Nghiên cứu xây dựng mô hình thực nghiệm bệnh tự kỷ bằng natri valproat và tác dụng cải thiện hành vi của môi trường phong phú trên chuột nhắt trắng (tt)

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ QUỐC PHÒNG HỌC VIỆN QUÂN Y ĐÀO THU HỒNG NGHIÊN CỨU XÂY DỰNG MƠ HÌNH THỰC NGHIỆM BỆNH TỰ KỶ BẰNG NATRI VALPROAT VÀ TÁC DỤNG CẢI THIỆN HÀNH VI CỦA MÔI TRƢỜNG PHONG PHÚ TRÊN CHUỘT NHẮT TRẮNG Chuyên ngành: Sinh lý học Mã số: 62720107 T M TẮT UẬN ÁN TIẾN SỸ Y HỌC HÀ NỘI - 2018 CƠNG TRÌNH ĐƯỢC HOÀN THÀNH TẠI HỌC VIỆN QUÂN Y Người hướng dẫn khoa học: PGS.TS Trần Hải Anh PGS TS Cấn Văn Mão Phản biện 1: PGS TS Nguyễn Văn Tường Phản biện 2: PGS TS Lê Thu Liên Phản biện 3: GS TS Cao Tiến Đức Luận án bảo vệ trước Hội đồng chấm luận án cấp trường Học viện Quân y vào hồi: … … ngày … tháng … năm 2018 Có thể tìm hiểu luận án tại: Thư viện Quốc Gia Thư viện Học viện Quân y ………………………… ĐẶT VẤN ĐỀ Tính cấp thiết Tự kỉ nằm nhóm rối loạn phát triển tâm thần lan tỏa, đặc trưng suy giảm khả hòa nhập xã hội, suy giảm khả giao tiếp, có hành vi rập khuôn, lặp lại quan tâm mang tính hạn hẹp Nguyên nhân chế bệnh sinh bệnh tự kỷ chưa hoàn toàn sáng tỏ Hiện nay, tự kỷ coi bệnh xã hội đại với tỉ lệ mắc tăng lên nhanh chóng tất quốc gia Theo số liệu Trung tâm Kiểm sốt Phòng ngừa bệnh tật (CDC) tỉ lệ tự kỷ chung giới 0,5/1000 trẻ (năm 1985) tăng lên 12/1000 trẻ (năm 2012) Nhiều nghiên cứu cho thấy trẻ phơi nhiễm với valproat (VPA) bụng mẹ biểu bất thường phát triển tăng nguy bị rối loạn phổ tự kỷ Trên động vật thực nghiệm, phơi nhiễm thai kỳ với valproat dẫn đến thay đổi hành vi bệnh học non tương tự quan sát bệnh nhân tự kỷ Do đó, valproat dùng gây mơ hình bệnh tự kỷ động vật thực nghiệm để tìm hiểu chế thay đổi sinh học liên quan đến rối loạn phổ tự kỷ đánh giá hiệu phương pháp can thiệp chứng bệnh Ở Việt Nam, nghiên cứu bệnh tự kỷ thường quan tâm h a cạnh dịch tễ học đặc điểm lâm sàng, nghiên cứu mơ hình bệnh tự kỷ động vật đánh giá hiệu biện pháp can thiệp mơ hình hạn chế Xuất phát từ thực tế thực đề tài với hai mục tiêu: Xây dựng mơ hình thực nghiệm bệnh tự kỷ chuột nhắt trắng chủng Swiss tiêm natri valproat trước sinh Đánh giá tác dụng môi trường phong phú lên hành vi chuột nhắt gây mơ hình thực nghiệm bệnh tự kỷ 2 Ý nghĩa khoa học Luận án cung cấp liệu thay đổi hành vi chuột nhắt trắng chủng Swiss phơi nhiễm trước sinh với natri valproat (VPA) dải liều 300-500 mg/kg cân nặng, qua xây dựng mơ hình bệnh tự kỷ chuột nhắt trắng chủng Swiss phơi nhiễm trước sinh với natri valproat liều 500mg/kg cân nặng Đồng thời, luận án cung cấp liệu tác dụng cải thiện hành vi môi trường phong phú chuột nhắt gây mơ hình bệnh tự kỷ Ý nghĩa thực tiễn Mơ hình ứng dụng để xác định thay đổi sinh học liên quan đến chế bệnh sinh bệnh tự kỷ đánh giá tác dụng dược chất phương pháp điều trị bệnh tự kỷ có hiệu Cấu trúc luận án Luận án gồm 124 trang Đặt vấn đề trang; Chương (Tổng quan tài liệu) 32 trang; Chương (Đối tượng phương pháp nghiên cứu) 14 trang; Chương (Kết nghiên cứu) 41 trang; Chương (Bàn luận) 33 trang; Kết luận trang Kiến nghị trang Luận án có 22 bảng (2 bảng phụ lục), 35 hình (5 hình phụ lục) 147 tài liệu tham khảo (7 tài liệu tiếng Việt, 140 tài liệu tiếng Anh) Chƣơng TỔNG QUAN TÀI IỆU 1.1 Khái niệm sơ lƣợc lịch sử nghiên cứu bệnh tự kỷ Bệnh tự kỷ lần đề cập đến từ năm 1900, nguồn gốc từ tiếng Hy Lạp “Autos” - “tự thân”, mơ tả bệnh nhân có biểu lập, rút lui xã hội Năm 1943, Kanner dùng khái niệm “tự kỷ” mơ tả trẻ có khiếm khuyết tương tác xã hội phát triển ngôn ngữ; có hành vi kỳ lặp lại; khởi phát trước tuổi Năm 1944, Asperger mô tả dạng tự kỷ nhẹ gọi “hội chứng Asperger” Những năm 1960 – 1970, có nhiều nghiên cứu nguyên nhân tự kỷ thay đổi cấu trúc não, sinh hóa chuyển hóa Năm 1999, tự kỷ xếp vào nhóm rối loạn phát triển lan tỏa Theo đó, tự kỷ dạng rối loạn phát triển lan tỏa, ảnh hưởng đến nhiều mặt phát triển ảnh hưởng nhiều đến kỹ giao tiếp quan hệ xã hội 1.2 Tiêu chuẩn chẩn đoán bệnh tự kỷ Hiện nay, có hai hệ thống tiêu chuẩn chẩn đốn tự kỷ “Sổ tay chẩn đoán thống kê rối loạn tâm thần” (DSM) Hội Tâm thần Mỹ “Bảng phân loại bệnh tật quốc tế” (ICD) Tổ chức Y tế Thế giới Trong tiêu chuẩn DSM ứng dụng phổ biến 1.3 Cơ chế bệnh sinh Cơ chế bệnh sinh tự kỷ chưa hoàn toàn sáng tỏ Một số giả thuyết cho yếu tố nguyên nhân tác động vào giai đoạn phát triển định dẫn đến bất thường phát triển não sau thay đổi chức Giả thuyết khác đề cập đến vai trò yếu tố mơi trường, yếu tố di truyền tương tác hai yếu tố dẫn đến rối loạn phổ tự kỷ 1.4 Các phƣơng pháp gây mơ hình bệnh tự kỷ Mơ hình động vật bệnh tự kỷ mô tái lập yếu tố nguyên nhân sinh bệnh người, để với yếu tố nguyên nhân thu động vật biểu hành vi bệnh học tương đồng với triệu chứng bệnh tự kỷ mơ tả người Các mơ hình động vật chia làm ba nhóm ch nh: - Mơ hình gây tổn thương não: gây tổn thương vùng tiểu não, hạch hạnh nhân vỏ não trung gian trán trước - Mơ hình yếu tố mơi trường: phơi nhiễm thời ỳ bào thai sau sinh với thuốc chống co giật, yếu tố gây viêm - Mơ hình di truyền: gây đột biến gen liên quan đến tự ỷ, mơ hình bệnh di truyền có liên quan với tự ỷ 1.5 Các tập đánh giá hành vi động vật gây mơ hình bệnh tự kỷ Các tập đánh giá hành vi thiết ế dựa tập hợp triệu chứng đặc trưng bệnh nhân tự ỷ suy giảm tương tác xã hội, suy giảm giao tiếp, có hành vi lặp lại, mối quan