SỰ HIỆN DIỆN VÀ VAI TRÒ CỦA VI KHUẨN TÍCH LŨY POLYPHOSPHATE TRONG NƯỚC AO NUÔI CÁ TRA VÀ CHẤT THẢI TRẠI CHĂN NUÔI HEO Ở ĐỒNG BẰNG SÔNG CỬU LONG

BẢNG CHÚ THÍCHĐBSCL: Đồng Bằng Sông Cửu Long DPAOs: Denitrifying polyphosphate accumulating organisms vi khuẩn tích lũy poly-P khử nitơEBPR: Enhanced biological phosphorus removal Tăng c

VIỆN NGHIÊN CỨU VÀ PHÁT TRIỂN CÔNG NGHỆ SINH HỌC

CHUYÊN ĐỀ LUẬN ÁN TIẾN SĨ

SỰ HIỆN DIỆN VÀ VAI TRÒ CỦA VI KHUẨN TÍCH LŨY POLYPHOSPHATE TRONG NƯỚC AO NUÔI CÁ TRA VÀ CHẤT THẢI TRẠI CHĂN NUÔI HEO Ở ĐỒNG BẰNG SÔNG CỬU LONG

Nghiên cứu sinh thực hiện

LÊ QUANG KHÔIKhóa: 2011 – 2015

VIỆN NGHIÊN CỨU VÀ PHÁT TRIỂN CÔNG NGHỆ SINH HỌC

CHUYÊN ĐỀ LUẬN ÁN TIẾN SĨ

SỰ HIỆN DIỆN VÀ VAI TRÒ CỦA VI KHUẨN TÍCH LŨY POLYPHOSPHATE TRONG NƯỚC AO NUÔI CÁ TRA VÀ CHẤT THẢI TRẠI CHĂN NUÔI HEO Ở ĐỒNG BẰNG SÔNG CỬU LONG

Người hướng dẫn khoa học PGS.TS CAO NGỌC ĐIỆP

Nghiên cứu sinh thực hiện

LÊ QUANG KHÔIKhóa: 2011 – 2015

Cần Thơ, 12/2012

MỤC LỤC

MỤC LỤC i

DANH SÁCH HÌNH iii

DANH SÁCH BẢNG iv

TÓM LƯỢC v

BẢNG CHÚ THÍCH vi

Chương 1 ĐẶT VẤN ĐỀ 1

1 1 Khái quát về tình hình nghiên cứu trong và ngoài nước 2

1 1 1 P và tác động của chúng đến chất lượng nước 2

1 1 2 Nguồn chất thải từ ao nuôi cá tra và trại chăn nuôi heo ở ĐBSCL 3

1 1 3 Loại bỏ P sinh học 5

1 1 4 Poly-P 6

1 1 5 Chuyển hóa và điều hòa sự trao đổi chất trong PAOs 8

1 1 6 Tình hình nghiên cứu cấu trúc quần thể vi khuẩn poly-P 14

1 1 7 Tình hình nghiên cứu cấu trúc quần thể vi khuẩn poly-P trong các ao hồ 17

1 1 8 Nhóm vi khuẩn tích lũy poly-P khử nitơ 18

1.2 Phạm vi nghiên cứu chuyên đề 19

1 2 1 Mục đích của chuyên đề 19

1 2 2 Yêu cầu chuyên đề 20

CHƯƠNG 2: PHƯƠNG TIỆN VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 21

2 1 Phương tiện nghiên cứu 21

2 1 1 Thiết bị, dụng cụ 21

2 1 2 Nguyên vật liệu 22

2 1 3 Hóa chất 22

2 2 Phương pháp 25

2 2 1 Thời gian và địa điểm tiến hành thí nghiệm 25

2 2 2 Phương pháp lấy mẫu 25

2 2 3 Phương pháp phân lập vi khuẩn tích lũy Poly-P 25

2 2 4 Xác định khả năng hình thành Poly-P nội bào 26

2 2 5 Gram staining 27

2 2 6 Chụp kính hiển vi điện tử (electron microscopy) 27

2 2 7 Nhận diện PAOs 27

CHƯƠNG 3 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 29

3 1 Kết quả 29

3 1 1 Phân lập và mô tả PAOs 29

3 1 2 Chụp SEM (Scanning electron microscopy) 31

3 1 3 Đặc điểm các dòng vi khuẩn đã phân lập 31

3 1 4 Chụp TEM 32

3 1 5 Định danh và phân tích sự phát sinh loài PAOs 33

3 2 Thảo luận 38

Chương 4 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 41

4 1 Kết luận 41

4 2 Đề nghị 41

Tài liệu tham khảo 43

DANH SÁCH HÌNH

Hình 1: Cấu trúc chuỗi poly-P 6

Hình 2: Ảnh chụp dưới kính hiển vi điện tử Burkholderia cepacia 6

Hình 3: Hiệu quả trích poly-P bằng nước lạnh, nước nóng và NaOH 8

Hình 4: Mô tả các đặc điểm sinh hóa chính trong quá trình EBPR 9

Hình 5: Mối tương quan giữa tốc độ hấp thu phosphate và hàm lượng COD ngoại bào 11

Hình 6: Sơ đồ mô tả sự đồng vận chuyển MeHPO4/H+ 12

Hình 7: Ảnh chụp SEM với kích thước các dòng vi khuẩn phân lập 31

Hình 8: Ảnh chụp TEM 32

Hình 9: Cây phát sinh loài dạng Maximum Likehood 32

Hình 10: Tỉ lệ các lớp trong các dòng vi khuẩn phân lập từ nước ao nuôi cá tra 38

DANH SÁCH BẢNG

Bảng 1: Các chất sử dụng và điều kiện ly trích poly-P (Eixler et al., 2005) 7

Bảng 2: Trình tự primer dùng nhận diện 16S rDNA vi khuẩn PAOs 22

Bảng 3: Kết quả phân lập các dòng vi khuẩn 29

Bảng 4: Kết quả kiểm hàm lượng poly-P nội bào 30

Bảng 5: Tỷ lệ phần trăm về đặc điểm hình thái của các dòng vi khuẩn phân lập 31

Bảng 6: Kết quả phân lập các dòng vi khuẩn trong nước ao nuôi ca tra 33

Bảng 7: Hàm lượng poly-P nội bào các dòng vi khuẩn phân lập nước ao nuôi cá tra 34

Bảng 8: Các dòng vi khuẩn tích lũy Polyphosphate phân lập từ nước ao nuôi cá tra 35

Bảng 9: Mối quan hệ phát sinh loài của các dòng vi khuẩn phân lập 37

TÓM LƯỢC

Vi khuẩn tích lũy polyphosphate (polyphosphate accumulating organisms - PAOs) lànhóm vi khuẩn có vai trò quan trọng trong xử lý nước thải bằng con đường sinh học.Chúng tích lũy lượng lớn polyphosphate nội bào, góp phần vào quá trình loại bỏphospho hòa tan trong nước

Áp dụng phương pháp phân lập truyền thống và kỹ thuật sinh học phân tử thông qua cácphương pháp thể hiện trong các tài liệu nghiên cứu trước đây cho thấy PAOs có sự đadạng về thành phần trong nước ao nuôi cá tra Kết quả có 439 dòng phân lập từ 196 mẫuchất thải từ ao cá tra và trại chăn nuôi heo Trong đó có 191 dòng phân lập từ 70 mẫunước ao nuôi cá tra và 248 dòng phân lập từ 126 mẫu chất thải trại chăn nuôi heo Kếtquả kiểm tra hàm lượng polyphosphate nội bào của từng dòng phân lập cho thấy hàmlượng polyphosphate dao động từ 2 mg/l đến 148,1 mg/l sau 6 ngày nuôi vi khuẩn trongmôi trường Khả năng tích lũy polyphosphate dao động lớn và tùy thuộc vào từng dòng

vi khuẩn Có 398/439 dòng vi khuẩn phân lập có khả năng tích lũy polyphosphate vớihàm lượng từ 2 – 19,5 mg/l (chiếm 90,66%) Chỉ có 45/439 dòng vi khuẩn phân lập cóhàm lượng polyphosphate tích lũy nội bào từ 19.6 – 148,1 mg/l (trong đó có 29/439dòng tích lũy từ 20 – 50 mg/l, 11/439 dòng có hàm lượng từ 50 – 100 mg/l và 5 dòngtích lũy từ 100 – 148,1 mg/l)

Dựa trên trình tự của 16S rRNA, 21 dòng trên 191 dòng phân lập từ nước ao nuôi cátra nằm trong bốn lớp Bacilli, Actinobacteria, Beta-proteobacteria, Gamma-

proteobacteria Các dòng có quan hệ gần gũi với giống Bacillus chiếm tỉ lệ cao

(52.4%) trong các dòng phân lập, nhưng dòng có khả năng tích lũy poly-P cao là

Burkholderia vietnamiensis TVT003L trong lớp Beta-proteobacteria, Acinetobacter radioresistens TGT013L trong lớp Gamma-proteobacteria và Arthrobacter protophomiae VLT002L trong lớp class Actinobacteria Kết hợp chụp TEM xác định

phosphate tồn trữ trong tế bào dạng hạt polyphosphate

Từ khóa: Vi khuẩn tích lũy poly-P, polyphosphate, loại bỏ phosphate, ao cá tra,

Bacilli, Actinobacteria

BẢNG CHÚ THÍCH

ĐBSCL: Đồng Bằng Sông Cửu Long

DPAOs: Denitrifying polyphosphate accumulating organisms (vi khuẩn tích lũy poly-P khử nitơ)EBPR: Enhanced biological phosphorus removal (Tăng cường sự loại bỏ P bằng sinh học)GAOs: glycogen accumulating organisms (vi khuẩn tích lũy glycogen)

SEM: Scanning electron microscopy (Kính hiển vi điện tử quét)

TEM: Transmission electron microscopy (kính hiển vi điện tử truyền quét)

VFAs: Volatile fatty acids (acid béo dễ bay hơi)

AGH: ký hiệu dòng vi khuẩn phân lập từ chất thải trại chăn nuôi heo ở tỉnh An GiangAGT: ký hiệu dòng vi khuẩn phân lập từ nước ao nuôi cá tra ở tỉnh An Giang

BLH: ký hiệu dòng vi khuẩn phân lập từ chất thải trại chăn nuôi heo ở tỉnh Bạc LiêuBTH: ký hiệu dòng vi khuẩn phân lập từ chất thải trại chăn nuôi heo ở tỉnh Bến TreBTT: ký hiệu dòng vi khuẩn phân lập từ nước ao nuôi cá tra ở tỉnh Bến Tre

CMH: ký hiệu dòng vi khuẩn phân lập từ chất thải trại chăn nuôi heo ở tỉnh Cà MauCTH: ký hiệu dòng vi khuẩn phân lập từ chất thải trại chăn nuôi heo ở tỉnh Cần ThơCTT: ký hiệu dòng vi khuẩn phân lập từ nước ao nuôi cá tra ở tỉnh Cần Thơ

DTH: ký hiệu dòng vi khuẩn phân lập từ chất thải trại chăn nuôi heo ở tỉnh Đồng ThápDTT: ký hiệu dòng vi khuẩn phân lập từ nước ao nuôi cá tra ở tỉnh Đồng Tháp

HGH: ký hiệu dòng vi khuẩn phân lập từ chất thải trại chăn nuôi heo ở tỉnh Hậu GiangHGT: ký hiệu dòng vi khuẩn phân lập từ nước ao nuôi cá tra ở tỉnh Hậu Giang

KGH: ký hiệu dòng vi khuẩn phân lập từ chất thải trại chăn nuôi heo ở tỉnh Kiên GiangKGT: ký hiệu dòng vi khuẩn phân lập từ nước ao nuôi cá tra ở tỉnh Kiên Giang

LAH: ký hiệu dòng vi khuẩn phân lập từ chất thải trại chăn nuôi heo ở tỉnh Long AnSTH: ký hiệu dòng vi khuẩn phân lập từ chất thải trại chăn nuôi heo ở tỉnh Sóc TrăngSTT: ký hiệu dòng vi khuẩn phân lập từ nước ao nuôi cá tra ở tỉnh Sóc Trăng

TGH: ký hiệu dòng vi khuẩn phân lập từ chất thải trại chăn nuôi heo ở tỉnh Tiền GiangTGT: ký hiệu dòng vi khuẩn phân lập từ nước ao nuôi cá tra ở tỉnh Tiền Giang

TVH: ký hiệu dòng vi khuẩn phân lập từ chất thải trại chăn nuôi heo ở tỉnh Trà VinhTVT: ký hiệu dòng vi khuẩn phân lập từ nước ao nuôi cá tra ở tỉnh Trà Vinh

CHƯƠNG 1 ĐẶT VẤN ĐỀ

Phú dưỡng hóa (eutrophication) là vấn đề nghiêm trọng về môi trường (Qin 2002) Mặc

dù sự phát triển quá mức của tảo gây ra hiện tượng phú dưỡng hóa, không chỉ dẫn đếnhậu quả là nước bị ô nhiễm nặng mà còn đưa đến vấn đề là phải xử lý ô nhiễm về môitrường xung quanh và ảnh hưởng của chúng đến sức khỏe con người Nhiều nghiên cứutập trung xem xét các yếu tố hóa học và vật lý như ánh sáng (Swale 1964), nhiệt độ củanước (Robarts và Zohary 1987), thủy động lực học (You et al., 2007), độ đục của nước

và thành phần các chất dinh dưỡng (Painting et al., 2007) gây ra sự phát triển quá mứccủa tảo xanh lục (Blue-green algae) Trong các yếu tố trên, thành phần dinh dưỡng đượcxem là chỉ tiêu chủ yếu dẫn đến sự phú dưỡng hóa, đặc biệt là phospho (P) được xem làyếu tố giới hạn cho sự phát triển của tảo và là thành phần chủ yếu gây sự phú dưỡng hóacho các ao hồ

Sự hấp thu và giải phóng P hòa tan dạng phosphate phụ thuộc vào các yếu tố nhạy cảmtrong các phản ứng oxy hóa khử dưới điều kiện hiếu khí và kỵ khí Trong điều kiệnhiếu khí P sẽ được hấp thu và giải phóng trở lại trong điều kiện kỵ khí dưới sự hiệndiện của Fe3+/Fe2+ (Zhou et al., 2005) Trước đây, quá trình hấp thu P hòa tan đượcxem như là quá trình loại bỏ bằng con đường hóa học (Peng et al., 2007) Tuy nhiên,nhiều bằng chứng cho thấy quá trình sinh học đóng vai trò quan trọng (Gächter et al.1988) Bên cạnh xử lý P hòa tan bằng con đường hóa học, nhiều vi sinh vật có khảnăng hấp thu lượng lớn phosphate và tồn trữ chúng dạng poly-P nội bào Nhiều nghiêncứu cũng cho rằng cả hai quá trình hóa học và sinh học đều có vai trò quan trọng trongquá trình hấp thu và giải phóng phosphate (Khoshmanesh et al., 1999) Tác động của

vi khuẩn trong quá trình hấp thu và giải phóng phosphate có thể thông qua con đườngtrực tiếp như: sự phân hủy các hợp chất hữu cơ, tích tụ và phóng thích phosphate hoặcgián tiếp thông qua quá trình khoáng hóa (Davelaar 1993) Chính vì vậy, vi khuẩn tíchlũy poly-P được xem xét và sử dụng trong quá trình loại bỏ các thành phần dinh dưỡngtrong các hệ thống xử lý nước thải (Mino et al., 1998), bên cạnh đó, chúng cũng hiệndiện trong các ao hồ trong tự nhiên (Davelaar 1993)

Vi khuẩn hấp thu P hòa tan đặc biệt là nhóm vi khuẩn tích lũy poly-P (PAOs) là nhóm

vi khuẩn có vai trò quan trọng trong xử lý nước thải bằng con đường sinh học Chúng

đây vài thập niên, từ khi các kỹ thuật sinh học phân tử được sử dụng để nhận dạngnhóm vi sinh vật này cho thấy chúng có sự phong phú cao trong các hệ thống xử lýnước thải Khoảng 6 năm trở lại đây, nhiều nghiên cứu về vi sinh vật học và sinh lý -sinh thái học đã có những bước phát triển nhảy vọt Một lớn thông tin về bộ gen đượckhám phá dựa vào các kỹ thuật giải trình tự DNA Tuy nhiên, chưa có nhiều nghiêncứu sự hiện diện và vai trò của vi khuẩn trong quá trình hấp thu P hòa tan trong nước ởcác ao - hồ, đặc biệt là trong các ao nuôi cá tra công nghiệp và các ao sinh học tiếpnhận nước thải từ hệ thống xử lý chất thải chăn nuôi heo (biogaz).

