Nghiên cứu thành phần hóa học và hoạt tính chống oxy hóa của một số loài dược liệu của đồng bào Pako và Bru Vân Kiều, Tỉnh Quảng Trị (Luận án tiến sĩ)

Nghiên cứu thành phần hóa học và hoạt tính chống oxy hóa của một số loài dược liệu của đồng bào Pako và Bru Vân Kiều, Tỉnh Quảng Trị (Luận án tiến sĩ)Nghiên cứu thành phần hóa học và hoạt tính chống oxy hóa của một số loài dược liệu của đồng bào Pako và Bru Vân Kiều, Tỉnh Quảng Trị (Luận án tiến sĩ)Nghiên cứu thành phần hóa học và hoạt tính chống oxy hóa của một số loài dược liệu của đồng bào Pako và Bru Vân Kiều, Tỉnh Quảng Trị (Luận án tiến sĩ)Nghiên cứu thành phần hóa học và hoạt tính chống oxy hóa của một số loài dược liệu của đồng bào Pako và Bru Vân Kiều, Tỉnh Quảng Trị (Luận án tiến sĩ)Nghiên cứu thành phần hóa học và hoạt tính chống oxy hóa của một số loài dược liệu của đồng bào Pako và Bru Vân Kiều, Tỉnh Quảng Trị (Luận án tiến sĩ)Nghiên cứu thành phần hóa học và hoạt tính chống oxy hóa của một số loài dược liệu của đồng bào Pako và Bru Vân Kiều, Tỉnh Quảng Trị (Luận án tiến sĩ)Nghiên cứu thành phần hóa học và hoạt tính chống oxy hóa của một số loài dược liệu của đồng bào Pako và Bru Vân Kiều, Tỉnh Quảng Trị (Luận án tiến sĩ)Nghiên cứu thành phần hóa học và hoạt tính chống oxy hóa của một số loài dược liệu của đồng bào Pako và Bru Vân Kiều, Tỉnh Quảng Trị (Luận án tiến sĩ)Nghiên cứu thành phần hóa học và hoạt tính chống oxy hóa của một số loài dược liệu của đồng bào Pako và Bru Vân Kiều, Tỉnh Quảng Trị (Luận án tiến sĩ)

LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan: Đây công trình nghiên cứu riêng tơi, kết thu luận án hoàn toàn trung thực, đồng tác giả cho phép sử dụng chưa cơng bố cơng trình khác Tác giả luận án Lê Trung Hiếu LỜI CẢM ƠN Luận án hồn thành Khoa Hóa, Trường Đại học Khoa học, Đại học Huế Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành sâu sắc đến PGS.TS Trần Thị Văn Thi Người hướng dẫn tận tình, chu đáo tạo điều kiện tốt giúp đỡ thời gian thực luận án Tôi xin trân trọng cảm ơn quan tâm giúp đỡ Ban Giám Hiệu Trường Đại học Khoa học, Phòng Đào tạo Sau Đại học Trường Đại học Khoa học, Phòng Đào tạo Sau Đại học Đại học Huế tạo điều kiện giúp đỡ tơi hồn thành luận án Tôi xin trân trọng cảm ơn Ban Chủ nhiệm Khoa Q Thầy Cơ Khoa Hóa giúp đỡ tạo điều kiện thuận lợi cho thời gian làm luận án Tôi xin trân trọng cảm ơn PGS TS Nguyễn Thị Hoài, PGS TS Phạm Cẩm Nam, PGS TS Võ Thị Mai Hương, TS Hồ Việt Đức NCS Lê Lâm Sơn giúp đỡ tơi q trình thực nghiệm Cuối cùng, tơi xin chân thành cảm ơn gia đình bạn bè cổ vũ, động viên tơi hồn thành luận án Tôi xin trân trọng cảm ơn ! Thừa Thiên Huế, ngày…tháng…năm 2017 Tác giả luận án Lê Trung Hiếu MỤC LỤC MỤC LỤC i DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT iv DANH MỤC CÁC BIỂU BẢNG vii DANH MỤC CÁC HÌNH vii DANH MỤC CÁC PHỤ LỤC xii MỞ ĐẦU Chương TỔNG QUAN 1.1 Tổng quan hoạt tính chống oxy hóa 1.1.1 Chất chống oxy hoá 1.1.2 Cơ chế hoạt động chất chống oxy hóa 1.1.3 Các hợp chất thiên nhiên có hoạt tính chống oxy hóa 1.1.4 Các phương pháp đánh giá hoạt tính chống oxy hóa 1.2 Tổng quan loài dược liệu nghiên cứu 11 1.2.1 Quá trình nghiên cứu sàng lọc từ kinh nghiệm sử dụng thuốc thực tế đồng bào Pako Bru - Vân Kiều, tỉnh Quảng Trị 11 1.2.2 Vị trí phân lồi, vùng phân bố đặc điểm thực vật 13 1.2.2 Thành phần hóa học chi lồi dược liệu 20 1.2.3 Hoạt tính sinh học loài dược liệu nghiên cứu 30 1.3 Tóm tắt tổng quan mục tiêu thực luận án 37 Chương PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU VÀ THỰC NGHIỆM 38 2.1 Đối tượng nghiên cứu 38 2.2 Mục tiêu nghiên cứu 39 2.3 Nội dung nghiên cứu 39 2.4 Hóa chất thiết bị 40 2.4.1 Hóa chất 40 2.4.2 Thiết bị 40 2.5 Phương pháp chiết cao toàn phần cao phân đoạn 40 2.5.1 Nguyên tắc: chiết rắn lỏng chiết lỏng - lỏng 40 2.5.2 Thực nghiệm 41 2.6 Phương pháp đánh giá hoạt tính chống oxy hóa 42 2.6.1 Đánh giá hoạt tính chống oxy hóa hóa học 42 i 2.6.2 Phương pháp chống oxy hóa sinh học 44 Thực nghiệm thực Phòng thử nghiệm sinh học - Viện Công nghệ sinh học, Viện hàm lâm Khoa học Công nghệ Việt Nam 44 2.6.3 Phương pháp hóa học tính tốn để xác định khả chống oxy hóa 48 2.7 Phương pháp xác định hàm lượng tổng hợp chất phenol flavonoid 48 2.7.1 Hàm lượng tổng hợp chất phenol 48 2.7.2 Xác định hàm lượng tổng flavonoid 49 2.8 Phương pháp phân lập, tinh chế xác định cấu trúc cấu tử 49 2.8.1 Phương pháp phân lập tinh chế cấu tử 49 2.8.2 Quy trình phân lập hợp chất 50 2.8.3 Phương pháp xác định cấu trúc hóa học cấu tử 59 2.9 Phương pháp sắc ký lỏng hiệu cao (HPLC) để phân tích hàm lượng hợp chất loài dược liệu 59 2.9.1 Nguyên tắc 59 2.9.2 Chuẩn bị mẫu cho phân tích sắc ký 60 2.9.3 Điều kiện phân tích sắc ký 60 Chương KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 62 3.1 Hoạt tính chống oxy hóa loài dược liệu 62 3.1.1 Hoạt tính chống oxy hóa cao tồn phần 62 3.1.2 Hàm lượng tổng hợp chất phenol hàm lượng tổng flavonoid 65 3.1.3 Hoạt tính chống oxy hóa cao phân đoạn 68 3.2 Các hợp chất từ loài Cổ ướm Mán đỉa 80 3.2.1 Hợp chất số 1: lup-20(29)-en-3-one 80 3.2.2 Hợp chất số 2: α-tocospiro A 82 3.2.3 Hợp chất số 3: spinasterol 84 3.2.4 Hợp chất số 4: oleanolic acid 86 3.2.5 Hợp chất số 5: daucosterol 89 3.2.6 Hợp chất số 6: methyl gallate 90 3.2.7 Hợp chất số 7: quercetin 91 3.2.8 Hợp chất số 8: rutin 92 3.2.9 Hợp chất số 9: α-tocopherol 95 3.2.10 Hợp chất số 10: betulinic acid 97 ii 3.2.11 Hợp chất số 11: -spinasterone 99 3.2.12 Hợp chất số 12: stigmasterol 101 3.2.13 Hợp chất số 13: 1-octacosanol 102 3.2.15 Hợp chất số 15: quercetin 3-O--L-rhamnopyranoside 103 3.2.16 Hợp chất số 16: 7-O-galloyltricetiflavan 106 3.3 Hoạt tính chống oxy hóa hợp chất phân lập 110 3.3.1 Hoạt tính chống oxy hóa hợp chất phân lập mơ hình DPPH 110 3.3.2 Mối tương quan hoạt tính bắt gốc tự DPPH thử nghiệm hoạt tính chống oxy hóa- bảo vệ gan in vitro sinh học 112 3.3.3 Xác nhận chế chống oxy hóa hợp chất phân lập phương pháp hóa tính tốn 113 3.4 Định lượng cấu tử có hoạt tính chống oxy hóa tốt loài dược liệu 117 3.4.1 Hàm lượng cao toàn phần tỷ lệ khối lượng cao toàn phần mẫu dược liệu 117 3.4.2 Kiểm tra phương pháp định lượng 118 3.4.3 Hàm lượng methyl gallate, rutin, quercetin, quercitrin α-tocopherol 122 3.4.4 Mối tương quan hàm lượng hoạt chất chống oxy hóa xác định phương pháp HPLC với tổng hợp chất phenol với tổng chất chống oxy hóa 124 KẾT LUẬN 126 TÍNH MỚI CỦA LUẬN ÁN 129 DANH MỤC CÁC CƠNG TRÌNH 131 TÀI LIỆU THAM KHẢO 133 iii DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT Các loài dược liệu Ab A bauchei Archidendron bauchei Ac A clypearia Archidendron clypearia Hp H parasitica Helixanthera parasitica Lr L rubra Leea rubra Mc M casearifolia Microdesmis casearifolia Pv P venusta Pyrostegia venusta So S oleracea Spilanthes oleracea Hoạt tính chống oxy hóa ROS Reactive oxygene species DPPH 1,1-diphenyl-2picrylhydrazyl TPC Tổng hàm lượng hợp TFC Tổng hàm lượng chất phenol TAC flavonoid Hàm lượng chất chống TA5C-HPLC Hàm lượng tổng oxy hóa quy tương đương hợp chất chống oxy hóa xác định gallic acid phương pháp HPLC HAT Hydrogen Atom Transfer SET Single Electron Transfer AST Aspartate Amino ALT Transferase PAR Alanin Amino Transferase Paracetamol iv Các phương pháp sắc ký CC Column Chromatography Sắc ký cột thường HPLC High Performance Liquid Sắc ký lỏng hiệu cao Chromatography TLC Thin Layer Chromatography Sắc ký mỏng Các phương pháp phổ H-NMR 13 C-NMR APCI-MS DEPT Proton Nuclear Magnetic Phổ cộng hưởng từ hạt nhân Resonance Spectroscopy proton Carbon-13 Nuclear Magnetic Phổ cộng hưởng từ hạt nhân Resonance Spectroscopy carbon 13 Atmospheric Pressure Chemical Phổ khối ion hóa hóa học áp Ionization Mass Spectrometry suất khí Distortionless Enhancement by Phổ DEPT Polarisation Transfer COSY Correlation Spectroscopy Phổ tương tác hai chiều 1H- 1H ESI-MS Electron Spray Ionization Mass Phổ khối ion hóa phun mù điện Spectrometry tử Heteronuclear Multiple Bond Phổ tương tác dị hạt nhân qua Correlation nhiều liên kết High Resolution - Electron Phổ khối phân giải cao ion hóa Spray Ionization - Mass phun mù điện tử HMBC HR-ESI-MS Spectrometry HSQC IR HSQC Heteronuclear Single Phổ tương tác dị hạt nhân qua Quantum Coherence liên kết Infrared Spectroscopy Phổ hồng ngoại v Hằng số tương tác tính J (Hz) Hz NOESY Nuclear Overhauser Effect Phổ NOESY Spectroscopy UV Ultraviolet Spectroscopy Phổ tử ngoại δ (ppm) (ppm = part per million) Độ dịch chuyển hóa học tính phần triệu s singlet q quartet dt double triplet d doublet dd double doublet br broad triplet m multiplet t Các ký hiệu viết tắt khác IC50 Inhibitory Concentration 50% Nồng độ ức chế 50% ED50 Effective dose 50% Liều lượng hiệu nồng độ 50% BDE Bond dissociation energy Năng lượng phân ly liên kết IE Ionization energy Năng lượng ion hóa Mp Melting point Điểm chảy OD Optical Density Mật độ quang CTPT Công thức phân tử EtAc Ethyl acetate DMSO B n-Butanol MeOH Methanol Dimethylsulfoxide C Chloroform H n-Hexane W Water GA Gallic aicd QU Quercetin vi DANH MỤC CÁC BIỂU BẢNG Bảng 1.1 Ưu nhược điểm số mơ hình đánh giá khả chống oxy hóa in vitro hóa học Bảng 1.2 loài dược liệu qua sàng lọc theo định hướng chống oxy hóa 12 Bảng 1.3 Thành phần hóa học số lồi chi Archidendron 20 Bảng 1.4 Thành phần hóa học số loài khác chi Leea 23 Bảng 1.5 Thành phần hóa học số lồi chi Microdesmis 24 Bảng 1.6 Thành phần hóa học số loài chi Pyrostegia 25 Bảng 1.7 Thành phần hóa học số loài chi Spilanthes 26 Bảng 1.8 Hoạt tính sinh học lồi y học dân gian 30 Bảng 1.9 Hoạt tính sinh học số lồi chi liên quan 30 Bảng 2.1 Tên khoa học, địa điểm lấy mẫu, thời gian lấy mẫu loài nghiên cứu 38 Bảng 2.2 Thơng số q trình định lượng HPLC 60 Bảng 3.1 Khối lượng cao toàn phần cao phân đoạn tách chiết từ loài dược liệu 62 Bảng 3.2 Hàm lượng chất chống oxy hóa quy tương đương gallic acid mẫu dược liệu nồng độ cao toàn phần 0,5 mg/mL ( p = 0,95; n= 5) 63 Bảng 3.3 Tỷ lệ bắt gốc tự DPPH dung dịch cao toàn phần mẫu dược liệu nồng độ khác 64 Bảng 3.4 Hàm lượng tổng hợp chất phenol tổng flavonoid loài dược liệu (XTB±S; n=6) 66 Bảng 3.5 Giá trị ED50 cao ethyl actetate từ Mán đỉa (A clypearia) thử nghiệm in vitro sinh học 74 Bảng 3.6 Hiệu bảo vệ gan cao ethyl acetate từ Mán đỉa (A clypearia) 75 Bảng 3.7 Kết biến đổi khối lượng gan chuột lơ thí nghiệm 76 Bảng 3.8 Kết hình thái trực quan gan chuột lơ thí nghiệm 78 Bảng 3.9 Hàm lượng MDA mẫu gan 79 Bảng 3.10 Số liệu phổ NMR hợp chất số hợp chất tham khảo 81 Bảng 3.11 Số liệu phổ NMR hợp chất số hợp chất tham khảo 82 Bảng 3.12 Số liệu phổ 13C-NMR hợp chất số hợp chất tham khảo 85 vii Bảng 3.13 Số liệu phổ 13C-NMR hợp chất chất tham khảo 87 Bảng 3.14 Số liệu phổ 1H-NMR chất số chất tham khảo 89 Bảng 3.15 Số liệu phổ NMR hợp chất số chất tham khảo 91 Bảng 3.16 Số liệu phổ 13C-NMR chất số chất tham khảo 93 Bảng 3.17 Số liệu phổ NMR hợp chất số chất tham khảo 95 Bảng 3.18 Số liệu phổ NMR hợp chất số 10 chất tham khảo 98 Bảng 3.19 Số liệu phổ 13C-NMR hợp chất số 11 chất tham khảo 100 Bảng 3.20 Số liệu phổ NMR hợp chất số 15 chất tham khảo 103 Bảng 3.21 Số liệu phổ NMR hợp chất số 16 chất tham khảo 108 Bảng 3.22 Thống kê hợp chất phân lập từ loài Cổ ướm (A bauchei) Mán đỉa (A clypearia) 109 Bảng 3.23 Kết thử nghiệm hoạt tính sinh học chống oxy hóa- bảo vệ gan in vitro 112 Bảng 3.24 Giá trị BDE (O – H) (kcal/mol) liên kết phân tử methyl gallate tính tốn theo hai phương pháp 114 Bảng 3.25 Năng lượng phân ly liên kết (BDE) methyl gallate, quercitrin, rutin quercetin tính tốn theo B3LYP/6-311 ++ G (2d, 2p)// PM6 115 Bảng 3.26 Khối lượng cao toàn phần mẫu dược liệu (n=3) 117 Bảng 3.27 Thời gian lưu methyl gallate, rutin,quercetin, quercitrin 119 α-tocopherol 119 Bảng 3.29 Kết khảo sát khoảng tuyến tính quercetin 120 Bảng 3.30 Kết khảo sát khoảng tuyến tính rutin 120 Bảng 3.32 Kết khảo sát khoảng tuyến tính α-tocopherol 121 Bảng 3.34 Hàm lượng hoạt chất mẫu dược liệu 122 Bảng 3.35 Hệ số tương quan thành phần có hoạt tính chống oxy hóa 124 viii ... 1.4 Thành phần hóa học số loài khác chi Leea 23 Bảng 1.5 Thành phần hóa học số loài chi Microdesmis 24 Bảng 1.6 Thành phần hóa học số lồi chi Pyrostegia 25 Bảng 1.7 Thành phần hóa học số. .. pháp đánh giá hoạt tính chống oxy hóa 1.2 Tổng quan loài dược liệu nghiên cứu 11 1.2.1 Quá trình nghiên cứu sàng lọc từ kinh nghiệm sử dụng thuốc thực tế đồng bào Pako Bru - Vân Kiều, tỉnh. .. đánh giá hoạt tính chống oxy hóa 42 2.6.1 Đánh giá hoạt tính chống oxy hóa hóa học 42 i 2.6.2 Phương pháp chống oxy hóa sinh học 44 Thực nghiệm thực Phòng thử nghiệm sinh học