TỔNG QUAN VỀ CÂY NÁNG HOA TRẮNG

Mục lục: LỜI MỞ ĐẦU Những năm gần với phát triển khoa học kĩ thuật, người bắt đầu có xu hướng “trở thiên nhiên” nhu cầu sử dụng sản phẩm dược phẩm, mỹ phẩm sản xuất từ thiên nhiên ngày tăng Những sản phẩm có nguồn gốc từ thiên nhiên thường thân thiện với người, tác dụng phụ Vì việc nghiên cứu loại dược phẩm có nguồn gốc từ nhiên nhiên hướng có tiềm mở nhiều hội, đặc biệt Việt Nam nước nằm khu vực nhiệt đới có khí hậu nóng ẩm, có nguồn thực vật phong phú đa dạng Trong dân gian, ông bà ta qua hàng ngàn năm đúc kết kinh nghiệm lưu truyền thuốc dân gian quý Đó hướng mà ta tìm hiểu mở rộng nghiên cứu Bài báo cáo tập trung tìm hiểu Náng hoa trắng (Crinum asiaticum L) loại thực vật thuộc họ loa kèn đỏ hay họ Thủy tiên Dễ trồng mọc nhiều nước ta Cây Náng hoa trắng biết đến việc chữa bệnh rối loạn tiêu hóa, sốt, đau họng, đau răng, bệnh ngồi da, mụn nhọt,… Trong báo cáo khoa học gần đây, người ta thấy Náng hoa trắng có tác dụng ức chế khối phì đại tiền liệt tuyến, làm thuốc chữa u xơ tiền liệt tuyến Chính có nhiều cơng dụng nên báo cáo tập chủ yếu làm rõ đặc điểm sinh thái, phân bố, thành phần hoạt tính sinh học Náng hoa trắng Từ đó, đưa ý kiến, kiến nghị, hướng để tiếp tục nghiên cứu sau CHƯƠNG I TỔNG QUAN VỀ CÂY NÁNG HOA TRẮNG 1.1 Đặc điểm sinh thái Cây Náng hoa trắng có tên khoa học Crinum asiaticum L Ở số quốc gia khác Náng hoa trắng có tên khác như: Malaysia (Bakong, Bawang Hutan), Indonesia (Bakung, Kajang- kajang), Ở Việt Nam Náng hoa trắng biết đến với tên Đại tướng quân, Chuối nước, Tỏi voi,…[9] Crinum asiatinum L loài thực vật họ Náng (hay gọi họ Hoa loa kèn đỏ), thân thảo, sống lâu năm, cao tầm 1m, có hành (giò) cỡ trung bình, hình trứng, đường kính 5-10cm, thót lại thành cổ dài 12–15 cm hay Lá Náng hoa trắng mọc từ gốc, nhiều, hình dãi giáo, lõm, có khía trên, mép nguyên, dài tới 1m rộng 5-10cm Hình 1.1 Cây náng hoa trắng Cụm hoa hình tán nằm đầu cán hẹp dài 40-60cm, to ngón tay, mang 612 hoa, có nhiều Hoa có màu trắng, có mùi thơm chiều, bao mo dài 8-10cm Hoa có ống mảnh, màu lục, phiến hoa giống nhau, hẹp, dài, nhị có nhị đỏ, bao phấn vàng Quả mọng hình gần tròn, đường kính 3–5 cm, thường chứa hạt Cây Náng hoa trắng thường hoa vào mùa hè[9] 1.2 Đặc điểm phân bố Náng hoa trắng có nguồn gốc từ châu Á, phân bố từ Ấn Độ qua Indonesia tới đảo Molluyc, Tây Bắc Úc, Đặc biệt loài tìm thấy nhiều Trung Quốc, Ấn Độ Việt Nam Ở nước ta, phân bố từ Bắc đến Nam Cây mọc hoang dại nơi ẩm mát, dựa rạch, thường trồng làm cảnh, trồng làm thuốc vườn thuốc Nam trạm y tế Người ta thường tách hành để trồng Để làm thuốc, người ta thu hái phận khác quanh năm, dùng tươi hay phơi khô Ở Đà Nẵng, Náng hoa trắng trồng làm cảnh nhiều tuyến đường Nguyễn Tất Thành, Hoàng Văn Thái,…và phổ biến huyện Hòa Vang, Hòa Cầm,… 1.3 Cơng dụng: Hiện nay, Náng hoa trắng trồng phổ biến nhờ vào đặc điểm phân bố phù hợp với điều kiện khí hậu, đất đai, thổ nhưỡng nước ta Tuy nhiên, mục đích chủ yếu để làm cảnh nhà, vườn, ven đường…Các công dụng Náng hoa trắng biết tới chưa phổ biến Theo y học dân gian, hầu hết phận sử dụng để chữa nhiều bệnh liên quan tới tiêu hóa, bệnh ngồi da, bệnh thấp khớp làm thuốc giải độc Dịch chiết từ dùng trị chứng khó tiêu, kiết lỵ Dịch chiết dùng để hỗ trợ sinh nở, xuất huyết hậu sản Ngồi nhiều cơng dụng ứng dụng vào chữa trị điều chế loại thuốc có mang thành phần thiên nhên Nhờ có nhiều hoạt tính mà gần Náng hoa trắng quan tâm ngày nhiều Các nghiên cứu khảo sát, tìm thành phần có chức sinh học cao đưa nhiều kết khả quan tác động chất thể Các