Lời cảm ơn 3 Lời mở đầu 4 PHẦN 1. TỔNG QUAN 5 1.1. Mô tả về loài thực vật 5 1.2. Sự phân bố và thu hái 5 1.3. Sơ lược về thành phần hóa học 6 1.4. Tác dụng dược lý 7 1.4.1. Bệnh Alzheimer 7 1.4.2. Dấu hiệu cảnh báo của bệnh Alzheimer 8 1.4.3. Điều trị Alzheimer từ thực vật 10 PHẦN 2. THÀNH PHẦN HÓA HỌC 11 2.1. Phương pháp 1 11 2.1.1. Sơ đồ khối 11 2.1.2. Thuyết minh 12 2.1.3. Thành phần 13 2.2. Phương pháp 2 14 2.2.1. Sơ đồ khối 14 2.2.2. Thuyết minh 15 2.2.3. Thành phần 15 2.3. Phương pháp 3 16 2.3.1. Sơ đồ khối 16 2.3.2. Thuyết minh 17 2.3.3. Thành phần 18 PHẦN 3. HOẠT TÍNH SINH HỌC 19 3.1. Hoạt tính ức chế ACh và AChE 19 3.1.1. Thí nghiệm ức chế sự hoạt động cholinesterase trong ống nghiệm 19 3.1.2. Vai trò của ACh và AChE 19 3.1.2.1. Vai trò của ACh trong bệnh Alzheimer 19 3.1.2.2. Vai trò của AChE trong bệnh Alzheimer 21 3.2. Một số chất có hoạt tính được phân lập từ Huperzia squarrosa 21 3.2.1. Huperzine A 21 3.2.2. Huperzine B 23 Kết luận 25 Tài liệu tham khảo 26
Mục lục Lời cảm ơn Lời đầu tiên, chúng em xin gửi lời cảm ơn tới thầy cô Trường Đại học Bách khoa Hà Nội tạo điều kiện thuận lợi cho chúng em trình học tập, nghiên cứu để hồn thành đồ án Với lòng biết ơn sâu sắc nhất, chúng em xin gửi lời cảm ơn chân thành tới ThS Lê Thị Thùy, cảm ơn tận tình bảo, truyền đạt cho chúng em nhiều kiến thức kinh nghiệm khoa học vô quý báu Cô tận tình hướng dẫn, giúp đỡ bước đường suốt thời gian học tập hoàn thành đồ án chun ngành mơn Cơng nghệ Hố dược & Bảo vệ thực vật - Trường Đại Học Bách khoa Hà Nội Chúng em xin chân thành cảm ơn bạn lớp Hoá dược – K59, trường Đại học Bách khoa Hà Nội quan tâm, giúp đỡ trình học tập thực đồ án Hà Nội, tháng năm 2018 Nhóm sinh viên Lời mở đầu Ngành cơng nghiệp hố dược Hóa học hợp chất thiên nhiên hợp chất có hoạt tính sinh học lĩnh vực nghiên cứu nhiều nhà khoa học quan tâm Trong đó, lồi thuốc nguồn nguyên quý báu mà thiên nhiên mang tặng cho người, cần biết trân trọng sử dụng hợp lý nguồn tài nguyên vô giá Do vậy, hiểu biết việc nghiên cứu thành phần hoá học cỏ làm thuốc cần thiết Việc xác định thành phần hoá học, tác dụng dược lý thuốc có ý nghĩa quan trọng, góp phần phát triển cung cấp hợp chất có giá trị cho cơng nghiệp hố dược, thực phẩm, hương liệu, mỹ phẩm…, có tác dụng thiết thực đời sống hàng ngày, vấn đề quan tâm toàn xã hội Cây Thạch tùng thân gập (tên khoa học Huperzia squarrosa (Forst.) Trevis, hay có tên gọi khác Thơng đất) chứa hoạt chất Huperzine A Huperzine B có tác dụng điều trị bệnh Alzheimer hiệu Chúng alcaloids ức chế Acetylcholinesterase (AChE) mạnh, thuận nghịch, có chọn lọc hứa hẹn loại thuốc đầy tiềm cho việc điều trị triệu chứng