thực tập vi sinh cơ sở

Giáo trình THỰC TẬP VI SINH CƠ SỞ MỤC LỤC Bài 1: Các qui tắc an tồn phòng thí nghiệm vi sinh vật Bài 2: Trang thiết bị - dụng cụ - phương pháp khử trùng Bài 3: Sử dụng kính hiển vi quang học qua n sát tế bào vi sinh vật Bài 4: Pha chế môi trường dinh dưỡng Bài 5: Các phương pháp phân lập vi sinh vật Bài 6: Các phương pháp quan sát vi sinh vật Bài 7, 8: Các đặc tính sinh hóa vi sinh vật Bài 9: Phương pháp kiểm tra số lượng tế bào vi sinh vật Bài 1: CÁC QUI TẮC AN TỒN TRONG PHỊNG THÍ NGHIỆM VI SINH VẬT Thao tác an toàn yêu cầu quan trọng thí nghiệm vi sinh vật Vi sinh vật có kích thước nhỏ bé mà mắt thường khơng nhìn thấy Trong q trình làm thí nghiệm, thường thao tác với số lượng lớn đậm đặc tế bào vi sinh vật Bên cạnh giống, lồi vi sinh vật có ích giống, lồi có khả gây bệnh có hại sức khỏe người Mặt khác, q trình thí nghiệm phải sử dụng nhiều loại hóa chất, có hóa chất có độc tính Chính thế, người làm thí nghiệm phòng thí nghiệm vi sinh vật cần tuân thử qui tắc sau đây: Những qui định chung: - Những người khơng có nhiệm vụ khơng vào phòng thí nghiệm - Khi vào phòng thí nghiệm phải mặc áo Blouse (cài khuy kín), cột tóc gọn gàng - Khơng nói chuyện ồn ào, giữ gìn trật tự Khơng ăn uống, hút thuốc phòng kiểm nghiệm - Mang trang, găng tay thao tác với vi sinh vật hóa chất - Trên bàn thí nghiệm để vật dụng thí nghiệm, số ghi chép, giấy ghi chép Tất vật dụng cá nhân, áo khoác, túi xách, sách vở,… phải để nơi qui định - Trước sau kết thúc thí nghiệm, phải sát trùng mặt bàn hóa chất sát trùng chuẩn bị sẵn lau khô giấy vệ sinh - Cần ghi tên chủng, ngày tháng thí nghiệm, người thí nghiệm lên tất hộp petri, ống nghiệm,… - Tuyệt đối khơng để canh trường hay vật phẩm có vi sinh vật dấy lên quần áo, sách dụng cụ cá nhân Đồng thời phải ý bảo vệ da quần áo khỏi bị dính hóa chất thuốc nhuộm - Cẩn thận thao tác với đèn cồn đèn Bunsen Tắt lửa chưa có nhu cầu sử dụng sau thực xong thao tác Tuyệt đối không dùng đèn cồn để mồi lửa đèn cồn - Sử dụng bóp cao su thao tác ống hút định lượng (pipette), Tuyệt đối không hút miệng - Không tự ý sử dụng trang thiết bị, dụng cụ phòng thí nghiệm chưa hướng dẫn cụ thể Sử dụng theo hướng dẫn, thận trọng, tránh làm đổ vỡ hư hỏng - Tất vật liệu bị nhiễm bẩn cần phải khử trùng trước vứt bỏ sử dụng lại - Kết thúc thí nghiệm phải vệ sinh thiết bị, dụng cụ sử dụng theo qui trình xếp vào nơi qui định - Rửa tay trước rời phòng thí nghiệm - Tất trường hợp tai nạn phải báo cáo cho cán hướng dẫn thí nghiệm để kịp thời xử lý Một số lưu ý với sinh viên nhằm đạt kết tốt thực hành vi sinh vật  Trước thực hành : - Cần đọc trước nội dung tồn để hình dung khối lượng công việc làm - Hiểu rõ nguyên tắc, mục đích thí nghiệm - Đọc cẩn thận cách tiến hành thí nghiệm  Trong thực hành: - Ghi cẩn thận dặn giảng viên thao tác qui trình thực hành - Thực thí nghiệm theo hướng dẫn giảng viên - Trong q trình thí nghiệm có thao tác, công đoạn không rõ cần hỏi lại