alkaloid Náng hoa trắng cho có khả ức chế phát triển loại ung thư tiền liệt tuyến Bên cạnh hoạt tính kháng viêm, kháng khuẩn,… tìm thấy Các nghiên cứu đem lại nhiều kết khả quan, mở tiếp hướng nghiên cứu Trong việc điều trị ung thư phương pháp ‘’thiên nhiên’’ quan tâm phát triển CHƯƠNG II THÀNH PHẦN HÓA HỌC 2.1 Akaloid: 2.1.1 Khái niệm phân loại: Alkaloid hợp chất hữu có chứa nitơ, đa số có nhân dị vòng, có phản ứng kiềm, thường gặp nhiều thực vật có động vật Alkaloid có dược tính mạnh cho phản ứng hóa học với số thuốc thử chung chúng Tuy nhiên, có số alkaloid khơng có nhân dị vòng mà mạch nhánh capsaisin (ớt Capsium annuum L); số khác khơng có phản ứng kiềm colchisine (từ hạt tỏi độc), ricinine (từ hạt thầu đâu Ricinus communis); số alkaloid phản ứng với acid yếu arecaidin guvacin (trong hạt cau Areca catechu L) Trong vài alkaloid chất độc số khác lại sử dụng y học với vai trò chất giảm đau hay gây tê, cụ thể morphin hay codein, số ứng dụng khác Để đáp ứng cho số lượng alkaloid nhiều đa dạng, người ta chia alkaloid thành loại [1]: • Alkaloid thật: hợp chất có hoạt tính sinh học, ln có tính base, thường có chứa ngun tử nitơ vòng dị hồn, thường sinh tổng hợp từ amino acid Nhóm đa số phân bố giới hạn thực vật diện dạng muối acid hữu • Protoalkaloid: nhóm chủ yếu amin đơn giản tổng hợp từ amino acid nguyên tử nitơ khơng vòng dị hồn • Giả alkaloid: hợp chất không bắt nguồn từ amino acid; bao gồm hai nhóm lớn alkaloid steroid alkaloid terpenoid purin 2.1.2 Tính chất: Đa số alkaloid có cấu tạo phức tạp, khối lượng phân tử lớn gồm C, H, N, O (nitơ thường nằm mạch vòng),dạng thể rắn nhiệt độ thường Các alkaloid thường kết tinh có điểm chảy rõ ràng; có số khơng có điểm chảy bị phân hủy nhiệt độ trước chảy Những alkaloid thành phần khơng chứa oxy thể lỏng, bay thường bền vững không bị phân hủy nhiệt độ sơi chúng Alkaloid có vị đắng; khơng có màu màu trắng trừ số có màu vàng berberine; palmatine; chiledonine Các alkaloid thường tồn dạng base tự muối: • Alkaloid base: khơng tan nước, dễ tan dung môi hữu methanol, ethanol.ether, chloroform, benzene • Muối alkaloid: dễ tan nước khơng tan dung mơi hữu phân cực Tính hòa tan alkaloid đóng vai trò quan trọng việc chiết tách chúng khỏi dược phẩm điều chế thuốc để uống Trong cây, alkaloid tồn dạng tự mà kết hợp với tamin( hợp chất polyphenol thực vật có khả tạo liên kết bền vững với hợp chất hữu cao phân tử khác) để tạo thành muối Do chúng base yếu nên dễ dàng bị base mạnh NH4OH, NaOH…đẩy khỏi muối Nhờ vào tính chất mà ta ứng dụng để tách chiết alkaloid từ dược liệu dung mơi thích hợp Một số alkaloid hồn tồn tìm thấy dịch chiết Náng hoa trắng như: crinumaquine, lycorine, hippacine, hippadine, ungeremine, methylcrinamine, 3O-acetylhamayne, crinamine, criwelline [10] Cơng thức hóa học vài alkaloid tiêu biểu: Hình 2.1 Một số cơng thức cấu tạo alkaloid 2.1.3Hoạt tính sinh học: Các hoạt tính sinh học Náng hóa trắng khơng q xa lạ với ngày thơng qua nhiều nghiên cứu lớn nhỏ nhiều nhà khoa học giới Phần lớn hoạt tính thử nghiệm mang lại kết tích cực như: Gây độc tế bào, chống lại tế bào ung thư (crinamine) [2,8,9] Chống oxy hóa, bảo vệ hồng cầu (lycorine) [6] Chống oxy hóa, bảo vệ hồng cầu (lycorine) [6] Kháng khuẩn, kháng nấm (quinine, berberine, arecoline) [1,5] Tác dụng lên hệ thần kinh: ức chế, kích thích thần kinh trung ương (caffeine, morphine), gây tê (cocaine)….