bệnh Alzheimer Hiện nay, Thạch tùng thân gập quan tâm, nghiên cứu, khai thác ứng dụng điều trị bệnh rối loạn trí nhớ, tổn thương não bệnh Alzheimer Vì thế, đề tài “Tìm hiểu thành phần hóa học hoạt tính sinh học Thạch tùng thân gập (Huperzia squarrosa)” góp phần đánh giá, bổ sung thành phần hoá học tác dụng dược lý Huperzia squarrosa Đồ án cung cấp thơng tin khoa học quy trình chiết tách, xác định thành phần hoá học phân lập từ Huperzia squarrosa qua số công bố khoa học giới Việt Nam Bên cạnh đó, tìm hiểu hoạt tính sinh học số chất có hoạt tính phân lập từ cây, đặc biệt khả ức chế AChE chúng, nhằm điều trị bệnh Alzheimer cách hiệu Nội dung đồ án gồm chương: Chương 1: Tổng quan Chương 2: Thành phần hố học Chương 3: Hoạt tính sinh học PHẦN TỔNG QUAN 1.1 Mơ tả lồi thực vật [1], [2], [7], [9] Tên khoa học: Huperzia squarrosa (Forst.) Trevis Tên đồng nghĩa: Lycopodium squarrosum (Forst.) Trevis Huperzia squarrosa (Forst.) Trevis thuộc Họ Thông đất (Lycopodiaceae), lớp Lycopodiopsida (bộ Lycopodiales); loài thực vật chi Huperzia Bernh Tên Việt Nam: Râu rồng, Thạch tùng vảy, Thông đất nhám Mơ tả lồi thực vật: Cây thảo phụ sinh, thân thòng thường mập, hình trụ, mọc đứng phần gốc, sau gập thõng xuống dài 30-70 cm, dài 50-60 cm, 1-2 lần lưỡng phân, to 4-5 mm Lá hẹp, nhọn, xếp xoắn ốc hình dải - giáo, tỏa rộng ra, không cuống, mép nguyên, đỉnh ngắn gốc Chùy dài chót nhánh Bào tử diệp khơng khác thường, nhỏ hơn; bào tử nang hình thận, nở thành mảnh không Bộ phận sinh sản thân thành không phân nhánh, dài khoảng 10 cm, bào tử giống thật, ngắn lần, thẳng, nhọn, phình gốc Túi bào tử hình thận, có mảnh vỏ Cơng dụng: Râu rồng có vị đắng, tính bình; có tác dụng khư phong, trừ thấp, huyết Dân gian dùng tồn trị ngoại thương xuất huyết Có thể dùng trị đòn ngã tổn thương Ở Vân Nam (Trung Quốc) nhân dân địa phương dùng toàn trị đau dây thần kinh hông đau lưng phong thấp Ở Nepal, toàn râu rồng dùng giã đắp trị đau lưng 1.2 Sự phân bố thu hái [1], [9] Sinh thái: Thường mọc thân cây, đá ẩm, vùng núi Râu rồng ưa ẩm, ưa bóng, thích nghi với điều kiện khí hậu mát ẩm vùng núi Cây thường bám vách đá, thân, cành gỗ lớn rừng kín thường xanh ẩm ngun sinh hay tương đối nguyên sinh Cây sinh sản bào tử diễn môi trường nước (chủ yếu nước mưa) Cây có khả mọc chồi nhanh sau bị cắt bị gãy Hiện nay, tình trạng trồng làm cảnh khác mơi trường sống tự nhiên kích thước quẩn thể nhỏ nên râu rồng xếp vào nhóm bị đe dọa Phân bố hẹp, số vùng núi thấp, có núi trung bình Cao Bằng (Trà Lĩnh), Thanh Hóa, Lâm Đồng (núi Lang Bian) Khánh Hòa (hòn Vọng Phu) Còn gặp Lào, Campuchia nhiều nước thuộc xứ hệ thực vật cổ nhiệt đới Trên giới có Trung