giảng viên hướng dẫn - Ghi chép cẩn thận ý quan trọng thí nghiệm kết thí nghiệm  Kết thúc thực hành: - Làm báo cáo thực hành theo yêu cầu giảng viên Bài 2: TRANG THIẾT BỊ - DỤNG CỤ - CÁC PHƯƠNG PHÁP KHỬ TRÙNG I/ TRANG THIẾT BỊ - DỤNG CỤ A Một số trang thiết bị, dụng cụ thông dụng o o o Tủ sấy (vacuum oven): t từ 60 C – 200 C, dùng để sấy khô, khử trùng loại dụng cụ chịu sức nóng khơ, chủ yếu dụng cụ thủy tinh, kim loại Tùy vào đối tượng cần khử khuẩn o mà sấy chế độ t thời gian khác nhau, thường sấy o o 160 C/2 giờ, 180 C/30 phút Hình 1: Tủ sấy o o o Tủ ấm (incubator or etuve ): t từ 20 C – 60 C, có chế độ ổn định nhiệt độ, sử dụng để nuôi cấy vi sinh vật nhiệt độ thích hợp cho sinh trưởng phát triển chúng Tùy vào o đối tượng nuôi cấy mà ủ t khác để vi sinh vật o phát triển tốt Ví dụ: Coliform 30 C/24h – 48h, E coli thích hợp o 44 C/24h – 48h Tủ lạnh hay tủ mát ( freezer ): dùng bảo quản môi trường pha chế, giống vi khuẩn, chế phẩm sinh học (vaccin, huyết thanh, đĩa giấy kháng sinh,…), hóa chất, thuốc thử dễ phân hủy nhiệt độ thường Nồi hấp ướt ( Autoclave ): Thiết bị cấp nhiệt nước áp suất cao (hơi nước bão hòa áp suất cao), sử dụng để hấp khủ trùng môi trường, số nguyên liệu dụng cụ thí nghiệm Tùy đối tượng mà sử dụng chế độ nhiệt độ áp suất o o thích hợp, thường dùng 121 C/1 atm/ 15 phút Hay 127 C/1.5 o atm/30 phút với môi trường đất, 117 C/ 0.8 atm/15 phút với môi trường chứa nhiều đường, môi trường sữa…… Chỉ số áp kế nồi hấp áp suất: Chỉ số áp kế 0,2 0,4 0,5 0,6 0,7 0,8 0,9 1,0 1,5 2,0 (đơn vị:atm ) o T sôi 100 105 110 112 114 116 117 119 121 127 134 nước o (đơn vị: C) o T sôi 212 221 230 234 237 241 243 246 250 261 273 nước o (đơn vị: F) Hình : Nồi hấp Cân phân tích điện tử (analytical balance): trọng lượng từ -4 100µg – 200g Độ xác 10 g Cân kỹ thuật (technical -2 balance)- độ xác 10 g Dùng cân hóa chất, mơi trường A B Hình : A- cân phân tích, B- cân kỹ thuật Tủ cấy vơ khuẩn có đèn cực tím (UV) (flux laminar ): Có khơng gian vô trùng sử dụng để thao tác với vi sinh vật nhờ hệ thống đèn tử ngoại phận thổi khí vơ trùng Hình 4: tủ cấy Máy ly tâm (centrifuge): Dùng tách chất pha rắn-lỏng khỏi tách sinh khối tế bào khỏi môi trường nuôi cấy, tách hồng cầu, enzyme,… Hình 5: máy ly tâm Máy lắc (shaker): Thiết bị dùng để nuôi cấy, nhân giống vi sinh vật cách lắc bình ni cấy theo chiều khác (lắc vòng lắc ngang) cách đặn để tăng lượng oxy hòa tan mơi trường Hình 6: máy lắc Kính hiển vi (microscope): có vai trò quan trọng nghiên cứu vi sinh vật Dùng nghiên cứu, quan sát tế bào vi sinh vật đặc điểm hình thái, sinh lý nhờ vào khả phóng đại kính (sẽ giới thiệu chi tiết sử dụng kính hiển vi) 10.Máy đo pH (pH meter): đo pH dung dịch, môi trường nuôi cấy, … Lưu ý: Dung dịch độc Do ngâm phải đậy kín,lúc rửa nên đeo trang, mang găng cao su kính bảo hiểm Cồn 70 %: Dùng để sát khuẩn tay, bàn , ghế, tủ cấy,… o o Cách pha: cồn 70 từ cồn 96 Vì khơng đòi hỏi xác,nên áp dụng cơng thức: V1C1 = V2C2 Nước muối sinh lý 9‰ vơ khuẩn: Cân xác 9g NaCl tinh khiết cho vào cốc có chứa 991ml nước cất (vừa đủ 1000ml ), dùng đũa thủy tinh khuấy Đem hấp o o vô khuẩn t = 121 C (1atm)/ 15 – 20 phút B THUỐC NHUỘM Crystal violet ( C25H30N3Cl 9H2O = 570,11 ): Công thức: a) Crystal violet o b) 0,4g Cồn 96 10ml Phenol 1g Nước cất 100ml Cách pha: Trộn hai dung dịch a b lại với nhau, khuấy cho hòa tan đem lọc Chú ý: dung dịch thuốc nhuộm bảo quản chai màu, tránh ánh sáng Lugol: Công thức: KI 2g Iod tinh thể 1g Nước cất 300ml Cách pha: Hòa 2g KI vào 5ml nước cất, sau thêm 1g iod Chờ cho iod tan hết thêm nước vừa đủ 300ml Fuchsine kiềm ( C19H18N3Cl = 323,82 ): Công thức: a) b) Fuchsine kiềm 0,3g Cồn 96% 10ml Phenol 5g Nước cất 35ml Cách pha: Trộn dung dịch a b với  khuấy cho tan đều,đem lọc Bảo quản chai màu Trước dùng pha lỗng lần ( dịch pha lỗng khơng giữ lâu dịch đặc giữ nhiều tháng ) Safranin O ( C20H19N4Cl = 350,80 ): Công thức: o Safranin O ( dung dịch 2,5% cồn 96 ) 25ml Nước cất 75ml Bảo quản chai màu 90 Methylene blue ( C37H27N2Sna2 = 799,80 ): Công thức: a) Methylen blue 3g Cồn 96% b) Dung dịch KOH 0.01% 30ml 1000ml Cách pha:Trộn hai dung dịch a b lại với  khuấy hào tan  đem lọc Bảo quản chai màu Thuốc nhuộm tiêm mao: a/ Thuốc nhuộm Nishizawa Kangen  Dung dịch A: + Acid tanic 5g + Nước cất 100ml Khuấy cho tan vừa lắc cho thêm vào thứ tự chất sau: + FeCl3 1,5g + Formalin 2ml + NaOH 4% 1ml  Dung dịch B: + AgNO3 2g + Nước cất 100ml Hòa AgNO3 vào nước cất,lấy 10ml cho vào cốc thủy tinh có dung tích 100ml C THUỐC THỬ VÀ CHỈ THỊ MÀU: NaOH 40 %: Cân xác 40g NaOH tinh thể + 60ml nước cất.Khuấy cho tan 91 KOH 10 %: Cân xác 10g KOH tinh thể + 90ml nước cất Khuấy cho tan Thuốc thử KOWAC: ( tìm khả tạo Indol vi khuẩn ) Công thức: P – dimetilaminobenzaldehit 5g Rượu amilic hay butilic 75ml HCl đậm đặc 25ml o Thuốc thử  - naph tol 10 %: pha cồn 96 , bảo quản lạnh chai màu trước dùng Thuốc thử để xác định khả khử Nitrat: Griess A: Acid sulfanilic 0,5g Acid acetic 30ml Nước cất vừa đủ 100ml Dung dịch bảo quản tháng, đựng chai màu tránh tiếp xúc với ánh sáng Griess B:  - naphtylamin 0,8g Acid acetic 30ml Nước cất 100ml Hòa tan 0,8g  - naphtylamin 100ml nước cất đun sôi Để nguội bổ sung thêm 30ml acid acetic, đem lọc Đựng chai màu Dung dịch bảo quản tuần Thuốc thử Metyl red 0.5% cồn: Metyl red Cồn 60 o 0,5g 100ml Cách làm giấy tẩm acetat Pb: Chuẩn bị: Giấy lọc cắt thành sợi khổ ( x 6cm ) Dung dịch acetat Pb 10 – 20% Cách làm:Ngâm sợi giấy lọc vào dung dịch acetat Pb 10 – 20%, khoảng 15 – 20 phút Sau vớt đem sấy khô nhiệt độ 50 – o 60 C Bảo quản lọ vô trùng Lưu ý: Tất bước tiến hành phải làm cách vơ trùng D MƠI TRƯỜNG I MƠI TRƯỜNG NI CẤY NẤM MỐC VÀ NẤM MEN Mơi trường Sabouraud : (để nuôi cấy nấm mốc nấm men) Công thức: Pepton 20g Mantose hay glucose 40g Agar 18g Nước cất vừa đủ 1000ml o o ( pH: 5,5 – 6,0 khử khuẩn nồi áp suất t = 121 C (1atm)/ 1520 phút) Môi trường Czapek: ( để nuôi cấy