Giải trình tự gen ADN ty thể vùng cytochrome b ứng dụng trong giám định phân biệt ADN ty thể người và một số động vật

VIỆN ĐẠI HỌC MỞ HÀ NỘI KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC -o0o - KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP Đề tài: GIẢI TRÌNH TỰ GEN ADN TY THỂ VÙNG CYTOCHROME B - ỨNG DỤNG TRONG GIÁM ĐỊNH PHÂN BIỆT ADN TY THỂ NGƯỜI VÀ MỘT SỐ ĐỘNG VẬT Giáo viên hướng dẫn : ThS Hà Hữu Hảo Sinh viên thực : Nguyễn Thị Yên Lớp : K20.13 - 02 HÀ NỘI - 2017 i VIỆN ĐẠI HỌC MỞ HÀ NỘI KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC -o0o - KHĨA LUẬN TỐT NGHIỆP Đề tài: GIẢI TRÌNH TỰ GEN ADN TY THỂ VÙNG CYTOCHROME B - ỨNG DỤNG TRONG GIÁM ĐỊNH PHÂN BIỆT ADN TY THỂ NGƯỜI VÀ MỘT SỐ ĐỘNG VẬT Giáo viên hướng dẫn : ThS Hà Hữu Hảo Sinh viên thực : Nguyễn Thị Yên Lớp : K20.13 - 02 HÀ NỘI - 2017 ii LỜI CẢM ƠN Lời đầu tiên, em xin gửi lời cảm ơn sâu sắc đến TS Đào Thị Hồng Vân đã tận tình giúp đỡ giúp em thực tập Viện Pháp y quốc gia Và với tất lòng biết ơn chân thành, em xin gửi lời cảm ơn đến: Các thầy cô giáo trường Viện đại học Mở Hà Nội giúp em có kiến thức q trình học tập trường ThS Hà Hữu Hảo - Trưởng khoa Y – Sinh học, Viện Pháp y quốc gia tận tình hướng dẫn, giảng dạy tạo điều kiện cho em tham gia lớp học đào tạo chuyên môn giám định ADN TS.Nguyễn Đức Nhự - Viện trưởng Viện Pháp y quốc gia, Khóa đào tạo phân tích ADN ty thể chuyên gia Phịng thí nghiệm nhận dạng ADN người thuộc qn đội Hoa Kỳ giảng dạy Trong trình thực tập, làm việc thực luận văn, em nhận giúp đỡ bảo cán Viện Pháp y quốc gia tạo điều kiện cho em có thời gian học tập, giúp em tiếp cận với kỹ thuật phòng nghiên cứu để hoàn thành luận văn Em xin chân thành cảm ơn ! Hà Nội, Ngày 15 tháng năm 2017 Sinh viên Nguyễn Thị Yên iii MỤC LỤC LỜI CẢM ƠN MỤC LỤC DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT DANH MỤC HÌNH DANH MỤC BẢNG ĐẶT VẤN ĐỀ PHẦN I TỔNG QUAN 1.1 Tổng quan ADN giám định ADN 1.1.1 ADN cấu trúc ADN 1.1.2 Giám định ADN 1.2 Ty thể ADN ty thể 1.2.1 Ty thể 1.2.2 ADN ty thể Vai trò việc nghiên cứu ADN ty thể Cơ sở khoa học di truyền ADN ty thể Cấu trúc ADN ty thể 10 1.3 Cytochrome B 11 1.4 Tình hình nghiên cứu gen Cytb nước 13 1.4.1 Tình hình nghiên cứu gen Cytb nước ngồi 13 1.4.2 Tình hình nghiên cứu gen Cytb Việt Nam 14 PHẦN II VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 15 2.1 Vật liệu nghiên cứu 15 2.1.1 Đối tượng nghiên cứu 15 2.1.2 Hóa chất thiết bị sử dụng 15 2.2 Phương pháp nghiên cứu 16 2.2.1 Tách chiết ADN 16 iv 2.2.2 Điện di ADN tổng số 19 2.2.3 Phản ứng PCR 20 2.2.5 Giải trình tự ADN 22 2.2.6 Xử lý thống kê số liệu 24 PHẦN III KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 25 3.1 Kết tách chiết ADN tổng số 25 3.2 Kết khuếch đại ADN ty thể vùng Cytb 26 3.3 Kết giải trình tự gen Cytb mẫu nghiên cứu 28 3.4 Kết so sánh ADN ty thể vùng Cytb người số động vật 29 3.4.1.Kết so sánh trình tự gen Cytb mẫu nghiên cứu so với trình tự tham khảo Genbank 29 3.4.2 Kết so sánh trình tự gen Cytb người số động vật 44 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 55 Kết luận 55 Kiến nghị 55 TÀI LIỆU THAM KHẢO 56 v DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT ADN Axit deoxyribonucleic D-Loop Displacement loop EDTA