1 MỞ ĐẦU 11 Đặt vẫn đề
Thuéc 14 (Nicotiana tabacum L) la cay céng nghiệp ngắn ngày có giá trị kinh tế cao Sản phẩm thu hoạch là lá tươi, phải thông qua giai đoạn chế biến đặc
trưng (say, hong, phơi ) mới có thể dùng lá làm nguyên liệu sản xuất thuốc lá
Ngoài ra cây thuốc lá cũng được sử dụng làm nguyên liệu sản xuất nicotin, đùng
làm chế phẩm trừ sâu, axit hữu cơ, hạt dùng để chiết xuất dầu thực vật
Nghiên cứu chọn tạo giống thuốc lá theo các hướng khác nhau được quan
tâm ở các quốc gia lớn như Mỹ, Brazil, Trung Quốc, ZIimbawe Một trong
những hướng chọn tạo giống được quan tâm hiện nay là ứng dụng công nghệ biến đổi di truyền để chọn tạo giống kháng sâu bệnh hại chính như kháng các bệnh virus khảm lá thuốc lá (TMV,CMV), virus xoăn lá thuốc lá (TLUCV) hoặc kháng sâu (sâu xanh, sâu xám ) Ngoài khuynh hướng tạo tính kháng sâu của cây bằng gen cry mã hóa cho sự tạo nội độc tô õ trong pha sinh bào tử của vi khuẩn Bacillus thuringensis (B0, gần đây các nhà khoa học đã phát hiện các gen vip (vegetative insecticidal protein - các protein sinh dưỡng diệt côn trùng) mã hóa cho các protein trong pha dinh dưỡng của chu trình phát triển vi khuẩn
Bt va Bacillus cereus (Bc), chiết tách, nhân bản, xác định trình tự và thử hoạt
tính sinh học Kết quả cho thấy các protein V7p có hoạt lực và phô tác dụng diệt côn trùng cao hơn rất nhiều lần các protein do gen crzy mã hóa Gen vj?3 tạo protein có hoạt tính kháng sâu xám cao gấp 260 lần so với protein cry IA và có
phố hoạt động rộng như diệt được sâu xanh hại ngô, sâu xanh hại thuốc lá [12]
Trang 2dụng công nghệ biến đổi di truyền để chọn tạo giống kháng sâu bệnh hại là một trong những hướng đi để giải quyết vẫn đề đó
Viện Công nghệ Sinh học đã bước đầu chuyển thành công gen kháng bệnh vào cây thuốc lá (kháng bệnh khảm lá thuốc lá TMV, khảm lá đưa chuột CMV) [2] nhưng chưa có nghiên cứu nào được công bố về sử dụng gen v¿;3A trong tạo giống cây trồng chuyển gen kháng sâu
Trên cơ sở đó chúng tôi tiến hành nghiên cứu đề tài: “Nghiên cứu tạo cây thuốc lá chuyển gen kháng sâu vip3A”
12 Mục đích và yêu cầu
1.2.1 Mục tiêu của dé tai:
Tạo ra cây thuốc lá chuyển gen mang gen khang s4u (vip3A) 1.2.2 Nội dung nghiÊn cứu:
- Thiét ké vector chuyén gen mang gen vip3A
Trang 32 TONG QUAN TAI LIEU
2.1 Giới thiệu chung về cây thuốc lá
Thuốc lá (Nicotiana fabacum L} là loại cây công nghiệp ngắn ngày có tầm quan trọng bậc nhất về kinh tế trên thị trường thế giới không chỉ đối với trên 33 triệu nông dân của trên 120 quốc gia, mà còn cho cả toàn bộ nền công
nghiệp - từ các nhà máy chế biến, cuốn điếu, sản xuất phụ gia, phụ liệu đến cả
hệ thống phân phối tiêu thụ, thậm chí cả một phần ngành sản xuất các vật tư
nông nghiệp phục vụ cho cây thuốc lá như phân bón, thuốc bảo vệ thực vật
[16], [20] Với tổng điện tích trồng trọt khoảng 4.0 - 5,5 triệu ha trải khắp từ 60° vi Bắc đến 40° vi Nam và tông sản lượng nguyên liệu thu được khoảng
6,5 - 8,5 triệu tấn (trong đó khoảng 3,5 - 4,5 triệu tân thuốc lá vàng; khoảng 0,6 - 1,0 triệu tấn thuốc lá burley; trên 0,5 triệu tấn thuốc lá oriental; còn lại là
các loại khác để sản xuất khoảng 6.000 tỷ điều hàng năm [22], [47]
Theo Reed S.M [41] thì cây thuốc lá được phân loại thuộc giới thực
vật, phụ giới có phôi, ngành có mạch dẫn, phụ ngành dương, lớp thực vật hạt
kín, lớp phụ 2 lá mầm, phân lớp Cúc, bộ Cà, họ Cà Họ này có tới trên 85 chỉ với tông số trên 1.800 loài Một số loài trong họ này được trồng rộng rãi như
khoai tây, cà chua, ớt, các loại cà và trong đó có chi NIcotiana Đặc trưng của
các loài trong họ này là trong thân và quả thường chứa alcaloid như solanin, atropin, scopalamin, nicotine
Chi Nicotiana duoc chia lam 3 chi phụ, 14 nhóm với tổng số tới 66 loài trong đó 45 loài có nguồn gốc ở Bắc và Nam Mỹ, 20 loài ở Australia và I loài ở Châu Phi Phần lớn những loài này là cây thân bụi hàng năm, một số là cây lâu năm và 2 loài là cây bụi thân gỗ Trong số 66 loài thuốc lá, có 2 loài
chưa tìm thay ở dạng hoang dai nhưng lại được trồng phổ biến làm thuốc lá là
Trang 4Loài N tabacum c6 s6 luong nhiém sắc thé lưỡng lưỡng bội (Dihaploid = 4n), có biến động lớn về kích thước lá, dạng ngọn lá, góc đóng
lá so với thân, kiểu tai cuống lá, mầu sắc lá Hoa tự chùm lưỡng tính mọc
trên đỉnh sinh trưởng, hoa dài khoảng 5 cm, có 5 cánh với mâu từ hồng đến đỏ (N fabacum) hay màu vàng đến vàng hơi xanh (N rustica) Hoa thường tự thụ phan trước khi nở và tỷ lệ tự thụ phấn đến 95% Mỗi cây có thể cho 200 - 400 quả và mỗi quả có khả năng cho khoảng 2000 - 4000 hạt Trong hat chtra 32 - 42% dau (Chu yéu 1a Linoleic acid va Oleic acid), 20 - 30% protein Trong 1 gam hạt có từ 10.000 - 15.000 hạt và hạt có khả năng sống rat lau [16], [20], [22]
2.1.1 Lịch sử hình thành - phát triển thuốc lá
Trong lịch sử, cây thuốc lá được trồng đầu tiên ở châu Mỹ từ hơn 6000 năm trước công nguyên và được sử dụng trong các nghỉ lễ tôn giáo, làm thuốc chữa bệnh [16], [22]
Thuốc lá là loài cây trồng có nguồn gốc Nhiệt đới và Á nhiệt đới, hương vị đặc biệt của nó đã được biết đến ở vùng Trung Mỹ có lẽ cách đây trên hai nghìn năm và trở nên phố biến từ thế kỷ 15 [16], [20]
Sử viết về cây thuốc lá bắt đầu vào ngày 12 tháng 10 năm 1492, khi Christopher Columbus đặt chân lên bãi biển San Salvado ở Tây An Độ Dương Các thổ dân ở đó đã mang tới hoa quả và cả những nắm lá khô cho mùi thơm quyến rũ khi chúng được châm hút đề mời đoàn thám hiểm [16], [20]
Trang 5Nam 1876, nghé trong thuốc lá ở Việt Nam chính thức khởi sự tại Gia Định,
tiếp theo là Tuyên Quang (1899) và thuốc lá điều bắt đầu được sản xuất tại Hà Nội cùng thời gian này Năm 1935, giống thuốc lá vàng sấy Blond cash đầu tiên được du nhập và trồng thử ở An Khê, đến năm 1940 trồng thử ở Tuyên
Quang, Ninh Binh [22]
2.1.2 Các đặc điểm thực vật học cây thuốc lá
Rễ thuốc lá là một hệ thống bao gồm: rễ cái (rễ trụ), rễ nhánh (rễ bên)
và rễ hấp thu Ngoài ra, thuốc lá còn có rễ bất định mọc ở cô rễ, phần trên sát
mặt đất Rễ trụ được hình thành từ phôi rễ Rễ nhánh được phát sinh từ trục
của rễ cái, thường có độ xiên 30 - 40° Rễ hấp thu được phát triển trên các rễ nhánh, có nhiệm vụ cung cấp nước và dinh dưỡng cho cây Rễ bất định mọc từ thân, những rễ bất định ở phần sát gốc dễ phát sinh thành rễ hút khi độ âm không khí cao Rễ thuốc lá tập trung dày đặc ở lớp đất 0 - 30 cm, phát triển theo các hướng Rễ thuốc lá là cơ quan sinh tổng hợp nicotin Nicotin được vận chuyến từ rễ và tích tụ trên thân, lá thuốc lá
Các dạng thuốc lá trồng có dạng thân đứng, tiết diện thân tròn, chiều cao thân cây có thể đạt từ 1 - 3 m, chia làm nhiều đốt, mỗi đốt mang một lá Đường kính thân đạt 2 - 4 cm, nách lá trên thân có chồi sinh trưởng gọi là chôi nách Có 2 loại chôi nách: chôi nách chính và chô1 nách phụ
Trên thân chính của cây thuốc lá có nhiều lá Số lượng lá trên cây thay đôi tuỳ theo giống Lá thuốc lá có các hình dạng chủ yếu là: Hình trứng, hình tim, hình elip, hình mũi mác Độ dày, màu sắc lá có thể thay đổi
Trang 6la quyét định độ dày mỏng, độ dan hồi của lá thuốc Ở trên mặt lá còn có
nhiều tuyến lông đa bào, có hình dạng và kích thước khác nhau Các tuyến này chứa nhựa, hợp chất thơm tự nhiên và tích luỹ nhiều khi lá chín kỹ thuật Trên mặt lá có gân chính và nhiêu gân phụ
Hoa thuốc lá là hoa đơn, lưỡng tính, có năm cánh, nhị cái ở giữa, xung quanh có 5 nhị đực thường mọc cao hơn nhị cái, thuộc loại hoa tự hữu hạn,
được hình thành do sự phần hoá của đỉnh sinh trưởng thân Chính giữa chùm
hoa có hoa trung tâm và có các nhánh hoa mọc từ trục chính của chùm hoa
Phương thức thụ phẫn của thuốc lá là tự phối (97 - 98%), còn lại có thé do thu phan chéo đo gió hoặc côn trùng,
Quả thuốc lá được hình thành trên đài hoa Mỗi cây có 100 - 150 quả trên mỗi chùm hoa, có những cây hoặc những giống có tới 400 - 500 quả trên chùm hoa Mỗi quả có hai ngăn, khi chín chúng thường tách ra
Hạt thuốc lá rất nhỏ, khối lượng 1000 hạt của các giống thuốc lá vàng say lò là 0,07 - 0,10 gam, trong mỗi gam hạt có từ 10.000 đến 15.000 hạt [14] 2.1.3 Tình hình sâu bệnh hại
Cây thuốc lá bị các loại bệnh hại chính là bệnh khảm lá thuốc lá do
virus (TMV,CMV), bệnh xoăn lá thuốc lá do virus (TLCV), bệnh héo rũ vi khuẩn , đen thân, héo đốm cà chua
Các loại sâu chính gây hại trên thuốc lá là sâu xanh (Helicoverpa assulta), stu khoang (Prodenia lifara), sầu xám (Agrofis ypsilon)
Trang 72.1.5 Giá trị của cây thuốc lá
Thuốc lá là cây công nghiệp ngăn ngày có giá trị kinh tế cao Sản phẩm chính là lá thuốc lá, sử dụng làm nguyên liệu cho ngành công nghiệp thuốc lá trên toàn thế giới Ngoài ra thuốc lá còn được sử dụng vào một số mục đích khác như:
- Trong nhom Nicotiana rustica dé chiét xuat từ lá hàm lượng nicotin từ 4 - 5 % để sản xuất thuốc trừ sâu Sulfat nicotin
- Từ thân và lá thuốc lá chiết xuất được sclareol và 13 epi - sclareol chống bệnh gỉ sắt cây họ đậu - Từ lá thuốc lá chiết xuất axit nicotineic dùng cho công nghiệp được phẩm - Hạt thuốc lá chiết xuất 34 - 40% dầu phục vụ trong công nghiệp, sử dụng trong thực phẩm
- Thân chế tạo các loại giấy có chất lượng cao - Hoa chiết xuất tinh đầu sản xuất nước hoa thuốc lá
- