Hóa phân tích quang phổ huỳnh quang

Các phân tử hấp thu photon ánh sáng trong chuyển từ trạng thái năng lượng cơ bản đơn Singlet S0 sang trạng thái năng lượng kích thích đơn Singlet S1 rồi trở về trạng thái cơ bản mà kh

Trang 1

QUANG PHỔ PHÁT XẠ PHÂN TỬ (F.S - Fluorescence spectrophotometry)

MỤC TIÊU:

- Trình bày được cơ chế của qúa trình phát huỳnh quang

của phân tử

- Nêu được cấu hình máy quang phổ huỳnh quang

- Nêu được ứng dụng và cách đọc phổ huỳnh quang

PHÂN TỬ

HẤP THU PHÁT XẠ

UV-VIS F.S I.R

Electron ở trạng thái kích thích cĩ thể ở trạng thái đơn (singlet) hay trạng thái ba (triplet)

• Trạng thái đơn (singlet): electron ở trạng thái kích thích cĩ spin đối song với electron ở trạng thái cơ bản, cĩ độ bội

M = 2S + 1 = 2(-1/2+1/2) + 1 = 1 (singlet)

• Trạng thái ba (triplet): chúng cĩ spin song song và độ bội

M = 2S + 1 = 2(1/2+1/2) + 1 = 3 (Triplet) Theo định luật Hund, electron singlet cĩ mức năng lượng cao hơn electron triplet

Trang 2

1 Các phân tử hấp thu photon ánh sáng trong

chuyển từ trạng thái năng lượng cơ bản đơn

(Singlet) S0 sang trạng thái năng lượng kích thích

đơn (Singlet) S1 rồi trở về trạng thái cơ bản mà

không phát xạ (quá trình khử hoạt hay quá trình

phục hồi không bức xa), năng lượng dư được

chuyển thành nhiệt năng cho môi trường

2 Các phân tử có tính chất phát huỳnh quang :

Khi hấp thu bức xạ l1 trong vùng UV-VIS, phân tử sẽ

chuyển từ trạng thái năng lượng cơ bản S0 sang trạng

thái năng lượng kích thích đơn (Singlet) S1 rồi từ mức

năng lượng cao nhất của trạng thái kích thích đơn trở

về mức năng lượng thấp nhất của trạng thái kích thích

đơn, giải phóng một phần năng lượng do sự TỰ VA

CHẠM, gọi là quá trình bất hoạt hay dao động hồi phục

Trang 3

 Quá trình chuyển nội hệ : khi electron trở về trạng thái

cơ bản S0 làm phân tử phát bức xạ huỳnh quang l3 do

sự giải phóng năng lượng còn lại Sự phát huỳnh

quang mất đi sau khi tắt nguồn kích thích (10-8 s) Năng

lượng phát huỳnh quang luôn luôn thấp hơn năng

lượng kích thích (một phần năng lượng mất đi do sự

TỰ va chạm), nghĩa là :

EPX < EKT hay l3 > l1

3 Các phân tử có tính chất phát lân quang :

• Quá trình vượt nội hệ: electron ở trạng thái năng

lượng kích thích đơn (Singlet) S1 chuyển sang trạng thái

năng lượng kích thích ba (Triplet) T1 (có mức năng

lượng thấp hơn)

3 Các phân tử có tính chất phát lân quang :

• Quá trình chuyển nội hệ: electron Triplet trở về trạng

thái cơ bản S0 phát bức xạ l4với bước sóng dài hơn bức xạ kích thích và bức xạ huỳnh quang Sự phát bức

xạ kiểu này gọi là sự phát lân quang, thời gian phát lân quang rất dài sau khi tắt nguồn bức xạ kích thích (10-4 –

101 s hoặc dài hơn) Sự phát lân quang chỉ xảy ra ở môi trường rắn và nhiệt độ thấp

Trang 4

Nguồn: Quantitative chemical analysis, Daniel C Harris, 2 nd Ed., Freeman

huỳnh quang và tổng số phân tử bị kích thích:

ĐỊNH LUẬT BEER TRONG SỰ PHÁT HUỲNH QUANG

- hiệu suất lượng tử huỳnh quang F

- cường độ bức xạ kích thích bị hấp thu bởi mẫu = Io – It

T = 10 -e.C.l

IF = F (Io – It)

= F.Io(1 – It / Io) = F.Io (1 – T) Mà: A = -logT = e.C.l

IF = F.Io (1 – 10 -e.C.l)

IF = F.Io.(e.C.l ) [1 – (e.C.l)2 / 2! + (e.C.l)3 / 3! + (e.C.l)n/ n!]