[4,9] - Tác dụng giảm đau, kháng viêm [7,9] Kích thích mọc tóc [11] 2.2.4 Các thuốc thử để định tính alkaloid: Alkaloid cho phản ứng tạo màu tạo kết tủa với nhiều thuốc thử thông dụng Mayer, Dragendoff, Wagner, Iodoplatinat số thuốc thử khác để nhận biết alkaloid đặc thù • Thuốc thử Mayer: Hòa tan 1.36g HgCl2 60ml nước cất hòa tan 5g KI 10ml nước cất Hỗn hợp hai dung dịch lại với thêm nước cất 100ml Nhỏ vài giọt thuốc thử vào dung dịch acid lỗng có chứa alkaloid, có alkaloid - xuất kết tủa màu trắng vàng nhạt Tuy nhiên tủa tạo bị hòa tan trở lại lượng dư thuốc thử etanol có sẵn dung dịch thử • Thuốc thử Dragendoff: Hòa tan 8g Nitrat bismuth Bi(NO 3)3.H2O 25ml HNO3 30% (d=1.18) Hòa tan 28g KI 1ml HCN 6N 5ml nước cất Hỗn hợp hai dung dịch, để yên tủ lạnh 5°C cho tủa màu sậm tan trở lại, lọc thêm nước cho đủ 100ml Dung dịch có màu cam đỏ cần đừng lọ tối màu, bảo quản tủ lạnh giữ lâu vài tuần Thuốc thử cho kết tủa màu camnâu với alkaloid (tủa thu hồi xử lý với Na 2CO3 sau chiết với dietyl eter) • Thuốc thử Wagner: Hòa tan 1.27g I2 2g KI 20ml nước cất, thêm nước 100ml Thuốc thử cho kết tủa màu nâu với dung dịch acid lỗng có chứa alkaloid • Thuốc thử Iodoplatinat: Hòa dung dịch clorur platin 10% (3ml) 97ml nước, 6g KI 94ml nước cất Hỗn hợp hai dung dịch trữ chai lọ tối màu, sau dùng phun xịt lên mỏng để phát alkaloid có nitơ vòng dị hồn Tuy nhiên thuốc thử cho kết dương tính với hợp chất purin, amino acid, protein, coumarin, polyphenol, acid triterpen, hợp chất có chứa nitơ…Do để kiểm tra diện alkaloid có bột người ta thường sử dụng nguyên tắc thử Webb gồm có hai phần: • Phần 1: Thử với dịch chiết bột hỗn hợp nước- acid Nếu có kết tủa chứng tỏ dịch chiết thu có chứa alkaloid Nếu khơng tạo kết tủa chưa thể kết luận vội mà phải thực tiếp phần thứ hai • Phần 2: Thử với dịch chiết bột dung dịch Prollius hỗn hợp gồm chloroform: etanol 95°: NH4OH đậm đặc theo tỉ lệ thể tích 8:8:1 Tiến hành thử nghiệm với loại thuốc thử nêu Dịch chiết phần chiết tất alkaloid base dạng tự do, alkaloid có tính phân cực mạnh Tuy nhiên dung dịch chiết hợp chất coumarin, polyphenol, purin, amino acid, protein… hợp chất alkaloid tạo kết tủa Ngồi phương pháp khơng thể chiết alkaloid có tính base yếu, alkaloid có cấu trúc đặc thù( -C=CN)…Mặc khác dung môi chiết hữu – kiềm lại chiết alkaloid dạng tự có tính base hay alkaloid cs cấu trúc đặc thù Vì việc kết hợp hai phương pháp giúp ta xác định xác diện alkaloid bột cần nghiên cứu 2.2 Flavonoid: Khái niệm: Flavonoid bioflavonoid (bắt nguồn từ tiếng Latin có nghĩa màu vàng) loại chất chuyển hóa trung gian thực vật Thường có màu vàng, nhiên có số flavonoid khác lại có màu xanh, tím đỏ khơng màu Flavonoid có số động vật nhiên khơng đáng kể Theo danh pháp IUPAC, flavonoid chia thành nhóm: flavonoids (hoặc bioflavonoids), isoflavonoids, neoflavonoids tùy theo cấu trúc khung cấu tạo chúng Flanovoid phổ biến nhiều loại thực vật, có mặt tất phận có nhiều chức khác nhau: • Là sắc tố sinh học, sắc tố thực vật quan trọng tạo màu sắc hoa, cụ thể giúp sản xuất sắc tố vàng, đỏ, xanh cho cánh hoa để thu hút nhiều động vật đến thụ phấn • Trong thực vật bậc cao, flavonoid tham gia vào lọc tia cực tím( UV), cộng sinh cố định đạm sắc tố hoa • Flavonoid hoạt động chất chuyển giao hóa học điều chỉnh sinh lý Chúng hoạt động chất ức chế chu kì tế bào Do có chứa nhiều nhóm –OH phenol nên flavonoid liên kết với liên kết với hợp chất khác để tạo thành nhiều chất phức tạp Đặc biệt flavonoid dễ kết tinh Các flavonoid có độ hòa tan khác tùy theo số nhóm hydroxyl nhóm khác có cấu trúc Vì khó có phương pháp chung cụ thể để trích ly hợp chất khỏi Một vài phương pháp tách chiết thường sử dụng như: tủa dung dịch acetate chì, hấp thu than hoạt tính, tách phân đoạn dung dịch kiềm có độ kiềm khác nhau…[1] Một số flavonoid tìm thấy Náng hoa trắng như: 7-dihydroxy-4’methoxyflavan; 7-hydroxyflavanone; 4’,7-dihydroxy-flavone [10] 2.3 Các amide: Khái niệm: Amit (thuật ngữ amide) tên gọi để hợp chất hữu phân tử có chứa nhóm chức acyl R-CO- liên kết với nguyên tử N tạo thành nhóm chức amide Amide tên gọi để gốc amine R2N{-} Amide nguồn dự trữ NH3 cho trình tổng hợp acid amin thể thực vật cần thiết Hợp chất giúp khử độc cho tế bào ammoniac tích lũy nhiều thể, dự trữ nhóm amin cần cho tổng hợp acid amin protein có nhu cầu Các hợp chất amide có tính base yếu Một vài amide tìm thấy Náng hoa trắng như: N-4-transcoumaroyltyramine; N-4-trans-caffeoyltyramine; 4-hydroxystyryolamine; 4aminobenzaldehyde [10] 2.4 Các hợp chất phenolic: Hợp chất phenolic nhóm hợp chất hóa học mà phân tử có nhóm chức hydroxyl (-OH) gắn với vòng hydro carbon thơm Hợp chất phenolic bao gồm nhiều chất khác phổ biến thực vật đồng thời sản phẩm trao đổi chất thể Trong thiên nhiên, hợp chất phenol phổ biến flavonoid, xanthon, quinon, polyphenol… Các hợp chất phenol dễ tan nước chúng thường diện dạng glycoside mang màu sắc tự nhiên Chất có mặt hầu hết phận cây, có tác dụng chống lại tia xạ, tia cực tím, ngăn chặn tác nhân gây bệnh góp phần làm tăng màu sắc cho Các hợp chất phenolic đa dạng cấu trúc chia thành nhiều nhóm chất khác dựa theo số carbon chúng sau: Nhóm chất C6 C6-C1 C6-C2 C6-C3 C6-C4 C6-C1-C6 C6-C2-C6 C6-C3-C6 (C6-C3)2 (C6-C1)n (C6-C3)n Nhóm Phenol đơn giản benzoquinone Acid phenolic hợp chất kliên quan Aceto phenol, acid phenylacetic Acis cinnamic, coumarin, isocoumarin chromone Naphthoquinone Xanthone Stilbene, anthraquinone Flavonoid Lignan, neolignan Tannin thủy phân Lignin Bảng 2.1 CHƯƠNG III QUY TRÌNH TÁCH CHIẾT ALKALOID Các alkaloid tự nhiên chứa nhiều thành phần khác với hoạt tính sinh học quý ứng dụng nhiều nghiên cứu sản xuất Do mà hợp chất thu hút nhiều quan tâm nhà nghiên cứu nhằm khai thác nhiều giá trị sinh học to lớn từ chúng Để nhận biết alkaloid ta sử dụng số loại thuốc thử đặc trưng chúng Mayer, Dragendorff, Wagner, Iodoplatinat Tuy nhiên, việc chiết tách phân lập alkaloid gặp nhiều khó khăn cấu trúc đa dạng alkaloid đòi hỏi nhiều quy trình kỹ thuật phức tạp Dưới vài phương pháp thu nhận alkaloid từ Náng hoa trắng nhiều nhà nghiên cứu thực đạt kết tích cực: Tách chiết sắc ký phân lập alkaloid từ Náng hoa trắng có alkaloid có khả ức chế phiên mã gây độc tế bào tế bào ung thư tuyến tụy tế bào ung thư tiền liệt nhóm tác giả người Nhật Bản [8]: • Mẫu Náng hoa trắng sau thu hái vùng Natore( Bangladesh) đem sấy khô, nghiền mịn dùng làm nguyên liệu cho trình chiết tách.Tiến hành chiết bột khơ với dung mơi chiết MeOH để thu dịch chiết thơ • Dịch chiết sử dụng cho chạy sắc ký cột Dia-nonHP-20 với MeOH-aceton để tao phân đoạn khơng chứa diệp lục 1A • Sau đó, phân đoạn 1A huyền phù dung dịch MeOH 10%, hỗn hợp tiếp tục đem chiết với dung môi hexane, EtOAc, n-BuOH để thu dịch chiết tương ứng • Dịch chiết với n-BuOH dung nạp sắc ký cột silica gel thu phân đoạn 2A-2G - Phân đoạn 2C đưa vào sắc lý gel Sephadex LH-20 ( với 100% MeOH) sắc ký cột SIL 100A ( với hexane : EtOH theo tỉ lệ 1:1) thu hợp chất 6hydroxycrinamine (1) - Phân đoạn 2D dung nạp sắc ký cột silicagel sắc ký cột SIL 100A (với hexane : EtOH theo tỉ lệ 1:1) thu hợp chất crinamine (3) - Phân đoạn 2E sau tiến hành sắc ký cột chớp nhoáng ODS, sắc ký cột siliscagel sắc ký cột Sephadex LH-20 thu lycorine (2) Kết quả: dịch chiết từ náng hoa trắng với dung môi MeOH qua