Sàng lọc các chỉ thị phân tử SNP liên quan tới tính trạng tăng trưởng ở tôm sú (Penaeus Monodon) (Luận văn thạc sĩ)

Sàng lọc các chỉ thị phân tử SNP liên quan tới tính trạng tăng trưởng ở tôm sú (Penaeus Monodon) (Luận văn thạc sĩ)Sàng lọc các chỉ thị phân tử SNP liên quan tới tính trạng tăng trưởng ở tôm sú (Penaeus Monodon) (Luận văn thạc sĩ)Sàng lọc các chỉ thị phân tử SNP liên quan tới tính trạng tăng trưởng ở tôm sú (Penaeus Monodon) (Luận văn thạc sĩ)Sàng lọc các chỉ thị phân tử SNP liên quan tới tính trạng tăng trưởng ở tôm sú (Penaeus Monodon) (Luận văn thạc sĩ)Sàng lọc các chỉ thị phân tử SNP liên quan tới tính trạng tăng trưởng ở tôm sú (Penaeus Monodon) (Luận văn thạc sĩ)Sàng lọc các chỉ thị phân tử SNP liên quan tới tính trạng tăng trưởng ở tôm sú (Penaeus Monodon) (Luận văn thạc sĩ)Sàng lọc các chỉ thị phân tử SNP liên quan tới tính trạng tăng trưởng ở tôm sú (Penaeus Monodon) (Luận văn thạc sĩ)Sàng lọc các chỉ thị phân tử SNP liên quan tới tính trạng tăng trưởng ở tôm sú (Penaeus Monodon) (Luận văn thạc sĩ)Sàng lọc các chỉ thị phân tử SNP liên quan tới tính trạng tăng trưởng ở tôm sú (Penaeus Monodon) (Luận văn thạc sĩ)

Số hoá bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn

VIỆN SINH THÁI VÀ TÀI NGUYÊN SINH VẬT

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN

TRẦN XUÂN THẠCH

SÀNG LỌC CÁC CHỈ THỊ PHÂN TỬ SNP LIÊN QUAN TỚI

TÍNH TRẠNG TĂNG TRƯỞNG Ở TÔM SÚ (PENAEUS

MONODON)

LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC

Số hoá bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn

Hà Nội - 2015

Số hoá bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn

VIỆN SINH THÁI VÀ TÀI NGUYÊN SINH VẬT

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN

TRẦN XUÂN THẠCH

SÀNG LỌC CÁC CHỈ THỊ PHÂN TỬ SNP LIÊN QUAN TỚI

TÍNH TRẠNG TĂNG TRƯỞNG Ở TÔM SÚ (PENAEUS

MONODON)

Chuyên ngành: Sinh học thực nghiệm

Mã số: 60420114

LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC

HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: PGS.TS ĐINH DUY KHÁNG

Số hoá bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn

Hà nội - 2015

Số hoá bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn

LỜI CẢM ƠN

Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới PGS.TS Đinh Duy Kháng, Phòng Vi sinh vật học phân tử, Viện Công nghệ sinh học, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam đã tận tình chỉ bảo, hướng dẫn tôi hoàn thành luận văn tốt nghiệp

Tôi xinchân thành cảm ơn PGS.TS Đồng Văn Quyền – Trưởng phòng Vi sinh vật học phân tử, Viện Công nghệ sinh học và các anh chị cán bộtrong Phòng đãtạo mọi điều kiện thuận lợi để tôi được thực tập tại phòng, được học hỏi và nâng cao kiến thức chuyên môn

Tôi cũng xin gửi lời cảm ơn tới TS Nguyễn Cường – Trưởng phòng Tin sinh học, Viện Công nghệ sinh học và các anh chị em cán bộ trong phòng đã nhiệt tình giúp đỡđể tôi có thể hoàn thành những kết quả nghiên cứu cuối cùng Cuối cùng, tôi xin gửi lời cảm ơn tới gia đình, người thân và bạn bè đã luôn giúp đỡ, động viên và tạo điều kiện tốt nhất để tôi được học tập, nghiên cứu và hoàn thành luận văn tốt nghiệp của mình

Hà Nội, ngày 28tháng12 năm 2015

Học viên

Trần Xuân Thạch

Số hoá bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn

0 MỤC LỤC

MỞ ĐẦU 1

CHƯƠNG I TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3

1.1 Sơ lược về tôm sú 3

1.2 Khái quát về tính trạng tăng trưởng 4

1.2.1 Di truyền tính trạng 4

1.2.2 Tính trạng tăng trưởng 5

1.2.3 Một số gene liên quan tới tính trạng tăng trưởng 6

1.2.4 Một số nghiên cứu về tính tăng trưởng 10

1.3 Hệ phiên mã 11

1.4 Chỉ thị phân tử SNP 12

1.4.1 Giới thiệu về SNP 12

1.4.2 Ứng dụng của chỉ thị SNP 14

1.4.3 Triển vọng của SNP 15

1.5 Tình hình nghiên cứu về chỉ thị SNP ở tôm 18

1.6 Công nghệ giải trình tự thế hệ mới 19

CHƯƠNG II VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 22

2.1 Đối tượng và vật liệu nghiên cứu 22

2.1.1 Đối tượng nghiên cứu 22

2.1.2 Hóa chất và sinh phẩm 22

2.1.3 Trang thiết bị 22

2.2 Phương pháp nghiên cứu 23

2.2.1 Phương pháp tách chiết RNA tổng số 23

2.2.2 Phương pháp tinh chế mRNA 23

2.2.3 Tạo thư viện cDNA 25

2.2.4 Phương pháp Phân tích dữ liệu 27

CHƯƠNG III KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 30

3.1 Tinh chế mRNA từ RNA tổng số 30

3.2 Tạo thư viện cDNA 30

3.3 Phân tích dữ liệu và tìm các SNP liên quan đến tính trạng tăng trưởng 34 3.3.1 Đánh giá chất lượng và tiền xử lý dữ liệu 35

Số hoá bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn

3.3.2 Lắp ráp de-novo hệ phiên mã 40

3.3.3 Phát hiện marker SNP trong ngân hàng unigene 41

3.3.4 Chú giải chức năng unigene trong hệ phiên mã 42

3.3.5 Phát hiện những unigene liên quan tới tính trạng tăng trưởng 45

3.3.6 Sàng lọc SNP liên quan đến tính trạng tăng trưởng tôm sú 46

CHƯƠNG IV KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 47

4.1 Kết luận: 47

4.2 Kiến nghị: 47

TÀI LIỆU THAM KHẢO 48

PHỤ LỤC 52

Phụ lục 1: Thống kê Unigene và các gene liên quan tới tăng trưởng 52

Phụ lục 2 Tên unigene, vị trí và SNP liên quan tới tính trạng tăng trưởng 60

Số hoá bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn

DANH MỤC HÌNH

Hình 1.1 Sơ đồ vòng đời tôm sú Penaeus monodon 4

Hình 1.2 Mô hình SNP 12

Hình 2.1 Tôm sú thu từ vùng biển Nghệ An 22

Hình 3.1 Kiểm tra chất lượng thư viện cDNA của mô cơ 31

Hình 3.2 Kiểm tra chất lượng thư viện cDNA của mô tim 32

Hình 3.3 Kiểm tra chất lượng thư viện cDNA của mô gan tụy 33

Hình 3.4 Kiểm tra chất lượng thư viện cDNA của mô gốc mắt 34

Hình 3.5 Kết quả đánh giá chất lượng dữ liệu thô và dữ liệu tinh sạch 39

Hình 3.6 Thống kê phân bố độ dài unigene 41

Hình 3.7 Phân bố tần số allele trong toàn bộ SNP 42

Hình 3.8 Tỷ lệ biến đổi transition và transversion 42

Hình 3.9 Kết quả 10 loài tương đồng nhất trên cơ sỡ dữ liệu Nr 43

Hình 3.10 Sự phân bố chất lượng unigene tôm sú 44

Hình 3.11 Biểu đồ phân bố tỷ lệ tương đồng 44

DANH MỤC BẢNG Bảng 3.1 Nồng độ mRNA của 4 mô 30

Bảng 3.2 Mô tả bộ dữ liệu sau khi giải trình tự 35

Bảng 3.3 Thống kê số lượng độ dài trình tự của 4 mô 36

Bảng 3.4 Thống kê chất lượng lắp ráp 40

Bảng 3.5Số lượng gene và hormone phát hiện 45

Số hoá bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn

KÍ TỰ VIẾT TẮT

Nr_NCBI)

0 MỞ ĐẦU

Tôm sú là loài thủy sản mang lại giá trị kinh tế lớn, hiện nay đang được nhiều nước chú trọng phát triển như: Thái Lan, Việt Nam, Hàn Quốc, Đài Loan, Malaysia, Indonesia, Ấn Độ… Nghề nuôi tôm sú có ưu thế lớn, vì đây

là nguồn tài nguyên bản địa có thể nuôi và khai thác lâu dài, mang lại lợi nhuận cao, xóa đói giảm nghèo và phát triển kinh tế xã hội của mỗi nước Tuy nhiên, việc sử dụng nguồn giống còn thụ động, tự nhiên, khiến chất lượng tôm sú sản xuất không đảm bảo, có dấu hiệu suy giảm sinh trưởng, mang mầm bệnh và tiềm ẩn nhiều rủi ro cho người nuôi tôm

Thông tin về cấu trúc phân tử hệ gen của tôm sú đang là vấn đề quan trọng và được quan tâm lớn đối với công tác chọn giống tôm Nghiên cứu hệ gen sẽ cung cấp thông tin chính xác cho việc xác định tính trạng quan trọng như: tính tăng trưởng, tính kháng bệnh, tính chống chịu… để từ đó có thể sàng lọc ra con giống sạch bệnh, năng suất cao, thân thiện với môi trường Hiện nay, những hiểu biết cơ bản về sinh học tôm, đặc biệt quan tâm đến

sự điều khiển sinh trưởng, sinh sản và hệ thống miễn dịch còn rất hạn chế do thiếu thông tin về hệ gen của chúng Một trong các hướng đi quan trọng của nghiên cứu hệ gen tôm sú là xác định các biến dị ảnh hưởng tới chức năngsinh lý của tôm

Với mục đích trên, chúng tôi tiến hànhnghiên cứu “Sàng lọc các chỉ thị

phân tử SNP liên quan tới tính trạng tăng trưởng ở tôm sú (Penaeus

monodon)”, mục tiêu sàng lọc các chỉ thị phân tử SNP và tìm vị trí SNP trên

những gen liên quan tới tính trạng tăng trưởng, nhằm cung cấp thông tin tìm được phục vụ cho công tác nghiên cứu các gen chức năng, công tác chọn tạo giống và bảo tồn giống tôm bản địa

Đề tài đƣợc thực hiện tại Phòng Vi sinh vật học phân tử, Viện Công nghệ sinh học, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam

1 CHƯƠNG I TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Sơ lược về tôm sú

Theo hệ thống phân loại của Holthui (1980) và Barnes (1989), tôm sú thuộc:

Ngành: Arthopoda (Chân khớp)

Lớp: Crustacea (Giáp xác)

Lớp phụ: Malacostraca

Bộ: Decapoda (Mười chân)

Bộ phụ: Macrura natantia (Bơi lội)

Họ: Penaeidae (Tôm he)

Giống: Penaeus

Loài: Penaeus monodon

Tên tiếng Anh: Black Tiger Shrimp

Tên địa phương : Tôm Sú , tôm Rong

Tên đồng nghĩa:

- Penaeus monodon Fabricius, 1798; Latreille, 1803 ;H.Milne Edwards,

1837; Bate, 1881; Miers, 1884;[24];Dall, 1957; Hall, 1962

- Penaeus carinatus Dana, 1852; Kemp, 1918

- Penaeus tahitensis Heller, 1862

- Penaeus semisulcatus exsulcatus Hilgeldorf, 1879

- Penaeus coeruleus Stebbing, 1905

- Penaeus bubulus[24]

- Penaeus monodon monodon Burkenroad, 1959

- Penaeus (Penaeus) monodon[3, 17]

Về đặc điểm sinh học, tôm sú là loài sống ở nơi chất đáy là bùn pha với cát ở độ sâu ven bờ đến 40m nước và độ mặn từ 5 – 34 ‰.Tôm sú có đặc điểm thường sinh trưởng nhanh, trong 3 – 4 tháng có thể đạt cỡ trung bình 40

– 50 g Tôm trưởng thành tối đa với con cái có chiều dài từ 220 – 250 mm, trọng lượng đạt từ 100 – 300 g, con đực dài từ 160 – 200 mm, trọng lượng đạt

từ 80 – 200 g Tôm có tính ăn tạp, thức ăn ưa thích là các loài nhuyễn thể, giun nhiều tơ và giáp xác Về mặt phân bố, ở nước ta tôm phân bố từ Bắc vào Nam, từ ven bờ đến vùng có độ sâu 40 m, vùng phân bố chính là vùng biển các tỉnh Trung bộ

Hormone điều khiển sự tăng trưởng của tôm là Gonal inhibiting hormone (GIH), được sản xuất bởi tế bào thần kinh trong cơ quan Xcủa cuống mắt, vận chuyển tới xinap của tuyến giáp đưa vào kho dự trữ và khi cần thì tiết ra, nên khi cắt mắt của tôm sẽ thúc đẩy chu kỳ lột xác, đem lại sự thành thục mau chóng hơn [4]

Hình 1.1Sơ đồ vòng đời tôm sú Penaeus monodon

1.2 Khái quát về tính trạng tăng trưởng

1.2.1 Di truyền tính trạng

Di truyền là hiện tượng chuyển những tính trạng của cha mẹ cho con cái thông qua gen của bố mẹ Trong sinh học, di truyền chuyển những đặc

trưng sinh học từ một sinh vật cha mẹ đến con cái và nó đồng nghĩa với di chuyển gen, gen thừa nhận mang thông tin sinh học (hay thông tin di truyền)

Tính di truyền biểu hiện ở sự giống nhau của các tính trạng giữa thế hệ này và thế hệ khác Đặc tính di truyền cho phép thế giới sinh vật bảo toàn nòi giống Trải qua nhiều thế hệ nối tiếp nhau nhưng những đặc tính di truyền không bị mất đi, thế hệ con cháu luôn có những đặc điểm giống bố mẹ, ông

1.2.2 Tính trạng tăng trưởng

Là sự tương tác của nhiều gen hình thành nên một tính trạng trong cơ thể và biểu hiện ra bên ngoài có thể là: tính kháng bệnh, tính chống chịu, tính trạng tăng trưởng…, đôi khi là sự thay đổi của một vị trị trong gen (SNP) hay

sự lặp lại của các base (microsatellites) có thể tạo ra một tính trạng hoàn toàn mới Tính trạng tăng trưởng và bệnh di truyền thông qua sự biểu hiện gen và mRNA ổn định

Tính trạng tăng trưởng có hệ số di truyền ở mức trung bình đến cao trên hầu hết các loài cá, tôm Điều này cho phép tính trạng tăng trưởng có thể được cải thiện từ 10 đến 20% [13],mỗi thế hệ chọn giống và về lý thuyết thì tốc độ tăng trưởng có thể được tăng gấp đôi sau 5 đến 6 thế hệ chọn lọc Yếu tối môi trường ảnh hưởng rất lớn tới tỷ lệ tăng trưởng (chế độ ăn uống, khẩu

phần thức ăn, mật độ thả giống, nhiệt độ, độ mặn, oxy hòa tan, các mầm bệnh

và hoạt động của các protein mã hóa, hoặc gây ra những thay đổi các yếu tố quy định trong quá trình phiên mã mRNA[20]

Những gene dưới đây có khả năng ảnh hưởng tới yếu tố tăng trưởng của những loài giáp xác dựa trên các nghiên cứu trước đó trong các loài sinh vật hoặc một số mô hình loài

1 5-Hydroxytryptamine receptor (5-HT): một amin neurotransmitter được tìm thấy trong hệ thần kinh của tất cả các loài sinh vật, ảnh hưởng tới sự

đa dạng các chức năng sinh lý, hành vi và nhận thức Trong loài giáp xác, hormone Serotinin não được sinh ra có thể kích hoạt một số hormone khác gồm: hormone hyperglycaemic (CHH), hormone đỏ pigmendispersing, hormone thay lông neurodepressing và ức chế hormonr MIH(Moult-inhibiting hormone) [20]

2 Alpha-amylase: Trong động vật giáp xác, duy trì mức độ thích hợp glucose trong huyết tương là điều cần thiết để hỗ trợ một số chức năng sinh lý quan trọng và để ứng phó với một loạt các yếu tố gấy stress môi trường

3 Cathepsin L: được quy ước là thành phần chính của hệ thống lysosome phân giải protein Khả năng thu nhận và phân giải protein thừa

4 Cyclophilin(Cyps): chứa một số isomerasa bảo tồn peptidylpoly

cis-transđơn, biểu hiện phong phú các protein cytosolic Các nghiên cứu về

cyclophilins ở động vật thủy sinh chứng minh nó đóng vai trò quan trọng trong hệ thống miễn dịch bẩm sinh

5 Fatty acid-binding protein (FANTs): là protein cytosolic nhỏ (~15 kDa) chủ yếu là acid béo, là những gene quan trọng liên quan đến sự phát triển tính trạng lipit (chất béo)

6 Fibrillarin: là một protein dài 40 kDa nằm trong các thành phần sợi nhỏ dày đặc của hạch nhân, có chức năng thiết yếu liên quan đến RNA nối và

xử lý rRNA

7 Glyceradehyde-3-phosphate dehydrogenase (GAPDH): là enzym glycolytic để biến đổi glyceraldehyde-3-phosphate thành 1,3-bisphosphoglycerate, chúng tham gia vào nhiều quá trình tế bào ngoài clycolysis, vài trò chức năng gồm: sửa chữa DNA, tRNA Trong khi GAPDH thường được sử dụng như là một gen kiểm soát biểu hiện

8 Growth hormone and insulin-like growth factor:axit somatotropic cơ bản bao gồm các hoc môn: growth hormone-releasing hormone (GHRH), growth hormone (GH), insulin-like growth factors (IGF-I and -II), một số protein mang và cơ quan cảm thụ Nói chung, các đường truyền tín hiệu của hormone insulin có thể điều chỉnh sự hấp thu glucose, axit béo, amino axit dẫn tới các mô mỡ động vật, mô cơ và gan, thúc đẩy việc lưu trữ các chất dinh dưỡng dưới dạng glycogen Sự tích lũy axit IGF, IGFs, IGFRs và sức mạnh của họ IGFNTs (IGF binding proteins), chúng cùng nhau kiểm soát một số quá trình sinh học quan trọng bao gồm: tăng trưởng của tế bào, tăng sinh tế bào, biệt hóa tế bào và di cư tế bào

9 Myostatin and growth differentiation factor 8/11: Myostatin (MSTN)còn được gọi là growth differentiation factor-8 (GDF-8), là một chất ức chế autocrine/paracrine quan trọng của sự phát triển cơ xương và là thành viên của họ lớn transforming growth factor-β (TGF-β) GDF-11 cũng là một hormone có liên quan chặt chẽ của siêu họ TGF- β được cho là có nguồn gốc từ một gen tổ tiên

10 Signal transducer and activator of transcription (STAT): là một trong những con đường tín hiệu chính trong các tế bào nhân chuẩn Con đường này sử dụng trong một loạt các quá trình tăng trưởng và phát triển ở nhiều mô để kiểm soát tế bào: tăng sinh, biệt hóa và xử lý tế bào chết Nó còn có vai trò trong quá trình miễn dịch virut ở động vật giáp xác và côn trùng

11 Secreted protein acidic and rich in cysteine (SPARC): còn được gọi là osteonectin hoặc basement membrane protein 40 (BM40), là một bó collagen, protein chống dính thuộc nhóm matricellular của protein SPARC tham gia vào một loạt các quá trình sinh học (phát triển, sửa chữa mô) và một số chức năng sinh lý (lắp ráp và cấu tạo lưới ngoại bào, điều chỉnh nhiều đường truyền tín hiệu nội bào, di cư tế bào, độ bám dính, tăng sinh và biệt hóa)

12 Translin-associated factor X (TRAX): translin và protein liên kết của nó,là thành phần của một RNA phức tạp liên quan đến nhiều hoạt động sinh học trong đó chúng có thể quy định sự tăng trưởng của tế bào, xử lý mRNA, sinh tinh, phát triển tế bào thần kinh và chức năng, ổn định hệ gen quy định và khu vực gây ung thư

13 Candidate growth genes effect on moulting: Neuropeptid là nhóm lớn nhất và đa dạng nhất của nội tiết phân tử tín hiệu trong hệ thống thần kinh giáp xác Ở loài giáp xác, sự lột xác định kỳ là quá trình sinh lý quan trọng nhất cần thiết cho sự tăng trưởng và phát triển bao gồm quá trình lột

xác và sự tái sinh Chúng được 2 neuropeptide điều khiển: inhibiting hormone (MIH) and crustacean hyperglycaemic hormone (CHH) được sản xuất trong các tuyến xoang X-organ (X-organ sinus gland complex: XOSG) nằm trong hạch quang của mắt

moult-14 Actin: protein cấu trúc có mặt mọi nơi trong tế bào nhân chuẩn Sợi actin tạo nên sức mạnh cho các cơ, kết nối với các tế bào khác

15 Crustacean hyperglycaemic hormone (CHH): liên quan chủ yếu trong điều chỉnh glucose trong huyết tương, cũng như trong quá trình chuyển hóa carbohydrate và chất béo

16 Eyestalk factors:ở động vật xác có chứa các tế bào neurosecretory được cho là có liên quan đến tính quy định sự lột xác Từ khi lột xác có liên quan trực tiếp đến sự phát triển cơ bắp và tăng trưởng ở động vật giáp xác.Nghiên cứu thực nghiệm cho thấy: việc cắt bỏ mắt dường như là cách hiệu quả nhất để ảnh hưởng đến lột xác và tăng trưởng vì nó ảnh hưởng trực tiếp đến hệ thống nội tiết [20].Nghiên cứu trên loài Cua (Scylla serrata): yếu tố quy định tốc độ tăng trưởng eyestalk factor dựa trên sự tăng trưởng của tim, vai trò của eyestalk factor và hormone gây lột xác điều khiển sự tăng trưởng ở tim[5]

17 Moult inhibiting hormone (MIH):giữ vai trò điều chỉnh quan trọng steroid trong YO (Y-organs), hormone này được sản xuất bởi các tế bào soma neurosecretory ở hành não của XO (X-organs)duy trì trong cơ thể động vật ở thời kì lột xác, trong khi 2 hormone MIH và CHH liên quan đến quy định độ dài thời kì lột xác

18 Candidate muscle build-up or degradation genes involved in moulting:sự tăng trưởng mô cơ ở động vật giáp xác là không liên tục và chúng chỉ tăng trưởng sau khi xảy ra quá trình lột xác Trong suốt quá trình lột xác,

sự phục hồi các mô cơ và dự trữ năng lượng gồm: glycogen và lipid được tích lũy trong huyết tương và ruột giữa cho quá trình lột xác tiếp theo Nói

chung tổng hợp protein cho mô cơ là rất quan trọng cho sự tăng trưởng, sinh sản và các hoạt động trao đổi chất khác trong động vật giáp xác

19 Methyl farnesoate (MF)and farneosoic acid O-methyltransferase (FAMeT): MF là tiền thân của hormone JHIII (juvenile hormone III), là một sesquiterpenoid được tổng hợp trong cơ quan hàm dưới giáp xác Hợp chất sesquiterpenoid phục vụ trong vai trò tiến hóa được bảo tồn chức năng như: điều chỉnh hoặc điều khiển lột xác, sinh sản, phát triển của ấu trùng, tăng trưởng, hình thái, hành vi, stress và sự tổng hợp protein nói chung Vai trò của MF và FAMeTnhư một morphogene, FAMeT được tìm thấy rất nhiều trong giai đoạn lột xác ở loài Cua xanh

20 Heat shock proteins (HSPs): là protein phổ biến, phong phú nhất, được tìm thấy trong tất cả các sinh vật HSP tham gia vào nhiều chức năng tế bào thiết yếu, bao gồm sự trao đổi chất, tăng trưởng, quá trình biệt hóa và giết chết tế bào

21 Myosin heavy chain: Myosins là thành phần quan trọng của bộ máy co bóp, bao gồm hai chuỗi nặng và bốn chuỗi nhẹ liên quan Là một siêu họ của protein, myosins tương tác với actin, thủy phân ATP, hình thành chức năng phát triển cơ và duy trì hiệu lực

22 Ubiquitin: thường gắn các protein khác trong tế bào như một monomer hay polymer để điều chỉnh hoạt động của chúng Thoái hóa protein được thực hiện chủ yếu ở các hệ thống Ubiquitin, kiểm soát chu kỳ tế bào, truyền tín hiệu, sửa chữa choromatin, quy định phiên mã, quá trình vận chuyển hạt nhân và các thụ thể màng Ở động vật có vú, nơi tăng biểu hiện Ubiquitin xảy ra trong quá trình teo cơ

1.2.4 Một số nghiên cứu về tính tăng trưởng

Thành phần cơ bản của một chương trình chọn giống bao gồm xác định mục tiêu chọn giống và ước tính các thông số di truyền cơ bản bao gồm hệ số

di truyền, tương quan di truyền giữa các tính trạng Hầu hết các chương trình chọn giống trên động vật nuôi đều bắt đầu bằng việc nâng cao tốc độ sinh trưởng[28] Tốc độ tăng trưởng nhanh có thể cho phép rút ngắn thời gian nuôi hoặc sản xuất được những con vật nuôi có trọng lượng lớn hơn trong cùng một khoảng thời gian nuôi Cả 2 trường hợp đều đem lại hiệu quả kinh tế cao hơn cho người nuôi

Tuy vậy, gần đây cũng có những nghiên cứu nhằm ước tính các thông số

di truyền tính trạng tăng trưởng hoặc nhiều tính trạng khác nhau trong đó có

tính trạng tăng trưởng trên giáp xác, những nghiên cứu này bao gồm: tôm thẻ

chân trắng (P vannamei) [12]; [33][31, 32], tôm sú (P monodon) [26].Một

số nghiên cứu nhằm ước tính hệ số di truyền tính trạng tăng trưởng ở nhiều độ tuổi khác nhau hoặc giữa con đực và con cái [22]

1.3 Hệ phiên mã

Hệ phiên mã (transcriptomes) là một bộ các phân tửRNA tại một thời điểm xác định, biểu hiện trong một tế bào, mô, sinh vật cụ thể Đó là một bộ các ARN mã hóa và không mã hóa Hệ phiên mã trải qua các thay đổi về số lượng và chất lượng, phản ánh các quá trình sinh lý tự nhiên hoặc do các kích thích bên ngoài [19] Việc phân tích thành phần hệ phiên mã giúp hiểu thêm

cơ chế hoạt động của sinh vật.Không giống như một bộ gen, transcriptomerất linh hoạtvới các biến thể, nó làmộtliên kết độnggiữacácgen vàđặc tính vật lýcủa một sinh vật[43] Có thể hiểutranscriptomecung cấpthông tinvề các khía cạnhkhác nhaucủasinh học tế bàovàsinh hóa; ví dụ sốlượnggen hoạt độngtrong các giai đoạnphát triển khác nhauhoặcthay đổibiểu hiện genliên quan đếnmột căn bệnhđặc biệt[27]

Mục đíchchính củamột nghiên cứutranscriptomeđể xác định vị trí chotất cả cácRNA thể hiện trong cácmôđược nghiên cứu, xác định cấu trúcphiên mãcủacác gen(5 'và 3' kết thúc, mô hìnhnốivàsửa đổisauphiên

mãkhác) và để định lượngmức độ biểu hiệncủa mỗiRNAđiều kiện sinh lýkhác nhau[45].Hiểuphức tạp hơn chức năngcủamộttranscriptomelàmột nhiệm vụđầy thách thứcnhưphần lớn các genđược phiên mãtheo hai chiều [30]

1.4 Chỉ thị phân tử SNP

1.4.1 Giới thiệu về SNP

Đa hình đơn nucleotide, hoặc SNP là những biến dị trong trình tự DNA xảy ra khi một nucleotide đơn (A, T, C, hoặc G) trong trình tự hệ gen bị thay đổi Ví dụ, một SNP có thể thay đổi trình tự GGCTAAA thành GGCTAAT Nếu một biến thể được coi là có một SNP thì SNP này phải được quan sát ít nhất là 1% toàn bộ số lượng nucleotide SNP tạo nên khoảng 90% biến dị di truyền của con người Phần lớn SNP liên quan đến sự thay thế của cytosine (C) với thymine (T)

Hình 1.2Mô hình SNP

Chỉ thị phân tử SNP (Single Nucleotide Polymorphism), có nghĩa là các dạng đa hình đơn nucleotide Marker này thường được dùng để phân tích genome người và hiện nay được áp dụng (qua đột biến điểm tại một nucleotide trên genome) với số lượng lớn nhất từ trước đến nay cho nhiều genome của sinh vật khác SNP có thể nằm trong trình tự mã hóa của gen, các khu vực không mã hóa, hoặc nằm giữa các gen SNP phân bổ trong hệ gen

không đồng nhất nhưng phần lớn chúng nằm trong vùng không mã hóa thường xuyên của gen Khi SNP nằm trong một trình tự mã hóa thì không nhất thiết sẽ thay đổi trình tự axit amin của protein được sản xuất do tính thoái hóa của mã di truyền SNP nằm trong vùng mã hóa có hai loại chính là SNP đồng nghĩa và SNP vô nghĩa SNP đồng nghĩa sẽ không ảnh hưởng đến trình

tự của chuỗi polypeptide SNP nằm ở vùng không mã hóa hoặc nằm giữa các gen có thể ảnh hưởng đến các yếu tố phiên mã hay các loại RNA [42]

Chỉ thị SNP xảy ra thường xuyên trong toàn bộ DNA của một người Trung bình một SNP được quan sát thấy một lần trong 300 nucleotide, có nghĩa là có khoảng 10 triệu SNP trong hệ gen của con người Thông thường, những SNP này được tìm thấy trong DNA giữa các gen Nó được xem như là dấu chuẩn sinh học giúp xác định vị trí các gen liên quan đến bệnh Khi SNP xảy ra trong gen hoặc trong một khu vực gần một gen quy định, nó có thể có vai trò trực tiếp trong việc biểu hiện bệnh bằng cách ảnh hưởng đến chức năng của gen[42]

