Nghiên cứu xây dựng mô hình thực nghiệm bệnh tự kỷ bằng natri valproat và tác dụng cải thiện hành vi của môi trường phong phú trên chuột nhắt trắng (tt)

Do đó, valproat được dùng gây mô hình bệnh tự kỷ trên động vật thực nghiệm để tìm hiểu cơ chế của những thay đổi sinh học liên quan đến rối loạn phổ tự kỷ cũng như đánh giá hiệu quả của

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ QUỐC PHÒNG

HỌC VIỆN QUÂN Y

ĐÀO THU HỒNG

NGHIÊN CỨU XÂY DỰNG MÔ HÌNH THỰC NGHIỆM BỆNH TỰ KỶ BẰNG NATRI VALPROAT VÀ TÁC DỤNG CẢI THIỆN HÀNH VI CỦA MÔI TRƯỜNG PHONG PHÚ

CÔNG TRÌNH ĐƯỢC HOÀN THÀNH TẠI HỌC VIỆN QUÂN Y

Người hướng dẫn khoa học:

1 PGS.TS Trần Hải Anh

2 PGS TS Cấn Văn Mão

Phản biện 1: PGS TS Nguyễn Văn Tường

Phản biện 2: PGS TS Lê Thu Liên

Phản biện 3: GS TS Cao Tiến Đức

Luận án sẽ được bảo vệ trước Hội đồng chấm luận án cấp trường tại Học viện Quân y vào hồi: … giờ … ngày … tháng … năm 2018

Có thể tìm hiểu luận án tại:

1 Thư viện Quốc Gia

2 Thư viện Học viện Quân y

3 ………

ĐẶT VẤN ĐỀ

1 Tính cấp thiết

Tự kỉ nằm trong nhóm các rối loạn phát triển tâm thần lan tỏa, đặc trưng bởi sự suy giảm khả năng hòa nhập xã hội, suy giảm khả năng giao tiếp, có những hành vi rập khuôn, lặp lại và những quan tâm mang tính hạn hẹp Nguyên nhân và cơ chế bệnh sinh của bệnh

tự kỷ chưa hoàn toàn sáng tỏ Hiện nay, tự kỷ được coi là căn bệnh của xã hội hiện đại với tỉ lệ mắc tăng lên nhanh chóng ở tất cả các quốc gia Theo số liệu của Trung tâm Kiểm soát và Phòng ngừa bệnh tật (CDC) tỉ lệ tự kỷ chung trên thế giới là 0,5/1000 trẻ (năm 1985) tăng lên 12/1000 trẻ (năm 2012) Nhiều nghiên cứu cho thấy những trẻ phơi nhiễm với valproat (VPA) trong bụng mẹ biểu hiện các bất thường phát triển và tăng nguy cơ bị rối loạn phổ tự kỷ Trên động vật thực nghiệm, phơi nhiễm trong thai kỳ với valproat cũng dẫn đến những thay đổi hành vi và bệnh học ở con non tương tự như quan sát được trên bệnh nhân tự kỷ Do đó, valproat được dùng gây mô hình bệnh tự kỷ trên động vật thực nghiệm để tìm hiểu cơ chế của những thay đổi sinh học liên quan đến rối loạn phổ tự kỷ cũng như đánh giá hiệu quả của các phương pháp can thiệp đối với chứng bệnh này Ở Việt Nam, các nghiên cứu về bệnh tự kỷ thường quan tâm về h a cạnh dịch tễ học và đặc điểm lâm sàng, những nghiên cứu về mô hình bệnh tự kỷ trên động vật và đánh giá hiệu quả của các biện pháp can thiệp trên mô hình vẫn còn hạn chế Xuất phát từ thực tế trên chúng tôi thực hiện đề tài này với hai mục tiêu:

1 Xây dựng mô hình thực nghiệm bệnh tự kỷ trên chuột nhắt trắng chủng Swiss bằng tiêm natri valproat trước sinh

2 Đánh giá tác dụng của môi trường phong phú lên hành vi trên chuột nhắt được gây mô hình thực nghiệm bệnh tự kỷ