nấm mốc ) Công thức: Saccharose 30g NaNO3 2g KH2PO4 0,5g MgSO4 0,5g FeSO4 0,01g Agar 18g Nước cất vừa đủ 1000ml o o ( Điều chỉnh pH: 6,khử khuẩn nồi áp suất t = 121 C (1atm)/ 15 – 20 phút) Môi trường Hansens (để nuôi cấy nấm men) Công thức: Maltose glucose 50g Pepton 10g KH2PO4 3g MgSO4 – 5g Agar 18g Nước cất vừa đủ 1000ml o o ( pH: 6, khử khuẩn nồi áp suất t = 121 C (1atm)/ 15 – 20 phút) Môi trường Gauzer I: (để nuôi cấy xạ khuẩn) Công thức: Tinh bột tan 20g KH2PO4 0,5g MgSO4 0,5g KNO3 1g NaCl 0,5g FeSO4 0,01g Agar 18g Nước cất vừa đủ 1000ml o o ( pH: 7,2 – 7,4; khử khuẩn nồi áp suất t = 121 C ( 1atm)/ 15 – 20 phút) II MÔ I TRƯỜNG NI CẤY ĐỐI VỚI VI KHUẨN Mơi trường Nutrient Broth (NB): Công thức: Cao thịt 5g Pepton bột 10g NaCl 5g Nước cất 1000ml ( pH: 7,4 – 7,6 ) Cân 13g bột mơi trường NB hòa vào 1000ml nước cất, khuấy o Đem hấp khử trùng 121 C (1am)/ 15 – 20 phút Môi trường Nutrient Agar ( NA ): Thành phần môi trường mơi trường NB có bổ sung 18g agar 1000ml mơi trường Cân 23g bột mơi trường NA hòa vào 1000ml nước cất, o o khuấy đều.Khử khuẩn nồi áp suất t = 121 C (1atm)/ 15 – 20 phút Môi trường Trypticase soya broth ( TSB): Công thức: Trypticase pepton 15g Thytone pepton 5g NaCl 5g Nước cất 1000ml pH: 7,3 Điều chế:Cân 30g bột mơi trường TSB hòa 1000ml nước cất, o đun sơi cho hòa tan Hấp 121 C/ 15 – 20 phút Môi trường Trypticase Soya Agar ( TSA ): Công thức: Trypticase pepton 15g Thytone pepton 5g NaCl 5g Agar 18g Nước cất 1000ml pH: 7,3 Điều chế:Cân 30g bột mơi trường TSB + 18g agar, hòa 1000ml o nước cất, đun sơi cho hòa tan hết agar.Hấp 121 C/15 – 20 phút Môi trường Brilliant Green Bile Lactose ( BGBL ) Broth: Công thức: Pepton 10g Lactose 10g Oxgall 20g Brilliant green 0,0133g Nước cất 1000ml ( pH: 7,7  0,1 ) Điều chế:Cân 40g bột mơi trường BGBL hòa vào 1000ml nước cất, o khuấy Đem hấp khử khuẩn 121 C (1atm)/15 – 20 phút Môi trường Lactose Broth: Công thức: Chiết thịt bò 3g Pepton 5g Lactose 5g Nước cất 1000ml ( pH: 6,9  0,2 ) Điều chế:Phân phối vào ống nghiệm, 10ml/ ống Cho ống Durham o o vào, hấp khử khuẩn t = 121 C (1atm)/ 15 – 20 phút Môi trường EC (Enrichmen coli): Công thức: Tryptose Bile salt (muối mật) 2g 1,5g Lactose 5g K2HPO4 4g KH2PO4 1,5g Nước cất 1000ml ( pH: 6,9  0,2 ) o Điều chế:Đem hấp khử trùng 121 C(1atm)/ 15 – 20 phút Môi trường Clark lubs (dùng để thử phản ứng MR & VP): Công thức: Pepton 7g Glucose 5g K2HPO4 5g Nước cất 1000ml ( H: 6,9  0,2) o Điều chế:Đem hấp khử trùng 121 C (1atm)/ 15 – 20 phút Môi trường Simmon’s citrat: Công thức: Sodium citrat 2g K2HPO4 1g MgSO4 0,2g Brothymol blue 0,08g NaCl 5g NH4H2PO4 1g Agar 18g ( pH: 6,9  0,2 ) o Điều chế: Đem hấp khử trùng 121 C (1atm)/ 15 – 20 phút 10 Môi trường Christensen’s Urea: Môi trường bản: Pepton 1g NaCl 5g Glucose 1g KH2PO4 2g Phenol red 0,012g Nước cất 900ml Hòa tan tất thành phần 900ml nước Hấp o o 121 C/15 phút để nguội đến 50 -55 C Dung dịch Ure: Urea 20g Nước cất 100ml pH: 6,8  0,1 