Quốc, Lào, từ Mađagátxca đến châu Đại Dương, Đài Loan Himalaya 1.3 Sơ lược thành phần hóa học [3], [10], [14] Các alkaloid phân lập từ Huperzia squarrosa (Forst.) Trevis: Lycosquarosine A (1), Acetylaposerratinine (2), Huperzine A (3), Huperzine B (4), 8αhydrophlemariurine B (5), Huperzinine (6), Lycoflexine N-oxide (7), Phlegmariurine B (8), Lycoposerramine U N-oxide (9), 12-epilycodine N-oxide (10) Pyrrolhuperzine A (11) Bảng Cấu trúc alkaloid Huperzia squarrosa 1.4 Tác dụng dược lý 1.4.1 Bệnh Alzheimer [3], [11], [12], [17] Bệnh Alzheimer (AD) loại chứng trí gây vấn đề trí nhớ, suy nghĩ hành vi Bệnh Alzheimer bệnh thối hóa thần kinh ngun nhân phổ biến chủ yếu gây chứng sa sút trí tuệ người cao tuổi, kích thích suy giảm nhận thức tiến triển, rối loạn tâm thần, trí nhớ, diện tuổi già, rối loạn dây thần kinh giảm truyền cholinergic Triệu chứng thường phát triển chậm trở nên trầm trọng theo thời gian, trở nên nghiêm trọng đủ để can thiệp vào công việc hàng ngày Thần kinh học chứng minh chức cholinergic làm suy giảm não trước vỏ não bệnh trí nhớ tuổi già chứng Alzheimer Các vấn đề bệnh Alzheimer: Bệnh Alzheimer dạng bệnh trí nhớ phổ biến nhất, thuật ngữ chung trí nhớ khả nhận thức khác nghiêm trọng ảnh hưởng đến sống hàng ngày Bệnh Alzheimer chiếm từ 60 đến 80% trường hợp sa sút trí tuệ Bệnh Alzheimer khơng phải phần bình thường lão hóa.Yếu tố rủi ro biết đến nhiều tuổi ngày tăng, phần lớn người mắc bệnh Alzheimer từ 65 tuổi trở lên Nhưng bệnh Alzheimer không bệnh tuổi già Khoảng 200.000 người Mỹ 65 tuổi mắc chứng bệnh Alzheimer sớm (còn gọi bệnh Alzheimer sớm khởi phát) Bệnh Alzheimer khơng có phương pháp điều trị, có phương pháp trị liệu cho triệu chứng tiếp tục nghiên cứu Mặc dù phương pháp điều trị Alzheimer ngăn chặn bệnh Alzheimer tiến triển, họ tạm thời làm chậm lại triệu chứng chứng trí cải thiện chất lượng sống cho người có bệnh Alzheimer người chăm sóc bệnh Alzheimer Ngày nay, toàn giới, nhà khoa học nỗ lực nhằm tìm phương pháp tốt để điều trị bệnh Alzheimer, trì hỗn thời gian khởi phát ngăn khơng cho phát triển Các yếu tố nguy bệnh Alzheimer sớm: Bệnh Alzheimer tiến triển theo thời gian, nơi triệu chứng trí trở nên trầm trọng qua năm Trong giai đoạn đầu, trí nhớ nhẹ, với bệnh Alzheimer giai đoạn muộn khả giao tiếp Bệnh Alzheimer nguyên nhân thứ sáu gây tử vong Hoa Kỳ Những người bị bệnh Alzheimer sống trung bình tám năm sau triệu chứng họ trở nên đáng ý với người khác, sống sót từ đến 20 năm, tùy theo tuổi tác điều kiện sức khoẻ khác 1.4.2 Dấu hiệu cảnh báo bệnh Alzheimer [18] • Mất trí nhớ làm ảnh hường tới sống ngày: Một dấu hiệu phổ biến bệnh Alzheimer trí nhớ, đặc biệt quên