Trường hợp dung địch rất lỗng (C rất nhỏ), thì e.C.l rất nhỏ, do

đĩ cĩ thể viết phương trình trên rút gọn lại như sau :

IF = F.Io.(e.C.l ) (3)

IF = F.Io.(e.C.l ) = k’.Io.C (3) k’ = F e.l

 Tăng độ nhạy khi tăng cường độ bức xạ kích thích (dùng đèn

cơng suất lớn) để cho tỷ số tín hiệu/nhiễu lớn,

 Tín hiệu huỳnh quang khơng được đo theo giá trị tuyệt đối mà

chỉ biểu thị theo nghĩa huỳnh quang tương đối, nghĩa là so sánh tín

hiệu huỳnh quang của chuẩn và thử

ĐỊNH LUẬT BEER TRONG SỰ PHÁT HUỲNH QUANG

Nguồn: các phương pháp phân tích Vật

lý & Hoá lý - Nguyễn Đình Triệu

UV-VIS khơng cĩ tính phát huỳnh quang, trừ một số nguyên tố đất

• Các hydrocarbon thơm cĩ hệ liên hợp - cĩ khả năng phát huỳnh quang, trong đĩ các hợp chất thơm đa vịng ngưng tụ phát

LIÊN QUAN CẤU TRÚC VÀ TÍNH PHÁT HUỲNH QUANG

NH 2

N O O

NH 3

Trang 5

 Hệ vịng ngưng tụ của các dị vịng cĩ hệ số hấp thụ cao hơn và thời gian sống của trạng thái kích thích ngắn hơn so với các dị vịng đơn nên khả năng phát huỳnh quang cao hơn

N

Indol

N

quinolin

N

isoquinolin

 Các phân tử dị vịng đơn khơng phát huỳnh quang O

N

pyridin

quang cao hơn các phân tử cĩ cùng khung cấu trúc nhưng quay tự

do quanh liên kết C-C

CH 2

N

OH

N

O N

O

C

O

- O

COO

O

COO

biphenyl

Floren

8-oxyquinolin

phức Zn 8-oxyquinolin

Phenolphtalein

Florescen

Φbiphenyl = 0,2 Φfloren = 1

• Thay đổi hố học

• Thay đổi dung mơi:

• Thay đổi pH:

pH= 7, phenol, anisol phát quang pH= 12, phenolat khơng phát quang

OCH 3

anisol

OH

phenol

Phổ phát xạ của 6-bromoacetyl-2-dimethylaminonapthalen ( l KT 380 nm)

Trang 6

• Quencher: chất làm tắt huỳnh quang

Phản ứng giữa chất phát huỳnh quang và Quencher

được giải thích là do sự va chạm giữa phân tử ở trạng thái

kích thích và Quencher

Đây là tính đặc hiệu của hợp chất phát huỳnh quang

được ứng dụng trong định tính và định lượng

CÁC YẾU TỐ KHÁC ẢNH HƯỞNG ĐẾN SỰ PHÁT HUỲNH QUANG

Sự phân cực

Liên kết hydro

Áp suất

Độ nhớt

Nhiệt độ

Quencher

Điện thế

Phân tử phát huỳnh quang

Hiệu suất lượng tử của sự phát huỳnh quang bị giảm khi

nhiệt độ tăng (tần số va chạm tăng) làm cho khả năng khử hoạt

thuận lợi hơn

Dung mơi chứa kim loại nặng, cũng làm giảm sự phát huỳnh

quang của phân tử

CÁC YẾU TỐ KHÁC ẢNH HƯỞNG ĐẾN SỰ PHÁT HUỲNH QUANG

Oxy khơng hịa tan thường làm giảm cường độ phát huỳnh

quang trong dung dịch Hiệu ứng này cĩ thể do sự oxi hĩa cảm ứng

quang hĩa của vật phát huỳnh quang hoặc do tính thuận từ của oxi

tử bị kích thích sang trạng thái ba (triplet)