tâm hạn chế; triệu chứng liên quan lo lắng, đáp ứng giác quan bất thường, vận động vụng về, suy giảm nhận thức, chống lại thay đổi, rối loạn giấc ngủ… 1.5.1 Bài tập đánh giá tương tác xã hội Để đo lường hoạt động tương tác xã hội dùng tập mê lộ ba buồng, tập đánh giá hành vi làm mẹ 1.5.2 Bài tập đánh giá giao tiếp, thông tin liên lạc Đánh giá đáp ứng động vật với mùi hương xã hội, mùi hương phi xã hội, phân tích âm chuột phát hoàn cảnh hác phương tiện đánh giá chức giao tiếp động vật 1.5.3 Bài tập đánh giá hành vi lặp lại Đếm hành vi lặp lại quay vòng, đào bới, chải lơng sử dụng tập mê lộ chữ T, mê lộ chữ 1.5.4 Bài tập đánh giá triệu chứng liên quan Để đánh giá giấc ngủ, đo lường co giật ghi điện não đồ Đánh giá hành vi lo lắng tập mê lộ chữ thập buồng sáng tối Đánh giá nhận thức, học tập hông gian tập mê lộ nước, tập nhận thức đồ vật Đo độ nhạy cảm cao với kích thích giác quan âm gây giật Đánh giá vận động vụng về, cứng nhắc qua tập phối hợp vận động (rotarod) 1.6 Phƣơng pháp điều trị bệnh tự kỷ Tự ỷ nhóm rối loạn ỹ phát triển bao gồm hành vi lệch lạc, hó hăn giao tiếp quan hệ xã hội Để việc can thiệp có hiệu cần có chuyên gia đánh giá huyết lực sở trường trẻ Can thiệp phải gồm nhiều lĩnh vực tâm lý, ngôn ngữ, giáo dục, y tế, hoạt động trị liệu…trong trọng tâm vào ỹ trẻ thiếu yếu so với trẻ tuổi 1.7 Tác dụng môi trƣờng phong phú lên hành vi động vật gây mơ hình bệnh tự kỷ Mơi trường phong phú (MTPP) điều kiện thí nghiệm, mơi trường làm “phong phú” thêm so với điều kiện nuôi tiêu chuẩn phòng thí nghiệm Năm 1947, Donald Hebb nhận thấy có khác biệt chất lượng hành vi chuột ông mang nhà cho chơi với giữ lồng phòng thí nghiệm Cho đến năm 1960 có phát thay đổi sinh hóa cấu trúc não động vật tiếp xúc với mơi trường thí nghiệm phong phú Tự kỷ bệnh rối loạn phát triển thần kinh nên việc sử dụng MTPP cho có tác dụng điều trị, cải thiện khiếm khuyết trình bệnh lý gây nên 1.8 Nghiên cứu bệnh tự kỷ Việt Nam Trong năm gần đây, số lượt trẻ đến hám điều trị rối loạn phổ tự ỷ ngày gia tăng Trong nước, có nhiều cơng trình nghiên cứu số yếu tố nguy cơ, dấu hiệu lâm sàng để phát sớm can thiệp cho trẻ tự kỷ, hướng nghiên cứu gây mô hình bệnh hiêm tốn Việc chẩn đốn, điều trị cho trẻ tự kỷ gặp nhiều hó hăn chưa đầu tư mức Vì vậy, nhiều trẻ tự kỷ hông phát điều trị sớm, dẫn đến trẻ bị thiệt thòi trí tuệ, sức khỏe, khó hăn hi hòa nhập cộng đồng Chƣơng ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Đối tƣợng nghiên cứu Chuột nhắt trắng chủng Swiss sinh từ chuột bố, mẹ Trung tâm nghiên cứu sản xuất động vật thí nghiệm chuẩn thức - Viện Vệ sinh dịch tễ Trung ương cung cấp, sử dụng hai nội dung nghiên cứu sau