thơng tin đọc gần Có thể bao gồm quên ngày kiện quan trọng; hỏi lại nhiều lần vấn đề; ngày cần phải dựa vào phận trợ giúp nhớ (ví dụ ghi nhắc nhở thiết bị điện tử) thành viên gia đình thứ họ tự xử lý • Gặp khó khăn việc lên kế hoạch giải vấn đề: Một số người gặp thay đổi khả họ để lập kế hoạch làm theo kế hoạch hay làm việc với số Họ quên công thức quen thuộc theo dõi hóa đơn hàng tháng Họ gặp khó khăn việc tập trung nhiều thời gian để làm việc giống trước làm • Khó hồn thành cơng việc hàng ngày: Những người bị Alzheimer thường cảm thấy khó hồn thành cơng việc hàng ngày Đơi khi, người gặp cố lái xe tới vị trí quen thuộc, quản lý tiền bạc ghi nhớ quy tắc trò chơi u thích • Qn thời gian địa điểm: Những người bị bệnh Alzheimer quên ngày, mùa thời gian Họ gặp khó khăn để hiểu điều khơng xảy Đơi họ qn vị trí họ cách họ đến • Gặp khó khăn để hiểu hình ảnh trực quan khơng gian: Đối với số người, có vấn đề thị lực dấu hiệu bệnh Alzheimer Họ gặp khó khăn đọc, đánh giá khoảng cách xác định màu sắc độ tương phản, điều gây vấn đề lái xe • Gặp khó khăn nói viết: Những người có bệnh Alzheimer gặp rắc rối theo dõi tham gia trò chuyện Họ dừng lại trò chuyện làm để tiếp tục hay gặp khó khăn với từ vựng giao tiếp • Để sai vị trí quên đường đi: Một người có bệnh Alzheimer để đồ đạc phòng nhầm chỗ Họ bị đồ quên đường 1.4.3 Điều trị Alzheimer từ thực vật [3], [4], [8] Theo đó, tăng cường truyền dẫn thần kinh cholinergic coi cách tiếp cận điều trị tiềm chống AD Mặc dù sinh bệnh học AD phức tạp liên quan đến nhiều đường, hai giả thuyết lớn xem xét chế phân tử là: giả thuyết cholinergic giả thuyết cascade amyloid Do đó, trọng tâm chất ức chế cholinesterase chọn lọc (ChE) để giảm bớt thiếu hụt cholinergic cải thiện truyền dẫn thần kinh Theo đó, hai thiết lập thành mục tiêu điều trị hữu hiệu AD Một chiến lược điều trị để tăng cường chức cholinergic sử dụng chất ức chế acetylcholinesterase (AChE, EC 3.1.1.7) để tăng lượng acetylcholine, có khớp thần kinh nơ-ron thần kinh cholinergic Các chất ức chế AChE donepezil, rivastigmine galantamine, nghiên cứu rộng rãi Các chất ức chế AChE, chứng minh cải thiện đáng kể chức nhận thức AD Các loài rêu (Lycopodiaceae) biết đến nguồnalkaloid Lycopodium phong phú có hệ dị vòng phức tạp đặc tính sinh học khác Huperzine A, loại alkaloid với khung C16N2 phân lập từ loài Huperzia serrata Trung Quốc chứng minh chúng có hiệu cao, đặc hiệu, chất ức chế thuận nghịch AChE Cho đến nay, 300 alkaloids Lycopodium công bố Hầu hết alkaloids Lycopodium có hoạt tính ức chế AChE huperzine A, huperzine B, N-methylhuperzine B thuộc nhóm Lycodine Người ta nỗ lực khơng ngừng để tìm kiếm alkaloid Lycopodium cấu trúc hoạt tính sinh học thú vị, đặc biệt Lycopodium spp từ Việt nam, alkaloid kiểu C 16N1 mới, lycosquarosine A phân lập với năm alkaloid Lycopodium biết đến từ loài Huperzia squarrosa (Forst.) Trevis Trước đây, Lycopodium squarrosum (H squarrosa) có nguồn gốc từ Thái Lan, nghiên cứu mặt hóa thực vật có số alkaloid fawcettimine mô tả PHẦN THÀNH PHẦN HÓA HỌC 2.1 Phương pháp [14] 2.1.1 Sơ đồ khối 10 Sắc ký cột Silicagel (2x20 cm, Hex 15 2.2.2 Thuyết minh Mẫu H.squarrrosa khô (750g) nghiền nhỏ ngâm MeOH (3Lx4) nhiệt độ phòng Cặn chiết thơ hồ với dung dịch gồm axit tartaric 5% (200ml) CH2Cl2 Pha nước kiềm hóa dung dịch Na 2CO3 tới pH=10 sau chiết với CH2Cl2 Phần chiết giàu alkaloid (1,39 g) tiến hành sắc ký cột Sephadex LH-20 (3×91 cm, CH2Cl2:MeOH, 1:1, 700 mL) thu phân đoạn (P1-P6) Phân đoạn P5 (686,4mg) tiến hành sắc ký cột lần Sephadex LH-20 (3×70 cm, CH2Cl2:MeOH, 1: 1, 2000 mL) thu phân đoạn (P5.1-P5.7) Phân đoạn P5.5 (543,3mg) tiến hành sắc kí cột silicagel (3×30 cm, CH2Cl2:MeOH: NH3-MeOH, 1:0:0–0:9:1) thu phân đoạn (P5.5.1-P5.5.7) • Phân đoạn P5.5.1 (44,3 mg) tiến hành sắc kí cột silicagel (2x20 cm, Hexane: EtOAc:MeOH, 3:7:0-0:7:3) thu hợp chất Pyrrolhuperzine A (11) (6,7 mg) chất rắn màu trắng • Từ phân đoạn P5.5.2 thu Huperzine A (3) tinh khiết (214,5 mg, 0.0014%) 2.2.3 Thành phần Bảng Cấu trúc alkaloid phân lập 16 2.3 Phương pháp [3] 2.3.1 Sơ đồ khối 17 Hợp chất Hợp chất 18 2.3.2 Thuyết minh Cây thạch tùng thân gập (H.Squarrosa) thu hái tỉnh Lâm Đồng, miền Trung Việt Nam tháng năm 2012, xác định giáo sư Trần Công Luận, khoa Y học cổ truyền, trường Đại học Y Dược thành phố Hồ Chí Minh Mẫu nghiên cứu (TCL 00116) đặt Trung tâm Sâm Dược liệu thành phố Hồ Chí Minh Mẫu nguyên liệu thô (2.5 kg) chiết với 5L Metanol lần Dịch chiết cô áp suất giảm thu dich chiết thơ (502g), sau huyền phù hóa HCl 5% hòa với CH2Cl2 Lớp nước kiềm hóa tới pH~10 với dung dịch NH 3, chuẩn bị cho sắc ký cột hạt nhựa macrophy Dianion HP 20, kích thước cột (750×1000 mm) Q trình sắc ký cột thực sau: Dịch chiết(pH=10) bơm vào cột Sau hấp phụ, cột rửa với nước khử ion để loại bỏ chất phân cực, sau rửa giải với Metanol 100% thu dịch chiết alkaloid thô Dịch chiết cô quay 40 ̊C, thu cặn chiết Cặn chiết tiếp tục tiến hành sắc ký cột với chất hấp phụ silicagel, hệ dung môi sử dụng CH 2Cl2/MeOH với gradient nồng độ thay đổi từ 100-0 đến 0-100, 80%CH2Cl2/MeOH, sau bão hòa với , thu phân đoạn • Sau loại dung môi phân đoạn (242 mg) thu chất rắn vơ định hình, khơng màu (16.3mg, hợp chất 1) từ kết tinh hệ dung mơi MeOH- acetone • Sau loại bỏ dung môi phân đoạn (870 mg), hợp chất thu từ kết tinh hệ dung môi MeOH-acetone (26mg) • Phân đoạn (218 mg) tiến hành chạy cột MPLC với hệ dung môiMeOH/H 2O (5:1) thêm 0.1% axit triflo axetic (TFA) thu hợp chất (8.5mg) • Từ phân đoạn (115 mg), hai hợp chất (3.6 mg, tR = 18.6 min) hợp chất (3.6 mg, tR = 21.1 min) tinh chế semi-preparative HPLC (sử dụng hệ dung môi MeOH 0.1% TFA (25:75 → 85:15; tốc độ dòng mL/ phút) 90 phút; phát UV bước sóng 210 nm; YMC Pak cột ODS-A (20×250 mm, kích thước hạt μm] • Hợp chất (5.5 mg; tR = 28.6 min) thu từ phân đoạn (212 mg) semi-preparative HPLC (sử dụng hệ dung môi MeOH-0.1% TFA (20:80 → 80:20; tốc độ dòng ml/phút) 90 phút; phát UV bước sóng 210 nm; YMC Pak cột ODS-A (20×250 mm, kích thước hạt μm) 19 2.3.3 Thành phần Các chất phân lập được: Bảng Cấu trúc hợp chất phân lập 20 PHẦN HOẠT TÍNH SINH HỌC 3.1 Hoạt tính ức chế ACh AChE 3.1.1 Thí nghiệm ức chế hoạt động cholinesterase ống nghiệm [3] Hoạt tính ức chế enzym Acetylcholinesterase (AChE) butyryl-cholinesterase (BChE) đo phương pháp quang phổ phát triển Ellman cộng với điều chỉnh nhỏ ACH BCh sử dụng làm chất để phát ức chế AChE BChE Hỗn hợp phản ứng có dung dịch đệm natri phosphat (pH = 8.0, 140 μL); dung dịch mẫu thử nghiệm (20 μL); dung dịch AChE BChE (20 μL) trộn lẫn ủ 15 phút nhiệt độ phòng Tất mẫu kiểm tra đối chứng dương tính (berberine) hòa tan dimethyl sulfoxide phân tích 10% Các phản ứng bắt đầu với việc bổ sung DTNB (10 ml) ACh BCH (10 ml), tương ứng Quá trình thủy phân ACh BCh theo dõi cách tạo thành anion 5-thio-2-nitrobenzoate màu vàng 412 nm 15 phút, kết phản ứng DTNB với thiocholine, giải phóng trình thủy phân enzyme ACh BCh Tất phản ứng thực ba lần ghi lại 96-well microplates, sử dụng dụng cụ VERSA max (Molecular Devices, Sunnyvale, CA, USA) Tỷ lệ ức chế tính từ biểu thức (1-S/E)x100, E S enzyme hoạt động tương ứng khơng có có mẫu kiểm tra tương ứng Hoạt tính ức chế ChE mẫu biểu diễn theo số IC50 (μM cần thiết để ức chế thủy phân chất nền, ACh BCh, 50%), tính từ đường cong ức chế log-dose 3.1.2 Vai trò ACh AChE 3.1.2.1 Vai trò ACh bệnh Alzheimer [6] Acetylcholine (ACh) thúc đẩy tỉnh táo phần não trước Kích thích phần não tăng giải phóng acetylcholine, giúp tỉnh táo có giấc ngủ REM (Rapid Eye Movement), ngược lại ức chế phóng thích acetylcholine phần não trước adenosine gây giấc ngủ sóng chậm Sự góp mặt phân tử acetylcholine (ACh) có vai trò quan trọng đáng ý việc truyền dẫn thần kinh Tuy nhiên, thực tế toàn khu vực vỏ não nhận cholinergic vào từ phần não trước cho thấy ACh có nhiều vai trò ngồi việc tăng khả tập trung, giả thuyết phù hợp với phát cho thấy 21 cholinergic có tác động đáng kể tới nhận thức Trên thực tế, giả thuyết cholinergic bệnh Alzheimer