Tuthienbao com thuong tieu luan cnsh 2763

CÔNG NGHỆ SINH HỌC Tuthienbao.com Đề Tài : Tế Bào Gốc - Tế Bào Mầm Người Hướng Dẫn : Pgs Ts Nguyễn Bá Lộc Người Thực Hiện : Phạm Văn Thương KXX – Động Vật Học Huế, tháng - 2012 MỤC LỤC I.tổng quan tế bào gốc 1.1 khái niêm tế bào gốc 1.2 lược sử hình thành 1.3 phân loại tế bào gốc II.một số ứng dụng tế bào gốc 2.1 Ghép tế bào gốc trị liệu (stem cell therapy): .8 2.2 Công nghệ mô (tissue engineering) 2.3 Các ứng dụng tế bào gốc phôi không liên quan đến ghép 10 2.4 Tế bào gốc tạo máu 11 2.5 Các nguồn lấy tế bào gốc tạo máu: 12 2.6 Các ứng dụng lâm sàng tế bào gốc tạo máu .12 2.7 Điều trị bệnh lý quan khác (nhồi máu tim, Parkinson…) .13 III ni cấy biệt hóa tế bào gốc 13 Thành phần môi trường 13 Kỹ thuật nuôi cấy .13 Một số quy trình thu nhận ni cấy biệt hóa tế bào gốc 15 3.1 Thu nhận nuôi cấy tế bào gốc từ tủy xương chuột .15 3.2 Quy trình thu nhận tế bào gốc từ máu cuống rốn .16 3.3 Nghiên cứu ni cấy, biệt hóa tế bào gốc sinh tinh từ bệnh nhân azoospermia 16 3.4 Thu nhận biệt hóa tế bào gốc trung mô từ cuống dốn người 20 3.5 Giai đoạn 2, nuôi cấy thứ cấp: cấy chuyền tăng sinh MSC .21 3.6.Biệt hoá MSC .21 3.7 Biệt hóa MSC thành tế bào tạo mỡ (adipocyte) 21 3.8 Biệt hoá MSC thành nguyên bào xương (Osteoblast) 22 IV kết luận 22 Tài liệu tham khảo: 23 I.tổng quan tế bào gốc 1.1 khái niêm tế bào gốc Tế bào gốc tế bào có khả phát triển thành nhiều loại tế bào khác thể Là công cụ "hệ thống sửa chữa" thể, đưa vào phận khác nhau, tế bào gốc phân chia khơng giới hạn để lấp đầy thiếu hụt tế bào phận chừng thể sống Tế bào gốc trở thành tế bào cơ, hồng huyết cầu, tế bào não Tế bào gốc có đặc điểm quan trọng tạo nên khác biệt với loại tế bào khác Thứ nhất, tế bào gốc loại tế bào khơng chun dụng nên tự tái tạo thời gian dài nhờ q trình phân chia Thứ hai, mơi trường sinh lý thí nghiệm định, tế bào gốc biến đổi trở thành tế bào chuyên dụng tế bào gây đập tim tế bào sản sinh insulin tuyến tụy 1.2 lược sử hình thành Các tế bào gốc tìm thấy thể sinh vật sống Những tế bào làm phát sinh tế bào mà nhiều người khác phân biệt thành loại tế bào đặc biệt Năm 1960, Ernest A McCulloch James E Till cho thấy hai loại tế bào gốc động vật có vú Tế bào gốc phôi tách từ khối tế bào blastocysts, tế bào gốc người lớn tìm thấy mơ dành cho người lớn Trong phôi thai phát triển, tế bào gốc, thừa kế, biệt hóa thành mơ phơi thai Trong người lớn tế bào gốc giúp sửa chữa phận thể bên cạnh tiền thân Vai trò tế bào gốc người lớn để sản xuất hệ thống sửa chữa, bổ sung tế bào đặc biệt trì suất quan tái sinh tự nhiên Các tế bào gốc trưởng thành thay đổi thành tế bào chuyên giúp cho việc tạo tế bào bắp khác mô thần kinh Tủy xương máu dây rốn sử dụng liệu pháp tế bào gốc người lớn đàn hồi Trong năm 1800, chuyên gia y tế đến để biết số tế bào tạo tế bào khác năm 1900, chứng minh tế bào gốc tạo tế bào máu, Các chuyên gia cấy ghép tủy xương vào bệnh nhân có bệnh bạch cầu Mặc dù, khơng thành cơng thúc đẩy chun gia để thực cấy ghép thành công tủy xương người Nó thực Pháp vào năm 1950 Jean Dausset nói protein bề mặt tế bào bạch cầu kháng nguyên HLA Với trợ giúp kháng nguyên HLA, hệ thống miễn dịch xác định tình trạng lành mạnh tế bào đồ đạc họ Trong thập niên 1960, cấy ghép tế bào thực anh chị em ruột Sau này, quốc gia Organ Transplant Act năm 1984 quốc gia tài trợ Chương trình tủy thực Hơn 16.000 cấy ghép thực thời gian này, tìm thấy chữa bệnh immunodeficiencies, dể băng huyết bệnh bạch cầu ung thư máu Tuy nhiên, nhiều câu hỏi nâng lên tế bào gốc, đặc biệt ưu nhược điểm họ Các tế bào gốc tế bào không chuyên mà làm phát sinh tế bào nhiều chuyên ngành Những tế bào từ phôi thai thai nhi coi tốt chúng làm tăng mức độ thành công so với tế bào gốc lấy từ trẻ em người lớn Tuy nhiên, tế bào gốc người lớn nhận từ tủy xương Những tế bào gốc cấy ghép vào bệnh nhân tạo thuận lợi cho sản xuất loại tế bào máu Nó xem tốt trường hợp bệnh bạch cầu, loại ung thư hạch lựa chọn, thiếu máu Aplastic, thalassemia, thiếu