Mặc dù hơn 99% trình tự DNA của con người đều giống nhau nhưng

sự thay đổi trong chuỗi DNA có thể có tác động lớn đến việc nghiên cứu mối tương quan giữa cơ thể con người và các yếu tố gây bệnh như vi khuẩn, virus, độc tố, Điều này chứng tỏ SNP có giá trị trong nghiên cứu y sinh học và phát triển các sản phẩm dược phẩm hoặc chẩn đoán y khoa SNP cũng tiến hóa ổn định, không thay đổi nhiều từ thế hệ này sang thế hệ khác làm cho chúng ta dễ dàng hơn khi nghiên cứu dân số[46]

Chỉ thị phân tử SNP là những biến dạng của chuỗi DNA được tìm thấy với tần suất cao trong genome người[39] Chúng ta có thể sử dụng SNP marker để phân lập các yếu tố di truyền có liên quan đến tính trạng bệnh lý vô cùng phức tạp[40] Người ta có thể dự đoán 100.000 hoặc nhiều hơn nữa SNP marker trong genome người[9] Những phương pháp đánh giá kiểu gen có kết

quả cao đòi hỏi lượng kiến thức về chuỗi trình tự rất chính xác của SNP Do

đó, bất cứ công bố nào về SNP phải hàm chứa hai nội dung:

(1) Xác định chuỗi trình tự DNA

(2) Tần số alen

Có hai phương pháp để tạo ra SNP, một là dùng trực tiếp mã trình tự di truyền và thứ hai là phân biệt các đột biến điểm thông qua tách sắc ký lỏng (High Performance Liquid Chromatography)

1.4.2 Ứng dụng của chỉ thị SNP

Một chiến lược nghiên cứu giúp cho việc phát hiện nhanh chóng những SNP từ số liệu lưu trữ Expressed Sequence Tag (EST)[34] Việc phát triển kỹ

thuật in-vitro nhằm khuếch đại những trình tự ở vị trí đặc biệt (ví dụ như

PCR) và khám phá marker có tính đa hình cũng như có thông tin di truyền cao như microsatallite, STR, đã và đang tạo điều kiện thuận lợi để lập bản đồ di truyền có mật độ thấp (low density map) của người Những dạng bản đồ này ngoài những ứng dụng hiệu quả trong lĩnh vực nghiên cứu khoa học động thực vật nó còn ứng dụng trong y khoa, ví dụ xét nghiệm bệnh u xơ, bệnh Huntington, bệnh tiểu đường …[7]

Chỉ thị SNP không gây bệnh, nhưng nó có thể giúp chúng ta chẩn đoán một căn bệnh di truyền cụ thể Các nhà khoa học tin rằng bản đồ SNP sẽ giúp

họ xác định được nhiều gen liên quan đến các bệnh phức tạp như ung thư, bệnh tiểu đường Bằng cách nghiên cứu mối liên quan của SNP với một đặc điểm bệnh, các nhà nghiên cứu đã phát hiện các gen có liên quan đến một căn bệnh Xác định và hiểu biết về vai trò của yếu tố di truyền của bệnh cũng sẽ cho phép các nhà nghiên cứu đánh giá tốt hơn vai trò của yếu tố di truyền, chẳng hạn như hành vi, chế độ ăn uống, lối sống và hoạt động thể chất của bệnh

Hầu hết các chỉ thị phân tử SNP không có ảnh hưởng đến sức khỏe hoặc sự phát triển Một số những sai khác di truyền đã được chứng minh là rất quan trọng trong việc nghiên cứu về sức khỏe con người Các nhà nghiên cứu

đã phát hiện SNP có thể giúp dự đoán phản ứng của một cá thể với một số loại thuốc nhất định, dự đoán độ nhạy với các yếu tố môi trường như chất độc

và nguy cơ phát triển các bệnh cụ thể SNP cũng có thể được sử dụng để nghiên cứu quá trình di truyền của các gen bệnh trong gia đình Các nghiên cứu trong tương lai sẽ xác định SNP liên quan đến các bệnh phức tạp như bệnh tim, tiểu đường và ung thư

Ngoài ý nghĩa nghiên cứu pharmacogenomic trong chẩn đoán, y sinh học, bản đồ SNP còn giúp để xác định hàng ngàn các dấu hiệu bổ sung trong

bộ gen, do đó hướng nghiên cứu của bản đồ hệ gen là rất lớn SNP không thay đổi nhiều từ thế hệ này sang thế hệ khác làm cho chúng ta dễ dàng hơn khi nghiên cứu về tiến hóa Nghiên cứu về SNP cũng có vai trò cực kì quan trọng trong việc sàng lọc hay tuyển chọn các giống cây trồng, vật nuôi bằng marker

do đó nó có thể được sử dụng để tìm kiếm và phân lập các gen gây bệnh

Để thực hiện một thí nghiệm di truyền, gen gây bệnh nào đó được xác định bởi các nhà khoa học bằng cách thu thập mẫu máu từ một nhóm các cá

nhân bị ảnh hưởng bởi căn bệnh này và phân tích SNP trên các mẫu DNA của

họ Tiếp theo, các nhà nghiên cứu so sánh các mẫu hình này với các mẫu hình SNP thu được bằng cách phân tích SNP trên các mẫu DNA từ một nhóm các

cá nhân không bị ảnh hưởng bởi căn bệnh này Loại so sánh này có thể phát hiện sự khác biệt giữa các mẫu hình SNP của hai nhóm và qua đó cho thấy mẫu hình có thể có liên quan nhiều đến gen gây bệnh Cuối cùng, hồ sơ SNP đặc trưng của nhiều loại bệnh khác nhau sẽ được thành lập Sau đó, chỉ là vấn

đề thời gian, các bác sĩ có thể xác định một người có thể nhạy với một căn bệnh nào đó chỉ bằng cách phân tích các mẫu DNA của họ đối với một mẫu hình SNP cụ thể

 Phát triển SNP và dược phẩm

Hiện nay, không có phương pháp đơn giản nào để xác định một bệnh nhân sẽ đáp ứng miễn dịch với một loại thuốc cụ thể như thế nào Một loại thuốc cụ thể có hiệu quả cho một bệnh nhân nhưng cũng có thể không có hiệu quả ở những người khác Tệ hơn nữa, một số bệnh nhân có thể trải qua một phản ứng miễn dịch bất lợi với chính loại thuốc đó

Trong tương lai, các loại thuốc thích hợp nhất cho một cá nhân có thể được xác định trước điều trị bằng cách phân tích hồ sơ SNP của bệnh nhân Mục tiêu là tạo một loại thuốc phù hợp cho cá nhân đó Điều này sẽ cho phép các công ty dược phẩm sản xuất nhiều loại thuốc hơn cho thị trường và cho phép các bác sĩ kê đơn phù hợp điều trị cho từng cá nhân cụ thể

 SNP và National Center for Biotechnology Information (NCBI)