nhiều phương pháp sắc ký khác thu alkaloid quan trọng: 6hydroxycrinamine (1), lycorine (2), crinamine (3) Phương pháp lập alkaloid sắc ký khí-phổ khối kết hợp với hạt nano kẽm thực Dong Zhu cộng đến từ Khoa Dược Đại học Y Khoa Nanjing, Trung Quốc [3] • Chuẩn bị dịch chiết: - Các tác giả sử dụng cách chiết xuất pha rắn (SPE) để chiết phương pháp mang lại nhiều ưu điểm: hiệu suất chiết cao, có khả phục hồi tốt, thời gian thực ngắn, dễ dàng tách riêng dung môi khỏi dịch chiết dễ tự động hóa - Cây Náng hoa trắng thu hái, sấy khô nghiền nhỏ thành bột để thực tách chiết - Tiến hành chiết với 1l hỗn hợp dung môi theo tỉ lệ etanol: nước 95:5, trì nhiệt độ 80°C, chiết liên tục suốt - Phần bã sau chiết xong chiết lại lần với dung môi điều kiện nhiệt độ thời gian lần chiết đầu để tách triệt để alkaloid có nguyên liệu • Chuẩn bị chất hấp thụ base ZnS cho trình sắc ký: -Các hạt nano kẽm có cấu trúc dạng xốp, mang nhiều lỗ nhỏ với diện tích bề mặt lớn, có độ bền học cao không bị trương nở hay co rút lại tiếp xúc lâu với dung môi - Chất tao nhờ phản ứng hòa trộn hợp chất poly-acrylicacid (PAA) với nhóm amin cysteamine vào hạt nano kẽm - Sử dụng chất hấp thụ base giúp cải thiện đáng kể hiệu tách tính chọn lọc alkaloid thông qua việc tạo tương tác tĩnh điện chất hấp thụ với nhóm carboxy mẫu • Tiến hành: Hình Sơ đồ chế tách chiết phân lập alkaloids sắc ký cột -Các hạt nano kẽm hòa trộn với cysteamine chuyển vào tủ ấm vòng 12h để nhóm mercapto(SH) cysteamine liên kết chặt chẽ với bề mặt cầu ZnS - Chất hấp thụ cho vào cột sắc ký, dịch chiết chảy từ xuống qua lớp ZnS Tại đây, alkaloid hình thành tương tác với chất hấp thụ base bị giữ lại hạt cầu ZnS, chất khác alkaloid len qua hạt kẽm ngồi - Sau tiến hành rửa giải alkaloid hỗn hợp CH3COONH4-ACN sấy khơ luồng khí nitơ nhẹ Cuối mẫu tiến hành phân tích HPLC-MS GC-MS để xác định cụ thể loại alkaloid nhận 10 • Kết quả: Từ hình ảnh quang phổ có thực phương pháp HPLC-MS GC-MS tác giả thu alkaloid có hợp chất (2 5) với tên công thức hóa học sau: STT Tên Thymine CTCT CTPT C5H6N2O2 Methylephedrine C11H17NO AC1LX3XL C15H9NO3 Saguinine Paullone C16H19NO3 C16H12N2O Hippadine C16H9NO3 Lycorine C16H17NO4 Bảng 3.1 Các alkaloid chiết tách • Tối ưu hóa trình: -Để tăng cao hiệu suất cho trình tách chiết alkaloids người ta tiến hành xem xét tối ưu hóa điều kiện cần thiết quy trình như: điều kiện tiên quyết, tải mẫu, loại dung mơi, thể tích dung mơi… 11 -Trong nghiên cứu này, tác giả khảo sát ảnh hưởng loại dung môi khác đến khả rửa giải thu hồi lycorine( số alkaloids phổ biến có Náng hoa trắng) Sử dụng loại dung môi : A: Acetonitrile (ACN ) B: ACN –acrylamid ( ACN- AM ) tỉ lệ 90:10,(v/v) C: ACN –ammonium acetate ( ACN- AMC ) 100mM D: MeOH- acid acetic ( MeOH-AA ) tỉ lệ 95:5,(v/v) E: MeOH- acrylamid ( MeOH-AM ) tỉ lệ 90:10,(v/v) F: Methanol ( MeOH ) - Kết khảo sát sau: Hình 3.1 Đồ thị ảnh hưởng loại dung môi thể tích dung mơi sử dụng Hình (A) thể khả thu hồi lycorine (%) ứng với loại dung môi khảo sát Kết cho thấy ACN -AM ( 90:10,v/v ) ACN- AMC ( 100mM) cho mức thu hồi lycorine cao (trên 85%) so với dung mơi lại Kết cho gây tương tác mạnh mẽ giai đoạn cố định chức ZnS ammonium dẫn đến việc giải phóng trở lại alkaloids ban đầu Sau chọn dung môi tối ưu ACN- AMC ( 100mM ), tiếp tục tiến hành khảo sát yếu tố thể tích dung mơi cần sử dụng Hình (B) biểu thị ảnh hưởng lượng dung môi sử dụng đến khả thu hồi lycorine (%) Đường đồ thị cho thấy thể tích tăng dần đến 2,0 mL tỉ lệ thu hồi tăng theo; tiếp tục tăng thể tích khoảng từ 2,0-5,0 mL thấy thay đổi không