máu tế bào hình liềm, rối loạn chuyển hóa bẩm sinh định suy giảm miễn dịch bệnh granulomatous mãn tính Người có tủy xương có lỗi lý cấy ghép với tế bào gốc Nó hữu ích điều trị bệnh Parkinson Alzheimer Các tế bào gốc người sử dụng, gọi cấy ghép autologus tế bào gốc lấy từ người khác, gọi cấy ghép allogeneic Trong autologus, tế bào gốc thu thập trước hóa trị liệu điều trị thiệt hại tế bào Sau điều trị, họ lại tiêm vào thể Trong trường hợp cấy ghép tủy xương, nhà tài trợ tiêm tủy gây mê sau lấy từ xương hơng với giúp đỡ ống tiêm Quá trình gần Trong allogenic, tế bào gốc thu từ máu Người tặng cho loại thuốc mà tế bào gốc vào mạch máu sau với giúp đỡ ống thông máu lấy khỏi cánh tay Những tế bào gốc chiết xuất sau tiêm vào tĩnh mạch người nhận họ giúp đỡ nhân tế bào máu Nó khoảng 2-4 sáu phiên trình 1-2 tuần Tuy nhiên, tế bào gốc bảo quản đông lạnh để sử dụng sau Cấy ghép tế bào gốc nguy hiểm từ điểm nhìn nhiễm trùng Các vấn đề tham nhũng-so-host bệnh tế bào thu cơng tế bào bệnh nhân tồn Tuy nhiên, tránh đến mức độ cách trì vệ sinh xung quanh bệnh nhân Bệnh nhân chủ yếu lại bệnh viện khoảng 1-2 tháng Sau nhận thải ra, họ nên đến bác sĩ cho kiểm tra thường xuyên Thống kê cấy ghép tế bào gốc cho thấy tám triệu người toàn cầu bốn triệu người Mỹ đăng ký thân nhà tài trợ cho tế bào gốc 1.3 phân loại tế bào gốc Chúng ta phân loại gọi tên “tế bào gốc”theo số cách sau a Theo tiềm biệt hóa: - Tế bào tồn năng(totipotent cell):hợp tử, hay Blastomere Là tế bào có khả phân chia biệt hoá thành tất tể bào thể, có khả biệt hố thành thể hồn chỉnh Vd: -Một cành phát triển thành hoán chỉnh -Ở người,Tinh trùng thụ tinh với trứng tạo thành totipotent cell(hợp tử),vài đầu sau thụ tinh , tế bào phân chia tạo thành totipotent giống hệt _ Tế bào Vạn năng(Pluripotent cell): khối tế bào bên Blastocyst Là tể bào có khả bịêt hố thành tẩt tể bào ngoại trừ tế bào phôi _ Tế bào đa (multipotent): Tế bào gốc tạo máu Tương tự tế bào Vạn năng, thật khó có chế xác phân biểt hai loại tế bào _ Ngồi có số tế bào gốc vài , đơn vd : tế bào gốc tuỷ xương tạo loại tế bào máu Cơ chất dưỡng bào( Mast cell precursor) bịêt hoá cho dưỡng bào b Theo nguồn gốc : _ Tế bào gốc phôi( Embryonic stem cell): thu nhận từ phôi giai đọan blastocyst Chúng khối tế bào bên Blastocyst gọi lớp sinh khối bên trong(ICM_Inner mass cell) Nó tương ứng với tế bào vạn theo cách phân loại( 1) _ Tế bào mầm(Embryonic germ cell): Là tế baò gốc thu nhận từ rãnh sinh dục, vị trí tiển thân quan sinh dục sau này, tế bào chứng minh vạn _ Tế bào khối u(Embryonic carcinomas): Được thu nhận từ khối u tinh hoàn buồng trứng chuột, tế bào nuôi cấy tế bào gốc phôi _ Tế bào gốc trưởng thành : chung loại tế bào chưa chuyên hoá, tìm thấy mơ thể trưởng thành, tự đổi biệt hố thành tế bào chuyên biệt từ nguồn gốc Những tế bào loại đặt tên theo nơi diện: tế bào gốc tuỷ xương, tế bào gốc biểu bì,… c Theo kiểu biệt hố: Vd: tế bào gốc tim tế bào biệt hoá thành tế bào tim, tế bào gốc xương tế bào biệt hoá thành tế bào xương,… Nhưng có số tác giả cho cách gọi tên khơng thật hợp lí tế bào trên( theo họ) tế bào tiền thân( progeneotor cell) hay chất( pecuor cell) không phảỉ tế bào gốc thực thụ Nhưng theo cách phân loại theo tiềm biệt hóa ta xem tế bào tế bào gốc năng(unipotent cell) Vậy thật tế bào mầm loại tế bào gốc , xét tiềm biệt hố khơng khác tế bào gốc phôi(đều pluripotent cell)  Phân biệt tế bào mầm (Embryonic germ cells) tế bào gốc (Embryonic stem cells) Tế bào mầm loại tế bào gốc, xét tiềm biệt hố khơng khác tế bào gốc phơi (đều tế bào gốc đa (Pluripotent cells) Tế bào mầm (Germ Cells) khái niệm để tế bào thuộc dòng sinh dục (Germline) Tế bào gốc phơi (Embryonic stem cells) tế bào mầm phơi (Embryonic germ cells) khác nơi thu nhận kiểu tế bào biệt hoá Thứ nhất, nơi thu nhận, tế bào gốc phôi thu nhận phôi từ giai đoạn phơi nang (blastocyst) trở trước tế bào mầm phôi thu nhận từ rãnh sinh dục phôi (genital ridge) Thứ hai, kiểu tế bào biệt hóa tế bào gốc phơi biệt hóa thành