2 Ý nghĩa khoa học

Luận án cung cấp các dữ liệu về thay đổi hành vi của chuột nhắt trắng chủng Swiss phơi nhiễm trước sinh với natri valproat (VPA) dải liều 300-500 mg/kg cân nặng, qua đó xây dựng được mô hình bệnh tự kỷ trên chuột nhắt trắng chủng Swiss bằng phơi nhiễm trước sinh với natri valproat liều 500mg/kg cân nặng Đồng thời, luận án cung cấp các dữ liệu về tác dụng cải thiện hành vi của môi trường phong phú trên chuột nhắt được gây mô hình bệnh tự kỷ

3 Ý nghĩa thực tiễn

Mô hình có thể ứng dụng để xác định những thay đổi sinh học liên quan đến cơ chế bệnh sinh bệnh tự kỷ và đánh giá tác dụng của các dược chất hoặc phương pháp điều trị bệnh tự kỷ có hiệu quả

4 Cấu trúc của luận án

Luận án gồm 124 trang Đặt vấn đề 2 trang; Chương 1 (Tổng quan tài liệu) 32 trang; Chương 2 (Đối tượng và phương pháp nghiên cứu) 14 trang; Chương 3 (Kết quả nghiên cứu) 41 trang; Chương 4 (Bàn luận) 33 trang; Kết luận 1 trang và Kiến nghị 1 trang

Luận án có 22 bảng (2 bảng phụ lục), 35 hình (5 hình phụ lục) và

147 tài liệu tham khảo (7 tài liệu tiếng Việt, 140 tài liệu tiếng Anh)

Chương 1 TỔNG QUAN TÀI IỆU 1.1 Khái niệm và sơ lược lịch sử nghiên cứu bệnh tự kỷ

Bệnh tự kỷ lần đầu tiên được đề cập đến từ những năm 1900, nguồn gốc từ tiếng Hy Lạp “Autos” - “tự thân”, mô tả những bệnh nhân có biểu hiện cô lập, rút lui xã hội Năm 1943, Kanner dùng khái niệm “tự kỷ” mô tả những trẻ có khiếm khuyết về tương tác xã hội

và phát triển ngôn ngữ; có những hành vi kỳ lặp lại; khởi phát trước

3 tuổi Năm 1944, Asperger mô tả một dạng tự kỷ nhẹ hơn gọi là

“hội chứng Asperger” Những năm 1960 – 1970, có nhiều nghiên cứu về nguyên nhân của tự kỷ có thể do những thay đổi về cấu trúc

não, sinh hóa và chuyển hóa Năm 1999, tự kỷ được xếp vào nhóm các rối loạn phát triển lan tỏa Theo đó, tự kỷ là một dạng rối loạn phát triển lan tỏa, ảnh hưởng đến nhiều mặt của sự phát triển nhưng ảnh hưởng nhiều nhất đến kỹ năng giao tiếp và quan hệ xã hội

1.2 Tiêu chuẩn chẩn đoán bệnh tự kỷ

Hiện nay, có hai hệ thống tiêu chuẩn chẩn đoán tự kỷ là “Sổ tay chẩn đoán và thống kê các rối loạn tâm thần” (DSM) của Hội Tâm thần Mỹ và “Bảng phân loại bệnh tật quốc tế” (ICD) của Tổ chức Y

tế Thế giới Trong đó các tiêu chuẩn của DSM được ứng dụng khá phổ biến

1.3 Cơ chế bệnh sinh

Cơ chế bệnh sinh của tự kỷ vẫn chưa hoàn toàn sáng tỏ Một số

giả thuyết cho rằng các yếu tố nguyên nhân tác động vào giai đoạn phát triển nhất định dẫn đến bất thường phát triển của não bộ và sau

đó là các thay đổi chức năng Giả thuyết khác đề cập đến vai trò của yếu tố môi trường, yếu tố di truyền và sự tương tác giữa hai yếu tố này dẫn đến rối loạn phổ tự kỷ

1.4 Các phương pháp gây mô hình bệnh tự kỷ

Mô hình động vật bệnh tự kỷ là sự mô phỏng tái lập những yếu tố nguyên nhân sinh bệnh trên người, để với cùng yếu tố nguyên nhân cũng sẽ thu được trên động vật những biểu hiện hành vi và bệnh học tương đồng với các triệu chứng bệnh tự kỷ được mô tả trên người Các mô hình động vật được chia làm ba nhóm ch nh:

- Mô hình gây tổn thương não: gây tổn thương các vùng như tiểu não, hạch hạnh nhân hoặc vỏ não trung gian trán trước

- Mô hình các yếu tố môi trường: phơi nhiễm trong thời ỳ bào thai hoặc sau sinh với thuốc chống co giật, yếu tố gây viêm

- Mô hình di truyền: gây đột biến các gen liên quan đến tự ỷ, mô hình các bệnh di truyền có liên quan với tự ỷ

1.5 Các bài tập đánh giá hành vi động vật gây mô hình bệnh tự kỷ

Các bài tập đánh giá hành vi được thiết ế dựa trên tập hợp các triệu chứng đặc trưng ở bệnh nhân tự ỷ như suy giảm tương tác xã hội, suy giảm trong giao tiếp, có các hành vi lặp lại, các mối quan tâm hạn chế; và các triệu chứng liên quan như lo lắng, đáp ứng của các giác quan bất thường, vận động vụng về, suy giảm nhận thức, chống lại sự thay đổi, rối loạn giấc ngủ…

1.5.1 Bài tập đánh giá tương tác xã hội

Để đo lường hoạt động tương tác xã hội có thể dùng bài tập mê lộ

ba buồng, bài tập đánh giá hành vi làm mẹ

1.5.2 Bài tập đánh giá sự giao tiếp, thông tin liên lạc

Đánh giá đáp ứng của động vật với mùi hương xã hội, mùi hương phi xã hội, phân tích âm thanh do chuột phát ra trong các hoàn cảnh hác nhau là phương tiện đánh giá chức năng giao tiếp ở động vật

1.5.3 Bài tập đánh giá hành vi lặp lại

Đếm hành vi lặp lại như quay vòng, đào bới, chải lông hoặc sử dụng bài tập mê lộ chữ T, mê lộ chữ

1.5.4 Bài tập đánh giá các triệu chứng liên quan

Để đánh giá giấc ngủ, đo lường sự co giật có thể ghi điện não đồ Đánh giá hành vi lo lắng bằng bài tập mê lộ chữ thập hoặc buồng sáng tối Đánh giá hả năng nhận thức, học tập hông gian bằng bài tập mê lộ nước, bài tập nhận thức đồ vật Đo độ nhạy cảm cao với kích thích giác quan bằng âm thanh gây giật mình Đánh giá vận động vụng về, cứng nhắc qua bài tập phối hợp vận động (rotarod)

1.6 Phương pháp điều trị bệnh tự kỷ

Tự ỷ là một nhóm rối loạn các ỹ năng phát triển bao gồm hành

vi lệch lạc, hó hăn trong giao tiếp và quan hệ xã hội Để việc can thiệp có hiệu quả cần có chuyên gia đánh giá những hiếm huyết và năng lực sở trường của trẻ Can thiệp sẽ phải gồm nhiều lĩnh vực như

tâm lý, ngôn ngữ, giáo dục, y tế, hoạt động trị liệu…trong đó trọng tâm vào những ỹ năng trẻ còn thiếu và yếu hơn so với trẻ cùng tuổi

1.7 Tác dụng của môi trường phong phú lên hành vi động vật gây mô hình bệnh tự kỷ

Môi trường phong phú (MTPP) là điều kiện thí nghiệm, trong đó môi trường được làm “phong phú” thêm so với điều kiện nuôi tiêu chuẩn trong phòng thí nghiệm Năm 1947, Donald Hebb nhận thấy

có sự khác biệt về chất lượng hành vi giữa những con chuột ông mang về nhà cho con chơi cùng với những con được giữ trong lồng ở phòng thí nghiệm Cho đến những năm 1960 đã có những phát hiện

về thay đổi sinh hóa và cấu trúc não ở động vật được tiếp xúc với môi trường thí nghiệm phong phú Tự kỷ là một bệnh rối loạn phát triển thần kinh nên việc sử dụng MTPP được cho là có tác dụng điều trị, cải thiện các khiếm khuyết do quá trình bệnh lý gây nên