Hòa tan Ure 10ml nước, lọc vô trùng, thêm vào môi trường làm nguội (thao tác vô trùng) Trộn, phân vào ống nghiệm vô trùng 11 Môi trường lên men loại đường: Công thức: Cao thịt 5g Pepton bột 10g NaCl 5g Đường 10g Phenol red 0,01g Nước cất 1000ml pH: 7,4 o Đem hấp khử trùng 110 C/15 – 20 phút 12 Môi trường tinh bột ( Starch medium ): Công thức: Nutrient agar 23g Tinh bột tan 10g Nước cất 1000ml Điều chế: hòa tan tinh bột 200ml nước cất Thêm thứ khác o vào cho đủ theo công thức Đem hấp khử trùng 121 C (1atm)/ 15 – 20 phút 13 Môi trường thạch bán lỏng di động: Công thức: Nutrient broth 13g Agar 5g Nước cất 1000ml pH: 7,2 Điều chế: Đem thành phần mơi trường hòa tan nước cất, đun cách thủy cho agar hòa tan Phân vào ống nghiệm 16 x 120 mm,mỗi ống khoảng 5ml Đem hấp khử khuẩn o 121 C (1atm)/ 15 – 20 phút Lấy để đứng cho môi trường đông lại 14 Môi trường Gelatine: Công thức: Nutrient broth Gelatine Nước cất 13g 150g 1000ml pH: 7,2 Điều chế: Đem thành phần môi trường hòa tan nước cất, đun cách thủy cho Geslatine hào tan Phân vào ống nghiệm 16 x 120 mm, ống khoảng 5ml Đem hấp khử o khuẩn 121 C (1atm)/ 15 – 20 phút.Lấy để đứng cho môi trường đông lại 15 Mơi trường thạch chì (tìm khả sinh H2S vi khuẩn): Công thức: Nutrient agar 23g Na2S2O3 2,5g Acetat Pb 10% 5ml Nước cất vừa đủ 1000ml pH: 7,0 Điều chế: Hòa tan thành phần mơi trường nước cất.Đun cho tan thạch thêm Na2S2O3 sau trộn khử khuẩn o o 121 C/ 15 – 20 phút Lấy đợi nguội khoảng 45 C, thao tác vô 100 khuẩn, bổ sung 5ml dung dịch acetat Pb 10% Phân vào ống nghiệm ( vô khuẩn ), đông dạng thạch đứng 16 Môi trường khử Nitrat: Công thức: Nutrient Broth 13g KNO3 ( NaNO3) 2g Nước cất 1000ml pH: 7,2 Điều chế:Phân chia vào ống nghiệm 16mm x 120mm, hấp khử khuẩn o 121 C/ 15 – 20 phút Ngồi người ta dùng mơi trường Nitrat dạng bán lỏng, mơi trường bán lỏng giữ phức màu sau thử lâu 17 Môi trường Mueller Hinton Agar ( MHA ): Công thức: Beef Infusion From 300g Casein acid hydrolysate 7,5g Starch 1,5g Nước cất 1000ml pH: 7,4 0,2 Điều chế: Cân 38g bột môi trường MHA hòa vào 1000ml nước cất, đun sơi,rồi khuấy cho agar hòa tan hết Đem hấp khử khuẩn o 121 C (1atm)/ 15 – 20 phút 18 Môi trường thạch máu BA (Blood Agar): Có loại mơi trường thạch máu: Thạch máu hiếu khí mơi trường thạch máu kỵ khí:  Thạch máu hiếu khí: 101 Cơng thức: MHA 38g Máu ( cừu thỏ ) 50ml Nước cất vừa đủ 1000ml ( pH: 7,4  0,2 ) Điều chế: Cân 38g bột mơi trường MHA, hòa vào 950ml nước cất, đun o sôi, khuấy cho agar hòa tan hết Đem hấp khử khuẩn 121 C (1atm)/ 15 – 20 phút o Lấy môi trường nguội dần đến khoảng 40 – 45 C, dùng kỹ thuật vô khuẩn, bổ sung thêm 50ml máu vào Lắc nhẹ từ trái sang phải ngược lại để tránh tượng mơi trường có bọt khí Khi mơi trường hòa đều, tiến hành đổ đĩa ( thao tác vô khuẩn )  Thạch máu kỵ khí: Cơng thức mơi trường cách điều chế trên, ta bổ sung thêm 1% glucose, vitamin K (hấp thụ oxy môi trường ), bổ sung kháng sinh để tiêu diệt vi sinh vật hiếu khí