Trong chuyên đề này sẽ tập trung tìm hiểu về quá trình trao đổi chất, cấu trúc quần thể

và sự phân bố về mặt sinh thái của nhóm vi khuẩn tích lũy poly-P trong các hệ thống

xử lý nước thải và trong các ao - hồ trong tự nhiên, nhằm mục đích tổng hợp các thôngtin nghiên cứu trên thế giới và trình bày một cách tổng quan về một số đặc tính sinhhọc của nhóm vi khuẩn quan trọng này Thông qua đó đề ra các phương pháp phân lập

và nhận diện vi khuẩn tích lũy poly-P

1 1 Khái quát về tình hình nghiên cứu trong và ngoài nước

1 1 1 P và tác động của chúng đến chất lượng nước

Phospho được xác định như là yếu tố dinh dưỡng thiết yếu cho sự sống P là thànhphần cấu tạo nên các hợp chất quan trọng của sự sống như: các phân tử di truyềnDNA, RNA; các phân tử cấu trúc như protein, lipid; các phân tử dự trữ năng lượng cho

tế bào như ATP, poly-P…Tuy nhiên, mặc dù P vừa là một yếu tố kiểm soát sự tăngtrưởng và phát triển của sinh vật nhưng chúng cũng là nhân tố chủ yếu gây ra hiệntượng phú dưỡng hóa Ở hàm lượng vượt mức cho phép, P kích thích mạnh mẽ khảnăng tăng sinh khối của thủy sinh vật như tảo, tảo lam…Bowman et al., (2007), chỉ rarằng, một lượng nhỏ P trong nước 0.1 mg/l và duy trì thời gian dài sẽ gây sự phát triểnmạnh mẽ của tảo Sự biểu hiện có thể nhận biết rõ của hiện tượng này là sự bùng nổ củatảo, sự giảm hàm lượng oxy hòa tan kéo theo nước ô nhiễm nặng, cá chết, các thực vật –động vật thủy sinh dần dần bị tiêu diệt Trong một vài trường hợp, có sự xuất hiện của tảo

độc như Microsystis Sự quá dư thừa lượng dinh dưỡng trong nước làm gia tăng sự hoạt động các vi sinh vật có hại như Pfisteria Điều này sẽ tác động đến nền kinh tế thông qua

ảnh hưởng của chúng đến nghề nuôi cá thương mại, du lịch sinh thái và có thể ảnh hưởngđến sức khỏe con người

1 1 2 Nguồn chất thải từ ao nuôi cá tra và trại chăn nuôi heo ở ĐBSCL

Nguồn chất thải chủ yếu chứa lượng lớn P là phân động vật Chúng tồn tại 3 dạng: Phữu cơ (P liên kết trong các hợp chất hữu cơ), orthophosphate (PO43-) và poly-P Hầu hếtcác P hữu cơ và poly-P có thể chuyển hóa thành PO43- thông qua quá trình sinh học ỞĐBSCL nguồn thải chứa P từ phân chủ yếu từ các ao nuôi cá tra và trại chăn nuôi heocông nghiệp

Đối với nuôi cá tra công nghiệp

Ở các nơi có nguồn thải N và P cao như khu vực nuôi cá tra công nghiệp tập trung ởĐBSCL Tổng N và P thải ra từ các ao nuôi cá tra khoảng 31,6 tấn N và 9,8 tấn P năm

2007 và 50,4 tấn N và 15,7 P tấn năm 2008 (De Silva et al., 2010) Nếu tất cả chúngthải trực tiếp ra các con sông ở ĐBSCL thì gây cơ gây ô nhiễm nặng Tuy nhiên,không phải tất cả chúng đều thải ra các con sông ở ĐBSCL, một phần chất thải sửdụng cho nông nghiệp và một phần chúng tích tụ trong bùn đáy ao hoặc được hấp thubởi các vi sinh vật trong ao Phan et al., (2009) quan sát sự tích lũy thành phần dinhdưỡng trong ao cho thấy rằng, khoảng 51% P được tích lũy trong bùn đáy ao Điều nàycho thấy rằng vai trò quan trọng của các vi sinh vật trong quá trình tích tụ P hòa tantrong nước nuôi cá tra

Theo Lê Bảo Ngọc (2004), bình quân sản xuất 1kg cá Tra sẽ thải ra môi trường 23,2g

N và 8,6g P Khi cho ăn, cá chỉ hấp thu được chỉ khoảng 17% năng lượng trong thức

ăn và phần còn lại (83%) sẽ thải ra và hòa lẫn trong môi trường nước trở thành cácchất hữu cơ phân hủy

Theo Huỳnh Trường Giang et al., (2008) nước ao nuôi cá Tra thâm canh ở An Giangvào mùa khô có TSS từ 3,5-122,7mg/l, TAN từ 0,053-2,513mg/l, PO43- từ 0,004-1,973mg/l, NO2- từ 0,001-1,359mg/l, NO3- từ 0,122-18mg/l; trong mùa mưa TSS từ18,5-188mg/l, TAN từ 0,11-4,062mg/l, PO43- từ 0,003-2,28mg/l, NO2- từ 0,034-1,359mg/l, NO3- từ 0,194-8,743mg/l

Thay nước ao nuôi là việc làm rất cần thiết trong quá trình nuôi cá Tra Số lần thaynước trong sáu tháng bình quân là 30-40 lần và có thể lên đến 90 lần (Lê Anh Tuấn,2008) Lượng nước nầy hầu như 100% được thải trực tiếp ra sông, rạch mà không qua

xử lý Đây là mối đe dọa lớn đến chất lượng nước mặt cho sinh hoạt và tăng nguy cơ

lây lan bệnh trong nuôi trồng thủy sản

Để có 100 tấn cá phi lê phải có 300 tấn cá nguyên liệu, tức phải cần 480 tấn thức ănthủy sản (tính theo hệ số chuyển hóa thức ăn bình quân 1,6) Như vậy, nếu vùngĐBSCL đạt chỉ tiêu 1 triệu tấn cá phi lê xuất khẩu thì phải đưa vào nguồn nước 4,8triệu tấn thức ăn - tức cùng lúc phải làm sao có đến 26 triệu ha mặt nước để tự xử lý ônhiễm do 2,1 triệu tấn chất thải hữu cơ phát sinh

Đối với các ao nuôi công nghiệp, chất thải trong ao có thể chứa đến 45% Nitrogen và22% là các chất hữu cơ khác Nguồn chất thải này lan truyền nhanh ra bên ngoài gâynguy cơ ô nhiễm còn khiến dịch bệnh thủy sản phát sinh trong môi trường nước

Đối với chăn nuôi heo

Số liệu thống kê cho thấy hoạt động chăn nuôi có khuynh hướng gia tăng từ năm 1990đến năm 2002 về số lượng đầu heo và sản lượng thịt heo hơi xuất chuồng

Hiện nay, do sự gia tăng nhanh về dân số và mức sống, nhu cầu về các sản phẩm chănnuôi (thịt, trứng, sữa) sẽ ngày càng gia tăng Việc tăng nhanh số trại chăn nuôi là điềutất nhiên, nhất là những trại nuôi có quy mô lớn Đối với chăn nuôi heo, năm 2001 cảnước có khoảng 22 triệu con heo, sản xuất 1,5 triệu tấn thịt hơi Hàng năm tổng đànheo cả nước tăng khoảng 1% (Nguyễn Đăng Vang, 2002)

Ô nhiễm môi trường nước do nước thải chăn nuôi có thể gây ra hiện tượng phú dưỡngđối với nước mặt Do đó, các vi khuẩn phân hủy rong tảo cũng phát triển, sử dụng oxytrong nước và khi chết đi tạo mùi vị khó chịu cho nước Sự phú dưỡng cũng gắn liền

với sự phát triển của một loài sinh vật có hại mang tên Pfiesteria piscicida có khả năng

giết chết cá hàng loạt và gây bệnh cho người

Tóm lược: P là yếu tố dinh dưỡng chính nhưng cũng là yếu tố kiểm soát chất lượng

nước Ở hàm lượng P hòa tan vừa đủ thì cần thiết cho sự phát triển của thủy sinh vật,tuy nhiên hàm lượng P vượt giới hạn cho phép sẽ phá vỡ sự cân bằng sinh thái thủysinh vật và ảnh hưởng đến môi trường sống Ở các ao hồ, đặc biệt là các ao nuôi cá tra

và nước thải chăn nuôi heo có hàm lượng P cao dạng phosphate không những là vấn đềnghiêm trọng có liên quan trực tiếp đến ô nhiễm môi trường nước xung quanh mà còntác động gián tiếp đến nghề nuôi cá trong khu vực

1 1 3 Loại bỏ P sinh học

Loại bỏ P hòa tan có ý nghĩa vô cùng quan trọng Hiện nay, một số biện pháp có thểloại bỏ P được sử dụng là biện pháp hóa học và sinh học Ba biện pháp được áp dụngnhư lắng tụ P bằng quá trình bổ sung các kim loại như muối natri hoặc kẽm, loại bỏ Pbằng màng thấm lọc, tích tụ P trong tế bào vi sinh vật

Quá trình loại bỏ P hòa tan bằng sinh học tùy thuộc vào hàm lượng P hòa tan và hiệuquả của quá trình tách bùn Sinh khối có thể chứa một lượng P 1.5 đến 2.5% (w/w)trên chất rắn dễ bay hơi Trong quá trình làm tăng cường sự loại bỏ P hòa tan, thì sinhkhối có thể chứa đến 6 đến 8%, một lượng P vượt quá mức nhu cầu thiết yếu của tếbào P tích lũy trong tế bào sẽ được loại bỏ bằng quá trình lắng tụ sinh học

Quá trình loại bỏ P bằng con đường sinh học tùy thuộc vào sự tăng cường khả năngcủa vi sinh vật hấp thu lượng phosphate tự do trong môi trường vào tế bào Do đó, quátrình này thường cho là quá trình làm tăng cường sự loại bỏ P sinh học (Enhancedbiological phosphorus removal – EBPR) EBPR được ứng dụng trong hầu hết các hệthống xử lý nước thải Mặc dù EBPR cho thấy loại bỏ P hiệu quả, nhưng đôi lúc hoạtđộng này bị gián đoạn Nhiều nghiên cứu trong 50 năm qua đã góp phần giải thíchhiện tượng này Tuy còn vài khía cạnh chưa được làm sáng tỏ, nhưng các nghiên cứucũng đã mang lại nhiều sự hiểu biết quan trọng về con đường trao đổi chất và được ápdụng vào thực tiễn Về mặt cơ bản, con đường trao đổi chất kỵ khí - hiếu khí và xácđịnh vi sinh vật có vai trò cho EBPR là rất quan trọng Về mặt thực tiễn, sự áp dụngđồng thời 2 quá trình: loại bỏ N và P với nồng độ oxy hòa tan thấp thì rất có ý nghĩa,

sẽ làm giảm đáng kể chi phí xử lý Phương pháp xử lý bằng sinh học có thể làm giảmnồng độ P trong nước xuống dưới 0.5 mg/l

Trải qua nhiều năm nghiên cứu và áp dụng thực tế, các hệ thống xử lý nước thải đãứng dụng các đặc tính sinh lý của một vài nhóm vi khuẩn để loại bỏ P hòa tan, các vikhuẩn này hấp thu lượng lớn phosphate hơn nhu cầu cần thiết cho quá trình trao đổichất và tồn trữ dạng poly-P nội bào Nhóm vi sinh vật này được gọi là vi khuẩn tíchlũy poly-P (poly-P accumulating organisms – PAOs) (Mino et al., 1998) hay còn đượcgọi với tên khác là Candidatus accumulibacter hay accumulibacter phosphatis (He etal., 2011 and McMahon, 2011)

Tóm lược: Bên cạnh sự loại bỏ P hòa tan trong nước bằng con đường hóa học, thì biện

pháp sinh học trở nên phổ biến và ngày càng được ứng dụng bởi vì các đặc tính hữudụng của chúng là: dễ ứng dụng, hiệu quả về mặt kinh tế và thân thiện với môi trườngsống Quá trình tích tụ và hòa tan P bằng con đường sinh học, đặc biệt là thông qua vikhuẩn, có vai trò quan trọng trong sự điều chỉnh hàm lượng P hòa tan trong nước.Chúng giải phóng P từ bùn đáy ao vào các tầng nước thông qua quá trình phân rã cáchợp chất hữu cơ hoặc các hợp chất vô cơ chứa P (poly-P), bên cạnh đó, P cũng có thểtích tụ trở lại bùn thông qua quá trình lắng tụ sinh học, kết quả là có thể loại bỏ P hòatan trong nước (Wang et al., 2005)

1 1 4 Poly-P

Hình 1: Cấu trúc chuỗi poly-P

Poly-P là polymer đầu tiên được xác định bởi Wiame (1947) như là một trong nhữngthành phần hạt quan trọng được tích lũy trong nội bào Chúng có khả năng bắt màu khinhuộm và được mô tả từ năm 1900 (Wiame, 1947) Ngày nay, poly-P được nhận biếtnhư là biopolymer hiện diện hầu hết trong các sinh vật: vi khuẩn, nấm, thực vật vàđộng vật (Dawes và Senior, 1973) Poly-P là chuỗi thẳng bao gồm gốc phosphate nốivới nhau bằng cầu nối giàu năng lượng phosphoalhydride và chiều dài từ 3 tới 1000gốc phosphate (Kulaev, 1979) (hình 1)

Hình 2: Ảnh chụp dưới kính hiển vi điện tử Burkholderia cepacia, các chấm đen

là hạt poly-P

Poly-P hiện diện trong nội bào dưới dạng hạt màu đen với kích thước và số lượng khácnhau khi quan sát dưới kính hiển vi điện tử (hình 2) Dưới điều kiện thích hợp, poly-P cóthể tích lũy trong nội bào chiếm khoảng 10 – 20% trọng lượng khô của tế bào và vượtmức nhu cầu cần thiết cho sự tăng trưởng và phát triển của vi khuẩn, điều này chứngminh sự hấp thu phosphate ngoại bào và tích lũy chúng dạng poly-P nội bào biểu hiệnvai trò trao đổi chất đặc biệt không chỉ là nguồn phosphate tồn trữ cho nhu cầu của tếbào (Pick et al., 1990) Các nghiên cứu mô tả các đặc tính vật lý và hóa học của chuỗipoly-P cũng như vai trò của chúng trong quá trình tiến hóa (Kortstee et al., 1994) Nhiềunghiên cứu xác định sự diện hiện và ước lượng hàm lượng poly-P nội bào dựa vào sốlượng và kích thước các hạt poly-P thông qua hình ảnh chụp TEM (Boswell et al., 2001;Eixler et al., 2005).

Trong một số điều kiện đặc biệt như môi trường nghèo dinh dưỡng, vi sinh vật tích lũyphosphate và đồng hóa thành poly-P như là nguồn năng lượng để duy trì sự sống.Thường hạt poly-P định vị vùng ngoại vi gần màng tế bào chất và chúng dễ dàng hòatan trong môi trường kiềm (Buzoleva et al., 2005) Eixler et al., (2005) sử dụng nhiều

phương pháp khác nhau để ly tích hạt poly-P nội bào của Chlorella vulgaris và Synechocystic sp (Bảng 2).

Bảng 1: Các chất sử dụng và điều kiện ly trích poly-P (Eixler et al., 2005)

Kết quả cho thấy rằng NaOH và nước nóng thích hợp để ly tích poly-P mà không ảnhhưởng đến sự thủy phân poly-P (Hình 3).

Hình 3: Hiệu quả trích poly-P bằng nước lạnh, nước nóng và NaOH ở những

nồng độ khác nhau từ Chlorella vulgaris ((Eixler et al., 2005).

Sau khi ly tích poly-P, dịch ly tích được lọc qua giấy lọc vi khuẩn có đường kính lổ lọc0.45µm để loại bỏ xác tế bào và dịch lọc chứa poly-P dạng hòa tan Kết quả cũng chothấy rằng, trong dịch lọc bên cạnh poly-P cũng còn có một phần phosphate tự do(Eixler et al., 2005) Hiện nay, chưa có phương pháp định lượng hàm lượng poly-P màchỉ có thể xác định hàm lượng poly-P thông qua hàm lượng phosphate sau khi thủyphân poly-P Poly-P dễ dàng thủy phân trong dung dịch axit 1 M HCl ở nhiệt độ 1000C(Buzoleva et al., 2005)

Tóm lược: Poly-P được xem là nguồn P và là nguồn năng lượng nội bào cần thiết cho hoạt

động của PAOs Chúng là các hạt bắt màu khi nhuộm, có thể hòa tan trong môi trườngkiềm mà không bị thủy phân Chính vì vậy, có thể sử dụng định tính bằng chụp TEM(Tranmission electron microscopy) và định lượng thông qua ly trích chúng bằng NaOH

1 1 5 Chuyển hóa và điều hòa sự trao đổi chất trong PAOs

1 1 5 1 Trao đổi chất với nguồn carbon là acetate

Acetate là nguồn carbon được sử dụng rộng rãi trong nghiên cứu về quá trình EBPR

Trong E coli acetate được vận chuyển qua kênh đồng vận chuyển acetate xuyên màng (ActP) (Gimenez et al., 2003) Gen actP đã được xác định hiện diện trong bộ gen của

Accumulibacter Acetate được chuyển xuyên màng thông qua kênh ActP cùng với sựchênh lệch gradient nồng độ H+ hoặc Na+ (hình 5) Tương tự như ActP của E coli, sự

- e-SRP: Soluble reactive phosphorus

- polyP: polyphosphate

- Cold water: nước lạnh

- Hot water: nước nóng

hấp thu acetate của vi khuẩn Accumulibacter bị ức chế bởi thể vận chuyển protoncarbonyl cyanide m-chlorophenylhydrazone (CCCP).