Ethylenedianinetetraacetic acid HV1 Hypervariable (Vùng siêu biến 1) HV2 Hypervariable (Vùng siêu biến 2) HV3 Hypervariable (Vùng siêu biến 3) mtDNA Mitochondrial DNA (ADN ty thể) PCR Polymerase chain reaction ( Phản ứng chuỗi trùng hợp) Rcrs Revised Cambridge Reference Sequence (Trình tự tham khảo Cambridge chỉnh sửa) Bp Cytb Base pair (Cặp base) Cytochrome B vi DANH MỤC HÌNH Hình : Cấu trúc chung gen điển hình Hình 2:Mơ hình ty thể Hình 3: Cấu trúc hệ gen ty thể Hình 4: Sơ đồ phả hệ xác định di truyền theo dòng mẹ ADN ty thể 10 Hình 5: Vị trí gen Cytb ADN ty thể [16] 11 Hình 6: Chương trình thiết lập phần mềm giải trình tự 24 Hình 7: Điện di ADN tổng số gel agarose 0.8% 25 Hình 8: Điện di sản phẩm PCR vùng Cytochrome B gel polyacrylamide27 Hình 9: Kết giải trình tự mẫu L2CB theo hướng dẫn hãng ABI (Mỹ)28 Hình 10: Kết giải trình tự mẫu L2CB 29 Hình 11: So sánh trình tự nucleotide thu từ mẫu người với trình tự tham khảo Genbank 34 Hình 12: So sánh trình tự nucleotide thu từ mẫu bị với trình tự tham khảo Genbank 38 Hình 13: So sánh trình tự nucleotid thu từ mẫu chó với trình tự tham khảo Genbank 40 Hình 14: So sánh trình tự nucleotid thu từ mẫu lợn với trình tự tham khảo Genbank 43 Hình 15: So sánh trình tự nucleotid từ bị, chó, lợn nghiên cứu với trình tự nucleotid người (Homo sapiens JN034136.1) 53 vii DANH MỤC BẢNG Bảng 1: Trình tự cặp mồi dùng khuếch đại vùng Cytb 20 Bảng 2: Thành phần PCR 20 Bảng 3: Chu trình nhiệt thực dùng cho máy PCR 21 (Eppendorf-Đức) 21 Bảng 4: Thành phần hóa chất điện di 21 Bảng 5: Thực PCR với BigDye Terminator kit [12]: 23 Bảng 6: Chu trình nhiệt PCR: 23 Bảng 7: Tinh sản phẩm PCR sử dụng BigDye Xterminator purification kit [10]: 23 Bảng Tỉ lệ phần trăm trình tự đa hình mẫu nghiên cứu với trình tự loài tương ứng Genbank 43 Bảng 9: Tỉ lệ phần trăm trình tự đa hình mẫu người với bị, chó, lợn 54 viii ĐẶT VẤN ĐỀ Trong vòng 20 năm trở lại đây, sinh học phân tử công nghệ gen phát triển mạnh mẽ đem lại thành tựu vĩ đại cho khoa học công nghệ cuối kỉ 20 đầu kỉ 21, việc giải trình tự hồn chỉnh gen người Từ sinh học phân tử trở thành công cụ đắc lực cho nhiều lĩnh vực khoa học khác như: khảo cổ học, nhân chủng học, di truyền y học đặc biệt giám định vụ án hình Ngày nay, phương pháp giám định gen sử dụng rộng rãi nhiều quốc gia khác nhau, đưa chứng đáng tin cậy cho việc phá án, giúp đem lại công cho xã hội Có hai phương pháp giám định gen phân tích ADN nhân tế bào phân tích ADN ty thể Phân tích gen nhân tế bào phương pháp có nhiều ưu điểm bên cạnh có nhiều hạn chế địi hỏi phải thu đươc ADN nhân nguyên vẹn mẫu phân tích Tuy nhiên, trường hợp mẫu phân tích bị phân hủy thu ADN nhân tế bào phương pháp áp dụng phân tích ADN ty thể Với đặc trưng bật ADN ty thể như: di truyền theo dòng mẹ, có kích thước tương đối nhỏ nên bền vững thời gian dài lên tới hàng nghìn năm, số lượng lớn tế bào Cấu trúc ADN mạch vòng, bảo vệ cấu trúc đặc biệt keratin tóc, hydroxyapatite xương Vì vậy, phân tích ADN ty thể trở thành công cụ thiếu khoa học y học khoa học điều tra Trong cơng tác giám định pháp y, phân tích dấu vết sinh học khơng rõ nguồn gốc, việc quan trọng cần tiến hành phải xác định mẫu vật có nguồn gốc từ người hay từ động vật khác Đơi việc xác định