KHẢO sát KHẢ NĂNG TIẾT ENZYME ENDO CELLULASE của các CHỦNG nấm TRICHODERMA

TRƯỜNG ðẠI HỌC CẦN THƠ KHOA NÔNG NGHIỆP & SINH HỌC ỨNG DỤNG NGUYỄN HOÀNG PHÚC KHẢO SÁT KHẢ NĂNG TIẾT ENZYME ENDO-CELLULASE CỦA CÁC CHỦNG NẤM TRICHODERMA Luận văn tốt nghiệp Ngành: BẢO VỆ THỰC VẬT Cần Thơ, 2010 TRƯỜNG ðẠI HỌC CẦN THƠ KHOA NÔNG NGHIỆP & SINH HỌC ỨNG DỤNG Luận văn tốt nghiệp Ngành: BẢO VỆ THỰC VẬT Tên ñề tài: KHẢO SÁT KHẢ NĂNG TIẾT ENZYME ENDO-CELLULASE CỦA CÁC CHỦNG NẤM TRICHODERMA Giảng viên hướng dẫn: ThS Dương Minh Ks ðào Thị Hồng Xuyến Ks Tơ Huỳnh Như Sinh viên thực hiện: Nguyễn Hồng Phúc MSSV: 3064963 Lớp: BVTV K32 Cần Thơ, 2010 TRƯỜNG ðẠI HỌC CẦN THƠ KHOA NÔNG NGHIỆP VÀ SINH HỌC ỨNG DỤNG BỘ MƠN BẢO VỆ THỰC VẬT Chứng nhận chấp thuận luận văn với ñề tài: “KHẢO SÁT KHẢ NĂNG TIẾT ENZYME ENDO-CELLULASE CỦA CÁC CHỦNG NẤM TRICHODERMA” Do sinh viên NGUYỄN HỒNG PHÚC thực đề nạp Kính trình hội đồng chấm luận văn tốt nghiệp xem xét Cần Thơ, ngày … tháng năm 2010 Giảng viên hướng dẫn ThS DƯƠNG MINH i TRƯỜNG ðẠI HỌC CẦN THƠ KHOA NÔNG NGHIỆP VÀ SINH HỌC ỨNG DỤNG BỘ MƠN BẢO VỆ THỰC VẬT Hội đồng chấm luận văn tốt nghiệp ñã chấp thuận luận văn với ñề tài: “KHẢO SÁT KHẢ NĂNG TIẾT ENZYME ENDO-CELLULASE CỦA CÁC CHỦNG NẤM TRICHODERMA” Do sinh viên NGUYỄN HOÀNG PHÚC thực bảo vệ trước hội ñồng ngày … tháng … năm 2010 Luận văn ñã ñược hội ñồng chấp thuận ñánh giá mức: ………………… Ý kiến hội ñồng: ………………………………………………………….…… ……………………………………………………………………………………… …………………………………………………………………………………….… Cần Thơ, ngày … tháng … năm 2010 DUYỆT KHOA Chủ tịch hội ñồng Trưởng khoa Nông Nghiệp Sinh Học Ứng Dụng ii LỜI CAM ðOAN Tơi xin cam đoan cơng trình nghiên cứu thân Các số liệu, kết trình bày luận văn trung thực chưa cơng bố luận văn trước ñây Tác giả luận văn (ký tên) Nguyễn Hoàng Phúc iii LÝ LỊCH CÁ NHÂN Sinh viên: NGUYỄN HOÀNG PHÚC Sinh ngày 12 tháng 02 năm 1988 Tại xã Kiến An, huyện Chợ Mới, tỉnh An Giang Con Ơng: Nguyễn Văn Hồng Thúc Và Bà: Nguyễn Thị Dạ Thảo ðã tốt nghiệp Trung Học Phổ Thông năm 2006, trường THPT Chu Văn An, huyện Phú Tân, tỉnh An Giang Vào trường ðại học Cần Thơ năm 2006, theo học ngành Bảo Vệ Thực Vật, khóa 32 Tốt nghiệp Kỹ sư Nông Nghiệp chuyên ngành Bảo Vệ Thực Vật năm 2010 iv LỜI CẢM TẠ Kính dâng! Ba, mẹ người suốt đời tận tụy nghiệp tương lai chúng con, xin cảm ơn người thân ñã giúp ñỡ, ñộng viên suốt thời gian qua Thành thật biết