MÁY QUANG PHỔ HUỲNH QUANG

 Nguồn sáng Có cường độ mạnh hơn nguồn sáng trong quang phổ hấp thu UV

Đèn hồ quang thủy ngân phát xạ các vạch phổ ở 254, 366, 405, 436, 546,

577, 691 và 773 nm (HQ kế) Đèn hồ quang xenon áp suất cao, phát bức xạ liên tục từ 300 – 1300 nm, công suất mạnh từ 75 – 450 W (QP HQ)

(3)

(4)

(5) (6)

Trang 7

Nguồn: các phương pháp phân tích Vật lý & Hoá lý - Nguyễn Đình Triệu

Bộ tạo đơn sắc

• Kính lọc hấp thụ và

trong huynh quang

kế

quang

Cĩ hai bộ tạo đơn sắc dùng cho nguồn sáng kích thích và

huỳnh quang

kế) hay chữ nhật

tinh hay bằng silic

(thạch anh

Vị trí của cuvet trong máy được đặt

đường đi của tia kích thích

• Đặt vuơng gĩc với tia kích thích nên chỉ cĩ 1 phần bức

xạ huỳnh quang đến được detector,

• Detector cĩ độ nhạy cao, thường

(photomultiplier) hay detector dãy diode quang (Diode array)

chiều

Trang 8

ỨNG DỤNG

 Định tính : lKT = ? lBX = ?

 Định lượng : so sánh cường độ phát quang tương đối

giữa mẫu chuẩn và mẫu thử

Cường độ phát quang tương đối thay đổi theo mơi trường đo, nên mơi trường đo phải thật ổn định (nhiệt đo

ổn định, dung mơi tinh khiết quang học, máy phải chuẩn

hố thường xuyên với chất chuẩn)

 Phân tích huỳnh quang các hợp chất vơ cơ

Dựa trên việc tạo ra các phức chất chelat của các

ion kim loại với thuốc thử hữu cơ rồi đo sự phát huỳnh

quang của chúng

 Thuốc thử đo huỳnh quang phần lớn cĩ cấu tạo vịng thơm chứa hai hoặc nhiều nhĩm chức cho electron để dễ tạo ra chelat với các ion kim loại

OH

O OH

OH

N HO

SO 3 Na

8-oxyquinolin Flavanol lizavin

OH O

benzoin

 Một số kim loại chuyển tiếp cĩ tính thuận từ (e- phân lớp d cĩ spin song song) làm tăng tốc độ của sự giao

nhau giữa các hệ sang trạng thái ba (triplet), dẫn đến sự

phát lân quang

PHÂN TÍCH HUỲNH QUANG CÁC HỢP CHẤT VƠ CƠ

Ag 2,3-napthotriazol

Eosin + 1,10-phenanthrolin Acid 8-hydroxy-quinolin-5-sulfonic

0,02  g/ml 0,004 0,01

Al Acid 3-hydroxy-napthoic 0,0002

Cu 2-amino-1-propen

Thiamin

0,01 3,0

Mg

N,N’-bissalicyliden-2,3-diamino-benzofuran

0,002

Mn

Zn

Xác định các acid amin thơm ở pH = 7 + phenylalanin (Phe) cĩ lKT = 280 nm, lBX = 348 nm + tyrosin (Tyr) cĩ lKT = 274 nm, lBX = 303 nm + triptophan (Trp) cĩ lKT = 254 nm, lBX = 282 nm Chuyên luận trong USP XXIII

+ Định lượng vitamin B1 : chuyển thành thiochrome,

đo huỳnh quang trong iso-BuOH với lKT = 365 nm, lBX

= 450 nm

Trang 9

Chuyên luận trong USP XXIII

+ Định lượng vitamin B2 : đo huỳnh quang trong CH3COOH

0,02 M với lKT = 440 nm, lBX = 530 nm

+ Định lượng reserpin trong HNO3 cho phát quang vàng với

lKT = 390 nm, lBX = 510 nm [Szalkowski và Mader ]

N

H 3 C

CH 2

N

CH 3

CH 2 CH 2 OH

N N

H 3 C

CH 2

N

CH 3

CH 2 CH 2 OH

K 3 [Fe(CN) 6 ]

OH

-PHÂN TÍCH HUỲNH QUANG CÁC HỢP CHẤT VÔ CƠ

 Xét nghiệm sinh hoá + Định lượng phenothiazin trong nước tiểu, sau khi ly trích, đo huỳnh quang trong môi trường H2SO4 0,02 M với

lKT = 310 nm, lBX = 460 nm + Định lượng salycylat trong máu, sau khi ly trích, đo huỳnh quang trong môi trường kiềm với lKT = 370 nm, lBX

= 460 nm

 Miễn dịch huỳnh quang + Acridine là chất nền trong chẩn đoán các tổ chức bị ung thư bằng kính hiển vi huỳnh quang

N

acridin

PHÂN TÍCH HUỲNH QUANG CÁC HỢP CHẤT VÔ CƠ

PHÉP ĐO QUANG PHỔ HUỲNH QUANG

• Định nghĩa

+ Phép đo quang phổ huỳnh quang là sự đo cường độ

phát quang tương đối (relative intensity) của một hợp chất

khi nó được kích thích bằng nguồn ánh sáng trong vùng

UV-VIS Nguồn sáng kích thích và phát xạ có bước sóng

tuân theo định luật Stock và phương trình của cường độ

phát quang tương đối tuân theo phương trình:

IF = F.Io.(e.C.l ) Trong phép đo quang phổ huỳnh quang ta thu nhận được 2 loại phổ : phổ kích thích và phổ huỳnh quang

 Phổ kích thích + Đường biểu diễn sự phụ thuộc của cường độ phát quang tương đối theo bước sóng của nguồn sáng kích thích :

IF = f(lKT)

+ Cố định bước sóng phát xạ (lBX) bằng cách chọn lBX trên bộ

tạo đơn sắc của nguồn phát xạ (phải có giá trị lớn hơn cho lKT )

và ghi phổ khi thay đổi bước sóng kích thích

+ Bước sóng mà tại đó ta có IF lớn nhất là bước sóng kích thích tối ưu của mẫu đo

 Phổ phát xạ + Đường biểu diễn sự phụ thuộc của cường độ phát quang tương đối theo bước sóng của nguồn sáng phát xạ

IF = f(lBX)

Trang 10

Đường biểu diễn sự phụ thuộc của cường độ phát quang

tương đối theo bước sóng của nguồn kích thích

IF = f(lKT) = F.Io.(e.C.l )

l

I F

+ Cố định bước sóng kích thích (lKT) bằng cách chọn lKT trên

bộ tạo đơn sắc của nguồn kích thích (thông thường có giá trị

trong vùng 220 – 380 nm, hoặc dựa vào giá trị lKT đã biết trước) và ghi phổ khi thay đổi bước sóng phát xạ

+ Bước sóng mà tại đó ta có IF lớn nhất là bước sóng phát xạ tối đa của mẫu đo

lKT = 369 nm Vit B1 oxy hoá lPX = 449 nm

• Phổ huỳnh quang 3 chiều:

+ xác định lKT và lBX đồng thời trong một lần đo mà

không phải thăm dò trong 2 lần đo

+ Phổ đường viền:

+ Phổ 3D

Trang 11

Trái:ZnS, phải: Sr aluminate Trong tối Trong tối sau 4’

http://en.wikipedia.org/wiki/File:Phosphorescent.jpg#filelinks

Kunzite phát quang UV

254

365

Định dạng
Số trang	11
Dung lượng	576,77 KB