nguồn gốc lồi mẫu phân tích số trường hợp đóng vai trị định đến khả kết luận vụ việc (như tai nạn giao thông liên quan đến động vật, tai nạn bị động vật công…) Tuy nhiên, mẫu bị cháy, đặc điểm hình thái đặc trưng, dập nát, bị phân hủy để lâu điều kiện không thuận lợi (chẳng hạn mẫu xương lâu năm bị phân hủy chôn điều kiện ngập nước, bị phân hủy tính axit đất, vi khuẩn, ánh sáng, nhiệt độ…) nhiệm vụ nhiều thực phương pháp nhận biết thơng thường Vì vậy, để nhận biết trường hợp việc có phương pháp nhận biết nguồn gốc loài mẫu giám định cách hiệu cần thiết Vì tơi thực đề tài: “Giải trình tự gen ADN ty thể vùng Cytochrome B - Ứng dụng giám định phân biệt ADN ty thể người số động vật” Với mục tiêu chính: - Hồn thiện kỹ thuật khuếch đại ADN ty thể vùng Cytochrome B - Phân tích đặc điểm đa dạng di truyền ADN ty thể vùng Cytochrome B mẫu nghiên cứu từ ứng dụng phân biệt ADN người số động vật B2CB_17 T.C A.AA A A C C TG.TA T TGC G C C A A.A B3CB_17 T.C A.AA A A C C TG.TA T TGC G C C A A.A B4CB_17 T.C A.GA A A C C TG.TA T TGC G C C A A.A B5CB_17 T.C A.AA A A C C TG.TA T TGC G C C A A.A B6CB_17 T.C A.AA A A C C TG.TA T TGC G C C A A.A B7CB_17 T.C A.GA A A C C TG.TA T TGC G C C A A.A B8CB_17 T.C A.AA A A C C TG.TA T TGC G C C A A.A B9CB_17 T.C A.GA A A C C TG.TA T TGC G C C A A.A B10CB_17 T.C A.AA A A C C TG.TA T TGC G C C A A.A Ch1CB_17 T.G A.AG.C A T .G A.G TGC T C C T TA.G Ch2CB_17 T.G A.AG.C A T .G A.G TGC T C C T TA.G Ch3CB_17 T.G A.AG.C A T .G A.G TGC T C C T TA.G Ch4CB_17 T.G A.AG.C A T .G A.G TGC T C C T TA.G Ch5CB_17 T.G A.AG.C A T .G A.G TGC T C C T TA.G L1CB_17 T A.AA A T C G.TA.A TG .C A G.T T A L2CB_17 T A.AA A T C G.TA.A TG .C A G.T T A L3CB_17 T A.AA A T C G.TA.A TG .C A G.T T A L4CB_17 T A.AA A T C G.TA.A TG .C A G.T T A L5CB_17 T A.AA A T C G.TA.A TG .C A G.T T A 90 100 110 120 130 140 150 160 | | | | | | | | | | | | | | | | CYTB Homo sapiens 81 CGCCAATGGCGCCTCAATATTCTTTATCTGCCTCTTCCTACACATCGGGCGAGGCCTATATTACGGATCATTTCTCTACT N1CB_16 81 N2CB_16 81 A N3CB_16 81 N4CB_16 81 N5CB_16 81 N6CB_16 81 N7CB_16 81 A N8CB_16 81 N9CB_16 81 N10CB_16 81 A 45 N11CB_16 81 N12CB_16 81 A N13CB_16 81 N14CB_16 81 N15CB_16 81 A B1CB_17 81 .A C A T G T .T.A.ATA.G G.A A T G T.ACACT.TTC B2CB_17 81 .A C A T G T .T.A.ATA.G G.A A T G T.ACACT.TTC B3CB_17 81 .A C A T G T .T.A.ATA.G G.A A T G T.ACACT.TTC B4CB_17 81 .A C A T G T .T.A.ATA.G G.A A T .T G T.ACACT.TTC B5CB_17 81 .A C A T G T .T.A.ATA.G G.A A T G T.ACACT.TTC B6CB_17 81 .A C A T G T .T.A.ATA.G G.A A T G T.ACACT.TTC B7CB_17 81 .A C A T G T .T.A.ATA.G G.A A T .T G T.ACACT.TTC B8CB_17 81 .A C A T G T .T.A.ATA.G G.A A T G T.ACACT.TTC B9CB_17 81 .A C A T G T .T.A.ATA.G G.A A T .T G T.ACACT.TTC C10CB_17 81 .A C A T G T .T.A.ATA.G G.A A T G T.ACACT.TTC Ch1CB_17 81 .A T C .A TG.A A C.A.G.A.T.A Ch2CB_17 81 .A T C .A TG.A A C.A.G.A.T.A Ch3CB_17 81 .A T C .A TG.A A C.A.G.A.T.A Ch4CB_17 81 .A T C .A TG.A A C.A.G.A.T.A Ch5CB_17 81 .A T C .A TG.A A C.A.G.A.T.A L1CB_17 81 T A C A A C G T A A.C G.A C C C.A.A.A.T.C L2CB_17 81 T A C A A C G T A A.C G.A C C C.A.A.A.T.C L3CB_17 81 T A C A A C G T A A.C G.A C C C.A.A.A.T.C L4CB_17 81 T A C A A C G T A A.C G.A C C C.A.A.A.T.C L5CB_17 81 T A C A A C G T A A.C G.A C C C.A.A.A.T.C 170 180 