1.8 Nghiên cứu về bệnh tự kỷ tại Việt Nam

Trong những năm gần đây, số lượt trẻ đến hám và điều trị rối loạn phổ tự ỷ ngày càng gia tăng Trong nước, có nhiều công trình nghiên cứu về một số yếu tố nguy cơ, các dấu hiệu lâm sàng để phát hiện sớm và can thiệp cho trẻ tự kỷ, hướng nghiên cứu gây mô hình bệnh vẫn còn hiêm tốn Việc chẩn đoán, điều trị cho trẻ tự kỷ còn gặp nhiều hó hăn vì chưa được đầu tư đúng mức Vì vậy, nhiều trẻ

tự kỷ hông được phát hiện và điều trị sớm, dẫn đến trẻ bị thiệt thòi

cả về trí tuệ, sức khỏe, khó hăn hi hòa nhập cộng đồng

Chương 2 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Đối tượng nghiên cứu

Chuột nhắt trắng chủng Swiss sinh ra từ chuột bố, mẹ do Trung tâm nghiên cứu và sản xuất động vật thí nghiệm chuẩn thức - Viện

Vệ sinh dịch tễ Trung ương cung cấp, được sử dụng trong hai nội dung nghiên cứu sau đây:

* Nội dung 1: Xây dựng mô hình bệnh tự kỷ trên chuột nhắt

trắng chủng Swiss Chuột được chia thành: nhóm chứng (Chứng) 35 con, các nhóm phơi nhiễm VPA trước sinh với các liều 300, 400 và

500 mg/kg cân nặng (VPA300, VPA400 và VPA500, với số lượng lần lượt là 31, 32 và 30 chuột)

* Nội dung 2: Đánh giá tác dụng cải thiện hành vi của môi

trường phong phú trên chuột nhắt được gây mô hình bệnh tự kỷ với liều xác định Chuột được chia thành: nhóm chứng nuôi trong môi trường chuẩn (Chứng-C) và nuôi trong MTPP (Chứng-PP), với số lượng lần lượt là 69 và 72 con; nhóm phơi nhiễm VPA trước sinh với liều xác định 500 mg/ g nuôi trong môi trường chuẩn (VPA-C) và nuôi trong MTPP (VPA-PP) với số lượng mỗi nhóm là 66 và 65 con Các quy trình thực nghiệm và chăm sóc động vật thực nghiệm được thực hiện theo hướng dẫn của Trung tâm nghiên cứu và sản xuất động vật thí nghiệm chuẩn thức - Viện Vệ sinh dịch tễ Trung ương và Ban cung cấp động vật thí nghiệm - Học viện Quân y

2.2 Phương pháp nghiên cứu

2.2.1 Thiết kế nghiên cứu

Thiết kế nghiên cứu thực nghiệm, can thiệp, có đối chứng

2.2.2 Phương tiện và hóa chất

Các hóa chất sử dụng trong nghiên cứu gồm natri valproat (Sigma Aldrich, Đức) và dung dịch natri clorid 0,9% (B.BRAUN, Việt Nam)

Chuột được nuôi trong điều kiện nhiệt độ ổn định ở 25 ± 10C, độ

ẩm 60-70% và chu kỳ sáng tối 12/12 giờ Các nhóm chuột Chứng-C

và VPA-C được nuôi trong môi trường chuẩn (MTC), còn các nhóm chuột Chứng-PP và VPA-PP được nuôi trong MTPP MTC là lồng

nuôi có ch thước 30x20x15 cm, đủ thức ăn dạng cám viên, nước uống, vật liệu làm tổ MTPP là lồng nuôi có ch thước lớn 50x30x30 cm, chia hai tầng, gồm các thành phần: bánh xe chạy bộ, cầu thang, dây leo, bập bênh, nhà ngủ, đường hầm, bóng lăn, đủ thức