lớp phơi (germ layers) biệt hóa thành 200 loại tế bào thể trừ tế bào thai cuống rốn Còn tế bào mầm phơi biệt hóa thành tế bào sinh dục II.một số ứng dụng tế bào gốc 2.1 Ghép tế bào gốc trị liệu (stem cell therapy): Là dùng tế bào gốc để thay thế, sửa chữa phần thể bị bệnh tổn thương tế bào khỏe mạnh Kỹ thuật gọi kỹ thuật ghép tế bào trị liệu (cell transplantation therapy) hay kỹ thuật thay tế bào trị liệu (cell replacement therapy) 2.1.1 Quy trình ứng dụng tế bào gốc trị liệu bao gồm khâu sau: - Sản xuất dòng tế bào gốc:  Thu tế bào gốc: từ phôi từ tổ chức trưởng thành  Nuôi cấy tế bào gốc labo nhằm nhân lên mặt số lượng - Với tế bào gốc phôi, cần nuôi cấy nhân tạo điều kiện mơi trường lý hóa thích hợp để định hướng biệt hóa thành tế bào mong muốn - Ghép tế bào gốc, đưa tế bào gốc vào khu vực tổn thương cần sửa chữa 2.1.2 Ứng dụng tế bào gốc trưởng thành điều trị: Trên lâm sàng, tế bào gốc trưởng thành sử dụng điều trị bệnh tự miễn, tai biến mạch máu não, suy giảm miễn dịch, thiếu máu, nhiễm Estein-barr virus, tổn thương giác mạc, bệnh máu bệnh gan, tạo xương khơng hồn chỉnh, tổn thương tủy sống, liền vết thương da, điều trị ung thư (kết hợp với hóa chất tia xạ), u não, u nguyên bào võng mạc, ung thư buồng trứng, khối u đặc, ung thư tinh hoàn, đa u tủy, lơ-xê-mi, ung thư vú, u nguyên bào thần kinh, u lympho Non-Hodgkin, carcinoma tế bào thận, tái tạo tim sau đau tim, đái đường type I, tổn thương xương sụn, bệnh Parki 2.1.3 Ứng dụng tế bào gốc phơi điều trị Tuy có nhiều triển vọng, tế bào gốc phôi chưa dùng tế bào gốc trị liệu người Các bệnh điều trị ghép tế bào có nguồn gốc từ tế bào gốc phôi người bao gồm bệnh Parkinson, đái đường, chấn thương tủy sống, suy tim… Vấn đề điều trị cho bệnh yêu cầu tế bào gốc phôi phải định hướng biệt hóa thành chủng loại tế bào đặc thù trước ghép Một ưu điểm dùng tế bào gốc phôi so với tế bào gốc trưởng thành tế bào gốc phơi có khả tăng sinh khơng giới hạn in vitro có khả sinh nhiều chủng loại tế bào định hướng biệt hóa Ưu tăng lên q trình ghép tế bào/mơ, tế bào gốc phơi khơng gây kích hoạt q trình thải ghép miễn dịch Có thể tránh tính sinh miễn dịch tế bào phát triển từ tế bào gốc phôi người chuyển gen thể nhận vào tế bào gốc phôi làm cho chúng mang phân tử kháng nguyên hòa hợp tổ chức (MHC) lớp I thể nhận, kỹ thuật chuyển nhân để tạo tế bào gốc phôi đồng gen với người nhận mô ghép Nhược điểm dùng tế bào gốc phôi cho ghép trị liệu dễ hình thành khối u teratoma Điều làm cho tế bào gốc phôi chưa sử dụng ghép tế bào gốc trị liệu lâm sàng Hiện có số phương pháp nhằm loại bỏ tế bào gốc phơi khơng biệt hóa trước ghép cho phép tránh việc hình thành khối u teratoma thể nhận 2.2 Cơng nghệ mơ (tissue engineering) Có thể coi cơng nghệ mô ứng dụng tế bào gốc trị liệu Các tiến gần nghiên cứu công nghệ mơ tế bào gốc cho thấy thiết lập tế bào thành cấu trúc không gian ba chiều dùng để sửa chữa mô tổn thương Sửa chữa tổ chức cơng nghệ mơ thực cách nuôi cấy tế bào gốc sau ghép vào mơ tổn thương Trong cơng nghệ mơ sử dụng tế bào gốc trưởng thành để phát triển thành mơ ghép dùng tế bào gốc phôi tạo kỹ thuật nhân phơi vơ tính để sản xuất mơ ghép phù hợp mặt miễn dịch (sơ đồ B) Một hướng khác có khả tạo mơ ghép phù hợp với bệnh nhân từ nguồn tế bào gốc phơi dùng kỹ thuật chỉnh sửa gen mã hóa phân tử hòa hợp tổ chức (MHC) (sơ đồ A) 2.3 Các ứng dụng tế bào gốc phôi không liên quan đến ghép: Các ứng dụng không liên quan đến ghép chủ yếu thực tế bào gốc phơi Có thể kể đến số ứng dụng sau: - Nghiên cứu kiện sớm xảy q trình phát triển phơi thai người nguyên nhân gây sinh trẻ dị tật bẩm sinh bất thường thai dẫn đến sảy thai - Khám phá ảnh hưởng bất thường chrosome giai đoạn sớm trình phát triển Ảnh hưởng hình thành sớm khối u trẻ em mà qua nghiên cứu người ta thấy tế bào khối u chủ yếu có nguồn gốc từ phơi - Thử nghiệm thuốc điều trị Hiện trước thử thuốc người tình nguyện, thuốc phải qua thử nghiệm tiền lâm sàng Trong thử nghiệm tiền lâm sàng có sàng lọc thuốc mơ hình động vật – ví dụ thử nghiệm in vitro có dùng tế bào chuột, thử nghiệm in vivo liên quan đến việc đánh giá độc tính cấp độc tính bán trường diễn thuốc Mặc dù nghiên cứu dược lấy phương pháp thử nghiệm mơ hình động vật làm bản, biện pháp lúc cho phép đốn xác tác dụng có thuốc tế bào người Vì lý việc nuôi cấy tế bào người thường sử dụng thử nghiệm tiền lâm sàng Các dòng tế bào người thường trì in vitro thời gian dài thường mang đặc tính biệt hóa tế bào thể Các khác biệt gây khó khăn việc đoán tác dụng thuốc thể dựa đáp ứng dòng tế bào người in vitro Chính tế bào gốc phơi định hướng biệt hóa thành loại tế bào đặc thù cho sàng lọc thuốc, tế bào đặc thù có lẽ mơ tốt đáp ứng tế bào/mô thể với thuốc cung cấp mơ hình sàng lọc thuốc an toàn, kinh tế hiệu - Sàng lọc chất có khả gây độc Lý sử dụng tế bào gốc phôi người sàng lọc độc chất giống lý dùng chúng vào việc thử thuốc nêu Độc chất thường có tác dụng khác lồi động vật khác nhau, điều nói lên tầm quan trọng cần có mơ hình in vitro phù hợp cho đánh giá tác dụng độc chất tế bào người - Nghiên cứu phương pháp công nghệ gen (genetic engineering) Hiện việc chỉnh sửa gen cho tế bào gốc phôi chuột in vitro thực cách dễ dàng nhờ kỹ thuật kỹ thuật tái tổ hợp gen Đây phương pháp thay thêm đoạn gen, cách phân tử DNA mong muốn đưa vào gen sau đặc tính biểu Dùng phương pháp đưa vào dòng tế bào gốc phơi gen định hướng tế bào gốc phơi biệt hóa thành tế bào đặc thù gen giúp cho 10 tế bào bộc lộ sản phẩm protein mong muốn Về bản, kỹ thuật phát triển với tế bào gốc phơi người, có lẽ cách mạng cơng nghệ gen tế bào gốc trị liệu 2.4 Tế bào gốc tạo máu Tế bào gốc tạo máu xếp vào loại tế bào gốc trưởng thành Đây tế bào tách từ máu tủy xương, chúng có khả tự tái tạo (self renew), biệt hóa thành tế bào đặc thù, di chuyển từ tủy xương vào máu, trải qua trình apoptosis để loại bỏ tế bào không cần thiết Các nghiên cứu tế bào gốc tạo máu nở rộ vào năm 1960 Trong thời gian nghiên cứu thực nghiệm cho thấy có hai loại tế bào gốc tạo máu Hai loại thực chất hai giai đoạn biệt hóa khác tế bào gốc tạo máu: - Các tế bào gốc tạo máu dài hạn (long-term hematopoietic stem cells): tế bào gốc tạo máu biệt hóa hơn, nói cách khác “non” hơn, có khả tự tái tạo tính đa cao Trên thực nghiệm tế bào khơi phục hồn tồn chức tạo máu chuột bị chiếu xạ liều chí tử sau vài tháng Một ví dụ tế bào gốc tạo máu dài hạn tế bào gốc tạo máu mang CD34+, tế bào biệt hóa thành tất chủng loại tế bào máu khác Trong điều kiện bình thường, tế bào gốc tạo máu dài hạn có khả tự tái tạo suốt đời sống cá thể Hiện thuật ngữ “tế bào gốc tạo máu” thường dùng để đề cập tới loại tế bào gốc tạo máu dài hạn - Các tế bào định hướng/tiền thân ngắn hạn (short-term progenitor or precursor cell): tế bào tạo máu trưởng thành, không mang CD34, tiền thân tế bào biệt hóa đầy đủ loại dòng tế bào máu, ví dụ tế bào định hướng dòng hồng cầu, tế bào định hướng dòng lympho, mẫu tiểu cầu… Các tế bào định hướng/tiền thân ngắn hạn có khả tăng sinh, biệt hóa thành tế bào máu so với tế bào gốc tạo máu dài hạn chúng có giới hạn tính đa Ví dụ tế bào tiền thân hồng cầu có lẽ tạo thành tế bào hồng cầu 11 2.5 Các nguồn lấy tế bào gốc tạo máu: Tủy xương: Là nguồn truyền thống để lấy tế bào gốc tạo máu Người hiến tế bào gốc gây mê, chọc hút tủy xương vùng xương chậu Mật độ tế bào gốc tủy xương khơng nhiều, trung bình 100,000 tế bào tủy xương có tế bào gốc tạo máu, tế bào khác tế bào thân, tế bào gốc thân, tế bào định hướng dòng máu tế bào hồng cầu, bạch cầu trưởng thành Máu ngoại vi: Là nguồn lấy tế bào gốc tạo máu dùng cho điều trị Với mục đích ghép tế bào gốc tạo máu lâm sàng, lý an toàn thuận lợi kỹ thuật, lấy tế bào gốc tạo máu từ máu ngoại vi thường thực nhiều lấy từ tủy xương Bình thường máu ngoại vi có lượng tế bào gốc tạo máu tế bào máu tiền thân Để huy động tế bào từ tủy xương vào máu, cần tiêm cho người hiến tế bào gốc cytokine yếu tố kích thích quần thể tế bào hạt (G-CSF) vài ngày trước thu tế bào gốc Thu tế bào gốc tạo máu thực cách đưa ống vào ven người cho cho dòng máu qua hệ thống lọc, hệ thống cho phép lấy tế bào CD34+ đưa trở lại thể tế bào máu khác Khoảng 520% lượng tế bào CD34+ thu tế bào gốc tạo máu thực sự, số lại tế bào máu tiền thân, bạch cầu giai đoạn trưởng thành khác Cuống rốn: Từ cuối năm 1980, đầu năm 1990 nhà nghiên cứu phát máu cuống rốn máu thai nguồn giầu tế bào gốc tạo máu Đến ghép máu cuống rốn có ứng dụng rộng rãi điều trị bệnh máu ác tính Các tế bào gốc phơi tế bào mầm phôi: Trong tương lai, ứng dụng tế bào gốc phôi trở nên rộng rãi, nguồn quan để lấy tế bào gốc tạo máu - Hệ thống tạo huyết thai nhi (gan, lách thai): Là nguồn tế bào gốc tạo máu quan trọng cho nghiên cứu cho sử dụng lâm sàng 2.6 Các ứng dụng lâm sàng tế bào gốc tạo máu a Điều trị bệnh lơ-xê-mi u lympho: Các tế bào gốc tạo máu (bị ung thư) bệnh nhân phá hủy tia xạ hóa chất thay ghép tủy xương ghép tế bào gốc 12 tạo máu lấy từ máu ngoại vi người cho phù hợp Người cho phù hợp thường anh, chị, em bệnh nhân, người thừa hưởng kháng nguyên hòa hợp tổ chức tương tự bệnh nhân, giảm thiểu phản ứng thải mô ghép phản ứng ghép chống chủ b Điều trị rối loạn máu bẩm sinh bao gồm thiếu máu bất sản, betathalassemia, hội chứng Blackfan-Diamon, thiếu máu hồng cầu liềm… c Dùng tế bào gốc tạo máu cứu nguy cho trường hợp hóa trị liệu xạ trị liệu điều trị ung thư Biện pháp gọi ghép tế bào gốc tự thân Với mục đích tế bào gốc huy động từ tủy xương vào máu thu giữ, bảo quản bệnh nhân điều trị hóa chất tia xạ để tiêu diệt tế bào ung thư Khi thể bệnh nhân lọc hết hóa chất/tia xạ, bệnh nhân nhận lại tế bào gốc tạo máu Với biện pháp điều trị khơng có vấn đề bất đồng miễn dịch dẫn đến thải ghép phản ứng mảnh ghép chống túc chủ Tuy nhiên vấn đề ghép tế bào gốc tự thân tế bào ung thư vơ tình thu gom truyền trở lại cho bệnh nhân với tế bào gốc Hiện có số kỹ thuật phát minh cho phép tránh điều cách tách tinh khiết bảo quản tế bào có CD34+, Thy-1+ 2.7 Điều trị bệnh lý quan khác (nhồi máu tim, Parkinson…): Các nghiên cứu mơ hình động vật số thử nghiệm lâm sàng cho thấy dùng tế bào gốc tạo máu tiêm trực tiếp vào vùng tổn thương tim để tái tạo lại mô tim mạch máu tổn thương nhồi máu tim tiêm tế bào gốc tạo máu để điều trị bệnh Parkinson Các nghiên cứu theo hướng dựa vào khả “mềm dẻo” tế bào gốc tạo máu gợi mở tiềm ứng dụng tế bào gốc tạo máu III nuôi cấy biệt hóa tế bào gốc Thành phần mơi trường • Muối vơ • Carbohydrate, acid béo, amino acid • Vitamine • Yếu tố vi lượng • Huyết Kỹ thuật nuôi cấy 2.1 Nuôi cấy sơ cấp : q trình ni cấy thực trực tiếp từ mảnh mô ban đầu đến cấy chuyền lần thứ 13 • Ni cấy sơ cấp gồm bước: thu nhận mô tách rời tế bào ni cấy tế bào • Trong mơ, tế bào liên kết với thành khối thống thông qua cầu nối gian bào Tách tế bào khỏi mô cách phá bỏ cầu nối gian bào Các cầu nối phá hủy hai cách: • (1) Tác động học: cắt nhuyễn mô, ép nhuyễn mô tách lọc tế bào • (2) Dùng enzyme phân hủy cầu nối: cầu nối gian bào có chất protein, enzyme thủy phân protein sử dụng để tách tế bào, enzyme thường sử dụng trypsin, collagenase, chymotrypsin 2.2 Nuôi cấy thứ cấp: q trình ni cấy thực sau lần cấy chuyền Cấy chuyền để cung cấp chất dinh dưỡng tươi không gian phát triển cho dòng tế bào phát triển liên tục Cấy chuyền gồm thao tác: loại bỏ môi trường cũ rửa bình/đĩa ni tách tế bào gốc bám vào đáy đĩa pha loãng tế bào gốc môi trường 14 Một số quy trình thu nhận ni cấy biệt hóa tế bào gốc 3.1 Thu nhận nuôi cấy tế bào gốc từ tủy xương chuột Đùi chuột vừa thu nhận Rửa dung dịch PBS Lóc bỏ phần thịt Rửa lại dung dịch PBS Thu nhận xương đùi chuột Cắt bỏ hai đầu xương đùi Rửa tủy xương dung dịch D’MEM thu nhận huyền phù tế bào bào Nuôi tế bào dụng cụ nuôi phù hợp Thay môi trường sau 24 15 3.2 Quy trình thu nhận tế bào gốc từ máu cuống rốn Pha mẫu máu thu với dung dịch PBS/2mM EDTA theo tỉ lệ 1:1 Dùng pipette hút 15 ml dung dịch Ficoll_Hypaque vào ống ly tâm 50ml Rót nhẹ 30 ml hỗn hợp PBS máu lên lớp dung dịch Ficoll_Hypaque cho không làm xáo động bề mặt Ficoll_Hypaque/mẫu Ly tâm 30’ 1500v\phút, nhiệt độ phòng Tách tế bào đơn nhân từ pha Rửa 2-3 lần với PBS/EDTA Tái huyền phù tế bào môi trường nuôi cấy 3.3 Nghiên cứu ni cấy, biệt hóa tế bào gốc sinh tinh từ bệnh nhân azoospermia * Phân lập tế bào dòng tinh - Các nghiên cứu phân lập tế bào dòng tinh nghiên cứu từ lâu Các nghiên cứu tiến hành người động vật Anna cs, 1996 nghiên cứu thành cơng q trình phân lập tế bào dòng tinh, đặc 16 biệt tinh nguyên bào loại A Quá trình tiến hành sau: Chuột Wistar ngày tuổi, trọng lượng thể từ 18-20g chọn để lấy tinh hoàn Tinh hoàn lấy đặt mơi trường MEM (minimum essential medium), có bổ sung glutamine (2nM), HEPES (15mM), số amino acid, penicillin (100IU/ml), streptomycin (100mg/ml), gentamycin (50mg/ml) Sau loại bỏ màng trắng tinh hồn, mơ tinh hồn đưa vào dung dịch ni cấy có khoảng 0,05% collagenase dispase 0,04mg/ml DNase, toàn sản phẩm đặt tủ ấm, nhiệt độ 320C Sau 10 phút thành phần mô liên kết loại bỏ Sản phẩm lại tiếp tục để tủ ấm 15 phút nhằm tách tế bào khỏi màng đáy Sản phẩm lại tiếp tục cho vào môi trường ni cấy 20 phút, có 0,5 U/ml heparinase III, 0,3 U/ml chondroitinase ABC, 0,5 mg/ml collagenase IV Sản phẩm thu lại lọc qua màng lọc có kích thước lỗ 70mm, sau 50mm Sau rửa lần, ly tâm 800 vòng/phút 30 phút, sản phẩm thu tế bào dòng tinh Tác giả nuôi cấy tế bào 32 0C, nồng độ CO2 5% - Hamra cs, 2008 tiến hành phân lập tế bào dòng tinh dựa vào nguyên tắc: tế bào thân tinh hoàn gắn chặt với collagen môi trường nuôi cấy Trong đó, tế bào dòng tinh, mơi trường ni cấy lại khơng có đặc tính * Ni cấy tế bào dòng tinh - Các nghiên cứu ni cấy tế bào dòng tinh có từ lâu, Steinberger, 1970; Matte, 1971; Ghatnekar, 1974; Curtis, 1981 tác giả tiến hành nuôi cấy tế bào dòng tinh - Tuy vậy, ni cấy tế bào dòng tinh thực có ý nghĩa từ sau năm 1990, kỹ thuật vi thao tác áp dụng - Ngày nuôi cấy tế bào dòng tinh với mục đích:   Biệt hóa tế bào dòng tinh Lựa chọn tế bào khỏe mạnh + Đối với azoospermia không tắc: - Zhu, 1996; Liu, 1997; Balaban, 1999; Cremades, 1999 Sousa, 2002, ni cấy tế bào dòng tinh thu từ TESE nhận thấy: sau 24h ni cấy mơi trường có FSH tỷ lệ di động khả thụ tinh tinh trùng tăng lên 17 - Aslam Fishel, 1998; Tesarik, 1998; Cremades, 1999 nuôi cấy tinh tử người có q trình sinh tinh bình thường Kết tinh tử phát triển nhanh với biểu hiện: nhân tụ đặc lại, hình thành phát triển - Terarik, 1998 nhận thấy có mặt FSH testosterone môi trường nuôi cấy làm tăng nhanh tốc độ biệt hóa - Các nghiên cứu Tesarik vào năm 1999 2000 thu kết tương tự bệnh nhân azoospermia không tắc - Năm 1999, đứa trẻ đời từ tinh tử ni cấy (Tesarik) - Cho đến nay, có nhiều phương pháp ni cấy tế bào dòng tinh khác Tesarik, 2006 tiến hành nuôi cấy tế bào dòng tinh với tế bào Sertoli, điều kiện nhiệt độ từ 30-32 0C, với chất khác FSH, LH Sousa, 2006 tiến hành nuôi cấy tế bào dòng tinh sau phân lập chọn lựa dựa vào kỹ thuật vi thao tác Một số tác giả khác nuôi cấy tế bào dòng tinh với tế bào Vero - Huleihel cs, 2007 tiến hành nuôi cấy tinh nguyên bào với tế bào Sertoli, dung dịch nuôi cấy Môi trường ni cấy ngồi nội tiết tố bổ sung chất GDNF (glial cell line derived neurotrophic factor), SCF (stem cell factor), LIF (leukemia inhibitory factor) Kết nghiên cứu cho thấy tế bào phân chia tốt - Perrard cs, 2007 tiến tới nuôi cấy tế bào dòng tinh Kết nghiên cứu cho thấy: betaNGF (beta nerve growth factor) có tác dụng trực tiếp đến lần thứ phân bào giảm nhiễm để hình thành tinh tử tròn Chính tác giả nhận thấy số lượng tinh tử tròn tăng nhanh q trình ni cấy - Zhang, 2008 tiến hành nuôi cấy tinh nguyên bào chuột tế bào Sertoli Sau đến ngày nuôi cấy, môi trường nuôi cấy thay Kết thí nghiệm cho thấy, sau 24 ni cấy phát phân chia tế bào Quá trình ni cấy kéo dài 50 ngày - Mito Kanatsu cs, 2008 tiến hành nuôi cấy tinh nguyên bào chuột Hamster thời gian kéo dài Các tinh nguyên bào sau phân lập ni cấy mơi trường có NGF, kết nghiên cứu thu tinh tử tròn 18 - Gần số tác giả tiến hành nghiên cứu biệt hố tế bào mầm gốc phơi thành noãn tinh trùng Lacham-Kaplan, 2008 Các tác giả thu số thành công, nhiên nhiều tồn cần nghiên cứu + Đối với azoospermia tắc: - Các bệnh nhân nhóm có q trình sinh tinh xảy bình thường Thơng thường, bệnh nhân có kích thước tinh hồn, nồng độ FSH, LH testosterone máu bình thường, mào tinh căng, xác định rõ Đặc biệt, thu tinh trùng tinh tử trưởng thành mào tinh qua kỹ thuật PESA, MESA (Silber, 1994) - Tuy vậy, tế bào dòng tinh thu thường chưa trưởng thành hoàn toàn, lại khó xác định tế bào sống để lựa chọn Một số tác giả tiến hành nuôi cấy tế bào đạt kết tốt đẹp như: tế bào biệt hóa, trưởng thành hơn, khả xác định tế bào sống cao tỷ lệ thụ tinh sau ICSI tăng đáng kể (Balaban, 1999) * Đặc điểm tế bào thu từ tinh hoàn bệnh nhân azoospermia: - Tinh trùng thường chưa biệt hóa hồn tồn khơng di động nên khó xác định tinh trùng sống việc chọn tinh trùng để làm ICSI - Theo Tesarik, 1998; Jurisicova, 1999; Gandini, 2000; Muratori, 2000, tỷ lệ đứt gãy ADN tinh tử thu từ tinh hoàn, đặc biệt tinh tử tròn (round spermatid) cao, nguyên nhân làm giảm tỷ lệ thành công - Nguyên nhân tỷ lệ thụ tinh tinh tử thấp (Tesarik): Sự chưa hoàn thiện trung thể  Sự chuyển tiếp protein nhân (từ histone thành protamine) chưa hồn tồn: thiếu hụt protamine cản trở hình thành tiền nhân  Sự thiếu hụt chất kích hoạt nỗn  Khơng có tinh trùng tinh dịch (azoospermia) chiếm tỷ lệ đáng kể nguyên nhân vô sinh nam nguyên nhân đáng quan tâm Nhóm azoospermia tắc, bệnh nhân điều trị phương pháp PESA-ICSI hay MESA-ICSI Nhóm thứ nhóm azoospermia khơng tắc, bệnh nhân khó có khả điều trị TESE-ICSI xin tinh trùng hướng giải cho bệnh nhân nhóm 19 Đối với bệnh nhân azoospermia không tắc, hướng giải xin tinh trùng, giải pháp tình Chính nuôi cấy tinh trùng, tinh tử tế bào gốc sinh tinh có ý nghĩa quan trọng việc nâng cao tỷ lệ thụ tinh mang lại hội làm cha cho bệnh nhân azoospermia 3.4 Thu nhận biệt hóa tế bào gốc trung mơ từ cuống dốn người 3.4.1 Thu nhận máu cuống rốn Máu cuống rốn thu nhận từ sản phụ xét nghiệm âm tính với HIV, HBV, HCV…ở Bệnh viện Hùng Vương Thành phố Hồ Chí Minh Sau thai nhi vừa sinh ra, tiến hành kẹp phần cuống rốn gần bụng cắt vị trí kẹp cm Dùng kim tiêm túi thu máu (có chứa sẵn chất chống đơng máu) đưa vào cuống rốn vị trí gần thai Máu cuống rốn theo kim ống dẫn chảy vào túi thu máu Khi máu hết chảy, rút kim mang túi chứa máu phòng thí nghiệm (được bảo quản lạnh đá gel) Thời gian từ thu nhận máu đến thao tác vòng 3.4.2 Giai đoạn 1, nuôi cấy sơ cấp tế bào máu cuống rốn: chọn lọc MSC Về nguyên tắc, máu cuống rốn ln chứa ba loại tế bào chính: tế bào gốc tạo máu (Hemapoietic Stem Cell_HSC), tế bào máu trưởng thành MSC Các MSC tế bào gốc tạo máu thuộc quần thể tế bào đơn nhân Tiến hành thu nhận quần thể tế bào đơn nhân phương pháp li tâm gradient nồng độ Ficoll-paque (Sigma) tốc độ 2.500 vòng/phút, phút Sau đó, thu nhận phân đoạn chứa tế bào đơn nhân nằm lớp Ficoll-paque lớp huyết tương bên Trong trình li tâm, tế bào biệt hóa với kích thước lớn xuyên qua lớp Ficoll lắng đáy ống li tâm Các tế bào hồng cầu không nhân nhẹ, nằm lớp huyết tương bên Và tế bào đơn nhân với kích thước trung bình ln nằm lớp MSC tách khỏi tế bào gốc tạo máu quần thể tế bào đơn nhân phương pháp nuôi cấy Trong nuôi cấy, MSC bám dính vào bề mặt (giá thể) ni cấy, tế bào gốc tạo máu khơng có khả Tế bào đơn nhân sau thu nhận huyền phù môi trường nuôi cấy IMDM, 10% FBS, ni bình ni cấy (Nunc, 25 cm2) cho đạt mật độ 3.105 tế bào/cm2 điều kiện 370C, 5% CO2 Sau 48 giờ, MSC bắt đầu bám bề mặt đáy bình ni, thay mơi trường để loại bỏ hết tế bào không bám (các tế bào chết tế bào gốc tạo máu), tiếp tục nuôi tế bào mọc đạt tỷ lệ 70-80% bề mặt đáy bình ni, với chế độ thay môi trường ngày/lần 20 3.5 Giai đoạn 2, nuôi cấy thứ cấp: cấy chuyền tăng sinh MSC Khi mật độ MSC bình ni tăng, đạt khoảng 70-80% tỷ lệ diện tích đáy bình, tiến hành cấy chuyền nhằm cung cấp không gian chất dinh dưỡng cho MSC Quy trình tiến hành sau: loại bỏ môi trường cũ rửa tế bào với 4-5 ml PBSA có bổ sung gentamycin (10 μg/ml) hai lần Tiếp tục loại bỏ dịch rửa bổ sung 4-5 ml trypsin/EDTA 0,05% Sau 15 giây, tiến hành đổ bỏ dung dịch enzyme giữ lại khoảng ml tiếp tục ủ tủ ấm 370C, từ 2-3 phút Sau đó, lắc nhẹ bình ni cấy để tách tế bào khỏi bề mặt đáy Khi tế bào co tròn tách khỏi bề mặt bình ni, phải trung hòa trypsin thừa 10-11 ml mơi trường IMDM 10% FBS Huyền phù tế bào chia cho bình ni 3.6.Biệt hố MSC Các MSC thu nhận theo phương pháp trên, sau cấy chuyền từ 5-7 lần, tiến hành kiểm tra độ tinh sạch, tạo nồng độ thích hợp để cuối sử dụng cho biệt hóa in vitro 3.7 Biệt hóa MSC thành tế bào tạo mỡ (adipocyte) Để biệt hóa thành tế bào tạo mỡ, MSC có nồng độ chuẩn nuôi môi trường IMDM 10% FBS có bổ sung μM dexamethasone, 200 μM indomethacin, 1,7 μM insuline, 500 μM isobutyl-methylxanthine (IBMX) (Sigma) Trong đó, dexamethasone glucocorticoid steroid có tác dụng cảm ứng cho biệt hóa yếu tố bổ sung lại kích thích biệt hóa Insuline kích thích thu nhận phân tử glucose vào tế bào, tạo nguyên liệu cho phản ứng chuyển hóa thành giọt mỡ [10;11] IBMX chất ức chế phosphodiesterase làm khóa chuyển cAMP thành 5’AMP [8] Điều gây nên điều hòa dương tính hormone nhạy cảm lipase (HSL) HSL chuyển triacyl glyceride thành glycerol acid béo tự do, q trình tạo mỡ [8] Indomethacin ligand PPAR (peroxisome proliferators-activated receptor) làm hoạt hóa nhân tố phiên mã ức chế tín hiệu Wnt, cần thiết cho biệt hóa thành mỡ [8;13] Sự biệt hóa ghi nhận quan sát kính hiển vi độ phóng đại X20, X40 thấy có xuất giọt mỡ nhỏ Các tế bào tạo mỡ xác định dựa vào phương pháp nhuộm với thuốc nhuộm Oil red (Merck) Oil red thuốc nhuộm lipid, hòa tan lipid tạo màu đỏ 3.8 Biệt hoá MSC thành nguyên bào xương (Osteoblast) Các MSC có nồng độ chuẩn nuôi môi trường IMDM 10% FBS có bổ sung 100 nM dexamethasone, 50 μg/ml L-ascorbic acid 2-phosphat (AsAP) 100 mM β- glycerolphosphate (Sigma) Dexamethasone có khả kích thích ức chế biệt hóa thành xương phụ thuộc vào nồng độ Nồng độ cao 21 dexamethasone cảm ứng biệt hóa thành mỡ, đó, với nồng độ thấp hơn, chất kích thích MSC biệt hóa thành xương AsAP làm dễ dàng q trình biệt hóa thành xương, bao gồm kích thích tổng hợp collagen, ngồi có tác động tăng sinh tế bào [5;6;9] Cuối cùng, β-glycerolphosphate yếu tố quan trọng kích thích hình thành chất khống hóa kết hợp với dexamethasone AsAP [9] Sau 7-14 ngày ni cấy, biệt hố đánh giá thơng qua khả tích tụ calcium chất nhờ phương pháp nhuộm với thuốc nhuộm Alizarin Red (Sigma) IV kết luận Việc nghiên cứu tế bào gốc hứa hẹn nhiều thành công với ứng dụng lớn người nhiên tồn nhiều khó khăn nghiên cứu Về mặt xã hội việc nghiên tế bào gốc chịu chi phối vấn đề đạo đức xã hội,người ta không chấp nhận nhà khoa học lấy tế bào gốc từ phơi người sinh mạng chưa tượng hình Tuy điều quan trọng việc nhận diện biệt lập tế bào gốc cần nhiều nghiên cứu chưa kể đến việc tạo môi trường biệt hố, cấy ghép điều vơ khó khăn.cơ thể có chế đào thải vật chất di truyền lạ vào thể cấy ghép tế bào hay quan điều gặp trở ngại việc giữ cho hoạt động thể sinh vật cấy ghép Nhưng nhìn chung việc nghiên cứu tế bào gốc bước đầu phát triển, tựu không nhiều tiêm nghiên cứu có hy vọng lớn giúp giải vấn đề nan giải lĩnh vực y học nhiều lĩnh vực khác tương lai 22 Tài liệu tham khảo            Sách:công nghệ sinh học – pgs.ts Nguyễn Bá Lộc http://www.khoahoc.com.vn/ http://giaoan.violet.vn/ sách “Công nghệ tế bào gốc”-Phan Kim Ngọc www.nhasinhhoctre.com/ www.sinhhocvietnam.com stemcells.nih.gov www.medicalnewstoday.com/ www.sciencedaily.com/ topics.nytimes.com www.cell.com/cell-stem-cell/ 23 ... http://www.khoahoc .com. vn/ http://giaoan.violet.vn/ sách “Công nghệ tế bào gốc”-Phan Kim Ngọc www.nhasinhhoctre .com/ www.sinhhocvietnam .com stemcells.nih.gov www.medicalnewstoday .com/ www.sciencedaily .com/ ... www.sinhhocvietnam .com stemcells.nih.gov www.medicalnewstoday .com/ www.sciencedaily .com/ topics.nytimes .com www.cell .com/ cell-stem-cell/ 23