190 200 210 220 230 240 | | | | | | | | | | | | | | | | CYTB Homo sapiens 161 CAGAAACCTGAAACATCGGCATTATCCTCCTGCTTGCAACTATAGCAACAGCCTTCATAGGCTATGTCCTCCCGTGAGGC N1CB_16 161 N2CB_16 161 N3CB_16 161 N4CB_16 161 46 N5CB_16 161 N6CB_16 161 N7CB_16 161 N8CB_16 161 N9CB_16 161 N10CB_16 161 C N11CB_16 161 G N12CB_16 161 N13CB_16 161 N14CB_16 161 N15CB_16 161 B1CB_17 161 T A T T AG.A T CA GTA C A T A C A A A B2CB_17 161 T A T T AG.A T CA GTA C A T A A A A B3CB_17 161 T A T T AG.A T CA GTA C A T A C A A A B4CB_17 161 T A T AG.A T CA GTA C A A C A A A B5CB_17 161 T A T T AG.A T CA GTA C A T A C A A A B6CB_17 161 T A T T AG.A T CA GTA C A T A C A A A B7CB_17 161 T A T AG.A T CA GTA C A A C A A A B8CB_17 161 T A T T AG.A T CA GTA C A T A C A A A B9CB_17 161 T A T AG.A T CA GTA C A A C A A A B10CB_17 161 T A T T AG.A T CA GTA C A T A C A A A Ch1CB_17 161 T A T A G.A AT.AT.C C C A G A A A A Ch2CB_17 161 T A T A G.A AT.AT.C C C A G A A A A Ch3CB_17 161 T A T A G.A AT.AT.C C C A G A A A A Ch4CB_17 161 T A T A G.A AT.AT.C C C A G A A A A Ch5CB_17 161 T A T A G.A AT.AT.C C C A G A A A A L1CB_17 161 T A T AG.AG A AT A.CGT C G C A L2CB_17 161 T A T AG.AG A AT A.CGT C G C A L3CB_17 161 T A T AG.AG A AT A.CGT C G C A L4CB_17 161 T A T AG.AG A AT A.CGT C G C A L5CB_16 161 T A T AG.AG A AT A.CGT C G C A 47 250 260 270 280 290 300 310 320 | | | | | | | | | | | | | | | | CYTB Homo sapiens 241 CAAATATCATTCTGAGGGGCCACAGTAATTACAAACTTACTATCCGCCATCCCATACATTGGGACAGACCTAGTTCAATG N1CB_16 241 N2CB_16 241 N3CB_16 241 N4CB_16 241 T N5CB_16 241 N6CB_16 241 N7CB_16 241 N8CB_16 241 N9CB_16 241 N10CB_16 241 N11CB_16 241 N12CB_16 241 N13CB_16 241 N14CB_16 241 T N15CB_16 241 B1CB_17 241 A A C C C C.CT A A C C A.TT CG B2CB_17 241 A A C C C C.CT A A C C A.TT CG B3CB_17 241 A A C C C C.CT A A C C A.TT CG B4CB_17 241 A A C C C C.CT A A C C A.TT CG B5CB_17 241 A A C C C C.CT A A C C A.TT CG B6CB_17 241 A A C C C C.CT A A C C A.TT CG B7CB_17 241 A A C C C C.CT A A C C A.TT CG B8CB_17 241 A A C C C C.CT A A C C A.TT CG B9CB_17 241 A A C C C C.CT A A C C A.TT CG B10CB_17 241 A A C C C C.CT A A C C A.TT CG Ch1CB_17 241 T A A T C T TC.T C T T T C A T T AG Ch2CB_17 241 T A A T C T TC.T C T T T C A T T AG Ch3CB_17 241 T A A T C T TC.T C T T T C A T T AG Ch4CB_17 241 T A A T C T TC.T C T T T C A T T AG 48 Ch5CB_17 241 T A A T C T TC.T C T T T C A T T AG L1CB_17 241 A T G C C TC .A T T T C A C AG L2CB_17 241 A T G C C TC .A T T T C A C AG L3CB_17 241 A T G C C TC .A T T T C A C AG L4CB_17 241 A T G C C TC .A T T T C A C AG L5CB_17 241 A T G C C TC .A T T T C A C AG 330 340 350 360 370 380 390 400 | | | | | | | | | | | | | | | | CYTB Homo sapiens 321 AATCTGAGGAGGCTACTCAGTAGACAGTCCCACCCTCACACGATTCTTTACCTTTCACTTCATCTTGCCCTTCATTATTG N1CB_16 321 N2CB_16 321 A N3CB_16 321 N4CB_16 321 N5CB_16 321 N6CB_16 321 N7CB_16 321 A N8CB_16 321 N9CB_16 321 N10CB_16 321 A N11CB_16 321 N12CB_16 321 A N13CB_16 321 N14CB_16 321 N15CB_16 321 A B1CB_17 321 C A.T AAG.A T C CG.T C T T C.T A T C CA B2CB_17 321 C A.T AAG.A T C CG.T C T T C.T A T C CA B3CB_17 321 C A.T AAG.A T C CG.T C T T C.T A T C CA B4CB_17 321 C A.T AAG.A T C CG.T C T T C.T A T C CA B5CB_17 321 C A.T AAG.A T C CG.T C T T C.T A T C CA B6CB_17 321 C A.T AAG.A T C CG.T