đây: * Nội dung 1: Xây dựng mơ hình bệnh tự kỷ chuột nhắt trắng chủng Swiss Chuột chia thành: nhóm chứng (Chứng) 35 con, nhóm phơi nhiễm VPA trước sinh với liều 300, 400 500 mg/kg cân nặng (VPA300, VPA400 VPA500, với số lượng 31, 32 30 chuột) * Nội dung 2: Đánh giá tác dụng cải thiện hành vi môi trường phong phú chuột nhắt gây mơ hình bệnh tự kỷ với liều xác định Chuột chia thành: nhóm chứng ni mơi trường chuẩn (Chứng-C) nuôi MTPP (Chứng-PP), với số lượng 69 72 con; nhóm phơi nhiễm VPA trước sinh với liều xác định 500 mg/ g nuôi môi trường chuẩn (VPA-C) nuôi MTPP (VPA-PP) với số lượng nhóm 66 65 Các quy trình thực nghiệm chăm sóc động vật thực nghiệm thực theo hướng dẫn Trung tâm nghiên cứu sản xuất động vật thí nghiệm chuẩn thức - Viện Vệ sinh dịch tễ Trung ương Ban cung cấp động vật thí nghiệm - Học viện Quân y 2.2 Phƣơng pháp nghiên cứu 2.2.1 Thiết kế nghiên cứu Thiết kế nghiên cứu thực nghiệm, can thiệp, có đối chứng 2.2.2 Phương tiện hóa chất Các hóa chất sử dụng nghiên cứu gồm natri valproat (Sigma Aldrich, Đức) dung dịch natri clorid 0,9% (B.BRAUN, Việt Nam) Chuột nuôi điều kiện nhiệt độ ổn định 25 ± 10C, độ ẩm 60-70% chu kỳ sáng tối 12/12 Các nhóm chuột Chứng-C VPA-C ni mơi trường chuẩn (MTC), nhóm chuột Chứng-PP VPA-PP ni MTPP MTC lồng ni có ch thước 30x20x15 cm, đủ thức ăn dạng cám viên, nước uống, vật liệu làm tổ MTPP lồng ni có ch thước lớn 50x30x30 cm, chia hai tầng, gồm thành phần: bánh xe chạy bộ, cầu thang, dây leo, bập bênh, nhà ngủ, đường hầm, bóng lăn, đủ thức ăn dạng cám viên, nước uống vật liệu làm tổ Phòng thực nghiệm yên tĩnh, nhiệt độ ổn định 25 ± 10C, có đặt buồng thực nghiệm để tiến hành tập đánh giá hành vi Buồng thực nghiệm hình trụ tròn (đường kính m, cao m), quây kín xung quanh trần vải đen dày sử dụng ánh sáng bóng đèn mờ 25 W Các thiết bị nghiên cứu hành vi gồm: mặt phẳng nghiêng, hệ thống ghi phân t ch âm siêu âm, môi trường mở, rotarod mê lộ chữ thập, ba buồng mê lộ nước, hệ thống ghi phân tích hành vi Any-maze 2.2.3 Quy trình nghiên cứu * Nội dung 1: Xây dựng mơ hình bệnh tự kỷ chuột nhắt trắng Chuột nhắt trắng trưởng thành chủng Swiss kiểm soát chu kỳ sinh sản, cho giao phối, xác định ngày thai kỳ Vào ngày thứ 12,5 thai kỳ, chuột mẹ chia ngẫu nhiên vào nhóm sinh chuột chứng nhóm sinh chuột phơi nhiễm VPA trước sinh Các chuột mẹ sinh chuột chứng tiêm phúc mạc liều đơn dung dịch NaCl 0,9%, 0,01 ml/g cân nặng Các chuột mẹ sinh chuột thuộc nhóm gây mơ hình tiêm phúc mạc dung dịch VPA nồng độ 50 mg/ml, liều đơn 300, 400, 500 600 mg/kg cân nặng Với liều VPA này, tiến hành thử liều tác dụng/gây độc Vì liều VPA 600 mg/kg gây chết/độc với chuột non phơi nhiễm tuần