng khác nhau, trong đó một số nhất định cácnhóm carboxyl bị ester hoá bởi các nhóm methoxyl Trong một số trường hợp, chẳng hạntrong pectin củ cải đường, có sự ester hoá giữa các nhóm carboxyl và các nhóm acetyl

Pectinic acid là polygalacturonic acid có một phần nhỏ các nhóm carboxylđược ester hoá bằng methanol Pectinase là muối của pectinic acid Pectic acid là

polygalacturonic acid đã hoàn toàn giải phóng khỏi một đơn vị galacturonic acid Pectate

là muối của pectic acid

Protopectin tạo độ cứng cho quả xanh, không tan trong nước và có cấu tạo hoáhọc phức tạp Trong pectin có các phân tử pectin, các phân tử cellulose và các ion Ca2+ ,

Mg2+ , các gốc phosphoric acid, acetic acid và đường Protopectin khi bị thủy phân bằngacid thì giải phóng pectin hoà tan

II Pectinase

Enzyme pectinase là enzyme xúc tác sự phân hủy của các polymer pectin Sựphân hủy pectin trong tự nhiên thường xảy ra khi trái cây chín Những enzyme này vìvậy có một vai trò hết sức quan trọng trong quá trình bảo quản trái cây và rau quả Việckiểm soát các enzyme này trong cà chua chuyển gen là một ví dụ điển hình trong việcứng dụng RNA đối mã để thao tác sự biểu hiện gen Enzyme pectinase cũng được ứngdụng nhiều trong quá trình chế biến thực phẩm, đặc biệt là khả năng làm trong nước quả.Việc kiểm soát hoạt động của enzyme pectinase cũng có thể kiểm soát được độ nhớt củasản phẩm

Enzyme pectinase có thể được phân loại theo cơ chế tác dụng của chúng.

•Pectinesterase (PE): xúc tác sự thủy phân của các nhóm methyl ester Enzymethường tấn công vào các nhóm ester methyl của đơn vị galaturonate nằm kề đơn vị không

bị ester hoá, phân cắt các nhóm methoxy (COOCH3) đứng cạnh các nhóm –COOH tự do,tạo thành acid pectinic hoặc acid pectic và methanol Pectinesterase thu được từ cácnguồn khác nhau có giá trị pH tối ưu khác nhau Nếu thu từ nguồn VSV thì PH tối ưu từ4,5-5,5, còn nếu từ nguồn thực vật thì có pH tối ưu từ 5,0-8,5 Pectinesterase từ nấm mốc

có nhiệt độ tối ưu là 30-40oC và bị vô hoạt ở 55-62oC Pectinesterase thường được hoạthoá bởi các ion Ca2+ và Mg2+

•Polygalacturonase còn có tên gọi là poly -1,4-galacturoniglucanohydrolase, xúctác sự phân cắt các mối liên kết –1,4-glycosid Các exo-PG (exo-poly 1,4 D-galacturonide) galacturonohydrolase, phân cắt từ các đầu không khử, và endo-PG (endo-poly1,4 D-galacturonide) glycanohydrolase, tấn công ngẫu nhiên vào giữa mạch cơ

chất Polygalacturonase ít gặp trong thực vật nhưng có chủ yếu ở một số nấm mốc và vikhuẩn Polygalacturonase là một phức hệ enzyme gồm có nhiều cấu tử và thường có tínhđặc hiệu cao đối với cơ chất Trên cơ sở tính đặc hiệu và cơ chế tác dụng với cơ chất,enzym polygalacturonase được chia làm bốn loại:

 Polymethylgalacturonase hay còn gọi là-1,4-galacturonite-methylesglucanohydrolase,tác dụng trên polygalactorunic acid đã được methoxyl hoá (tức là pectin) Enzyme nàylại được phân thành hai nhóm nhỏ phụ thuộc vào khả năng phân cắt ở trong hay cuốimạch trong phân tử pectin, đó là endo-glucosidáe-polymethyl galacturonase kiểu I vàexo-glucosidase-polymethylgalaturonase kiểu III

 Polygalacturonase, enzyme tác dụng trên pectic acid hoặc pectinic, cũng đượcchia thành hai nhóm nhỏ là endo-glucosidase-polygalacturonase kiểu II và exo-glucosidase-polygalacturonase kiểu IV Enzyme endo-glucosidase-Polymethyl-galacturonase kiểu I là enzyme polymethylgalacturonase dịch hoá pectin có mức độmethyl hoá càng cao thì bị thủy phân bởi enzyme này càng nhanh và càng có hiệu quả.Trong dung dịch, khi có mặt của enzyme pectinesterase thì hoạt độ của enzyme này

thường bị giảm Enzyme này rất phổ biến trong các VSV, đặc biệt là nấm mốc A niger,

A, awamori.