ơn! Thầy Dương Minh, Ks ðào Thị Hồng Xuyến, Ks Tô Huỳnh Như, Ks Lê Phước Thạnh, Ks Phan Thị Mỹ Phúc, Ks Phan Quốc Kiệt Ks Trần Minh Tài ñã tận tình hướng dẫn, giúp đỡ động viên em suốt thời gian làm hoàn thành luận văn tốt nghiệp Chân thành cảm tạ! Thầy cố vấn học tập Lê Văn Vàng, tồn thể q thầy khoa Nơng Nghiệp & Sinh Học Ứng Dụng kiến thức mà q thầy truyền đạt cho em suốt thời gian học tập trường ðây hành trang vững giúp em bước vào ñời Gửi lời cảm ơn ñến! Anh, chị bạn sinh viên làm đề tài Bộ mơn Bảo Vệ Thực Vật, toàn thể bạn sinh viên lớp Bảo Vệ Thực Vật khóa 32, đặc biệt bạn Nhụy, Xuyến, Duy, Thúy, Diện nhiệt tình giúp ñỡ suốt thời gian học tập thực đề tài Trân trọng! Nguyễn Hồng Phúc v Nguyễn Hoàng Phúc, 2010 “Khảo sát khả tiết enzyme endo-cellulase chủng nấm Trichoderma” Luận văn tốt nghiệp kỹ sư Nông Nghiệp chuyên ngành Bảo Vệ Thực Vật, khoa Nông Nghiệp & Sinh Học Ứng Dụng, trường ðại học Cần Thơ _ TÓM LƯỢC ðề tài “Khảo sát khả tiết enzyme endo-cellulase chủng nấm Trichoderma” ñược thực từ tháng 9/2009 ñến 4/2010 nhằm chọn lọc chủng Trichoderma có khả tiết nhiều endo-cellulase cao điều kiện phịng thí nghiệm Kết đạt góp phần hữu ích việc phân hủy rơm rạ ñồng ruộng hạn chế ngộ ñộc hữu cho lúa Thí nghiệm ñược thực phịng thí nghiệm mơn Bảo Vệ Thực Vật, khoa Nông Nghiệp & Sinh Học Ứng Dụng, trường ðại học Cần Thơ từ tháng 9/2009 ñến 4/2010, bố trí theo thể thức khối hồn tồn ngẫu nhiên lần lặp lại Ba mươi chủng Trichoderma ni cấy bình tam giác (250 ml) chứa 100 ml mơi trường TSM lỏng (Trichoderma selective medium Broth) có chứa CMC (carboxyl methyl cellulose) với mật số 106 bào tử/ml, nuôi lắc ngày 10 ngày với tốc ñộ 140 vịng/phút (rpm) Dịch trích mẫu lọc qua giấy Whatman # 5, trữ 0C, xác ñịnh hoạt tính endo-cellulase theo phương pháp Ghose (1987) hàm lượng protein theo phương pháp Bradford (1976) Kết thí nghiệm cho thấy chủng Trichoderma thử nghiệm có khả tạo sinh khối, tiết endo-cellulase có giá trị OD protein Trong đó: - Hai chủng T-CG10d (0,990 g/lít) T-LM3a (0,925 g/lít) có sinh khối cao - Ba chủng T-TB4a, T-VTa14c T-OM2a có giá trị OD protein cao (0,2580 - 0,2098) chủng lại - Các chủng T-LM7a, T-TO1g T-CG7d có giá trị OD endo-cellulase cao ( 0,2188 - 0,1688) chủng khác Ngồi ra, có số chủng Trichoderma cho giá trị OD endo-cellulase protein sau 10 ngày nuôi lắc cao so với ngày nuôi lắc Các chủng tiết nhiều endo-cellulase tiếp tục thử nghiệm ñiều kiện thực tế ñể ñánh giá khả phân hủy cellulose chọn lọc chủng có hiệu việc phân hủy chất hữu phục vụ sản xuất nơng nghiệp vi MỤC LỤC Lời cam đoan Lý lịch cá nhân Lời cảm tạ Tóm lược Mục lục Danh sách bảng Danh sách hình MỞ ðẦU CHƯƠNG 1: LƯỢC KHẢO TÀI LIỆU 1.1 ðặc ñiểm sinh thái phân bố nấm Trichoderma 1.1.1 ðặc ñiểm phân bố Trichoderma 1.1.2 ðặc ñiểm sinh thái Trichoderma 1.2 Khả ñối kháng Trichoderma với vi sinh vật gây bệnh 1.3 Khả phân hủy chất hữu Trichoderma 1.4 Khả phân giải cellulose Trichoderma CHƯƠNG 2: PHƯƠNG TIỆN VÀ PHƯƠNG PHÁP 2.1 Phương tiện 2.1.1 Thời gian địa điểm 2.1.2 Vật liệu thí nghiệm 2.2 Phương pháp thí nghiệm 2.2.1 Thí nghiệm 2.2.2 Bố trí thí nghiệm 2.2.3 Chỉ tiêu theo dõi CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1 Ghi nhận tổng quát 3.2 Kết thí nghiệm 3.2.1 Khả tiết endo-cellulase chủng Trichoderma 3.2.2 Sinh khối chủng Trichoderma 3.2.3 Hàm lượng protein dịch trích chủng Trichoderma Chương 4: KẾT LUẬN VÀ ðỀ NGHỊ 4.1 Kết luận 4.2 ðề nghị Tài liệu tham khảo Phụ chương vii Trang iii iv v vi vii viii viii 2 2 6 6 8 8 11 11 11 11 13 14 17 17 17 18 DANH SÁCH BẢNG Bảng Tên bảng Trang 3.1 Giá trị OD endo-cellulase dịch trích chủng Trichoderma sau ngày 10 ngày nuôi lắc (Bộ môn Bảo Vệ Thực Vật, 2009 - 2010) 12 3.2 Sinh khối khơ (g/lít) chủng Trichoderma sau 10 ngày nuôi lắc (Bộ môn Bảo Vệ Thực Vật, 2009 - 2010) 13 3.3 Giá trị OD protein dịch trích chủng Trichoderma sau ngày 10 ngày nuôi lắc (Bộ môn Bảo Vệ Thực Vật, 2009 - 2010) 15 DANH SÁCH HÌNH Hình Tên hình Trang Bố trí thí nghiệm máy lắc ngang 16 Trichoderma sau 10 ngày nuôi lắc 16 Máy ño ñộ hấp thu quang phổ Spectrophotometer 16 viii 2.1.2.4 Nguồn nấm Ba mươi chủng Trichoderma (T) nhận từ mơn Bảo Vệ Thực Vật, khoa Nông Nghiệp & Sinh Học Ứng Dụng, trường ðại học Cần Thơ, gồm có: - Huyện Long Mỹ (Hậu Giang) có chủng: T-LM1b, T-LM1f, T-LM1h, TLM3a, T-LM3c, T-LM3d, T-LM7a T-LM7c - Huyện Vị Thanh (Hậu Giang) có chủng: T-VTa2a, T-VTa3d, T-VTa3e, TVTa5a T-VTa14c - Quận Ơ Mơn (TP Cần Thơ) có chủng T-OM2a - Huyện Bình Minh (Vĩnh Long) có chủng: T-BM2a, T-BM5b, T-BM5c T-BM6b - Huyện Trà Ơn (Vĩnh Long) có chủng T-TO1c T-TO1g - Huyện Tam Bình (Vĩnh Long) có chủng T-TB4a - Huyện Tri Tơn (An Giang) có chủng T-TTAG3b - Huyện Cai Lậy (Tiền Giang) có chủng T-CL1c - Huyện Cái Bè (Tiền Giang) có chủng: T-CB1b, T-CB3a T-CB8c - Huyện Chợ Gạo (Tiền Giang) có chủng T-CG7d T-CG10d - Huyện Châu Thành (Tiền Giang) có chủng T-CTTG3d T-CTTG11a 2.1.2.5 Mơi trường nuôi cấy Môi trường PDA (potato dextrose agar) (Shurfleff Averre III, 1997) Khoai tây 200 g Dextrose 20 g Agar 20 g Nước cất vừa ñủ 1000 ml pH 6,5 - 6,8 Môi trường TSM lỏng (Trichoderma selective medium Broth) (Elad Chet, 1983) MgSO4.7H2O 0,2 g K2HPO4 0,9 g KCl 0,15 g NH4NO3 1g Glucose 1g CMC (carboxyl methyl cellulose) 5g Nước cất vừa ñủ 1000 ml pH 6,5 2.1.2.6 Chuẩn bị hoá chất - Chất nền: lọc giấy Whatman N05 1.0 x 6.0 cm (≈ 50 mg) - Citrate buffer M: Citric acid (C6H807.H20) 210 g Nước cất 750 ml Thêm NaOH ñến pH 4,3 - Thuốc thử Dinitrosalicylic Acid (DNS): Hỗn hợp: Nước cất 3,5-Dinitro-salicylic acid NaOH Hòa tan tất cả, sau thêm: Na-Ktartarate Phenol (nóng chảy 50 0C) Na-metabisufite - Na-citrate 0,05 M, pH = 4,8: Na-citrate (M = 294) Nước cất vừa ñủ pH 1416 ml 10,6 g 19,8 g 306 g 7,6 ml 8,3 g 14,7 g 1000 ml 4,8 2.2 PHƯƠNG PHÁP THÍ NGHIỆM 2.2.1 Thí nghiệm Thí nghiệm bố trí theo thể thức khối hoàn toàn ngẫu nhiên với 30 chủng lần lặp lại, lần lặp lại bình tam giác Tổng cộng 30 chủng x lặp lại = 120 bình thí nghiệm 2.2.2 Bố trí thí nghiệm Cho 100 ml môi trường TSM lỏng (Trichoderma selective medium Broth) vào bình tam giác (250 ml), trùng 1210C 25 phút Sau để nguội hồn tồn, tiến hành chủng Trichoderma vào môi trường nuôi cấy với mật số 106 bào tử/ml Tất nghiệm thức ñược ñặt máy lắc ngang, lắc với tốc ñộ 140 vòng/phút (rpm) Sau ngày 10 ngày ni lắc thu dịch trích mơi trường cách lọc qua phễu giấy lọc Whatman # - Phần dịch trích lọc cho vào ống nghiệm đem dự trữ nhiệt ñộ C, ñể xác ñịnh hàm lượng protein mẫu dịch trích khảo sát hoạt tính endo-cellulase Spectrophotometer - Phần sinh khối thu lấy tồn bộ, sấy 1050C cân trọng lượng khô sinh khối 2.2.3 Chỉ tiêu theo dõi 2.2.3.1 Xác ñịnh hàm lượng protein mẫu dịch trích Theo Bradford (1976), protein chuẩn Bovine serum albumin, chất nhuộm màu protein Coomassie brilliant blue G250 Thành phần tham gia phản ứng: Bradford Buffer Dịch trích 2500 µl µl 1000 µl * Cách pha thuốc thử Bradford: - Cân 0,1 g Coomassie brilliant blue G250 cho vào 50 ml ethanol 95 - ðặt lên máy khuấy từ khuấy ñủ - Thêm 100 ml phosphoric acid (85%) - Tiếp tục khuấy thêm - Thêm nước cất vừa đủ lít - Sau dùng máy khuấy từ, khuấy ñều dung dịch qua ñêm ñến Coomassie brilliant blue G250 tan hết ñem lọc qua giấy Whatman # - ðọc Spectrophotometer có giá trị OD dung dịch khoảng 0,3 0,45 bước sóng λ = 465 nm * Cách pha Buffer - Dung dịch A: ðong 11,55 ml CH3COOH 0,2 M, sau thêm nước cất cho đủ 1000 ml - Dung dịch B: Cân 27,2 g CH3COONa pha vào lít nước cất với nồng độ 0,2 M - Buffer = 105 ml dung dịch A + 395 ml dung dịch B + nước cất cho ñủ 1000 ml (pH = 5,2) * Cách ño mẫu - Cuvette chuẩn: 2,5 ml Bradford + 1000 µl buffer - Cuvette mẫu: 2,5 ml Bradford + 1000 µl dịch trích - Lắc hỗn hợp mẫu máy lắc (Vortex Stuart SA6, Uk) cho ñều ño ñộ hấp thu OD λ = 595 nm - Lặp lại lần/mẫu lấy giá trị trung bình 2.2.3.2 Khảo sát hoạt tính endo-cellulase Các bước thực hiện: - Cho ml Na-citrate 0,05 M vào ống nghiệm - Thêm ml dịch trích - Giữ nhiệt ñộ 500C Waterbath - Thêm lọc giấy Whatman # 1.0 x 6.0 cm (≈ 50 mg) - Ủ nhiệt ñộ 500C ñúng 60 phút - Thêm 0,5 ml DNS - Ngâm ống nghiệm nước sơi phút - Cho ống nghiệm vào nước lạnh để trở nhiệt độ phịng - Thêm 0,5 ml nước cất - Lắc hỗn hợp máy lắc (Vortex Stuart SA6, UK) cho ñều, sau ñó ño ñộ hấp thu OD λ = 540 nm Spectro 0: ml citrate buffer Ủ nhiệt ñộ 500C 60 phút 0,5 ml DNS ðể nước sôi phút Làm nguội chậu nước lạnh Thêm 0,5 ml nước cất Enzyme blank: ml citrate buffer ml dịch trích Ủ nhiệt độ 500C 60 phút 0,5 ml DNS ðể nước sôi phút Làm nguội chậu nước lạnh Thêm 0,5 ml nước cất Autozero với cuvette chuẩn: Spectro Phân tích lượng sản phẩm khử hình thành tác động enzyme từ 1000 µl dịch trích thơ theo phương pháp so màu λ = 540 nm ðo lặp lại lần/mẫu lấy giá trị trung bình
Xử lý thống kê Số liệu phân tích thống kê theo phần mềm IRRISTAT for DOS Phân tích diễn OD theo thời gian dựa vào phương pháp thí nghiệm tổng hợp (Combined Experiments) với thời ñiểm nhân tố 10 ... Kredics ctv., 2003) Trên sở đề tài ? ?Khảo sát khả tiết enzyme endo- cellulase chủng nấm Trichoderma? ?? nhằm chọn lọc chủng Trichoderma có khả tiết nhiều endo- cellulase có khả cho sinh khối cao để làm tảng... _ TÓM LƯỢC ðề tài ? ?Khảo sát khả tiết enzyme endo- cellulase chủng nấm Trichoderma? ?? ñược thực từ tháng 9/2009 ñến 4/2010 nhằm chọn lọc chủng Trichoderma có khả tiết nhiều endo- cellulase cao điều... đồng chấm luận văn tốt nghiệp ñã chấp thuận luận văn với ñề tài: “KHẢO SÁT KHẢ NĂNG TIẾT ENZYME ENDO- CELLULASE CỦA CÁC CHỦNG NẤM TRICHODERMA? ?? Do sinh viên NGUYỄN HOÀNG PHÚC thực bảo vệ trước hội