TIEU LUAN SINH THAI RUNG Chuyên đề: “Trình bày và phân tích một số phương pháp nghiên cứu hệ sinh thái”

ĐẠI HỌC HUẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM HUẾ  TIỂU LUẬN CAO HỌC HỌC PHẦN: SINH THÁI RỪNG Chuyên đề: “Trình bày phân tích số phương pháp nghiên cứu hệ sinh thái” GVGD: TS Ngô Tùng Đức Học viên thực hiện: Nguyễn Quốc Cường Lớp: Cao học lâm học 22C Huế, 1/2018 1 Phương pháp đánh giá đa dạng di truyền thị phân tử làm sở tuyển chọn phát triển nguồn gen Bời lời đỏ trội lựa chọn miền Trung Tây Nguyên 1) Tách chiết ADN tổng số: - Lá Bời lời đỏ lau cồn 70%; - Nghiền - g tươi nitơ lỏng thành dạng bột mịn cối chày sứ; - Chuyển bột sang ống eppendoft 2ml, sau bổ sung 800µl đệm chiết CTAB (đã làm nóng đến 650C); - Bổ sung thêm 60µl đệm SDS 10%; - Đảo ủ mẫu 650C thời gian 60 phút (10 phút đảo lần); - Để nguội nhiệt độ phòng Bổ sung thêm 800µl chloroform (tương đương tỷ lệ 1:1), đảo 10 phút; - Ly tâm 12000 vòng/phút nhiệt độ 4oC vòng 15 phút; - Sau chuyển dịch phía ống eppendoft sang ống epp 2ml (~ 500µl); - Bổ sung thể tích tương đương (500µl) chloroform, đảo đều; - Ly tâm 12000 vòng/phút nhiệt độ 4oC vòng 15 phút; - Thu dịch vào ống epp mới, bổ sung thêm 500µl Isopropanol, lắc đều, sau để vào - 20oC thời gian - giờ; - Lấy ống mẫu để nhiệt độ phòng 10 phút; ly tâm thu tủa 10000 vòng/phút nhiệt độ C thời gian 20 phút Đổ dịch trên, thu tủa; o - Rửa tủa lần cách bổ sung thêm 700µl ethanol 70% để rửa tủa, ly tâm 10000 vòng/phút nhiệt độ 4oC thời gian 20 phút Đổ dịch trên, thu tủa; - Làm khô tủa nhiệt độ phòng Thêm 100µl đệm TE; - Bổ sung 1µl RNase (10mg/ml), Ủ mẫu 370C 3h; - Bảo quản ADN - 20°C; 2) Kiểm tra độ tinh nồng độ ADN phương pháp điện di gel agarose 0,8% máy đo quang phổ - Phương pháp điện di kiểm tra ADN gel Agarose: Các bước tiến hành: + Lấy2µl ADN/mẫu 3µl loading dye; + Tra mẫu vào giếng khay gel agarose 1%; + Điện di thời gian 30 phút 100V; + Nhuộm gel ethidium bromide - Đo nồng độ ADN độ tinh (OD 260/280) máy đo NanoDrop: Máy quang phổ NanoDrop cho phép phân tích với độ xác cao với lượng mẫu cực nhỏ, không cần sử dụng cuvet, không cần pha loãng mẫu Nguyên lý cách tiến hành: Dùng pippet nhỏ trực tiếp lượng nhỏ 1µl mẫu vào vị trí đo, có tay cầm nơi có sợi quang học ấn xuống vị trí đặt mẫu sau thả nhẹ để tạo khoảng cách nhỏ, duới tác dụng sức căng bề măt, cột chất lỏng mẫu kéo lên, lúc mày thực phép đo với thời gian nhỏ 10 giây Phổ đồ phân tích hình máy tính kèm Ngay phép đo hoàn thành, mẫu lau Phần mềm thiết lập account cho tổng người sử dụng Dữ liệu xử lý phần mềm khác 3) Phương pháp PCR: Tổng thể tích hỗn hợp phản ứng 10µl bao gồm:5,7µl nước cất khử trùng; 1,0µl đệm 10xPCR có 25mM MgCl2; 0,2µl dNTPs (10mM); 1µl hỗn hợp mồi xi ngược (10µM/ µl); 0,1µl Taq polymerase (5 U/µl); 2,0µl ADN khn (10ng/µl) Điều kiện phản ứng PCR Các bước Nhiệt độ (oC) Thời gian Số chu kỳ I 95 phút II 94 45 giây 50 phút 72 phút III 72 phút V 10 phút 35 Giữ mẫu 40C 4) Phân tích xử lí số liệu Để xác định quan hệ di truyền dòng Bời lời đỏ, kết thu từ trình điện di sản phẩm PCR với cặp mồi SSR thành lập dựa vào xuất hay không xuất băng ADN nhờ khuếch đại PCR Số 1: alen có xuất băng ADN Số 0: alen khơng xuất băng ADN Số 9: dòng khơng xuất băng ADN tất alen (mất số liệu) Các số liệu nhập vào phần mềm Exel theo mồi - Hệ số PIC (Polymorphic Information Content) tính theo cơng thức sau: PIC = 1- Pi2 Trong đó: Pi tần số xuất alen thứ i Sau đó, số liệu chuyển sang chương trình NTSYSpc 2.1 để phân tích, tìm hệ số tương đồng di truyền (Jaccard) thành lập quan hệ phát sinh - Tỷ lệ alen dị hợp (H%) giống Bời lời đỏ tính theo cơng thức: X H% = P  Y Trong đó: X tổng số mồi có xuất nhiều băng ADN/1 locus SSR Y tổng số mồi SSR không xuất băng ADN P tổng số mồi sử dụng nghiên cứu - Tỷ lệ số mồi không xuất băng ADN (M%) tính cơng thức: Z M% = P Trong đó: Z tổng số mồi khơng xuất băng ADN P tổng số mồi sử dụng nghiên cứu PHƯƠNG PHÁP BỐ TRÍ Ơ MẪU VÀ ĐIỀU TRA XÁC ĐỊNH CÁC CHỈ TIÊU CẤU TRÚC THẢM THỰC VẬT 2.1 Bố trí mẫu 2.1.1 Ơ mẫu dùng để điều tra tầng cao - Diện tích mẫu + Rừng trồng, non: tối thiểu 400 m2/ô mẫu + Rừng trồng, từ giai đoạn rừng sào trở đi: tối thiểu 500 m2/ô mẫu Trường hợp mật độ rừng dày, giảm diện tích mẫu, diện tích mẫu khơng nhỏ 100 m2/ơ khơng 31 gỗ/ơ + Rừng tự nhiên: tối thiểu 1000 m2/ô Trường hợp lô rừng thiết kế theo băng chiều rộng mẫu chiều rộng băng (W, m), chiều dài ô diện tích chia cho chiều rộng (m) - Tỷ lệ rút mẫu Tổng diện tích mẫu chiếm 2% diện tích lơ rừng trồng chiếm 1% diện tích lơ rừng tự nhiên Trường hợp lơ rừng có diện tích nhỏ (gồm lơ cần ô mẫu), trạng rừng biến động lớn (phân bố không liên tục, gồm từ mảnh rừng trở lên, mảnh rừng có trạng khác rõ rệt) giải thơng qua cách sau: Cách 1: Bổ sung thêm số mẫu để có mẫu đại diện tốt cho mảnh rừng Cách 2: + Mỗi mảnh rừng chọn mẫu điển hình Diện tích mẫu S o/k (trong đó, So diện tích ngun mẫu; k số mảnh rừng lơ) Khơng giảm diện tích ô mẫu nhỏ 100 m2 Trường hợp cần thiết phải bổ sung thêm số ô mẫu đo đếm + Các tiêu đo đếm xác định phương pháp bình qn gia quyền theo diện tích + Trong trường hợp số tính tốn lẻ, phải làm tròn theo ngun tắc tốn học Nếu diện tích lô rừng bé, số lượng ô xác định theo tỷ lệ phần trăm diện tích tính tốn nhỏ 0,5 phải bố trí mẫu lơ rừng - Phương pháp rút mẫu: mẫu rút theo phương pháp chọn mẫu điển hình 2.1.2 