đáng kể Như thể tích ACN –AMC (100mM) tối ưu cho trình mL CHƯƠNG IV CÁC HOẠT TÍNH CỦA NÁNG HOA TRẮNG 12 4.1 Khả giúp tế bào chống nhiễm trùng: Nghiên cứu cho thấy dịch chiết từ Náng hoa trắng làm tăng khả sống sót tế bào bị nhiễm trùng huyết Để chứng minh người ta thực gieo mầm đại thực bào Raw 264.7 vào 24-cell với mật độ 8.10 tế bào nuôi cấy 377̊C, 5% CO2 Sau ngày, môi trường chứa 10% huyết thêm vào tế bào, tế bào xử lý với LPS (lipopolysaccharide) để gây nhiễm trùng huyết với tế bào Sau thêm dịch chiết từ Náng hoa trắng nồng độ khác theo dõi 24h Độc tính sinh học đánh giá MTT Sau 24 giờ, MTT chèn vào giếng, đĩa ủ 37˚C thêm h Sau môi trường chứa MTT bị loại bỏ sản phẩm MTT formazan tách với 1ml DMSO Lượng formazan môi trường nuôi cấy xác định độ hấp phụ bước sóng 570nm Số tế bào sống sót tính sau: N(%) = (OD570M/OD570C)×100 Trong đó: -OD570M: độ hấp phụ bước sóng 570nm mẫu -OD70C: độ hấp phụ bước sóng 570nm mẫu chứa tế bào không bị xử lý -N: phần trăm tế bào sóng sót(%) Kết thể biểu đồ: Hình 4.1 Khả sống sót tế bào Qua biểu đồ nhận thấy tăng nồng độ dịch chiết lên số lượng tế bào sống sót bị nhiễm trùng huyết cao Với kết nhận thấy dịch chiết từ Náng hoa trắng có làm tăng khả chống nhiễm trùng tế bào lên xấp xỉ 10 đến 60% tùy vào nồng độ khác 4.2 Tính kháng khuẩn: Ngồi khả chống viêm, gây độc tế bào với tế bào ung thư Dịch chiết từ Náng hoa trắng tìm thấy khả kháng khuẩn với số loài: gram âm (Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa); gram dương (Staphylococcus aureus, Bacillus subtilis) thông qua phương pháp khuếch tán đĩa thạch [5] 13 Sau nuối cấy vi sinh vật lên đĩa, bổ sung mẫu: Penicillin (đối chứng dương); dịch chiết với ethanol; dịch chiết với nước đem ủ vòng 24 37°C Khi đủ thời gian ủ, tiến hành quan sát độ đục đĩa khơng thấy có phát triển vi sinh vật Kết cho thấy dịch chiết với ethanol cho hoạt tính cao nhiều so với dịch chiết nước Sự khác biệt giải thích ngun nhân hoạt chất sinh học có hoạt tính mạnh có mặt ethanol khả chiết triệt để với dung môi Với mẫu có nồng độ 0.5mg/ml ức chế hoạt động Pseudomonasaeruginosa, Klebsilla pneumonia gây tác động với E coli, Bacillus subtilis.Với mẫu có nồng độ 1.5mg/ml ức chế với hầu hết vi khuẩn Nghiên cứu cho thấy dịch chiết với nhiều hợp chất khác đặc biệt alkaloid có Náng hoa trắng có khả kháng khuẩn, ức chế hoạt động số vi sinh vật phổ biến Từ mở hướng phát triển cho việc tìm kiếm hợp chất kháng khuẩn áp dụng vào mục đích tạo sản phẩm thuốc kháng vi khuẩn có nguồn gốc từ thiên nhiên; hạn chế bớt biểu mẫn cảm, ức chế miễn dịch, phản ứng dị ứng thường gặp sử dụng kháng sinh 4.3 Ức chế hoạt động phiên mã Hh / GLI, gây độc tế bào với số loại ung thư: Theo số nghiên cứu dịch chiết từ Náng hoa trắng có khả ức chế phiên mã Hh, gây độc tế bào tế bào ung thư tuyến tụy (PANC1), tế bào ung thư tiền liệt tuyến (DU145) [8] Các đường truyền dẫn tín hiệu hedgehog (Hh)/GLI đóng vai trò quan trọng phát triển phôi thai, bảo tồn mô người lớn liên quan tới phát triển số khối u da, não, tuyến tiền liệt, tiêu hóa, tuyến tụy, phổi Người ta tíến hành xác đinh loại alkaloid dịch chiết Náng hoa trắng 6-hydroxycrinamine(1), lycorine(2), crinamine(2) tiến hành xác định hoạt tính ức chế hoạt động phiên mã trung gian Hh/GLI gây độc tế bào với số loại tế bào ung thư tuyến tụy tiền liệt tuyến Các tế bào (HaCaT-GLI1-luc) nuôi cấy đĩa 96 giếng với mật độ 2.104 tế bào/ giếng 37 ° C 12 Sau ủ, µg / ml tetracycline thêm vào giếng để thể protein ngoại sinh GLI1, tế bào ủ 37 ° C 12 Sau thay dung dịch tetracycline dung dịch có chứa