C T T C.T A T C CA B7CB_17 321 C A.T AAG.A T C CG.T C T T C.T A T C CA B8CB_17 321 C A.T AAG.A T C CG.T C T T C.T A T C CA 49 B9CB_17 321 C A.T AAG.A T C CG.T C T T C.T A T C CA B10CB_17 321 C A.T AAG.A T C CG.T C T T C.T A T C CA Ch1CB_17 321 G C T G AAG.A A G.A C T C.C T C C Ch2CB_17 321 G C T G AAG.A A G.A C T C.C T C C Ch3CB_17 321 G C T G AAG.A A G.A C T C.C T C C Ch04_17 321 G C T G AAG.A A G.A C T C.C T C C Ch5CB_17 321 G C T G AAG.A A G.A C T C.C T C C L1CB_17 321 G TT C C AAG.A .CG T C A C A L2CB_17 321 G TT C C AAG.A .CG T C A C A L3CB_17 321 G TT C C AAG.A .CG T C A C A L4CB_17 321 G TT C C AAG.A .CG T C A C A L5CB_17 321 G TT C C AAG.A .CG T C A C A 410 420 430 440 450 460 470 480 | | | | | | | | | | | | | | | | CYTB Homo sapiens 401 CAGCCCTAGCAACACTCCACCTCCTATTCTTGCACGAAACGGGATCAAACAACCCCCTAGGAATCACCTCCCATTCCGAT N1CB_16 401 G N2CB_16 401 G T N3CB_16 401 G N4CB_16 401 G N5CB_16 401 G N6CB_16 401 G N7CB_16 401 N8CB_16 401 G N9CB_16 401 G A N10CB_16 401 G G .A N11CB_16 401 G N12CB_16 401 G N13CB_16 401 G N14CB_16 401 G N15CB_16 401 G B1CB_17 401 T AA.T C.T.G .A C.C A C C AAC TT AG.CGTA C B2CB_17 401 T AA.T C.T.G .A C.C A C C AAC TT AG.CGTA C 50 B3CB_17 401 T AA.T C.T.G .A C.C A C C AAC TT AG.CGTA C B4CB_17 401 T AA.T C.T.G .AT C.C A C C T AAC .T AG.CGTA C B5CB_17 401 T AA.T C.T.G .A C.C A C C AAC TT AG.CGTA C B6CB_17 401 T AA.T C.T.G .A C.C A C C AAC TT AG.CGTA C B7CB_17 401 T AA.T C.T.G .AT C.C A C C T AAC .T AG.CGTA C B8CB_17 401 T AA.T C.T.G .A C.C A C C AAC TT AG.CGTA C B9CB_17 401 T AA.T C.T.G .AT C.C A C C T AAC .T AG.CGTA C B10CB_17 401 T AA.T C.T.G .A C.C A C C AAC TT AG.CGTA C Ch1CB_17 401 T .T.G.A TC.A C C TTC .A AG.C A C Ch2CB_17 401 T .T.G.A TC.A C C TTC .A AG.C A C Ch3CB_17 401 T .T.G.A TC.A C C TTC .A AG.C A C Ch04_17 401 T .T.G.A TC.A C C TTC .A AG.C A C Ch5CB_17 401 T .T.G.A TC.A C C TTC .A AG.C A C L1CB_17 401 C C G.CG.A T .C C C TACC T.A AG.CATA C L2CB_17 401 C C G.CG.A T .C C C TACC T.A AG.CATA C L3CB_17 401 C C G.CG.A T .C C C TACC T.A AG.CATA C L4CB_17 401 C C G.CG.A T .C C C TACC T.A AG.CATA C L5CB_17 401 C C G.CG.A T .C C C TACC T.A AG.CATA C 490 500 510 520 530 540 550 560 | | | | | | | | | | | | | | | | CYTB Homo sapiens 481 AAAATCACCTTCCACCCTTACTACACAATCAAAGACGCCCTCGGCTTACTTCTCTTCCTTCTCTCCTTAATGACATTAAC N1CB_16 481 C N2CB_16 481 N3CB_16 481 N4CB_16 481 N5CB_16 481 N6CB_16 481 N7CB_16 481 N8CB_16 481 C N9CB_16 481 N10CB_16 481 A N11CB_16 481 51 N12CB_16 481 N13CB_16 481 N14CB_16 481 N15CB_16 481 B1CB_17 481 C.A C T C T G AT.T.A GGCC CT.AC.AA AG.TC ACT.C GT B2CB_17 481 C.A C T C T G AT.T.A GGCC CT.AC.AA AG.TC ACT.C GT B3CB_1 481 C.A C T C T G AT.T.A GGCC CT.AC.AA AG.TC ACT.C GT B4CB_17 481 C.A C T C T G AT.T.A GGCC CT.AC.AA AG.TC ACT.C GT B5CB_17 481 C.A C T C T G AT.T.A GGCC CT.AC.AA AG.TC ACT.C GT B6CB_17 481 C.A C T C T G AT.T.A GGCC CT.AC.AA AG.TC ACT.C GT B7CB_17 481 C.A C T C T G AT.T.A GGCC CT.AC.AA AG.TC ACT.C GT B8CB_17 481 C.A C T C T G AT.T.A GGCC CT.AC.AA AG.TC ACT.C GT B9CB_17 481 C.A C T C T G AT.T.A GGCC CT.AC.AA AG.TC ACT.C GT B10CB_17 481 C.A C T C T G AT.T.A GGCC CT.AC.AA AG.TC ACT.C GT Ch1CB_17 481 .TC.A T G TAT A AGCCT.A C.A C AAT.C AT C GT Ch2CB_17 481 .TC.A T G TAT A AGCCT.A C.A C AAT.C AT C