Chỉ thị phân tử SNP xảy ra thường xuyên trong hệ gen và tương đối ổn định về mặt di truyền, nên nó là dấu chuẩn sinh học Dấu chuẩn sinh học là các đoạn DNA có một vị trí xác định, dễ dàng nhận dạng cũng như theo dõi Dấu chuẩn này cho phép các nhà khoa học nghiên cứu và xác định những kết quả từ sự tương tác của nhiều gen NCBI đóng một vai trò quan trọng trong

việc tạo điều kiện thuận lợi cho việc xác định và định danh SNP thông qua việc tạo và duy trì cơ sở dữ liệu SNP NCBI tạo điều kiện thuận lợi cho nghiên cứu SNP Người dùng có thể truy cập The Single Nucleotide Polymorphism Database (dbSNP) trực tiếp hoặc tìm kiếm một phần bất kỳ trong NCBI để xây dựng một bộ hồ sơ dbSNP đáp ứng các điều kiện tìm kiếm của họ Hồ sơ cũng được tích hợp với các nguồn thông tin bên ngoài thông qua chương trình Uniform Resource Locator (URL) mà người dùng dbSNP làm theo để tìm hiểu thông tin chi tiết vượt ra ngoài phạm vi của dbSNP

Cung cấp các dữ liệu SNP sẽ tạo điều kiện nghiên cứu khoa học trong nhiều mức độ khác nhau, từ di truyền quần thể và hay đến sinh học tiến hóa quy mô lớn Đầu tư lâu dài trong các nghiên cứu hứa hẹn không chỉ để nâng cao tuổi thọ con người mà còn để “cách mạng hóa” trong thực nghiệm y học hiện đại

 Một vài nghiên cứu về chỉ thị SNP

Chỉ thị phân tử SNP (single nucleotide polymorphism) làmarker chỉsaikhácmộtnucleotidecủa trình tự DNA, xuất hiện ởtần suất cao khi sàng lọc SNP của đa số các hệ gen, cứ khoảng 225 nt là tìm thấy 1 SNP trên bộ gen

gà và khoảng 1.250 nt là sàng lọc được 1 SNP cho bộ gen người[25] Điều quan trọng là SNP có thể xuất hiện ở vùng gen mã hoá, tác động trực tiếp đến tính trạng quan tâm, rất hiệu quả trong việc xác định mối tương quan giữa SNP và tính trạng nào đó[6] Mặc dù ứng dụng SNPtrong các chương trình chọn giống còn mới mẻ, gần đây SNP đã được sử dụng để sàng lọc các gen tiềm năng liên quan đến tính trạng tăng trưởng của một số đối tượng thuỷ sản,

alpinus[41],cáchẽm[47],tômthẻchântrắngLitopenaeusvannamei và tôm sú P monodon[14]

1.5 Tình hình nghiên cứu về chỉ thị SNP ở tôm

Năm 2005, Glenn và cộng sự đã nghiên cứu về bệnh gen trên 2 loài tôm

sú (P monodon) và tôm thẻ chân trắng (Litopenaeus vannamei), họ đã tìm kiếm SNP trong 2 gen alpha-amylase (AMY2) và cathepsin-l (CTSL) liên quan tới tính trạng tăng trưởng Xác định được 4 SNP trong AMY2 ở tôm thẻ chân

trắng và 1 SNP trong CTLS ở tôm sú [14]

Năm 2006, Yu và cộng sự đã phân tích SNP của gen liên quan tới sự lột xác ở tôm sú và tôm thẻ chân trắng, trên 2 gen liên quan tới tính trạng tăng trưởng molt-inhibiting hormone (MIH) và the crustacean hyperglycemic hormone (CHH) Phát hiện 1 SNP trong 2 gen MIH1 và MIH2 ở loài tôm sú,

2 SNP trong gen CHH ở loài tôm thẻ chân trắng [48]

Năm 2008, Khamnamtong và cộng sự nghiên cứu tính đa dạng di truyền và sự khác biệt về địa lý của tôm sú ở Thái Lan, phân tích trình tự gen

ti thể COI [21]

Năm 2010, Prasertlux và cộng sự đã nghiên cứu mức độ biểu hiện của RuvBL2 của sự phát triển buồng trứng và mối quan hệ giữa đột biến đa hình đơn (SNP) và sự tăng trưởng ở tôm sú [35]

Năm 2010, Ciobanu và cộng sự nghiên cứu nguồn SNP liên quan đến kiểu hình và sự biến đổi gen ở tôm thẻ chân trắng [8]

Năm 2010, Gorbach và cộng sự đã khai thác EST thông qua SNP ở loài tôm Phân tích ở tôm thẻ chân trắng và một số loài tôm khác Trên tất cả 4.597 SNP đã dự đoán từ 4.600 contig với 703 SNP của cùng loài, 735 SNP khác loài và 18 SNP có ở nhiều loài khác nhau [15]

Năm 2010, Du và cộng sự tìm kiếm SNP xây dựng bản đồ gen loài tôm thẻ chân trắng Thái Bình Dương Trong tổng số 1344 SNP tìm được, 825 SNP

nằm ngoài gen và 418 SNP nằm trong 347 contig tương đồng với 45 nhóm liên quan đến giới tính [11]

Năm 2014, Sellars và cộng sự đã so sánh marker microsatellite và SNP cho việc phân tích xây dựng cây phả hệ loài tôm sú [38]

Một vài nghiên cứu trong nước:

Năm 2010, Nguyễn Minh Thành và cộng sự nghiên cứu mối tương quan giữa SNP (Single nucleotide polymorphisms) của gen CHH (crustacean hyperglycemic hormone) và tính trạng tăng trưởng của tôm càng xanh,

Macrobrachium rosenbergii [42]

Tác giả Nguyễn Thị Thảo và cộng sự (2003-2004), Đánhgiáđahìnhcủa

3 quầnđàntômsú (PeanaeusMonodon) nuôi ở Việt Nam

bằngphươngphápMicrosattelite[2]

Lê Thị Hội và Phan Thị Phượng Trang (2001-2003);

gâybệnhđốmtrắngtrêntômsúViệt Nam[1]

1.6 Công nghệ giải trình tự thế hệ mới

Các kỹ thuật đọc trình tự gen đã trở nên đơn giản và nhanh hơn nhờ sự ứng dụng huỳnh quang phân tích tự động[29] Các công nghệ đọc trình tự mới luôn hướng tới làm tăng dung lượng (throughput), làm giảm thời gian và giá

thành

Giải trình tự thế hệ mới (NGS: next generation sequencing)là một bước tiến vượt bậc về công nghệ đọc trình tự, cho phép đọc được từ 8Gb - 600Gb tức là cho phép đọc trình tự nguyên bộ gene còn được gọi là đọc trình tự bộ gene (whole genome sequencing)

Nguyên lý đọc trình tự gen thế hệ mới: theo 2 nguyên lý chính Nguyên

lý thứ nhất đọc trình tự bằng tổng hợp (sequencing by synthesis, SBS) đã

được các thế hệ máy Roche 454, Ion Torrent và Illumina sử dụng Nguyên lý thứ hai đó là đọc trình tự gắn nối (sequencing by ligation, SBL) được sử dụng

ở máy SOLiD do George Church phát minh SBL đã được sử dụng để xác định trình tự genome và là nền tảng cho các thiết bị đọc trình tự thế hệ mới Công nghệ đọc trình tự gen thế hệ mới được thực hiện theo 3 bước chính như sau:

- Chuẩn bị các đoạn DNA và gắn lên các giá bám: Trước hết DNA bộ gene

được cắt nhỏ thành các đoạn DNA ngắnnhờ siêu âm hay nhờ khí dung, sau đó

2 đầu các đoạn DNA ngắn này được gắn 2 đoạn adapter có trình tự nhận biết bởi các đoạn dò và trình tự mồi PCR Các đoạn DNA này sẽ được gắn lêncác giá bám là các hạt nano (Roche 454, SOLiD hay Ion Torrent) hay trên các vi bản (Illumina) nhờ các đoạn dò đặc hiệu adapter đã gắn sẵn trên các giá bám này

- Khuếch đại các đoạn DNA trên giá bám bằng mồi đặc hiệu adapter: Nếu giá

bám là vi bản thì thành phần PCR được bơm trải lên vi bản và khi thực hiện PCRsẽ có từng cụm sản phẩm khuyếch đại được gắn trên các vị trí tách rời nhau Nếu giá bám là các vi hạt thì phải nhũ hoá thành phần PCR để các giọt nhũ chỉ chứa một vi hạt, nhờ vậy sau khi thực hiện PCR mỗi vi hạt chỉcó một loại sản phẩm khuyếch đại bám lên Sauđó, các vi hạt được loại bỏ nhũ dịch

và bơm vào một vi chip có chứa hàng chục ngàn đến hàng trăm ngàn giếng kích thước nano (nanowell), kích thước này cho phép mỗi nanowell chỉ chứa

được một vi hạt

- Đọc trình tự bằng tổng hợp hoặc bằng gắn nối: Nguyên tắc cũng gần giống

pyrosequencing, tuy nhiên có một số điểm khác biệt bao gồm: (i) Thay vì phải huỷ bỏ các thành phần A T, C, và G còn dư thừa trong phản ứng trước khi cho thành phần tham gia mới vào thì ở đọc trình tự thế hệ mới, thành phần tham gia đọc trình tự dư thừa này được thu hồi sau khi thu được tín hiệu và bơm

thành phần tham gia mới; (ii) Tín hiệu tổng hợp được ghi nhận sau mỗi lần bơm các thành phần tham gia vào có thể là tín hiệu phát quang dựa trên hệ thống luciferinluciferase (Roche 454),tín hiệu điện do thay đổi pH, tín hiệu huỳnh quang được đánh dấu trên các nucleotide A, T, C hay G hay cũng có thể là tín hiệu huỳnh quang được gắn lên probe;(iii) Tổng hợp mạch bổ sung dựa trên mạch khuôn có thể là kéo dài đầu 3’ của mạch bổ sung bằng các nucleotide (A, T, C hay G) và cứ mỗi khi một nucleotide được kéo dài thì sẽ

có một tín hiệu phát quang (Roche 454), huỳnh quang (Illumina) hay pH (ion Torrent) được ghi nhận, hay có thể là kéo dài đầu 3’ của mạch bổ sung mỗi lần 2 base nhờ sự kéo dài và nối đoạn dò dựa trên sợi khuôn và cứ mỗi khi tổng hợp được 2 base thì sẽ có một tín hiệu huỳnh quang được ghi nhận (SOLiD)

Thứ tự của các lần bổ sung các thành phần đọc trình tự vào chip nanowell hay vào vi bản được máy tính ghi lại đồng thời với thứ tự và cường

độ tín hiệu tổng hợp sợi bổ sung của từng cụm DNA bám lên vi bản hay trên

vi hạt, nhờ vậy mà sẽ đọc được trình tự của các đoạn DNA trên từng cụm Vì

có đến hàng trăm ngàn cụm nên sẽ có hàng trăm ngàn trình tự sẽ được đọc, tương ứng với hàng trăm ngàn đoạn DNA từ bộ gene sẽ đọc được Các trình

tự của các đoạn đọc được sẽ được phần mềm của thiết bị nối lại với nhau bằng cách so sánh trình tự, tìm các đoạn trùng lặp ở hai đầu và như vậy là sẽ

có kết quả của trình tự nguyên bộ gene[36, 37]

2 CHƯƠNG II VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Đối tượng và vật liệu nghiên cứu

2.1.1 Đối tượng nghiên cứu

Tổng số 140 con tôm sú trưởng thành không mắc bệnh được thu thập tại vùng biển Nghệ An, do viện nuôi trồng thủy sản 2 cung cấp (vùng Bắc Trung Bộ)

Hình 2.1Tôm sú thu từ vùng biển Nghệ An

2.1.2 Hóa chất vàsinh phẩm

- Kit tinh sạch mRNA (Dynabeads mRNA DIRECT TM Micro Lifetechnology)

Kit Kit tạo thư viện cDNA

- Hóa chất:Choloroform, Trizol, ethanol,elution buffer…dùng trong sinh học phân tử của các hãng uy tín như Invitrogen, Sigma, Merck…

2.1.3 Trang thiết bị

quang phổ (NanoDrop, Techmo Scientific, Mỹ), box cấy vô trùng (Sanyo), bộ nguồn điện di (Bio-Rad), bộ điện di DNA (Advance, Nhật Bản), pipettman

các loại (Gilson), máy li tâm lạnh tốc độ cao (Sorvall), máy lắc ổn nhiệt 37o

C, máy khuấy từ (IKA, Đức), máy khuấy trộn Vortex, cân phân tích 10-4

g (Mettler Toledo), cân điện 10-2

g (Mettler Toledo)

2.2 Phương pháp nghiên cứu

2.2.1 Phương pháp tách chiết RNA tổng số

 Nghiền mô trong Nito lỏng, sau đó đồng hóa trong dung dịch Trizol

Trong nghiên cứu này, chúng tôi sử dụng bộ sinh phẩm Dynabeads mRNA DIRECT TM Micro Kit (Life technology) để tiến hành tinh chế mRNA

từ RNA tống số, cụ thể như sau:

1 Chuẩn bị

 Đưa hạt Dynabeads về nhiệt độ phòng

 Ủ với nước siêu sạch không chứa nuclease (180 µl /mẫu) tại 80C

 Dùng pipet hút thể tích hạt beads phù hợp với lượng RNA tổng số đầu vào (100 µl)

 Đặt Ependorf chứa hạt bead lên giá từ, loại bỏ dịch nổi

 Rửa lại hạt beads bằng thể tích tương đương Lysis/Binding Buffer

 Vortex nhẹ, spin

b) Xử lý mẫu RNA tổng số

Pha loãng mẫu RNA tổng số với nồng độ từ 20 – 50 µg trong tổng thể tích 300 µl bằng nước deion không chứa nuclease

c) Tinh sạch mRNA 2 lần qua cột

 Mẫu RNA sau pha loãng được xử lý nhiệt trong 2 phút 70C

 Thêm thể tích tương tự Lysis/Binding Buffer vào mỗi mẫu, trộn đều, spin nhẹ

 Gắn mRNA vào hạt beads:

+ Chuyển hạt beads vào các giếng của phiến nhựa 96 giếng

+ Bổ sung RNA đã xử lý nhiệt vào các giếng

+ Mix hỗn hợp 10 lần bằng pipet, ủ nhiệt độ phòng trong 5 phút

+ Đặt phiến lên giá từ, khi dung dịch đã trong trở lại (hạt beads lắng xuống đáy) loại bỏ dịch trong

 Rửa RNA

+ Chuyển phiến ra khỏi giá từ, bổ sung vào giếng 600 µl Washing buffer A, đảo lên xuống 10 lần bằng pipet

+ Thực hiện tương tự với Washing buffer B

 Hòa lại RNA

Cặn hạt từ thu được sau khi rửa với Washing buffer B được hòa lại bằng 90 µl nước deion (đã được ủ trước ở 80C), trộn đều 10 lần và để nhiệt

độ phòng 30 giây

 Gắn lại mRNA vào hạt beads

+ Bổ sung Lysis/Binding Buffer vào các giếng, trộn đều 10 lần

+ Ủ nhiệt độ phòng 5 phút

+ Đặt đĩa trên giá từ và loại bỏ dịch nổi

+ Lặp lại bước rửa mRNA

 Hòa lại mRNA trong 30 µl nước deion không chứa nuclease, sử dụng ngay để tổng hợp cDNA hoặc bảo quản trong tủ - 80oC

a)Cắt nhỏ mRNA sau khi tinh sạch

 Bổ sung 19 µl RNA Seq Fragmentation Mix vào mỗi giếng của phiến

96 giếng chứa mRNA đã tinh chế

 Dán kín phiến và lắc nhẹ nhàng trong 5 giây Li tâm nhanh phiến trong máy li tâm chuyên dụng để thu dịch trong