nồng độ khác mẫu Sau điều trị tại37°C 12 giờ, hoạt tính luciferase đo Hoạt tính luciferase phóng viên tế bào điều trị mẫu vào tế bào không điều trị tính tốn GLI1 trung gian hoạt động phiên mã Đồng thời, số tế bào sống sót xác định hệ thống FMCA Các hoạt tính phiên mã hoạt dịch trung gian Hb / GLI1 với giá trị IC50 14,3, 19,4, 4,7µM 14 Hình 4.2 Bảng kết thể khả gây độc tế bào ung thư Qua ta thấy hợp chất thứ có khả ức chế Hh/GLI1 mạnh Và hợp chất có khả ức chế yếu Để xác định khả gây độc tế bào tế bào ung thư, nhà khoa học tiến hành phân lập tế bào ung thư tuyến tụy người (PANC1) tuyến tiền liệt (DU145) tế bào gốc (C3H10T1/2) xuất phát từ chuột để kiểm tra Kết cho thấy tính gây độc tế bào hai tế bào PANC1 (IC50: 22.7, 19.9, 10,0 µM tương ứng) tế bào DU145 (IC50: 9,3, 21,7 18,5µM tương ứng), mà không ảnh hưởng đến tế bào khác Biểu đồ sau cho ta thấy khả gây độc tế bào loại chất với loại ung thư khác nồng độ khác Hình4.3 Biểu đồ khả gây độc tế bào nồng độ khác Cây Náng hoa trắng chứa thành phần, alkaloid có khả ức chế hoạt động phiên mã Hh/GLI1 gây độc tế bào với dòng ung thư tiền liệt tuyến ung thư tuyến tụy Hiện nhà khoa học mở rộng nghiên cứu với loại ung thư khác 4.4 Tính giảm đau: Các nhà khoa học đến từ Bangladesh gồm Md.Atiar Rahman, S.M.Azad Hossain, Nazim Uddin Amed, Md.Shahidul Islam phân tích hoạt tính giảm đau, kháng viêm dịch chiết từ Náng hoa trắng [7] Thử hoạt tính giảm đau với Acid acetic: Cho chuột uống dịch chiết (với nồng độ 2g/kg thể trọng) 30 phút trước tiêm acid để gây đau; dùng Diclofenac natri (một loại thuốc giảm đau) làm đối chứng dương, nước cất làm đối chứng âm Quan sát biểu chuột vòng 20 phút thấy số lần biểu đau tăng dần 15 theo thứ tự : DN< dịch chiết(2g/kgBw)< dịch chiết(1g/kgBw)< nước cất Cho dịch chiết có khả giảm bớt đau hoạt tính tăng dần tăng liều lượng sử dụng Thử hoạt tính giảm đau với Formalin: Tiến hành tương tự với nồng độ dùng chất gây đau Forrmalin tiêm vào bàn chân chuột, Morphin đối chứng dương, nước cất làm đối chứng âm Quan sát đếm số lần chuột liếm bàn chân giảm dần theo thứ tự: nước cất > dịch chiết(1g/kgBw) >dịch chiết (2g/kgBw) > Morphin Từ cho thấy dịch chiết có khả giảm đau với Morphin hoạt tính tăng dần tăng liều lượng sử dụng Nhóm tác giả tiến hành thử độc cấp tính cách cho chuột uống dịch chiết với nhiều nồng độ khác tiến hành quan sát thay đổi da, lông, mắt, hô hấp, tuần hoàn, hệ thần kinh trung ương Kết cho thấy khơng có chuyển biến bất thường xảy ra, dịch chiết khơng có tác động gây độc cấp tính với thể vật chủ 4.5Khả giảm béo: Ngồi hoạt tính gần người ta tìm thấy khả giảm béo dịch chiết Náng hoa trắng Người ta nuôi chuột với chế độ ăn giàu lipid ( 60%) để gây béo phì Tiếp theo, người ta sử dụng dịch chiết bổ sung vào chế độ ăn chuột Kết cho thấy tỉ lệ lipid chuột giảm dần Nguyên nhân dịch chiết chứa chất gây ức chế trình phiên mã tạo lipid KẾT LUẬN Qua nhiều cơng trình nghiên cứu báo cáo khoa học trong, ngồi nước; hoạt tính sinh học chức nhiều hợp chất có Náng hoa trắng làm sáng tỏ Thành phần Náng hoa trắng có chứa nhiều hợp chất alkaloid, flavonoid, phenolic… với hàm lượng cao vai trò vơ hữu ích Dịch chiết thu từ kích thích mọc tóc, kháng khuẩn, kháng nấm… Cao chiết( cao thô cao tinh) có khả ức chế gốc tự so với Vitamin C tốt Ngồi phải kể đến tác động gây độc tế bào nhiều loại tế bào ung thư tuyến tụy, tuyến tiền liệt Với hàng loạt công dụng điều trị nhiều bệnh khác nhau, Náng hoa trắng đối tượng vô có giá trị cho hướng nghiên cứu phát triển loại dược phẩm, sản phẩm thiên nhiên Ngoài nhiều lợi ích có