Vài dạng trao đổi chất được nghiên cứu để mô tả sự biến đổi sinh hóa các nguồn carbontrong quá trình trao đổi chất Khi nghiên cứu với acetate như là nguồn carbon duy nhất,quá trình trao đổi chất được trình bày trong hình 4

Hình 4: Mô tả các đặc điểm sinh hóa chính trong quá trình EBPR Sự chuyển đổi kiểu trao đổi chất xảy ra dưới điều kiện kỵ khí và hiếu khí.

1 1 5 2 Trao đổi chất với nguồn carbon khác

Dạng trao đổi chất trên được nghiên cứu chủ yếu dựa trên các hệ thống bùn hoạt tínhnhân tạo với acetate là nguồn carbon duy nhất Tuy nhiên, trong hệ thống bùn hoạt tínhtrong tự nhiên, bên cạnh acetate thì còn có nhiều hợp chất carbon mạch ngắn khác Sựtrao đổi chất kết hợp giữa các nguồn carbon khác nhau thì chưa được nghiên cứunhiều Có báo cáo cho rằng, khi thí nghiệm với glucose là nguồn carbon duy nhất thìquá trình EBPR sẽ thất bại Tuy nhiên, dạng trao đổi sinh hóa cho quá trình EBPR vớiglucose cũng được báo cáo và cho rằng khi bổ sung glucose sẽ có tác dụng hỗ trợ cho

sự ổn định quá trình EBPR Đầu tiên glucose sẽ được chuyển hóa thành acid lactic bởi

vi khuẩn lên men lactic Chúng có vai trò đồng hóa glucose dưới điều kiện kỵ khí vàtạo ra acid lactic và cuối cùng là tồn trữ glycogen Một số giống có khả năng sử dụngamino acid như là nguồn hoạt chất

Quá trình EBPR được biết đến như sự biến đổi theo chutrình của các chất tích lũy nội bào như poly-P, PHAs vàglycogen Trong điều kiện kỵ khí, poly-P nội bào bịthủy phân tạo năng lượng ATP cho quá trình hấp thucác chất hữu cơ như các axid béo mạch ngắn và thôngqua quá trình đó phosphate phóng thích ra môi trường.VFAs được chuyển hóa thành PHAs Ngược lại, dướiđiều kiện hiếu khí, PHAs bị oxy hóa và P được hấp thuvào trong tế bào trở lại và đồng hóa thành poly-P Songsong với quá trình này thì glycogen được tái tổng hợp

và tế bào sẽ tăng trưởng và phát triển (Hình 4)

Các dạng trao đổi chất sinh hóa hiện nay vẫn chưa giải thích hết các thông tin nhậnđược từ các sự quan sát cho quá trình EBPR như sự đồng hóa hoạt chất dưới điều kiện

kỵ khí cùng với sự thủy phân poly-P và sự chuyển hóa glycogen tới PHA, EBPR cũng

có thể hoạt động với nguồn carbon là glucose nhưng không có sự tích lũy PHAs Điềunày thể hiện thiếu các cơ sở để giải thích một cách hoàn toàn và đầy đủ về quá trìnhEBPR, cũng như thiếu các nghiên cứu về cấu trúc và chức năng của quần thể vi khuẩnnày Có lẽ các dạng trao đổi chất này chỉ có thể giải thích một cách thích đáng khinghiên cứu quá trình trao đổi chất dưới điều kiện nuôi cấy thuần các dòng vi khuẩnphân lập được với các dạng khác nhau của PAOs để xác định lại các quá trình trao đổichất được tìm thấy trong các hệ thống có sự tăng cường loại bỏ phosphate

1 1 5 3 Ảnh hưởng của tỉ lệ giữa hàm lượng carbon và phosphate trên khả năng đồng hóa và dị hóa poly-P

Tính hữu dụng của nguồn carbon là yếu tố cơ bản cho quá trình EBPR bởi vì vi khuẩntích lũy poly-P sử dụng nguồn carbon đặc biệt (như acetate) cho quá trình sinh tổnghợp Tỉ lệ COD (biểu thị qua hàm lượng carbon) và P (mg/mg) trên 40 thì thích hợp để

xử lý phosphate hòa tan và quá trình EBPR được duy trì ổn định (Randall et al., 1992).Dạng hợp chất carbon cũng là yếu tố quan trọng, tỉ lệ các hợp chất hữu cơ mạch ngắn(như acetate, propionate, succinate,…) phải chiếm tỉ lệ cao trong hàm lượng COD, hoặchàm lượng COD có thể dễ dàng bị phân hủy nhanh chóng thành VFAs bởi các vi khuẩnkhác Tỉ lệ VFAs và P khoảng 14 hoặc COD dễ phân hủy và P là 16 trong nước thảiđược xem là thành phần lý tưởng cho vi khuẩn tích lũy poly-P hoạt động và nhận đượchàm lượng thấp phosphate hòa tan (Barnard và Abraham, 2006) Bên cạnh đó, một vàinghiên cứu cho rằng tỉ lệ COD và P cao sẽ mang lại các điều kiện thuận lợi cho vi khuẩntích lũy glycogen, vì vậy dẫn đến quá trình EBPR không hiệu quả (Liu et al., 1997) Đểhạn chế sự phát triển của GAOs, Schuler và Jenkins (2003) đề nghị tỉ lệ COD (acetate)

và P khoảng 10 sẽ hạn chế sự giới hạn về nguồn carbon và P cho quá trình hoạt độngcủa vi khuẩn và nhận được hàm lượng thấp phosphate hòa tan sau khi xử lý

Panswad et al., (2007) nghiên cứu tỉ lệ giữa P và COD và đánh giá hàm lượng P nộibào trong vi khuẩn tích lũy poly-P, cho rằng khi tỉ lệ giữa P và COD tăng từ 0.02, 0.04

và 0.16 thì hàm lượng P trong bùn hoạt tính ở điều kiện hiếu khí tăng từ 0.053 tới0.084 và 0.205 mg P/mg VSS)

Soejima et al., (2008) nghiên cứu ảnh hưởng của hàm lượng acetate trên quá trình xử

lý đồng thời P và N Ở thời gian đầu của quá trình xử lý hiếu khí, sự bổ sung acetate(COD) sẽ ngăn cản quá trình hấp thu phosphate bởi PAOs Tốc độ hấp thu phosphate

có liên quan trực tiếp đến sự hiện diện và hàm lượng carbon ngoại bào Tốc độ hấp thuphosphate giảm đột ngột khi hàm lượng COD dao động 0 – 20 mg/l và giải phóngphosphate ra khỏi tế bào khi hàm lượng COD cao hơn 40 mg/l Điểm cân bằng giữahấp thu và giải phóng phosphate khi hàm lượng COD là 10 mg/l (Hình 6)

Hình 5: Mối tương quan giữa tốc độ hấp thu phosphate và hàm lượng COD ngoại bào

Trong quá trình đồng xử lý P và N, sự bổ sung nguồn carbon nhằm hạn chế sự hấp thunhanh chóng phosphate của vi khuẩn tích lũy polyphosate trong môi trường, để cungcấp phosphate cho hoạt động của vi khuẩn vừa có khả năng loại bỏ N và P, và vì vậy

có thể xử lý đồng thời chúng Hàm lượng COD từ 50 – 100 mg/l ở thời điểm đầu củaquá trình hiếu khí sẽ hạn chế sự hấp thu phosphate và có thể nhận được sự loại bỏđồng thời P và N khi xử lý bằng vi khuẩn DPAOs