•Pectate lyase (PEL): xúc tác sự phân cắt các đơn vị galacturonate không bị esterhoá Cả hai enzyme exo-PEL (exo-Poly(1,4 D-galacturonide) lyase) và endo-PEL(endo-poly(1,4 D-galacturonic) lyase) đều tồn tại Pectate và pectin có lượng methoxylthấp là các cơ chất thích hợp hơn cả cho các enzyme này Nói chung, cả hai enzyme nàyđều có khoảng pH tối đa nằm trong khoảng từ 8,0-11, đều cần ion Ca2+ để hoạt động.Pectate lyase không được tìm thấy trong cây xanh, nhưng có ở vi khuẩn và nấm Cácenzyme VSV ngoại bào này đóng một vai trò rất quan trọng trong quá trình gây bệnh ởthực vật, gây ra sự phân hủy mô của thành tế bào, làm mềm và làm mục mô thực vật

Ngoài ra còn có:

• Pectin-transeliminase hay còn được gọi là poly –-1,4-galaturonite –methylesteglucanoliase, là enyme tác dụng trên pectin và pectinic acid.

• Polygalactorunate-transeliminase còn được gọi là poly -1,4D-galaturonite –glucanoliase, là enzyme tác dụng trên pectic acid và pectinic acid

• Pectin lyase (PNL): xúc tác sự phân cắt các đơn vị galacturonate đã bị ester hoá.Tất cả các PNL đều là endo-enzyme

III Đặc điểm của các pectinase từ các nguồn khác nhau

1.1 Đặc điểm của pectineaterase thực vật:

Cà chua chứa ít nhất hai loại PE Cả PE1 và PE2 đều tăng trong giai đoạn đầu củaquá trình chín Khi bước vào giai đoạn chín, nồng độ enzyme PE1 giảm xuống, nhưngPE2 tích luỹ dần cho đến khi trái cây có màu đặc trưng của trái chín PE2 có khối lượngphân tử 23kD, pH tối ưu 7,6 Enzyme này bị bất hoạt 50% sau 5 phút đun ở 67oC Các ion

Ca2+ và Na+ làm tăng hoạt độ của enzyme lên tối đa ở các nồng độ 0,005M và 0,05M, theothứ tự

PE của đậu nành là protein có khối lượng phân tử 33kD, hoạt động tối ưu tại

pH gần 8 Polygalacturonic acid, sản phẩm hình thành do quá trình để methyl hoá, là mộtchất ức chế cạnh tranh

Trong thịt quả chuối có hai isoenzyme PE Cả hai có cùng khối lượng phân tử

là 30kD, nhưng có điểm đẳng điện khác nhau: 8,8 và 9,3 Các enzyme này hoạt động ở

pH tối đa là 7,5 Hoạt độ enzyme tăng lên khi thêm vào dung dịch NaCl ở nồng độ 0,2M,

và đưa pH của dung dịch về 6,0 Các enzyme này bị ức chế bởi nhiều loại polyol có khốilượng phân tử thấp, như glycerol, sucrose, glucose, maltose và galactose

PE trong quả cam có hai loại: đó là hai isoenzyme PE1 và PE2 có khối lượngphân tử 36,kD, nhưng có điểm đẳng điện khác nhau là 10,05 và ∃11,0, theo thứ tự pH tối

ưu của PE1 là 7,6, còn của PE2 là 8,0

Thịt quả cũng chứa hai isoenzymem, một trong hai enzyme này có tính bềnnhiệt hơn, còn enzyme kia thì ít mẫn cảm hơn khi bị tác động của protease Độ ổn địnhcủa enzyme có thể liên quan đến mức độ glycosyl hoá của các phân tử enzyme Enzymebền nhiệt hơn và enzyme còn lại có khối lượng là 51kD và 36kD, theo thứ tự

Cả táo và kiwi cũng chứa hai loại isoenzyme Các isoenzyme của kiwi cócùng khối lượng phân tử là 57kD và cùng điểm đẳng điện là 7,3 Tuy nhiên, chúng khácnhau về mức độ bền nhiệt

1.2 Đặc điểm của pectineaterase vi sinh vật:

Một điểm đáng lưu ý là tất cả enzyme VSV đều không phải là protein kiềm PE

của Trichoderma reerei có điểm đẳng điện nằm trong khoảng 8,3-9,5 và pH tối ưu là 7,6 Tuy nhiên, PE của Aspergillus có điểm đẳng điện và pH tối ưu trong khoảng acid Hoạt động của enzyme PE sinh ra bởi A niger đạt tối đa ở pH 4,5 ở 40oC Các PE acid vàkiềm có thể đề methyl hoá cơ chất pectin theo cùng một kiểu PE kiềm làm hình thànhcác pectin được đề ester hoá và pectin này có thể tạo gel yếu với ion calcium; PE acid tạo

ra pectin bị đề ester hoá có khả năng tạo gel mạnh với ion calcium

1.3.Trình tự amino acid:

Cấu trúc bậc một của PE cà chua chứa 305 amino acid với khối lượng phân tử 33

239 Enzyme này có chứa hai cầu nối disulfide (Cys98-Cys125 và Cys166-Cys200) Cys

166 có mặt trong tất cả các enzyme pectinesterase Trình tự amino acid suy luận trên cơ

sở các nucleotide cDNA cho thấy sự không nhất quán, 18 trong 27 vị trí khác nhau, cóthể làm thay đổi điện tích của protein Mặt khác, chỉ có khoảng 94% trình tự amino acidtrong một phần chuỗi amino acid có tính đồng dạng với toàn bộ trình tự của cDNA Sựkhông nhất quán này có thể phản ánh sự tồn tại của các isoenzyme, mặc dù chỉ có haiisoenzyme trong cà chua được biết đến Một số gen mã hoá cho các enzyme PE đã được

tách dòng và nghiên cứu đặc điểm Gen tách dòng từ Pseudomonas mã hoá cho PE có

chứa 396 amino acid với khối lượng phân tử là 41 004

1.4 Cơ chế để methyl hoá:

PE loại bỏ các nhóm methoxyl trong phân tử pectin bằng tương tác ái nhân của

enzyme lên ester, làm hình thành hợp chất trung gian acyl-enzyme và phóng thíchmethanol Tiếp theo sau là phản ứng deayl hoá, là phản ứng thủy phân của hợp chất trunggian acyl-enzyme, để giải phóng enzyme và carboxylic acid

Các PE có nguồn gốc thực vật phản ứng theo kiểu làm hình thành các khối

pectin chứa các nhóm carboxylate dọc theo mạch pectin Enzyme của Trichoderma reesei là một protein cơ bản cho kiểu phản ứng tương tự Enzyme của các loài Asperillus

với pH tối đa trong vùng acid, xúc tác phản ứng từ bên trong

Anh hưởng của các ion kim loại khi kích hoạt enzyme pectinesterase có thể cóliên quan đến tương tác của nó với cơ chất Polygalacturonic acid là một chất ức chếcạnh tranh trong phản ứng thủy phân nhờ sự xúc tác của PE Pectin chứa các nhómcacboxylate được sắp xếp như hình khối có thể tác dụng theo cách tương tự Sự liên kếtcủa các ion kim loại vào các nhóm carboxylate trong trường hợp này có khuynh hướngtrung hoà ảnh hưởng ức chế của cơ chất pectin lên enzyme Tuy nhiên Lượng dư các ionnày trên thực tế gây ra sự bất hoạt của PE vì các ion kim loại bị vây quanh bởi các nhómcarboxylate nằm kế cận với các liên kết ester cần thiết cho phản ứng thủy phân xảy ra

và Fusarium osyporum Tuy nhiên, trong thực tế, PG của thực vật bậc cao được nghiên

cứu rất nhiều ở cà chua chín

2.1.Các enzyme trong cà chua chín:

Các enzyme PG trong cà chua chín tồn tại dưới hai dạng, và cả hai đều là

endo-enzyme PG1 có khối lượng phân tử 84kD và có khoảng 50% bị bất hoạt ở nhiệt độ 78oC.PG2 có khối lượng phân tử 44kD và có khoảng 50% bị bất hoạt ở 57oC PG1 có độ ổnđịnh tối đa ở pH 4,3, trái lại PG2 ổn định tối đa ở pH 5,6 Sự phân tích sử dụng SDS-PAGE cho rằng PG1 là một dimer của PG2, tuy nhiên các nghiên cứu khác lại cho rằngPG1 hình thành là do sự kết hợp của PG2 với một ∃–subunit Các chuỗi polypeptide của

PG đều bị glycosyl hoá PG2 chứa 4,6 đường trung tính (mannose, L-gucose, xylose) liên kết với nhau thông qua cầu nối N-acetylglucosaminylasparaginyl Có sựkhác nhau chút ít về khối lượng phân tử, chẳng hạn các isoenzyme của PG2, PG2A vaPG2B có khối lượng phân tử tương ứng là 43 và 46kD Sự khác nhau này có thể là doquá trình sửa sai hoặc quá trình glycosyl hoá sau dịch mã Trong thực tế, các nghiên cứusau đó cũng đã chứng minh được rằng PG2A và PG2B là các dạng glycosyl hoá khácnhau của cùng các polypeptide

D-2.2 Trình tự amino acid:

Các trình tự amino acid được suy luận trên cơ sở các nucleotic của cDNA phân lập

không những từ trái cà chua mà còn từ phấn của các loài Pseudomonas solanacearum, Oenothera organesis, phấn hoa bắp, và từ trái bơ Gen của PG2 phân lập từ trái cà chua

mã hoá cho protein hoàn chỉnh có 373 amino acid, với khối lượng phân tử là 40 279.Enzyme này được tổng hợp từ một tiền chất, sau đó đi qua quá trình sửa chửa sau dịch

mã, gồm cả các quá trình loại bỏ các peptide tín hiệu, bị glycosyl hoá tại bốn điểm cókhả năng glycosyl, và sửa chữa ở đầu C cuối Các gen PG đơn mã hoá cho các loạiisoenzyme khác nhau, dẫn đến kết luận rằng PG1 và PG2 đều xuất phát từ cùng mộtchuỗi polypeptide, và rằng PG1 được tạo thành nhờ sự kết hợp của PG2 với β-subunit

β-subunit Sự chuyển đổi PG2 và PG1 trong quá trình chín của cà chua là một

vấn đề gây được nhiều chú ý β-subunit, một yếu tố bền nhiệt, đầu tiên được phân lập từ

cà chua xanh, có khả năng chuyển đổi PG2 thành PG1 trong ống nghiệm Yếu tố này sau

đó được xác minh là một glycoprotein rất đặc trưng với polypeptide PG về mặt miễn

dịch Phân tử PG1 được tạo thành từ một phân tử PG2 và một phân tử β-subunit; tuynhiên, chỉ có polypeptide PG có hoạt tính enzyme.

cDNA mã hoá cho –subunit có trong cà chua là một tiền chất có kích thước phân

tử lớn (69kD, 630 amino acid) Trong phân tử này, thêm vào phân tử protein hoàn chỉnh

là một trình tự tín hiệu kị nước (30 amino acid), một polypeptide chứa đầu cuối N-(78amino acid), và một tiền peptide chứa đầu cuối C-(233 amino acid) Protein hoàn chỉnhchứa glycosyl hoá là chứa 289 amino acid nặng 31,5 kD, điểm đẳng điện 4,9 Protein nàychứa lượng lớn amino acid gly, tyr, phe, và một motif lặp có cấu trúc liên ứngFTNYGxxGNGGxxx, trong đó “x” phần lớn là các amino acid phân cực Chức năng củamotif này trong protein vẫn chưa được biết rõ

2.3.Vai trò của PG trong quá trình làm chín trái cây.

Hoạt độ của enzyme trong giai đoạn đầu của quá trình làm chín chủ yếu là nhờ

PG1 PG1 tiếp tục tăng trong quá trình chín, và có mặt trong tất cả các giai đoạn của quátrình chín PG2 có khối lượng phân tử thấp hơn và ít bền nhiệt, PG2 xuất hiện trong giaiđoạn cuối của quá trình, và chiếm lượng lớn trong giai đoạn chín Sự xuất hiện kế tiếpnhau của hai enzyme này là kết quả của hoạt động điều hoà của –subunit, yếu tố nàyđược tìm thấy với lượng ít trong cà chua xanh, sau đó tăng lên trong giai đoạn chín

PG2 được coi như một endo-enzyme trong cà chua chín, PG1 được hình thànhtrong suốt quá trình chín khi β–subunit được sinh ra để phản ứng với PG2 Bằng cáchđiều chỉnh những thay đổi trong các phân tử PG trong các dịch chiết khác nhau có cácnồng độ khác nhau của NaCl và pH đệm khác nhau Trên thực tế gen mã hoá chopolypeptide PG trong một số nghiên cứu trước đây đã chứng minh điều này Gần đây, cácnghiên cứu về các kiểu biểu hiện gen của β–subunit và các phân tử PG cho thấy mRNAcủa β–subunit xuất hiện sớm trong quá trình phát triển của trái cây(10 ngày sau khi thụphấn) và tăng đến mức tối đa trong 30 ngày, cũng là lúc trái cây chín Sau đó, lượngmRNA của β-subunit giảm nhanh chóng, trong khi lượng mRNA của PG tăng một cáchđáng kể

Vì tất cả các kết quả nghiên cứu đạt được ở trên, ta có thể cho rằng enzyme PG2 được hình thành trong các giai đoạn sớm của quá trình chín phải đượcchuyển về PG1 do sự có mặt của β–subunit Sự tích lũy của PG2 trong các giai đoạn saucủa quá trình chín là do β–subunit bị cạn kiệt Vai trò của quá trình chuyển đổi này nhằmđiều hoà hoạt động của PG trong các giai đoạn của quá trình chín β–subunit phản ứng vàneo phân tử PG2 vào thành tế bào, tạo ra phân tử PG1 dưới dạng hoạt động để phân hủypectin Một số nghiên cứu khác cũng chứng minh được rằng PG1, chứ không phải PG2