Ơ mẫu dùng để điều tra đất khơng có rừng; bụi, thảm tươi vật rơi rụng tán tầng gỗ - Đất trảng cỏ, trảng bụi, đất canh tác nơng nghiệp, nương rẫy: diện tích tối thiểu 100 m2/ơ - Ơ mẫu điều tra độ che phủ bụi, thảm tươi tán gỗ: dựa vào ô mẫu sơ cấp dùng để điều tra tầng gỗ thiết lập (tiểu mục 1.1), tiến hành chia ô mẫu sơ cấp thành hai phần nhờ việc thiết lập đường vng góc với cạnh chiều dài ô mẫu Thiết lập đường chéo ô mẫu thứ cấp (tổng số có đường chéo) - Ơ mẫu điều tra độ che phủ vật rơi rụng: sử dụng ô dạng có diện tích m 2/ơ Bố trí bốn góc mẫu sơ cấp ô giao điểm hai đường chéo hai ô thứ cấp Tổng số ô dạng cần điều tra ô 2.2 Điều tra xác định tiêu thảm thực vật 2.2.1 Chỉ số diện tích tán (Cai, %) Chỉ số diện tích tán xác định cho tầng cao, đo đường kính tán (D T) ô tiêu chuẩn (điều tra tồn diện), sau lấy tổng diện tích tán tất chia cho diện tích tiêu chuẩn quy đổi tỷ lệ phần trăm thu số diện tích tán Cai (%) = Σ(DTtán)/DTđất rừng (1) Diện tích tán tính theo cơng thức tính diện tích hình tròn 2.2.2 Độ che phủ bụi, thảm tươi (CP, %) Độ che phủ bụi, thảm tươi xác định thông qua điều tra tuyến thiết lập (tiểu mục 1.2) Đo tổng chiều dài tuyến tổng chiều dài có bụi, thảm tươi chiếm Lập tỷ số tổng chiều dài chiếm bụi thảm tươi tổng chiều dài tuyến quy đổi tỷ lệ phần trăm thu trị số độ che phủ bụi thảm tươi Bằng cách này, tỷ lệ phần trăm diện tích biểu thị tỷ lệ phần trăm độ dài CP (%) = Lgặp bụi, thảm tươi/Lcủa tuyến điều tra (2) 2.2.3 Độ che phủ vật rơi rụng (VRR, %) Độ che phủ vật rơi rụng điều tra ô dạng thiết lập (ở tiểu mục 1.2) tương tự phương pháp điều tra tính tốn độ che phủ bụi thảm tươi VRR (%) = Lgặp VRR/Lcủa đường chéo ô dạng (3) PHƯƠNG PHÁP ĐIỀU TRA TÁI SINH RỪNG TỰ NHIÊN Phương pháp thu thập số liệu Số liệu thu thập từ hệ thống ô tiêu chuẩn điển hình, đại diện cho trạng thái rừng khu vực nghiên cứu Ô tiêu chuẩn (ƠTC) thiết lập có hình chữ nhật (25x40m) diện tích 1000m2/ơ Số liệu điều tra tái sinh thu thập dạng (ƠDB) Đã sử dụng phương pháp điều tra tái sinh khác nhau, gồm: + Phương pháp I (PP I): Chia ÔTC thành 40 phần nhau, phần gọi ÔDB có diện tích 5x5m = 25m2 Tiến hành điều tra tồn tái sinh 40 dạng Kết điều tra sử dụng làm đối chứng để đánh giá phương pháp điều tra khác + Phương pháp II (PP II): Bố trí 28 ƠDB, diện tích 4m (2x2m), ƠDB bố trí giao điểm tuyến song song cách 5m + Phương pháp III (PP III): Bố trí 12 ƠDB, có diện tích 9m (3x3m), ƠDB bố trí giao điểm tuyến song song với cạnh ÔTC + Phương pháp IV (PP IV): Bố trí ƠDB, có diện tích 16m (4x4m), ƠDB bố trí giao điểm tuyến song song với cạnh ÔTC + Phương pháp V (PP V): Bố trí ƠDB, có diện tích 25m (5x5m), ƠDB bố trí góc tâm ÔTC + Phương pháp VI (PP VI): Bố trí dải song song dọc theo chiều dài ƠTC, dải có bề rộng 1,2m (diện tích dải 40x1,2 = 48m2), dải bố trí cách cạnh dài ƠTC 5m Số ƠDB, diện tích tỷ lệ diện tích điều tra tương ứng với phương pháp thống kê bảng Bảng Thông tin phương pháp điều tra tái sinh T T Phương pháp Số ƠDB Diện tích ƠDB (m2) Tổng diện Tỷ lệ tích điều tra % điều (m ) tra I (toàn 40 25 1000 100 II 28 112 11,2 III 12 108 10,8 IV 16 96 9,6 V 25 125 12,5 VI dải 48 96 9,6 diện) Phương pháp xử lý số liệu + Mật độ tái sinh tính theo cơng thức: Trong đó: Ni/ha: mật độ loài i/ha S0: tổng diện tích ƠDB (m2) Ni: số lượng cá thể loài thứ i Dựa vào mật độ lồi để tính mật độ tái sinh cho (N/ha = Ni/ha) + Chất lượng tái sinh đánh giá theo cấp (Tốt, trung bình, xấu) + Nguồn gốc tái sinh tính theo cơng thức: Trong đó: N% tỉ lệ % số nguồn gốc hạt chồi Ni tổng số có nguồn gốc hạt chồi N tổng số tái sinh + Tổ thành tái sinh xác định theo tỷ lệ số lượng lồi có mặt ƠDB so với tổng số lồi ƠDB Tổ thành lồi tái sinh tính theo cơng thức: Trong đó: Ki hệ số tổ thành lồi i Xi số lượng cá thể loài i N tổng số lượng loài + Phân bố số tái sinh theo cấp chiều cao: Chiều cao tái sinh phân thành cấp sau: 0,5m; 0,5-0,99m; 1-1,49m; 1,5-1,99m; 2-2,99m; ≥3m Cây tái sinh triển vọng có H 1,5m + Phân bố số tái sinh mặt đất: Nghiên cứu hình thái phân bố tái sinh bề mặt đất rừng dựa vào phân bố số ô theo số ô Dựa vào tỷ số phương sai trung bình số quan sát ô chọn hệ thống bề mặt diện tích rừng (gọi tắt phương pháp tỷ số) Nếu phân bố tn theo luật Poisson tỷ số (vì theo lý thuyết phânbố Poisson có kỳ vọng phương sai) người ta chứng minh rằng: T = (W-1)/Sw Nếu giá trị tuyệt đối t < tn / , phân bố ngẫu nhiên Nếu trị số dương t > tn / , phân bố cụm Nếu trị số âm t < tn / , phân bố cách + Lựa chọn phương pháp điều tra tái sinh phù hợp: Phương pháp điều tra tái sinh phù hợp lựa chọn sở so sánh sai số tiêu biểu thị tái sinh phương pháp với phương pháp điều tra toàn diện Phương pháp chọn phương pháp có sai số nhỏ, đồng thời đáp ứng mục tiêu đề dễ thao tác đo đếm thực địa  ... bố số tái sinh mặt đất: Nghiên cứu hình thái phân bố tái sinh bề mặt đất rừng dựa vào phân bố số ô theo số ô Dựa vào tỷ số phương sai trung bình số quan sát ô chọn hệ thống bề mặt diện tích rừng... < tn / , phân bố ngẫu nhiên Nếu trị số dương t > tn / , phân bố cụm Nếu trị số âm t < tn / , phân bố cách + Lựa chọn phương pháp điều tra tái sinh phù hợp: Phương pháp điều tra tái sinh phù hợp... tái sinh phù hợp lựa chọn sở so sánh sai số tiêu biểu thị tái sinh phương pháp với phương pháp điều tra toàn diện Phương pháp chọn phương pháp có sai số nhỏ, đồng thời đáp ứng mục tiêu đề dễ