Nghiên cứu này cũng phù hợp với You et al., (2004) khi nghiên cứu ảnh hưởng củahàm COD trên khả năng hấp thu và giải phóng phosphate trong điều kiện hiếu khí vàthiếu oxy của vi khuẩn DPAOs và PAOs cho thấy rằng khi hàm lượng COD cao chúng

sẽ phòng thích phosphate ra khỏi tế bào

1 1 5 4 Ảnh hưởng pH và Mg 2+ trên quá trình đồng hóa và dị hóa poly-P và acetate

Sự vận chuyển điện tử thông qua chuỗi dẫn truyền điện tử định vị trên màng tế bàochất của vi khuẩn có nhiệm vụ giải phóng proton ra khỏi tế bào Sự chênh lệch hàmlượng proton trong và ngoài màng tế bào tạo ra sự khác biệt lượng proton và điện tíchxuyên màng được gọi là lực vận chuyển điện tử (Neidhardt et al., 1990) Năng lượngvận chuyển điện tử xuyên màng được vi khuẩn sử dụng cho nhiều mục đích khác nhaunhư tổng hợp ATP thông qua bơm proton (ATPase) và vận chuyển hoạt chất vào trong

tế bào theo sự chênh lệch gradient nồng độ van Veen et al., (1994) chứng minh rằng

Acinetobacter johnsinii 210A có khả năng dự trữ năng lượng cần thiết cho quá trình

trao đổi chất từ các hạt poly-P tích lũy

Hình 6: Sơ đồ mô tả sự đồng vận chuyển MeHPO 4 /H + với nguồn năng lượng cần cho

các quá trình vận chuyển trong A johnsonii 210A (van Veen et al., 1994) (1) H+ ATPase, (2) kênh vận chuyển MeHPO 4 /H + , (3) kênh đồng vận chuyển lysine/proton, (4) kênh vận chuyển thuận nghịch sodium/proton, (5) kênh đồng vận chuyển

-proline/sodium, CM: màng tế bào, pro: proline, lys: lysine

Khi tế bào cần lượng lớn phosphate cho tăng trưởng, sẽ có lượng lớn phosphate phóngthích ra khỏi tế bào từ sự phân hủy poly-P Song song đó, lượng lớn ATP nội bào đượctạo ra và làm gia tăng điện thế xuyên màng Hệ thống đồng vận chuyển ion kim loại vàphosphate (MeHPO4) thông bơm MeHPO4/H+ ra khỏi tế bào, tạo lực dịch chuyển protoncần thiết cho quá trình vận chuyển H+-ATPase, Na+/H+ và Lys/H+ (Hình 7) pH cao sẽlàm gia tăng giải phóng phosphate trong điều kiện kỵ khí vì sử dụng lực vận chuyểnproton để tổng hợp ATP ở màng tế bào Bên cạnh đó, ion Mg2+ kích thích PAOs hấp thu

lượng lớn phosphate thông qua hệ thống MgHPO4/H+ dưới điều kiện hiếu khí và ức chếgiải phóng phosphate trong điều kiện kỵ khí Sự tích lũy poly-P xảy ra cùng với sự hấpthu và tích lũy ion K+ và Mg2+ trong tế bào Sự phóng thích phosphate cũng xảy ra cùngvới sự phóng thích ion K+ và Mg2+ ra khỏi tế bào (Wu et al., 2006).

Năng lượng cho quá trình hấp thu hoạt chất đã được xem như là yếu tố điều hòa cơbản cho quá trình hấp thu nguồn carbon bởi vi khuẩn PAOs và GAOs (Liu et al., 1997;Smolders et al., 1994) Nghiên cứu cho thấy rằng, trong điều kiện môi trường kiềm, vikhuẩn cần nhiều năng lượng hơn để hấp thu hoạt chất Chính vì vậy, sự gia tăng pH sẽtạo điều kiện thuận lợi cho PAOs hơn GAOs Các nghiên cứu cho thấy rằng điều kiện

pH cao ức chế sự phát triển của GAOs hơn là ảnh hưởng đến quá trình trao đổi chấtcủa PAOs Liu et al., (1996) nghiên cứu ảnh hưởng của pH lên quá trình chuyển hóaacetate cho thấy rằng, khi pH ban đầu trong môi trường khoảng 5 - 6.5 sự hấp thuacetate và phóng thích phosphate sẽ tăng cùng với sự gia tăng pH theo, khi pH trongkhoảng 6.5 - 8 sự hấp thu acetate cân bằng nhưng tốc độ giải phóng phosphate vẫntăng Khi pH trên 8.0 thì hấp thu acetate và giải phóng phosphate bắt đầu giảm Filipe

et al., (2001) chứng minh rằng sự tăng trưởng và phát triển của PAOs, quá trình loại bỏphosphate, phân hủy PHAs trong điều kiện hiếu khí chịu ảnh hưởng bởi pH Khi pHthấp ảnh hưởng lên quá trình trao đổi chất của PAOs, tốc độ hấp thu phosphate chỉkhoảng 37% ở pH 7.5, bên cạnh đó tốc độ phân hủy PHAs và sự tăng trưởng củaPAOs giảm đáng kể pH giảm xuống 6.5 khả năng loại bỏ phosphate trong môi trườnggiảm theo Khi pH tăng trên 7 sẽ không có ảnh hưởng bất lợi lên PAOs, chính vì thếmang lại sự ổn định trong quá trình EBPR Trong điều kiện kỵ khí, sự gia tăng pHkhông ảnh hưởng tới khả năng hấp thu acetate của tế bào là do PAOs có thêm nguồnnăng lượng dự trữ dưới dạng poly-P, sự thủy phân poly-P cung cấp thêm nguồn nănglượng ATP cần thiết khi pH trong môi trường gia tăng

Tóm lược: Kiểu trao đổi chất của PAOs đã được nghiên cứu và mô trả như là tiến

trình sinh hóa Trong điều kiện kỵ khí, poly-P nội bào bị thủy phân tạo năng lượngATP cho quá trình hấp thu các chất hữu cơ như các axid béo mạch ngắn (short chainfatty acids – SCFAs) hay các acid hữu cơ dễ bay hơi (Volatile fatty acids – VFAs) nhưacetate và thông qua quá trình đó P phóng thích ra môi trường VFAs được chuyển hóa

VFAs Năng lượng sử dụng cho quá trình chuyển hóa này được cung cấp từ sự phânhủy glycogen nội bào hoặc từ chu trình tricarboxylic acid (TCA) PHAs được xem lànguồn carbon và là nguồn năng lượng cho sự tăng trưởng và phát triển của PAOs.Ngược lại, dưới điều kiện kỵ khí, PHAs bị oxy hóa tạo năng lượng cung cấp hấp thu Ptrở lại vào trong tế bào trở lại và đồng hóa thành poly-P Song song với quá trình nàythì glycogen được tái tổng hợp và tế bào sẽ tăng trưởng và phát triển Vì vậy, quá trìnhEBPR được biết đến như sự biến đổi theo chu trình của các chất tích lũy nội bào nhưpoly-P, PHA và glycogen Với đặc điểm trao đổi chất này, có thể sử dụng cấy luânphiên giữa hai môi trường có bổ sung nguồn carbon và không bổ sung nguồn carbon

mà PAOs vẫn có thể phát triển bình thường, để có thể chọn lọc ban đầu trong quá trìnhphân lập Bên cạnh đó, sự hấp thu nguồn carbon, sự phóng thích hoặc tích lũy poly-Pphụ thuộc vào nhiều yếu tố và nồng độ các hoạt chất khác nhau như COD, Mg2+, K+,

pH Chính vì vậy, khi tuyển chọn các dòng vi khuẩn tích lũy poly-P để ứng dụng vàothực tiển, thì các điều kiện này là rất cần thiết để tạo môi trường tuyển chọn phù hợpvới các đặc tính và yếu tố trao đổi chất của PAOs, cũng như phù hợp với thành phần

và tính chất của nước ao nuôi cá tra

1 1 6 Tình hình nghiên cứu cấu trúc quần thể vi khuẩn poly-P trong hệ thống xử

lý nước thải

Trải qua nhiều thập niên ứng dụng quá trình EBPR để xử lý nước thải, mặc dù chúngthể hiện tính hiệu quả về mặt kinh tế và thân thiện với môi trường, nhưng đôi lúc quátrình này biểu lộ tính không ổn định và quá trình loại bỏ P khỏi nước thải đôi khi thấtbại (Neethling et al., 2005) Chính vì thế tìm hiểu rõ poly-P được tích lũy bởi nhóm visinh vật nào, chúng tích lũy để làm gì và tích lũy như thế nào có vai trò quan trọng đểcung cấp cơ sở cho thiết kế, vận hành và khắc phục các sự cố không mong muốn xảy

ra trong các hệ thống xử lý nước thải

Từ nghiên cứu phân lập đầu tiên của Fuhs và Chen (1975) cho rằng các loài vi khuẩn

thuộc giống Acinetobacter được xác định như là PAOs Vào những năm 1980, nhiều báo cáo cũng cho rằng sự đa dạng loài trong giống Acinetobacter trong bùn hoạt tính của các hệ thống xử lý (Stephenson, 1987) Sau đó, Acinetobacter được xem là nhóm

vi khuẩn có vai trò chính trong quá trình EBPR (Auling et al., 1991; Carr et al., 2001;Ohtake et al., 1985; Tandoi et al., 1998; Bark et al., 1992; Boswell et al., 2001; Sidat et

al., 1999), nhiều nghiên cứu về các kiểu trao đổi chất phản ánh các đặc tính trao đổichất của PAOs tập trung vào nhóm vi khuẩn này (Wentzel et al., 1986; Wentzel,