cho thấy thiếu hụt dẫn truyền thần kinh cholinergic vỏ não góp phần vào suy giảm nhận thức đặc trưng bệnh nhân Tuy nhiên, tầm quan trọng cholinergic khả tập trung, mức độ rối loạn chức nhận thức bệnh Alzheimer kết trực tiếp từ bất thường cholinergic (chứ di chứng tượng tập trung lỗi dẫn truyền thần kinh cholinergic) Ví dụ, hoạt tính acetyltransferase choline, enzyme xúc tác trình tổng hợp ACh từ choline acetyl coenzyme A, giảm xuống 35% đến 50% mức bình thường bệnh Alzheimer Hơn nữa, tái hấp thu synaptic cholin, điều cần thiết cho việc tổng hợp phân tử ACh giải phóng vào khe synaptic (khớp thần kinh) vòng truyền dẫn thần kinh tiếp theo, giảm xuống -60% mức bình thường bệnh Alzheimer, qua phép đo trực tiếp cho thấy mức độ tổng hợp ACh giảm xuống nửa bệnh nhân bị ảnh hưởng Trên thực tế, điều chứng minh mức độ suy giảm tổng hợp ACh có tương quan đáng kể với tượng ngày tăng mức độ nghiêm trọng chứng sa sút trí tuệ bệnh nhân mắc bệnh Alzheimer (Bảng 5) Bảng Sự thay đổi Cholinergic marker bệnh Alzheimer Độ ảnh hưởng so với mức bình thường (%) Hoạt tính ChAT 35-50 Tổng hợp ACh 40-50 Hấp thu Choline 60 Hoạt tính AChE 40-60 Nicotinic 60-70 Muscarinic 80-100 ChAT=Choline Acetyltransfease; ACh=Acetylcholine; AChE=Acetylcholinesterase Mặc dù đột biến cholinergic khác tìm thấy nhiều bệnh Alzheimer, chất tiếp nhận ACh gần không thay đổi bệnh nhân 22 Do đó, can thiệp dược lý nhằm khơi phục mức ACh bình thường não có kì vọng làm tăng khả truyền dẫn thần kinh cholinergic 3.1.2.2 Vai trò AChE bệnh Alzheimer [15] Acetylcholinesterase (AChE) enzym đích quan trọng điều trị bệnh Alzheimer Vai trò AChE thủy phân acetylcholine dẫn đến ức chế dẫn truyền xung động thần kinh Bệnh Alzheimer rối loạn thối hóa thần kinh thường gặp nguyên nhân phổ biến chứng trí, với triệu chứng lâm sàng suy giảm nhận thức tiến triển liên quan đến suy giảm hoạt động sống hàng ngày rối loạn hành vi tiến triển suốt trình bệnh Theo giả thuyết cholinergic, việc phát sinh bệnh Alzheimer có liên quan đến thiếu hụt chất dẫn truyền thần kinh acetylcholine não tới gần 90% bệnh nhân mắc bệnh Alzheimer suy giảm nồng độ ACh vùng đồi vỏ não Acetylcholine chất dẫn truyền thần kinh khe synapse, có vai trò quan trọng hoạt động hệ thần kinh nồng độ acetylcholine trì ổn định enzyme acetylcholinesterase (AChE) AChE enzyme có chức làm ngưng lại hoạt động chất dẫn truyền thần kinh acetylcholine synapse thần kinh cholinergic thông qua việc thủy phân acetylcholine tạo thành cholin acid acetic Ở bệnh nhân mắc bệnh Alzheimer, có tích tụ mảng amyloid đám rối thần kinh, khiến cho nồng độ acetylcholine bị suy giảm đáng kể Do vậy, thuốc ức chế AChE nhằm trì nồng