khả sinh trưởng phù hợp với điều kiện thổ nhưỡng nước ta nhân tố quan trọng góp phần đưa việc ứng dụng loại ngày quan tâm Từ mở định hướng cho phân tích chuyên sâu nhiều phận nhiều hợp chất khác để ứng dụng vào nghiên cứu sau Có thể tiến hành nghiên cứu với đối tượng Náng hoa trắng vùng khác nhau, thời điểm thu hoạch, phận khác Ngồi ra, tiến hành nghiên cứu dòng ung thư khác 16 TÀI LIỆU THAO KHẢO Tiếng Việt [1] Nguyễn Thị Kim Phụng (2007), Phương pháp cô lập hợp chất hữu NXB Đại học quốc gia TP Hồ Chí Minh Tiếng Anh [2] Chia-Chuan Chang, Shoei-Sheng Lee (2014), Application of HLPCSPE-NMR in Characterization of Bioactive Natural Compounds, http://pubs.acs.org doi: 10.1021/bk-2014-1185.ch011 [3] Dong Zhu, Zhao YiMiao, RuiXiang Yang, HongMei Wen,Wei Li,Jun Chen,An Kang (2016), Layer-by-layer functionalized porous Zinc sulfide nanospheres based solid phase extraction combined with liquid chromatography time of flight/mass and gas chromatography mass spectrometry for the specific enrichment and identification of alkaloids from Crinum asiaticumvar.sinicum, Analytica Chimica Acta 932 (2016) 6068 [4] Geoffrey A Cordell, Mary Lou Quinn-Beattie and Norman R Farnsworth (2001), The Potential of Alkaloid in Drug Discovery, Phytotherary Research, Phytother Res 15, 183-205 (2001) [5] Ilavenil, S., B Kaleeswaran, B and Ravikumar, S (2010), Evaluation of Antibacterial Activity and Phytochemical Analysis of Crinum Asiaticum, International Journal of current research, Vol 1, pp 035-040, January, 2010 [6] Kunwar Awaneesh Singh, Manasa K Nayak, Medicherla V Jagannadham , Debabrata Dash (2011), Thrombolytic Along with Anti-platelet Activity of Crinumin, a Protein Constituent of Crinum Asiaticum, Blood Cells, Molecules and Diseases 47 (2011) 129-132 [7] Md Atiar Rahman, S.M.Azad Hossain, Nazim Uddin Ahmed and Md Shahidul Islam (2013), Anelgasic and Anti-flammatory Effects of Crinum AsiaticumLeafAcoholic Extract in Animal Models, African Journal of Biotechnology, Vol 12(2), pp 212-218, January, 2013 [8] Midori A Arai, Ryuta Akamine, Samir K Sadhu, Firoj Ahmed, Masami Ishibashi (2015), Hedgehog/GLI-mediated Transcriptional Activity Inhibitorsfrom Crimun Asiaticum, J Nat Med, DOI 10.1007/s11418-015-0922-8 [9] Nguyen Thi Ngoc Tram, Tz.V Titorenkova, V St Bankova, N.V Handjieva, S.S Popov (2002), Review Crinum L (Amaryllidaceae), Fitoterapia 73 (2002) 183208 [10] Qian Sun, Yun-Heng Shen, Jun-Mian Tian, Jian Tang, Juan Su, Run-Hui Liu, Hui-Liang Li, Xi-Ke Xu, Wei-Dong Zhang (2009), Chemical Constituents of Crinum Asiaticum L var sinicum Baker and Their Cytotoxic Activities, CHEMISTRY AND BIODIVERSITY, Vol.6 (2009) 17 [11] Sang-Cheol KIM, Jung-Il KANG, Min-Kyoung KIM, Jae-Hee HYUN, HyeJin BOO, Doek-Bae PARK, Young-Jae LEE, Eun-Sook YOO, Young Ho KIM, Young Heui KIM, Hee-Kyoung KANG (2010), Promotion effect of norgalanthamine, a component of Crinum asiaticum, on hairgrowth, Eur J Dermatol 2010; 20 (1): 42-8 18 ... thành cổ dài 12–15 cm hay Lá Náng hoa trắng mọc từ gốc, nhiều, hình dãi giáo, lõm, có khía trên, mép ngun, dài tới 1m rộng 5-10cm Hình 1.1 Cây náng hoa trắng Cụm hoa hình tán nằm đầu cán hẹp... Quả mọng hình gần tròn, đường kính 3–5 cm, thường chứa hạt Cây Náng hoa trắng thường hoa vào mùa hè[9] 1.2 Đặc điểm phân bố Náng hoa trắng có nguồn gốc từ châu Á, phân bố từ Ấn Độ qua Indonesia... hoạt tính mà gần Náng hoa trắng quan tâm ngày nhiều Các nghiên cứu khảo sát, tìm thành phần có chức sinh học cao đưa nhiều kết khả quan tác động chất thể Các alkaloid Náng hoa trắng cho có khả