1991) Trong các loài thuộc giống Acinetobacter, A Johnsonii cho thấy có khả năng

tích lũy lượng lớn poly-P và được xem là loài vi khuẩn kiểu mẫu cho nghiên cứu vềquá trình trao đổi năng lượng, các enzyme chuyển hóa poly-P và quá trình vận chuyểncác hoạt chất qua màng tế bào (van Veen et al., 1994) Những năm gần đây, các kỹthuật sinh học phân tử được sử dụng để mô tả cấu trúc quần thể của PAOs dựa trênmối quan hệ phát sinh loài Áp dụng các kỹ thuật sinh học phân tử trong việc xác địnhquần thể của PAOs cho thấy vi khuẩn trong bùn hoạt tính của các hệ thống xử lý nướcthải rất đa dạng bao gồm các lớp Proteobacteria (α, β và ɣ), Gram positive với hàmlượng G+C cao (Actinobacteria), Planctomycetes và Bacteroides (Crocetti et al., 2000;Ahn et al., 2007; Bond et al., 1995; Bond et al., 1999; Kong et al., 2005; Liu et al.,2001; Gloess et al., 2008; Tamaki et al., 2005) Bên cạnh đó, thường có sự khác nhau

về thành phần các nhóm vi khuẩn chiếm ưu thế trong các hệ thống xử lý khác nhau Sựthể hiện thành phần và tính chất của từng loại nước thải mà có sự khác biệt trong thànhphần của PAOs (Beer et al., 2006; Wong et al., 2005; Crocetti et al., 2000) Trong lớp

Actinobacteria các vi khuẩn được xem là PAOs như Arthrobacter sp (Shoda et al., 1980), Mycobacterium sp (McMahon et al., 2002), Gordonia sp (Beer et al., 2006).

Nguyen et al., (2011) sử dụng kỹ thuật dò mẫu gen kết hợp khuếch đại và giải trình tựđoạn 16S rRNA bằng cặp mồi (27F và 1492R) của nhóm vi khuẩn Actinobacteria

trong các hệ thống EBPR phát hiện giống Tetrasphaera thuộc họ Intrasporangiaceae

chiếm khoảng 30% trên tổng số vi khuẩn quan sát và có các kiểu hình khác nhau Khảnăng hấp thu orthophosphate và hình thành poly-P xảy ra ở hầu hết các dòng

Tetrasphaera Khả năng hấp thu orthophosphate dưới điều kiện hiếu khí chỉ xảy ra khi

chúng hấp thu nguồn carbon dưới điều kiện kỵ khí Nguồn carbon rất đa dạng nhưamino axít, glucose và acetate Chúng có hình dạng rất khác nhau như hình que ngắn,que chia nhánh, hình cầu, hình sợi

Ivanov et al., (2005) phân tích vi khuẩn loại bỏ phosphate dựa trên khuếch đại và giải

trình tự 16S rRNA bằng cặp mồi 27F và 1492R cho thấy Stenotrophomonas maltophilia LMG 10989 có khả năng loại bỏ phosphate cao vừa là giảm hàm lượng Fe

với tỉ lệ 0.17 g P/g Fe2+

Hesselmann et al., (1999) đặt tên nhóm vi sinh vật tích lũy Poly-P là Candidatusaccumulibacter phosphatis hay accumulibacter Chúng được xem là nhóm có liên quan

trực tiếp đến Rhodocyclus Các nghiên cứu sau đó cũng chứng tỏ Accumulibacter rất

phổ biến (Oehmen et al., 2007) Trong một số nơi Accumulibacter chiếm khoảng 90%trong bùn hoạt tính có khả năng loại bỏ phosphate cao Sau đó, một số nghiên cứucũng cho biết, không chỉ có Accumulibacter chứa hạt Poly-P (poly-P) và một vài nhóm

vi khuẩn khác cũng có như Actinobacter (Wong et al., 2005) Tuy nhiên, Actinobacter

không thể hấp thu các axit béo dễ bay hơi (volatile fatty acids - VFAs) Hấp thu VFAs

là đặc tính chính được quan sát trong nhiều tiến trình EBPR Điều này cho thấy, vai tròquan trọng của nhiều vi sinh vật khác nhau trong quá trình EBPR

Nakamura et al (1991, 1995) phân lập Micrococcusstrain NM-1 Chúng tích lũy

Poly-P trong điều kiện hiếu khí và sử dụng chúng như là năng lượng để hấp thu nguồncarbon trong điều kiện kỵ khí như glucose và casamino axít, không phải là acetate.Ubukata và Takii (1994) cũng phân lập dòng vi khuẩn tương tự và chứng minh rằngcác vi khuẩn này chỉ thể hiện sự đồng hóa nguồn carbon (PHAs) và tích lũy poly-P vàotrong tế bào khi có sự luân phiên quá trình kỵ khí –hiếu khí Tuy nhiên, chúng khôngphải là một trong các vi khuẩn nổi trội trong tiến trình EBPR vì chúng không chuyểnhóa acetate tới PHAs dưới điều kiện kỵ khí Gần đây, việc áp dụng các kỹ thuật sinh họcphân tử như FISH (Fluorescence in situ hydridization) (Wagner et al., 1994 ; Kampfer etal., 1996 ; Liu, 1995) cho thấy có ít nhất ba nhóm vi khuẩn có vai trò quan trọng trongquá trình EBPR với hình dạng khác nhau

Auling et al., (1991) sử dụng phương pháp DAP để phân tích quần thể vi sinh vật tích

lũy poly-P trong hệ thống xử lý nước thải Bên cạnh Acinetobacter còn có Pseudomonas

sp và Xanthobacter sp cũng góp phần quan trọng trong quá trình EBPR.

Sidat et al., (1999) phân lập các vi khuẩn tích lũy Poly-P trong bùn hoạt tính cho thấy

có sự đa dạng trong thành phần các chủng vi khuẩn phân lập có khả năng tích lũy

Poly-P Bên cạnh hai giống Pseudomonas spp (chiếm 58% trên tổng số vi khuẩn phân lập được) và Staphylococcus spp (chiếm 40%), còn có một số giống cũng có khả năng tích lũy lượng lớn Poly-P như Acinetobacter calcoaceticus, Enterobacter spp., Aeromonas spp., Moraxella spp., Bacillus cereus Trong đó, Enterobacter spp và Pseudomonas spp tích lũy Poly-P nhiều nhất (> 5.3 x 10-12 mg/tế bào)

Crocetti et al (2000) đã sử dụng phương pháp FISH để phân tích các vi sinh vật tích lũy

P trong bùn nước thải Các nhóm vi sinh vật tích lũy P ở mức cao chiếm khoảng 15,1%

trong lượng sinh khối có chứa vi khuẩn coccobacilli Có hơn 80% vi khuẩn là β -2 Proteobacteria thuộc nhóm coccobacilli là nhóm vi sinh vật PAOs Nhóm vi khuẩn trội

thứ hai là Actinobacteria Bên cạnh đó, phương pháp PCR để khuếch đại gen 16S rRNA

của vi khuẩn, những dòng thuộc nhóm β-2 Proteobacteria được giải trình tự Trong các dòng này có mức độ tương đồng của Rhodocyclus spp (94 ÷ 97%) và Propionibacter pelophilus (95 ÷96%) được nhận diện là các vi khuẩn có khả năng tích lũy Poly-P nhiều

nhất Ba mẫu dò PAO462, PAO651 và PAO846 cũng được thiết lập để nhận diện PAOs

Cả ba mẫu dò nhận diện vi khuẩn thuộc nhóm β -proteobacteria.