ăn dạng cám viên, nước uống và vật liệu làm tổ

Phòng thực nghiệm yên tĩnh, nhiệt độ ổn định ở 25 ± 10C, có đặt một buồng thực nghiệm để tiến hành các bài tập đánh giá hành vi Buồng thực nghiệm hình trụ tròn (đường kính 2 m, cao 2 m), được quây kín xung quanh và trần bằng vải đen dày và sử dụng ánh sáng bóng đèn mờ 25 W Các thiết bị nghiên cứu hành vi gồm: mặt phẳng nghiêng, hệ thống ghi và phân t ch âm siêu âm, môi trường mở, rotarod và các mê lộ chữ thập, ba buồng và mê lộ nước, cùng hệ thống ghi và phân tích hành vi Any-maze

2.2.3 Quy trình nghiên cứu

* Nội dung 1: Xây dựng mô hình bệnh tự kỷ trên chuột nhắt trắng

Chuột nhắt trắng cái trưởng thành chủng Swiss được kiểm soát chu kỳ sinh sản, cho giao phối, xác định ngày của thai kỳ Vào ngày thứ 12,5 của thai kỳ, các chuột mẹ được chia ngẫu nhiên vào nhóm sinh chuột con chứng và các nhóm sinh chuột con phơi nhiễm VPA trước sinh Các chuột mẹ sinh chuột con chứng được tiêm phúc mạc liều đơn dung dịch NaCl 0,9%, 0,01 ml/g cân nặng Các chuột mẹ sinh chuột con thuộc các nhóm gây mô hình được tiêm phúc mạc dung dịch VPA nồng độ 50 mg/ml, liều đơn 300, 400, 500 và 600 mg/kg cân nặng Với các liều VPA này, chúng tôi tiến hành thử liều tác dụng/gây độc Vì liều VPA 600 mg/kg gây chết/độc với các chuột non phơi nhiễm ngay trong tuần đầu sau sinh, nên số chuột non phơi nhiễm ở liều VPA600 được đánh giá hành vi trong các giai đoạn tiếp theo rất hạn chế Bởi vậy, nghiên cứu hiện tại sử dụng các liều 300–

500 mg/kg và các kết quả thực nghiệm tương ứng với các liều này

Chuột con sinh ra được chia thuộc nhóm chứng hoặc các nhóm VPA300, VPA400, VPA500 theo liều phơi nhiễm trong thời kỳ bào thai Đánh giá hành vi chuột con gồm: ghi âm siêu âm ở giai đoạn 3-

10 ngày tuổi; bài tập mặt phẳng nghiêng ở 6-8 ngày tuổi; các bài tập trong môi trường mở, tương tác xã hội ba buồng, mê lộ chữ thập, rotarod, mê lộ nước ở giai đoạn 49-61 ngày tuổi Từ đó, xác định liều VPA phù hợp nhất gây mô hình bệnh tự kỷ trên chuột nhắt

* Nội dung 2: Đánh giá tác dụng cải thiện hành vi của MTPP trên

chuột nhắt đã gây mô hình bệnh tự kỷ với liều xác định

Gây mô hình bệnh tự kỷ trên chuột nhắt bằng phơi nhiễm ở ngày 12,5 của thai kỳ với liều VPA xác định để đánh giá tác dụng cải thiện hành vi của MTPP trên mô hình này Chuột con ở các nhóm chứng

và VPA sau khi cai sữa (ngày 21) được chia nhóm ngẫu nhiên nuôi trong MTC hoặc trong MTPP, mỗi lồng 3-6 con, nuôi riêng theo

giới, với thời gian nuôi là 4 tuần

Đánh giá hành vi chuột con các nhóm trước khi nuôi trong MTC

và MTPP, gồm: ghi âm siêu âm ở giai đoạn 3-10 ngày tuổi; bài tập

mặt phẳng nghiêng ở 6-8 ngày tuổi

Quy trình nuôi trong MTPP: lồng nuôi được sắp xếp thành các

mẫu đánh số thứ tự, mỗi mẫu có 5 đồ vật, 3 ngày thay đổi một lần bao gồm thay ổ mới, rửa sạch và làm hô đồ vật, thay thế một đồ vật mới và đổi vị tr hai đồ vật cũ

Đánh giá hành vi chuột con sau khi nuôi trong MTC và MTPP:

Chuột ở giai đoạn 49-61 ngày tuổi, qua các bài tập môi trường mở,

mê lộ ba buồng, mê lộ chữ thập, rotarod, mê lộ nước, so sánh, đánh giá tác dụng của MTPP so với ở MTC lên hành vi chuột nhắt đã gây

mô hình thực nghiệm bệnh tự kỷ

2.2.4 Xử lý số liệu

Số liệu được thể hiện qua các giá trị trung bình, độ lệch chuẩn, tỉ

lệ phần trăm So sánh các tỉ lệ bằng kiểm định 2

, so sánh các giá trị trung bình của nhiều nhóm có phân phối chuẩn bằng phân tích phương sai một nhân tố, hoặc phân tích Kruskal-Walis với phân phối không chuẩn, so sánh giá trị trung bình giữa nhiều nhóm ở nhiều thời điểm khác nhau bằng phân t ch phương sai hỗn hợp, các thuật toán thống kê chạy trên phần mềm IBM SPSS Statistics 20.0

2.2.5 Địa điểm nghiên cứu

Labo Sinh lý học - Học viện Quân y

Chương 3 KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 3.1 Xây dựng mô hình thực nghiệm bệnh tự kỷ trên chuột nhắt trắng chủng Swiss bằng tiêm natri valproat trước sinh

3.1.1 Ảnh hưởng của phơi nhiễm natri valproat trước sinh lên sự phát triển phối hợp vận động, thăng bằng trong bài tập mặt phẳng nghiêng

Hình 3.1 Thời gian hoàn thành quay 1800 ở chuột nhóm chứng và

các nhóm phơi nhiễm VPA trước sinh 6–8 ngày tuổi

**: p<0,01, *** p:<0,001 so với của nhóm chứng cùng ngày

+:p<0,05, ++: p<0,01 so với ở ngày 6 cùng nhóm

Thời gian hoàn thành động tác quay ở các nhóm VPA400 và VPA500 dài hơn nhóm chứng, rõ nhất ở nhóm VPA500

3.1.2 Ảnh hưởng của phơi nhiễm natri valproat trước sinh lên giao tiếp bằng phát âm

Hình 3.7 Số lần phát âm của chuột nhóm chứng và các nhóm phơi

nhiễm VPA trước sinh 3–10 ngày tuổi ở dải tần số dưới 35 kHz

Số lần phát âm ở nhóm chứng cao hơn ở các nhóm VPA, rõ nhất

Bảng 3.4 Số lần và thời gian vào các buồng trong mê lộ ba buồng

phiên 1 ở chuột nhóm chứng và các nhóm phơi nhiễm VPA trước sinh

Số lần vào buồng 1 ở nhóm chứng cao hơn ở các nhóm VPA400, VPA500 (p <0,01 đến p < 0,001) Thời gian ở buồng trung tâm ở

nhóm VPA500 cao hơn ở nhóm chứng (p < 0,05)

3.1.5 Ảnh hưởng của phơi nhiễm natri valproat trước sinh lên hành vi liên quan đến lo lắng trong bài tập mê lộ chữ thập

Kết quả nghiên cứu trên Bảng 3.8 cho thấy số lần vào cánh mở ở nhóm chứng cao hơn ở các nhóm VPA300 (p < 0,05) và VPA400 (p

< 0,01), không có sự khác biệt với nhóm VPA500 Thời gian ở cánh

mở ở nhóm chứng cao hơn ở các nhóm VPA300, VPA400 và VPA500 (p < 0,05 đến p < 0,001) Thời gian ở cánh đóng ở nhóm chứng thấp hơn ở nhóm VPA400 (p < 0,001), không có sự khác biệt với các nhóm VPA300 và VPA500.

3.1.6 Ảnh hưởng của phơi nhiễm natri valproat trước sinh lên khả năng phối hợp vận động, thăng bằng trong bài tập trên rotarod

Hình 3.12 Thời gian duy trì vận động trên trục quay ở chuột nhóm

chứng và các nhóm phơi nhiễm VPA trước sinh

Thời gian vận động trên trục quay ở nhóm chứng cao hơn ở các nhóm VPA (p < 0,01 đến p < 0,001)

3.1.7 Ảnh hưởng của phơi nhiễm natri valproat trước sinh lên khả năng học tập và trí nhớ không gian trong bài tập mê lộ nước