độ acetylcholine đóng vai trò quan trọng việc ngăn chặn tiến triển bệnh Alzheimer 3.2 Một số chất có hoạt tính phân lập từ Huperzia squarrosa 3.2.1 Huperzine A [13], [19] Công thức phân tử: C15H18N2O Trọng lượng phân tử: 242.322 g/mol (-)-Huperzine A lần phân lập từ Huperzia serrata năm 1986, hàm lượng trung bình Huperzine A 0,011% 23 Danh pháp IUPAC: [5R-(5a, 9b, 11E)]-5-amino-11-ethlidene-5,6,9,10-tetrahydro7-methyl-5,9-methanocycloocta [b] pyridin-2(1H)-on Số CAS cho Huperzine A 120786-18-7 Huperzine A ổn định bảo quản nhiệt độ phòng Huperzine A chứng minh có tính bảo vệ thần kinh cách hoạt động chất đối kháng không cạnh tranh thụ thể NMDA (N-methyl-D-aspartate) vị trí gắn kết polyamine gần vị trí phối hợp PCP (Phencyclidine) MK-801 (Dizocilpine) khơng có hiệu ứng phụ thần kinh PCP MK-801 Việc tiền xử lý tế bào thần kinh sơ cấp với Huperzine A làm giảm độc tính gây glutamate Huperzine A chất ức chế mạnh, cụ thể ức chế acetylcholinesterase, có hiệu lực tương đương với physostigmine, galantamine, donepezil, tacrine Nó tạo norepinephrine dopamine phụ thuộc liều vỏ não chuột dùng nội màng chỗ thông qua phân tách vi mô nhiều hoạt động khác, bao gồm khả bảo vệ tế bào chống lại hydrogen peroxide, protein beta amyloid (hoặc peptide) staurosporine -cô nhiễm cytotoxicity apoptosis Các tác dụng bảo vệ liên quan đến khả làm suy giảm oxy hố, điều hồ biểu protein apoptosis Bcl-2, Bax, P53, caspase-3, bảo vệ ty thể, tăng cường yếu tố tăng trưởng thần kinh thụ thể can thiệp vào tiền chất amyloid chuyển hóa protein Huperzine A dùng cho người tình nguyện khỏe mạnh bệnh nhân nhiều thử nghiệm Trung Quốcchứng minh an toàn, khả dung nạp hiệu việc điều trị bệnh Alzheimer, suy nhược thể lành tính, chứng trí, chứng nhồi máu tim Nó thường sử dụng Trung Quốc để điều trị sưng, sốt viêm, rối loạn máu tâm thần phân liệt, chấp thuận để sử dụng Trung Quốc để điều trị bệnh Alzheimer Huperzine A lựa chọn để nghiên cứu mơ hình chứng động kinh động vật dựa đặc tính bảo vệ thần kinh Dưới trợ giúp ASP (Anticonvulsant Screening Program), Huperzine A (ADD 357133) chứng minh có khả hoạt động mạnh chống lại co giật PTZ (pentylenetetrazol) gây 24 động kinh gây điện giật tối đa sau tiêm cho chuột Swiss-Webster, với hoạt động chống co giật cao điểm Với liều 1,2 4mg /kg, nhận thấy có tối đa 62,5% bảo vệ Quan sát thấy suy giảm thử nghiệm rotarot 75 100% chuột thử nghiệm liều 4mg/kg TD50là 0,83mg/kg Huperzine A nghiên cứu vớinhững “cơn đau formalin” chuột mg/kg i.p (tiêm phúc mô) ức chế hoàn toàn đau tất thời điểm, 0.5mg/kg i.p (60% TD50) gây ức chế hoàn toàn Cả hai kết cho thấy khác biệt có ý nghĩa thống kê từ việc kiểm soát (P