McMahon et al.(2002) đã phát hiện ra poly-P kinase gense (ppk) từ các vi khuẩn trongbùn hoạt động quá trình loại bỏ P bằng phương pháp sinh học Bốn gen mới được tìm

ra, trong đó có hai kiểu gen (kiểu I và II) có mức độ tương đồng về trình tự amino axit

với gen của vi khuẩn Rhydocyclus tenuis (86 ÷ 87%) Hoạt tính của gen ppk này sau

tinh sạch có hoạt tính đặc hiệu có thể so sánh với các gen ppk khác của vi khuẩn tíchlũy Poly-P

He et al (2007) sử dụng poly-P kinase 1 gene (ppk1) như là marker di truyền để phân

tích cấu trúc quần thể “Candidatus Accumulibacteria” trong hệ thống EBPR Sự phát

sinh loài thông qua phân tích 16S rRNA và ppk1 có sự tương đồng lớn, sử dụng ppk1

gene như là marker di truyền để phân tích sự phát sinh loài phát hiện cho thấy có sự đadạng như khi phân tích bằng 16S rRNA trong quần thể “CandidatusAccumulibacteria”

1 1 7 Tình hình nghiên cứu cấu trúc quần thể vi khuẩn poly-P trong các ao hồ tự nhiên

Các vi sinh vật trong các ao hồ có vai trò quan trọng trong sự khoáng hóa nguồncarbon từ các hợp chất hữu cơ tích tụ tầng đáy và giải phóng phosphate Sự phân hủycác hợp chất hữu cơ với sự hiện diện của oxy và nitrat là điều kiện thiết yếu (Gächterand Meyer, 1993) Sử dụng các ion, mangan và sulfat như là chất nhận điện tử để tăngcường giải phóng phosphate từ sự phân hủy các hợp chất hữu cơ (Nealson, 1997) Mặc

dù nhiều nghiên cứu các khía cạnh có liên quan đến vi khuẩn tích lũy poly-P trong các

sinh loài, sự phong phú và mối liên quan giữa vi khuẩn tích lũy poly-P và môi trườngtrong các ao - hồ thì không nhiều (Waara et al., 1993; Hupfer et al., 2007).

Szabó et al., (2011) nghiên cứu cấu trúc quần thể vi khuẩn theo thời gian ở hồ Balaton(Hungary) bằng kỹ thuật phân lập và giải trình tự 16S rRNA Nhận diện vi khuẩn tíchlũy poly-P bằng phương pháp nhuộm Neisser staining Dựa trên trình tự 16S rRNA,63/216 dòng phân lập được định danh, chúng liên kết với 6 nhóm chính: Firmicutes,Actinobacteria, Bacteroidetes, Alpha-proteobacteria, Beta-proteobacteria và Gamma-

proteobacteria Bacillus sp hiện diện trong hầu hết các mẫu Kết quả nhuộm Neisser cho thấy rằng Firmicutes, Actinobacteria, Alpha-proteobacteria và Aeromonas có khả

năng tích lũy lượng lớn poly-P nội bào Mặc dù các giống vi khuẩn thuộc lớpFirmicutes cho thấy tỉ lệ phần trăm dương tính khi nhuộm Neisser (67% Bacillus sp.),nhưng chúng có sự khác biệt đáng kể hàm lượng poly-P nội bào giữa các loài Phần

lớn các loài B pumilus, B idriensis, B barbaricus, B muralis đều dương tính khi nhuộm Neisser, trong khi đó các loài B megaterium, B mycoides, B weihenstephanensis, B thuringiensis, B drentensis chỉ chiếm khoảng 40% cho dương tính khi nhuộm Neisser Trong lớp Actinobacteria, các giống Arthrobacter sp., Microbacterium sp., Rhodococcus sp., Leucobacter sp., Plantibacter và Williamsia tích lũy lượng lớn poly-P Trong lớp Alpha-proteobacteria, ngoại trừ Mycoplana bullata dương tính với Neisser, cón các dòng khác thì không Ở lớp Gamma- proteobacteria, 40% Rheinheimera, 33% Shewanella và 33% Pseudomonas phản ứng

dương tính với Neisser

1 1 8 Nhóm vi khuẩn tích lũy poly-P khử nitơ (Denitrifying poly-P accumulating organisms – DPAOs)

Theo các nghiên cứu trước đây cho thấy có sự tương quan nghịch giữa hàm lượngnitrat và hàm lượng phosphate trong nước thải sau khi xử lý, dẫn đến nhiều nhà nghiêncứu cho rằng trong hệ thống xử lý phosphate có hàm lượng nitrat tự do (Wentzel,1989) Các hệ thống xử lý nước thải được thiết kế theo dạng “Phoedox và Bardenpho”bao gồm các bể kỵ khí, bể có hàm lượng oxy thấp và bể hiếu khí nhằm hạn chế tốithiểu lượng nitrat tuần hoàn trở lại (Barnard, 1974) Sự phân hủy VFAs bởi vi khuẩn dịdưỡng khử nitrat không có khả năng tích lũy poly-P (denitrifying non-poly-P

heterotrophs) (Barker và Dold, 1996) và sự ức chế PAOs bởi nitrit sẽ mang lại sự khửnitrat không hoàn toàn (Ahn et al., 2001).

Tuy nhiên, nhiều nghiên cứu cũng cho thấy có thành phần quan trọng của PAOs vừa

có khả năng tích lũy poly-P vừa có thể khử nitrat trong điều kiện thiếu oxy (Kuba etal., 1994 và Smolder et al., 1995) Bên cạnh đó, PAOs có thể sử dụng nitrat như là chấtnhận điện tử được xem như là PAOs khử nitrat (DPAOs) (Kerrn-Jespersen và Henze,1993) Sự hiện diện của DPAOs được xem như lý tưởng vì chúng vừa có khả năng loại

bỏ cả P và N Các đặc điểm vi sinh và sinh lý của nhóm vi khuẩn DPAOs phức tạp hơnPAOs, tuy nhiên một số báo cáo đã phân lập và xác định một số loài thuộc giống

Pseudomonas, Agrobacterium, Pasteurella và Sphingononas (Jorgensen và Pauli, 1995) Merzouski et al., (1999) phân lập Agrobacterium tumefaciens và Aquaspirillum dispar từ hệ thống xử lý nước thải, chúng có vai trò như là DPAOs.

Tóm lược: Cấu trúc quần thể PAOs đa dạng và phong phú kể cả trong các hệ thống xử

lý nước thải và trong các ao – hồ tự nhiên Sự hiện diện của các giống loài và thànhphần phần trăm các giống cũng có sự khác nhau giữa 2 hệ sinh thái: nhân tạo (hệ thống

xử lý nước thải) và tự nhiên (ao - hồ) Tuy nhiên, chúng chủ yếu thuộc các lớpFirmicutes, Actinobacteria, Alpha-proteobacteria, Beta-proteobacteria, Gamma-proteobacteria và Bacteroidetes Tùy vào hệ sinh thái mà thành phần nào chiếm ưu thế,thường trong hệ thống xử lý nước thải có thành phần dinh dưỡng cao thì lớp Beta-proteobacteria, Actinobacteria và Gamma-proteobacteria được cho là các lớp có nhiều

ưu thế nổi trội về thành phần và số lượng Trong khi ở các ao hồ có thành phần dinhdưỡng ít hơn đặc biệt là N và P, thì lớp Firmicutes, Actinobacteria được nhận thấy làPAOs chiếm ưu thế Bên cạnh đó, vai trò của DPAOs rất quan trọng trong quá trìnhloại bỏ đồng thời P và N trong nước Việc tuyển chọn vi khuẩn có khả năng tích lũypoly-P trong điều kiện có hàm lượng oxy thấp trong môi trường, sử dụng NO3- như làchất nhận điện tử (thay cho oxy) sẽ phù hợp để ứng dụng vào trong xử lý P và N trongcác ao nuôi cá tra

1.2 Phạm vi nghiên cứu chuyên đề

Tổng hợp các tài liệu có liên quan đến vi khuẩn tích lũy poly-P làm cơ sở cho việcphân lập và tuyển chọn vi khuẩn tích lũy poly-P trong nước ao nuôi cá tra và chất thải