 Đặt phiến vào máy chu kỳ nhiệt và chạy chương trình để phân cắt RNA: 94oC 8 phút, sau đó chuyển sang giữ ở 4 o

 Dán kín phiến và lắc nhẹ nhàng trong 5 giây

 Li tâm phiến ở 1500 x g trong 1 phút

 Để phiến vào máy chu kỳ nhiêt và chạy chương trình: bước 1: 25o

C 10 phút, bước 2: 37oC 40 phút, bước 3: chyển sang giữ ở 4o

C

c) Tổng hợp cDNA sợi thứ hai:

 Bổ sung 25 µl RNA Seq Second Strand + End Repair Enzyme Mix vào 20µl mẫu cDNA sợi thứ nhất đã chuẩn bị

 Bổ sung 5 µl RNA Seq Second Strand + End Repair Oligo Mix vào mỗi giếng, như vậy ta sẽ có 50 µl dịch trong mỗi giếng

 Gián kín phiến và lắc nhẹ nhàng trong 5 giây

 Li tâm phiến ở 1500 x g trong 1 phút

d)Khuếch đại các đoạn DNA đã gắn Adaptor

Các đoạn DNA đã gắn Adaptor được khuếch đại bằng PCR với cặp mồi đặc hiệu gắn adaptor

 Phản ứng khuếch đại cDNA:

+ Chuyển 6 µl mẫu cDNA vào ống PCR mới

+ Chuyển 47µl PCR mix vào 6 µl mẫu cDNA ở trên

+ Đảo ống phản ứng để hòa tan đều

+ Chạy PCR với chu trình nhiệt như sau

Các bước Nhiệt độ Thời gian

 Thư viện cDNA sau khi tinh sạch được gửi đi giải mã trên hệ giải trình

tự gen thế hệ mới Illumina MiSeq

2.2.4 Phương pháp Phân tích dữ liệu

2.2.4.1 Lắp ráp de novo hệ phiên mã

Dữ liệu trình tự đọc sau khi được giải trình tự sẽ được tiền xử lý để loại

bỏ adaptor và trình tự xấu do lỗi của máy giải trình tự Những trình tự đọc có chất lượng base quá thấp (chất lượng nhỏ hơn 20) cũng như số base nhiễu nhiều (mỗi trình tự đọc có >2% N base) sẽ được chỉnh sửa bằng công cụ cutadapt (https://code.google.com/p/cutadapt/) Những trình tự đọc chất lượng cao từ bốn mô: mô cơ, mô tim, mô gan tụy, mô gốc mắt, được lắp ráp để tạo nên hệ phiên mã bao gồm các unigene của tôm sú bằng phần mềm Trinity (http://trinityrnaseq.sourceforge.net/) [16] với tham số mặc định

2.2.4.2 Phát hiện SNP marker trong ngân hàng Unigene

Các trình tự unigene bên cạnh đó cũng sẽ được khai phá các marker đa hình đơn nucleotide SNP hay các marker mất/thêm đoạn nhỏ Insert/Delete Chúng tôi ánh xạ các trình tự đọc ngược trở lại vào hệ phiên mã tham chiếu vừa lắp ráp bằng phần mềm Bowtie2 Kết qủa ánh xạ sẽ được 2 công cụ SAMtools và VarScan (http://varscan.sourceforge.net/) [23] xử lý để tìm ra các locus tiềm năng bị thay đổi nucleotide Để sàng lọc kết quả dương tính giả

do lỗi giải trình tự hoặc mẫu nhiễm trình tự lạ chúng tôi áp dụng các tham số sau: chỉ lấy những trình tự đọc có chất lượng ánh xạ lớn hơn 20, tần số alen của biến dị phải lớn hơn 0,1 và độ sâu tối thiểu của alen biến dị phải lớn hơn

10

2.2.4.3 Chú giải và phân loại unigene trong hệ phiên mã

Chú giải chức năng cho các unigene trong hệ phiên mã đòi hỏi phải sử dụng những thuật toán tìm kiếm tương đồng trên các cơ sở dữ liệu protein quan trọng Tôi sử dụng công cụ BLAST+ với chương trình BLASTx để so sánh toàn bộ unigene lên các cơ sở dữ liệu NCBI non-redundant protein (Nr,

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/), với tham số E-value là 1e-6 Trong khi đó với những unigene không được chú giải trên cơ sở dữ liệu Nr-NCBI, phần mềm ESTScan [18] sẽ dự đoán vùng mã hóa tiềm năng trong chuỗi trình tự của unigene Kết quả chú giải từ ngân hàng Nr sau đó được phần mềm Blast2GO [10] sử dụng để lấy ra mã Gene Ontology (GO) riêng biệt cho mỗi unigene Toàn bộ unigene trong hệ phiên mã sẽ được ánh xạ vào các mã GO và phân loại dựa vào 3 hạng mục: quá trình sinh học, thành phần tế bào và phân tử chức năng Trong nghiên cứu này tôi tập chung vào nghiên cứu và phân loại unigene tiềm năng liên quan tới tính trạng tăng trưởng

2.2.4.4 Phát hiện SNP liên quan đến tính trạng tăng trưởng

Sau khi phân tích dữ liệu trên máy chủ của viện Công Nghệ Sinh học, thu được dữ liệu phát hiện marker SNP (file.vcf gồm: tên unigene, vị trí biến đổi trên gen tham chiếu và vị trí SNPtương ứng, thông tin, định dạng…) và tiến hành thống kê SNP

Blast các trình tự unigene lên ngân hàng Nr-NCBI bằng phần mềm blast2GO và phân tích thống kê với công cụ Microsoft Excel, dùng bộ lọc Filter và hàm VLOOKUP thống kê số lượng gene liên quan tới tính trạng tăng trưởng, các gen tăng trưởng chứa SNP, vị trí SNP trên hệ gen tham chiếu Từ

đây lọc ra những chỉ thị SNP liên quan tới tính trạng tăng trưởng ở loài tôm

sú

3 CHƯƠNG III KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1 Tinh chếmRNAtừ RNA tổng số

Trong nghiên cứu này, chúng tôi sử dụng bộ sinh phẩm Dynabeads mRNA DIRECT TM Micro Kit của hãng Life Technology để tiến hành tinh chế mRNA từ RNA tổng số tách từ 4 mô (mô cơ, gan tụy, tim và gốc mắt) như được trình bày trong phần Phương pháp nghiên cứu Nồng độ mRNA được xác định bằng máy NanoDrop (Bảng 3.1) Theo hướng dẫn của Illumina, nồng độ mRNA cần thiết để thực hiện tạo thư viện cDNA là 20 ng/µl trở lên Kết quả Bảng 3.1cho thấy, các mẫu mRNA đảm bảo độ tinh sạch và nồng độ cho phản ứng tiếp theo

Bảng 3.1Nồng độ mRNA của 4 mô

3.2 Tạo thư viện cDNA

Bộ sinh phẩm Truseq strand mRNA library preparation kit (Illumina) sử dụng để tạo thư viện cDNA, các bước tiến hành như trình bày trong phần Phương pháp nghiên cứu Chất lượng cDNA (kích thước và độ tinh khiết) được kiểm tra bằng máy Bioanalyzer, sử dụng bộ sinh phẩm High Sensitivity DNA assay (Agilent Technologies) trước khi đưa lên hệ thống giải trình tự gen thế hệ mới (NGS) Illumina MiSeq Các thư cDNA trên đều đảm bảo chất lượng theo tiêu chuẩn của Illumina, với kích thước chủ yếu từ 300-400 bp

Hình 3.1Kiểm tra chất lƣợng thƣ viện cDNA của mô cơ