đầu sau sinh, nên số chuột non phơi nhiễm liều VPA600 đánh giá hành vi giai đoạn hạn chế Bởi vậy, nghiên cứu sử dụng liều 300– 500 mg/kg kết thực nghiệm tương ứng với liều Chuột sinh chia thuộc nhóm chứng nhóm VPA300, VPA400, VPA500 theo liều phơi nhiễm thời kỳ bào thai Đánh giá hành vi chuột gồm: ghi âm siêu âm giai đoạn 310 ngày tuổi; tập mặt phẳng nghiêng 6-8 ngày tuổi; tập môi trường mở, tương tác xã hội ba buồng, mê lộ chữ thập, rotarod, mê lộ nước giai đoạn 49-61 ngày tuổi Từ đó, xác định liều VPA phù hợp gây mơ hình bệnh tự kỷ chuột nhắt * Nội dung 2: Đánh giá tác dụng cải thiện hành vi MTPP chuột nhắt gây mơ hình bệnh tự kỷ với liều xác định Gây mơ hình bệnh tự kỷ chuột nhắt phơi nhiễm ngày 12,5 thai kỳ với liều VPA xác định để đánh giá tác dụng cải thiện hành vi MTPP mơ hình Chuột nhóm chứng VPA sau cai sữa (ngày 21) chia nhóm ngẫu nhiên ni MTC MTPP, lồng 3-6 con, nuôi riêng theo giới, với thời gian nuôi tuần Đánh giá hành vi chuột nhóm trước ni MTC MTPP, gồm: ghi âm siêu âm giai đoạn 3-10 ngày tuổi; tập mặt phẳng nghiêng 6-8 ngày tuổi Quy trình ni MTPP: lồng ni xếp thành mẫu đánh số thứ tự, mẫu có đồ vật, ngày thay đổi lần bao gồm thay ổ mới, rửa làm hô đồ vật, thay đồ vật đổi vị tr hai đồ vật cũ Đánh giá hành vi chuột sau nuôi MTC MTPP: Chuột giai đoạn 49-61 ngày tuổi, qua tập môi trường mở, mê lộ ba buồng, mê lộ chữ thập, rotarod, mê lộ nước, so sánh, đánh giá tác dụng MTPP so với MTC lên hành vi chuột nhắt gây mơ hình thực nghiệm bệnh tự kỷ 11 Số lần vào buồng nhóm chứng cao nhóm VPA400, VPA500 (p 0,05 pa,c < 0,05 pc,d < 0,001 pa,b > 0,05 pa,c > 0,05 pc,d < 0,01 Số lần thời gian vùng trung tâm nhóm VPA-C cao nhóm VPA-PP (p < 0,01 đến p < 0,001) 13 3.2.2.2 Tác dụng môi trường phong phú lên hoạt động tương tác xã hội chuột nhắt gây mơ hình thực nghiệm bệnh tự kỷ Bảng 3.12 Số lần thời gian vào buồng mê lộ ba buồng phiên chuột nhóm chứng mơ hình VPA500 ni Chỉ số Số lần vào buồng (lần) Thời gian buồng (s) Thời gian buồng trung tâm (s) MTC MTPP ± SD Nhóm n a.Chứng-C 69 14,75 ± 9,98 b.Chứng-PP 72 8,76 ± 4,07 c.VPA-C 66 10,86 ± 8,66 d.VPA-PP 64 9,34 ± 4,53 a.Chứng-C 69 314,33 ± 95,94 b.Chứng-PP 72 360,03 ± 145,93 c.VPA-C 66 307,22 ± 113,21 d.VPA-PP 64 342,63 ± 138,99 a.Chứng-C 69 85,71 ± 51,68 b.Chứng-PP 72 80,95 ± 93,41 c.VPA-C 66 116,92 ± 91,61 d.VPA-PP 64 83,48 ± 76,40 p pa,b < 0,001 pa,c < 0,01 pc,d >0,05 pa,b < 0,05 pa,c >0,05 pc,d > 0,05 pa,b < 0,01 pa,c < 0,05 pc,d < 0,01 Số lần vào buồng nhóm chứng ni MTC cao nhóm chứng ni MTPP nhóm VPA ni MTC (p < 0,01) Thời gian buồng nhóm chứng ni MTC thấp nhóm chứng ni MTPP (p < 0,05) Thời gian buồng trung tâm nhóm chứng thấp nhóm VPA (p