GT Ch3CB_17 481 .TC.A T G TAT A AGCCT.A C.A C AAT.C AT C GT Ch04_17 481 .TC.A T G TAT A AGCCT.A C.A C AAT.C AT C GT Ch5CB_17 481 .TC.A T G TAT A AGCCT.A C.A C AAT.C AT C GT L1CB_17 481 .TC.A T A T T ATT A GGCCT.AT.TA.AA.A AAT.C C.A.TCC.TGT L2CB_17 481 .TC.A T A T T ATT A GGCCT.AT.TA.AA.A AAT.C C.A.TCC.TGT L3CB_17 481 .TC.A T A T T ATT A GGCCT.AT.TA.AA.A AAT.C C.A.TCC.TGT L4CB_17 481 .TC.A T A T T ATT A GGCCT.AT.TA.AA.A AAT.C C.A.TCC.TGT L5CB_17 481 .TC.A T A T T ATT A GGCCT.AT.TA.AA.A AAT.C C.A.TCC.TGT 570 580 590 600 | | | | | | | | CYTB Homo sapiens 561 ACTATTCTCACCAGACCTCCTAGGCGACCCAGACAATTATACCC N1CB_16 561 N2CB_16 561 N3CB_16 561 N4CB_16 561 T N5CB_16 561 52 N6CB_16 561 N7CB_16 561 N8CB_16 561 N9CB_16 561 N10CB_16 561 N11CB_16 561 N12CB_16 561 C N13CB_16 561 N14CB_16 561 N15CB_16 561 B1CB_17 561 .G C C A T C C B2CB_17 561 .G C C A T C C B3CB_17 561 .G C C A T C C B4CB_17 561 .G C C A T C C B5CB_17 561 .G C C A T C C B6CB_17 561 .G C C A T C C B7CB_17 561 .G C C A T C C B8CB_17 561 .G C C A T C C B9CB_17 561 .G C C A T C C B10CB_17 561 .G C C A T C C Ch1CB_17 561 TT T T AT A T C C Ch2CB_17 561 TT T T AT A T C C Ch3CB_17 561 TT T T AT A T C C Ch04_17 561 TT T T AT A T C C Ch5CB_17 561 TT T T AT A T C C L1CB_17 561 A A C C L2CB_17 561 A A C C L3CB_17 561 A A C C L4CB_17 561 A A C C L5CB_17 561 A A C C Hình 15: So sánh trình tự nucleotid từ bị, chó, lợn nghiên cứu với trình tự nucleotid người (Homo sapiens JN034136.1) 53 Ghi : dòng trình tự nucleotide chuẩn lồi người lưu Genbank Các dịng kí hiệu từ trình tự gen Cytb 15 mẫu người, 10 mẫu bị, chó, mẫu lợn nghiên cứu Dấu (.) biểu thị giống nucleotide; sai khác nucleotide so với trình tự chuẩn kí hiệu chữ ký hiệu nucleotide Tỉ lệ phần trăm trình tự đa hình mẫu người với bị, chó, lợn đạt kết sau : Mẫu Mẫu so sánh Tỉ lệ phần trăm trình tự nucleotid đa hình (%) Bị 29,14% Chó 24,17% Lợn 25,17% Người Bảng 9: Tỉ lệ phần trăm trình tự đa hình mẫu người với bị, chó, lợn Trong lồi đa hình khơng cao (0,49% - 2,15% bảng 8), so sánh loài với cho thấy tỷ lệ đa hình cao (24% - 30% bảng 9) Sau so sánh trình tự người với bị, chó, lợn kết cho thấy tỷ lệ phần trăm trình tự đa hình 29,14%; 24,17% 25,17% Các tỉ lệ nằm khoảng từ 5,97% đến 34,83%, hoàn toàn tương ứng với nghiên cứu Hsing-Mei Hsieh [17] cộng loài khác có tỉ lệ phần trăm trình tự đa hình từ 5,97% đến 34,83% Qua bảng cho thấy tỷ lệ đa hình gen Cytb lồi lớn, đủ độ tin cậy để dùng gen Cytb làm thị phân biệt loài với 54 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ Kết luận Qua nghiên cứu trình tự gen Cytb người số động vật đến kết luận sau: Đã hoàn thiện kỹ thuật khuếch đại giải trình tự ADN gen Cytb genome ty thể người, bị, chó lợn Đã phân tích trình tự ADN vùng Cytb nhằm kết luận trường hợp giám định ADN phân biệt người số động vật Kiến nghị Qua nghiên cứu tôi: Tiếp tục nghiên cứu với số lượng mẫu lớn để thu số lượng trình tự gen Cytb đa hình đầy đủ Tiếp tục thực nghiên cứu vùng gen Cytb nhiều loài động vật khác để có liệu phân biệt người động vật đầy đủ 55 TÀI LIỆU THAM KHẢO A - Tiếng Việt Nguyễn Anh, Nguyễn Duy Huy, Đỗ Văn Thu, Nguyễn Bích Nga, Lê Thanh Hịa (2007) Nghiên cứu xác định trình tự gen mã hóa Cytochrome B hệ gen ty thể đánh giá mối quan