endo-có chức năng trong việc làm phân huỷ và ổn định polyuronide, endo-có nghĩa là sự phân hủycủa polyuronide dưới tác động của enzyme PG là nguyên nhân dẫn đến quá trình mềmcủa cà chua.Tuy nhiên, khi nghiên cứu về sự xen đoạn và biểu hiện của gen PG trong càchua chuyển gen thì kết quả cho thấy polyuronide bị phân hủy nhưng không làm cho trái

cà chua mềm đi

2.4 Cơ chế và kiểu tác dụng:

Exo-PG thủy phân các đầu không khử của chuỗi polygalacturonic, tạo ra

galacturonic acid là sản phẩm thủy phân chiếm ưu thế(H.6.8) Sự thủy phân polymer này

bị gián đoạn của sự tồn tại của các mạch nhánh trong cơ chất Mức độ thuỷ phân tăng tỉ

lệ với kích thước cơ chất, đạt tối đa với mức polymer hoá 20 đối với các exo-PG ở cà rốt

và đào Hoạt động của các exo-enzyme làm tăng nhanh sự tạo thành các nhóm khử và làmtăng chậm độ nhớt của dung dịch cơ chất Sự phân hủy polyuronide trong quá trình chínkhông gây ra sự tích lũy galacturonic acid, và chỉ có endo-enzyme PG là có liên quan

Các endo-PG phân hủy pectic acid từ bên trong mạch, làm giảm nhanh độ nhớtcủa dung dịch cơ chất Tính đặc hiệu và kiểu tác dụng của endo-enzyme được xác địnhbởi trạng thái của điểm hoạt động Mức độ thủy phân của endo-PG ở nấm men giảmcùng với sự giảm độ dài mạch cơ chất Vị trí liên kết của endo-PG ở Aspergillus nigerđược cấu thành từ 4 điểm và sự phân cắt xảy ra giữa các điểm 1 và 2(H.6.9) Một cơ chấttetramer chịu sự phân cắt(3+1) thành trigalacturonic acid galacturonic Một cơ chấtpentamer cho ra hai sản phẩm phức tạp hơn, cả hai đều đáp ứng sự chiếm giữ hoàn toàn

của 4 điểm liên kết, tạo sự phân cắt (4+1) và (3+2) Cũng tương tự, đối với cơ chất làhexagalacturonic acid, sản phẩm sẽ tạo thành lối phân cắt (5+1), (4+2) và (3+3).Trigalacturonic acid bám vào điểm hoạt động để tạo thành các phức hợp hữu ích hoặckhông hữu ích Liên kết hữu ích trong trường hợp này làm sinh ra sự phân cắt (2+1).Liên kết không hữu ích được tạo thành khi ba đơn vị đơn lẽ bám vào ba điểm 2, 3 và 4 làkhông hề tương tác với các nhóm xúc tác định vị bên trong điểm 1 và 2 Cơ chất trongtrường hợp này đóng vai trò là một chất ức chế cạnh tranh (K = 0,67mM).

3.Pectate lyase:

Pectate lyase (PEL) là các enzyme VSV ngoại bào Các enzyme của giống

Erwina và Bacillus được biết đến là tác nhân gây ra triệu chứng soft-rod ở thực vật Tuy nhiên, chúng cũng được tìm thấy phổ biến ở Aeromonas, Pseudomonas, Xanthomonas, Aspergillus và Fusarium.

Erwinia chrysanthemi sinh ra các enzyme pectate lyase ở dạng isoenzyme có thể

được phân thành các nhóm trên cơ sở điểm đẳng điện của chúng: acid (pH 4-5), trunghoà (pH 7-8,5) và kiềm (pH 9-10) Số lượng các isoenzyme trong mỗi nhóm có thể thayđổi tùy theo loài Đa số các loài được nghiên cứu cho năm hay ít nhất bốn isoenzyme:một acid (PELA), hai trung hoà (PELA và C), hai kiềm (PELD và E) Tất cả cácisoenzyme này đều cần Ca++ để làm tăng độ hoạt động và có pH tối ưu 8-10 Các nghiêncứu trên chủng EC16 cho thấy rằng tất cả 4 isoenzyme trên đều là endo-enzyme(PELA(pI 4,2), PELA (pI 8,8), PELC (pI 9,0), và PELD (pI 10,0)) Các PEL kiềm rất đặchiệu trong việc gây ra sự giầm nước của các mô thực vật, tiếp theo là các isoenzymetrung hoà, trái lại các PEL acid không gây ảnh hưởng gì

Ở các chủng Erwinia carotovara, có ít nhất ba PEL được tiết ra, tất cả đều có

điểm đẳng điện ở pH kiềm: PELI (pI 9,7), PELII (pI 10,2), và PELIII (pI 10,35) Cả baisoenzyme này đều có pH tối ưu là 9,0 Nhiệt độ tối ưu cho hoạt động của PELII vàPELIII là 50 và 60oC, theo thứ tự PELI có độ bền nhiệt thấp Ở chủng GIR726, có bốnloại endo-PEL isoenzyme với các điểm đẳng điện ở các pH rất kiềm (10,0, 10,6, 10,3 và10,9) và khối lượng phân tử nằm trong khoảng từ 28-33 kD pH tối ưu cho hoạt động là

9,3 cho PELII 9,5 cho PELIV và 9,7 cho PEL I và III Cũng như với các PEL từ cácnguồn khác, những isoenzyme này được kích hoạt bởi Ca++ Hoạt độ enzyme tăng 50-70% khi có mặt của Ca++ ồng độ 0,5mM Isoenzyme với pI>10 chứa 2,5-4.8% đường

trung tính Các PEL từ một số loài Bacillus cũng có khả năng gây ra sự giảm nước ở mô

2 Polygalacturonase:

Việc xác định hoạt tính của enzyme này bằng cách đo độ nhớt của dung dịchpectic acid gồm methylester và glycolester cho thấy sự giảm nhanh tốc độ và mức độthuỷ phân, đồng thới tăng mức độ ester hoá Các nhóm acetyl có mặt làm giảm mức độthủy phân bằng cách giảm ái lực của các phân tử cơ chất qua các khối chứa các điểm liênkết Sự thủy phân bị hạn chế do sự có mặt của các nhóm acetyl có thể được xác minhbằng cách sử dụng pectin củ cải đường làm cơ chất PG tạo bởi nấm có thể thủy phân đến70% pectin bị acetyl hoá Tuy nhiên, kiểu tác dụng lên cơ chất của các PG có từ cácnguồn khác nhau thì khác nhau

Cơ chất tốt nhất cho sự phân hủy của endo-pectin-lyase ở pH>7 là pectin hoàntoàn bị ester hóa Tuy nhiên,ở các giá trị pH nhỏ hơn, enzyme này vẫn hoạt động đối vớipectin bị ester hóa ít hơn, đồng thời cần Ca++ để kích hoạt Điều này có ý nghĩa thực sựđối với các quá trình chế biến trái cây Những enzyme này cần các nhóm methylester đểhoạt động, trái lại chúng bị bất hoạt khi có mặt các nhóm glycolester và các pectate bịamidate hóa.

3.Endo-pectate lyates:

Trái lại, endo-pectate lyates không phân biệt methylester và glycolester củapectic acid Điều thú vị là pectate không phải là cơ chất tốt nhất cho vi khuẩn PAL từ vikhuẩn Chúng có hoạt độ cực đại (tốc độ ban đầu và mức độ phân hủy) nên pectin cóhàm lượng methoxyl thấp

4.Rhamno-galacturonase:

Gần đây, rhamno-galacturonase là enzyme được phát hiện có khả năng phân cắtliên kết glucoside trong các vùng phân nhánh nhiều của phân tử galacturonic rhamnoseacid có trong pectin của quả táo với hoạt tính rất cao khi những phân tử này bị đề esterhoá và arabinose bị lấy đi do bị thủy phân bởi acid (vùng phân nhánh nhiều bị sửa chữa).Enzyme này có mặt trong các chế phẩm thương mại của pectinase và chắc chắn phảiđược phân loại là pectinase Sản phẩm cuối là các oligomer có các đơn vị rhamnose vàgalacturonic acid, trong đó rhamnose làm hình thành đầu không khử

5 Pectinase thương mại:

Enzyme thương mại là các chế phẩm enzyme của nấm mốc, được điều chế chủ

yếu từ các loại Aspergillus Chúng thường là hỗn hợp của các PE, PG và Pl,

hemicellulase và endo-β -glucanase (C-x-cellulase) Hoạt tính của ba chế phẩm thươngmại khác nhau được trình bày ở bảng 6.13 Các enzyme đều được thu nhận từ nấm mốcđược sử dụng để sản xuất chế phẩm pectinase, trừ enzyme C-1-dellulase(cellobiohydrolase) là được thêm vào để chế phẩm đạt được mục đích kỹ thuật Enzymearabinanase đóng vai trò rất quan trọng trong quá trình chế biến nước ép trái cây

Có một điều chắc chắn là kỹ thuật gen sẽ được sử dụng nhằm mục đích sản xuấtcác chế phẩm enzyme, mở ra những khả năng mới cho các ứng dụng công nghiệp củacác chế phẩm enzyme này.

Phần II ỨNG DỤNG CỦA HỆ ENZYM PECTINASE

I Giới thiệu về ứng dụng của hệ enzym Pectinasa

Trong sản xuất thực phẩm, người ta thường sử dụng các chế phẩm pectinasedưới dạng tinh khiết Người ta không dùng chế phẩm dưới dạng canh trường nấm mốcsấy khô Tỉ lưởng chế phẩm pectinase cô đặc trên lượng nguyên liệu đem chế biến vàokhoảng từ 0.03 – 0.05 đến 0.10%

Pectinase thường được sử dụng trong các ngành công nghiếp thực phẩm sau:

-sản xuất rượu vang;

-sản xuất nước quả và nước uống không có cồn;

-sản xuất các mặt hàng từ quả: nước quả cô đặc, mứt nhừ, mứt đông, … ;

-sản xuất nước giải khát;

-sản xuất cà phê và cà phê hòa tan

Trong sản xuất rượu vang, cũng như trong sản xuất nước quả và các nước uốngkhông rượu, đều có thể sử dụng pectinase một cách rất hiệu quả Nhờ tác dụng củapectinase mà các quá trình ép, làm trong và lọc dịch quả rất dễ dàng, do đó làm tăng hiệusuất sản phẩm Chẳng hạn đưa pectinase vào khâu nghiền quả, sẽ làm tăng hiệu suấtnước quả sau khi ép lên tới 15 – 25% Bởi lẽ khi có pectin thì khối quả nghiền sẽ cótrạng thái keo, do đó khi ép dịch quả không thoát ra được Nhờ pectinase phân giải cácchất pectin di mà dịch quả trong suốt không bị vẩn đục và lọc rất dễ dàng Không nhũngvậy, enzym pectinase còn góp phần chiết rút được các chất màu, tanin và những chất hòatan nữa, do đó làm tăng thêm chất lượng của thành phẩm

Trong sản xuất các mặt hàng từ quả (mứt nhừ, mứt đông, …) pectinase cũng cóvai trò quan trọng Nhờ pectinase mà có thể thu được dịch quả có nồng độ đậm đặc.Chẳng hạn như dịch táo cô đặc đến 72 độ Brix, nếu không tách các pectin tự nhiên chứatrong đó đi thì sản phẩm sẽ bị keo tụ một cách mạnh mẽ và không thể cô đặc hơn nữa Đa

số trường hợp, người ta khử pectin đi, sau đó mới lọc rồi cô đặc, nhưng đôi khi người tacho pectinase tác dụng trong suốt thời gian cô đặc.

Trong sản xuất cà phê, người ta dùng pectinase để tách lớp keo ở trên bề mặt củahạt cà phê Trước đây người ta dùng ngay vi sinh vật để làm công việc này, nhưngthường quá trình xảy ra không đồng đều và khó kiểm tra Hiện nay người ta thường dùngcác chế phẩm pectinase

Pectin là hợp chất polyme của axit galaturonic, ester methyl và một số thànhphần nhỏ khác chỉ tồn tại trong tế bào thực vật Carbohydrat tồn tại cùng pectin bao gồm:araban, arabinoxylan, gaclactan Pectin chia ra làm hai loại: loại tan trong nước và loạikhông tan trong nước Loại không tan trong nước còn được gọi là protopectin và chúngthường liên kết với cellulose để tạo thành pectinocellulose

Tồn tại 3 nhóm enzym pectinase phân giải pectin:

-Pectin methyl esterase

-Depolymease

-Exoenzym pectinase

Pectin methyl esterase (EC.3.1.1.11): Enzym này tham gia phân giải pectin

thành axit pectic và methanol Enzym này còn có tên khác là pectiestenase (PE) Hiệusuất thủy phân pectin của enzym này rất cao, có thể đạt được 98%

Pectinesterase của nấm sợi hoạt đông mạnh ở pH 3 – 5

Cả hai loại pectinase này bị biến tính ở nhiệt độ 80OC

Enzym pectin methyl esterase tham gia tác động vào COOCH3 theo cơ chế sau:

Pectin depolymease: Enzym này có trong tế bào thực vật Tuy nhiên hiện nay

người ta sản xuất enzym này theo qui mô công nghiệp từ nấm sợi và từ vi khuẩn Chúngđược phân ra làm 4 loại như sau:

1- Endo pectin traseliminase (EC.4.2.2.3) viết tắt là PTE – pectiliase

2- Endo pectin axit traseliminase (EC.4.2.2.1) viết tắt là PATE

3- Endo - poly galacturonase (EC.3.2.1.15) viết tắt PG

4- Endo - poly methyl galacturonase viết tắt PMG

Các enzym thường phân cắt liên kết glucozit trong cấu tạo của pectin:

Enzym polygalacturonase tham gia tác động vào glucoside cuối cùng để tạo ra những phân tử cấu thành

Tùy theo nguồn thu nhận enzym depolymease mà chúing có pH tối ưu khácnhau Ta có thể tham khảo pH tối ưu của các enzym này trong bảng sau:

Bảng 1: Giá trị pH tối ưu của depolymease

5- exoenzym là những enzym giải phóng axit galacturonic bắt đầu từ điểm cuối của phân tử pectin Enzym pectinase được ứng dụng chủ yếu để phá vỡ thành tế bào của quả nhằm giải phóng các chất có trong tế bào của quả ra ngoài

Việc ứng dụng pectinase để thu nhận nước quả được áp dụng lần đầu tiên vàonăm 1930 Từ đó đến nay việc áp dụng enzym này đã trở nên rất phổ biến ở nhiều nướctrên thế giới

Việc thu nhận nước quả từ trước đến nay chủ yếu bằng phương pháp ép Nếupectin còn nhiều sẽ theo nước quả và gây ra hiện tượng nước quả bị đục, có độ keo cao

và rất khó lọc trong

Trong tế bào của quả nước chiếm khoảng 90 – 95% Nếu ta chỉ nghiền sau đó épthì ta chỉ có thể thu nhận được khoảng 60 – 70% là tối đa Khi ta cho enzym pectinasevào, hiệu suất ép sẽ tăng 15 – 30% Nhiều trường hợp, hiệu suất ép tăng đến 50% Liềulượng chế phẩm enzym tinh khiết cho vào là 0,03 – 0,05% hoặc chế phẩm thô là 0,5 –2% Nhiệt độ duy trì cho quá trình thủy phân là 43 – 45oC Thời gian thủy phân là 4 – 8h.dịch quả thu được bằng pectinase sẽ trong hơn, khả năng lọc sẽ tốt hơn và hiệu quả kinh

và sản phẩm cần đạt tới Ngoài ra, việc sử dụng các loại chế phẩm enzym như trình bày trên còn phụ thuộc vào công nghệ sản xuất (các yếu tố kỹ thuật)

Trong sản xuất nước quả và rượu vang, người ta thường sử dụng một trong sáunhóm enzym sau

•Nhóm chế phẩm enzym dùng để sản xuất nước quả đục Mục đích sử dụngnhóm chế phẩm enzym này là làm tăng hiệu suất trích ly để thu được lượng sản phẩmlớn

•Nhóm chế phẩm enzym dùng để sản xuất nước quả trong, không chứa pectin.Mục đích sử dụng nhóm chế phẩm enzym này là làm tăng hiệu suất trích ly và thủy phânhoàn toàn các chất protein, pectin, làm giảm độ nhớt và làm triệt tiêu nguyên nhân làmđục nước quả

•Nhóm chế phẩm enzym dùng để làm tăng khả năng đồng hóa nước quả và thịtquả, làm tăng khả năng trích ly nước quả.

•Nhóm chế phẩm enzym dùng để sản xuất bán sản phẩm rượu vang, nhằm làmtăng hiệu suất trích ly của bán sản phẩm

•Nhóm chế phẩm enzym dùng để ngăn cản quá trình oxy hóa và làm cản trở sựphát triển của vi sinh vật hiếu khí phát triển trong nước quả, trong rượu vang

•Nhóm chế phẩm enzym dùng vào mục đích chống lại sự lại đường trong sảnxuất siro thành phẩm

Việc sử dụng các chế phẩm enzym phải được xem xét kỹ lưỡng trên cơ sở đặcđiểm nguyên liệu trái cây cần xử lý Trong các đặc điểm của trái cây, người ta quan tâmrất nhiều đến đặc điểm màu sắc tự nhiên của sản phẩm Trong nhiều trường hợp, việc sửdụng enzym phải đảm bảo giữ được màu sắc tự nhiên ban đầu hoặc tạo ra những màu sắctheo ý muốn bằng cách điều khiển những phản ứng enzym Theo màu sắc tự nhiên, cácloại trái cây được chia làm hai loại:

Trái cây có màu nhạt: táo, lê, nho trắng, chuối, cam, xoài, bưởi …

Trái cây có màu sẫm do chứa nhiều antoxian: anh đào, mận đỏ, nho đỏ, mận

đen, dâu …

Để xử lý quả nghiền có màu nhạt, người ta thường sử dụng một loạt các enzym sau:

- Enzym endo-PMG để làm giảm độ nhớt của dịch quả

- Enzym PE làm tăng hiệu suất trích ly

- Enzym khác như cellulase, hemicellulase, protease không bắt buộc

Tuy nhiên, nếu cho thêm những enzym này vào sẽ làm tăng khả năng trích ly vậtchất hòa tan trong tế bào quả

Riêng enzym PTE, cần lưu ý là enzym này phân hủy protopectin, thường không

có lợi cho việc thoát các chất có trong tế bào quả Do đó trong trường hợp này, người ta không sử dụng enzym PTE

Sự có mặt của enzym ascorbinatoxidase thường gây ra sự phân giải vitamin C