hệ di truyền số loài cá song (Epinephelus Spp) nuôi thả vùng biển Việt Nam Tạp chí Cơng nghệ Sinh học 5(2): 171 -178, 2007 Nguyễn Mạnh Hà, Vũ Thị Hương Giang (2013) nghiên cứu khả sinh trưởng đa hình gen Cytochrome B gà Bị gà Mía phục vụ cho cơng tác bảo tồn giống Tạp chí Khoa học Công nghệ 107(07): 11, 2013 Nguyễn Minh Tâm, Nguyễn Thị Phương Trang, Nguyễn Xuân Đặng (2008) Trình tự Cytochrome Sao la (Pseudoryx Nghetinhensis) Tạp chí Cơng nghệ sinh học 6(2): 161 - 167, 2008 Hồ Huỳnh Thùy Dương 2002 Sinh học phân tử Nhà xuất Giáo dục Nguyễn Như Hiền 2014 Giáo trình sinh học tế bào Nhà xuất Giáo dục Việt Nam Quy trình giám định ADN Thơng tư số 47/2013 ngày 31/12/2013 Bộ Y tế ban hành Quy trình giám định pháp y B – Tiếng Anh H Afonso Costa et al (2010) Species identification from genetic materialwith cytochrome b Imprensa da Universidade de Coimbra; International Academy of LegalMedicine Anderson, S., Bankier, A T., Barrell, B G., de Bruijn, M H L., Coulson, A R., Drouin, J., Eperon, I C., Nierlich, D P., Roe, B A., Sanger, F., Schreier, P H., Smith, A J H., Staden, R., and Young, I G (1981), “ Sequence and organization of the human mitochondrial genome ”, Nature 290: 457–465 56 Anderson, et al 1981 “Sequence and Organization of the Human Mitochondrial Genome.” Nature 290 (5806): 457–65 10 Andrews, et al 1999 “Reanalysis and Revision of the Cambridge Reference Sequence for Human Mitochondrial DNA.” Nature Genetics 23 (2): 147 doi:10.1038/13779 11 Applied Biosystems 2007 BigDye XTerminatior Purification Kit 12 Applied Biosystems 2010 BigDye Terminator v3.1 Cycle Sequencing Kit 13 Bellagamba F., Valfre F., Panseri S., & Moretti V M., (2003) Polymerase chain reaction-based analysis to detect terrestrial animal protein in fish meal Journal of Food Protection 66(4): 682 - 685 11 14 L Cainé., G Lima., L Pontes., D Abrantes., M Pereira., M.F Pinheiro (2006) Species identification by cytochrome b gene: Casework samples International Congress Series Volume 1288, Pages 145 - 147 15 Holland MM., Fisher DL., Mitchell LG., Rodriquez WC., Canik JJ., Merril CR, Weedn VW (1993) Mitochondrial DNA sequence analysis of human skeletal remains: identification of remains from the Vietnam War J Forensic Sci 38(3):542 - 53 16 Hsieh HM, Chiang HL., Tsai LC., Lai SY., Huang NE., Linacre A., Lee JC (2001) Cytochrome b gene for species identification of the conservation animals Forensic Sci Int: 122(1):7-18 17 Irwin D.M., Kocher T.D., Wilson A.C., 1991 Evolution of the cytochrome b gene of mammals Journal of Molecular Evolution 32: 128-44 18 Kocher T D., Thomas W K., Meyer A., Edwards S V., Paabo S., Villablanca F X., et al., 1989 Dynamics of mitochondrial DNA evolution in animals: amplification and sequencing of conserved primers Proceedings of the National Academy Sciences of the United States of America 86: 6196-200 57 19 Lee, et al 2012 “Agarose Gel Electrophoresis for the Separation of DNA Fragments.” Journal of Visualized Experiments: JoVE, no 62 doi:10.3791/ 3923 20 Malgorzata N., Ewa S Beata (2010) Use of Cytochrome b Polymorphism for Species Identification of BiologicalMaterial Derived from Cattle, Sheep, Goats, Roe Deer and Red Deer Folia biologica (Kraków), vol 58, No 1-2 21 Matsuda H., Seo Y., Kakizaki E., Kozawa S., Muraoka E., Yukawa N (2005) Identification of DNA of human origin based on amplification of human-specific mitochondrial cytochrome b region Forensic Sci Int 2005 Sep 10;152(2-3):109-14 22 Matsunaga T., Chikuni K., Tanabe R., Muroya S., Shibata K., Yamad J., Shinmura Y., (1999) A quick and simple method for the identification of meat species cow meat product by PCR assay Meat Science 51: 143-148 23 Maede, D (2006) A strategy for molecular species detection in meat and meat products by PCR-RFLP and DNA sequencing using mitochondrial and chromosomal genetic sequences European Food Research and Technology 224(2): 209–217 24 Nakaki S., Hino D., Miyoshi M., Nakayama H., Moriyoshi H., Morikawa T., Itohara K (2007) Study of animal species (human, dog and cat) identification using a multiplex single-base primer extension reaction in the cytochrome b gene Forensic Sci Int.;173(2-3):97-102 25 W Parson., K Pegoraro., H Niederstätter., M Föger., M Steinlechner (2000) Species identification by means of the cytochrome b gene International Journal of Legal Medicine, Volume 114, Issue 1, pp 23-28 58 26 Pascoal A., Prado M., Calo P., Cepeda A., & Barros-Velazquez J., (2005) Detection of bovine DNA in raw and heat-processed foodstuffs, commercial foods and specific risk materials by a novel specific polymerase chain reaction method European Food Research and Technology 220(3–4): 444–450 27 Promega, Corp 1996 GenePrintTM STR Systems Technical Manual (Silver Stain Detection) 28 Promega 2010 “Wizard(R) SV Gel and PCR Clean-Up System Protocol.” 29 Raju Panday., Dinesh K Jha., Nirajan Thapa., Basant R Pokharel and Nanda K Aryal (2014) Forensic Identification Wildlife Parts and their Product and Individualization Using DNA Barcoding The Open Forensic Science Journal 7, 6-13 30 Rob Ogden., Nick Dawnay., Ross McEwing (2009) Wildlife DNA forensics -bridging the gapbetween conservation genetics and lawEnforcement Endang Species Res 9: 179 -195 31 Sullivan KM., Hopgood R., Gill P (1992) Identification of human remains by amplification and automated sequencing of mitochondrial DNA Int J Legal Med;105(2):83-6 32 Tomáš Minarovič., Anna Trakovická., Alica Rafayová., Zuzana Lieskovská (2010) Animal Species Identification by PCR - RFLP of Cytochrome b Scientific Papers: Animal Science and Biotechnologies 43 (1) 33 Wilson MR., Polanskey D., Butler J., DiZinno JA., Replogle J., Budowle B (1995) Extraction, PCR amplification and sequencing of mitochondrial DNA from human hair shafts Biotechniques.18(4):662-9 59 ... nghiên cứu gen cịn hạn chế người, số lồi động vật b? ??, chó, lợn Chính đề tài chủ yếu nghiên cứu giải trình tự gen ADN ty thể vùng Cytb từ ứng dụng giám định phân biệt ADN ty thể người số động vật 14... -o0o - KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP Đề tài: GIẢI TRÌNH TỰ GEN ADN TY THỂ VÙNG CYTOCHROME B - ỨNG DỤNG TRONG GIÁM ĐỊNH PHÂN BIỆT ADN TY THỂ NGƯỜI VÀ MỘT SỐ ĐỘNG VẬT Giáo viên hướng dẫn : ThS Hà Hữu Hảo... sánh ADN ty thể vùng Cytb người số động vật 3.4.1.Kết so sánh trình tự gen Cytb mẫu nghiên cứu so với trình tự tham khảo Genbank Trình tự ADN thu mẫu người, b? ??, chó, lợn xác định máy giải trình tự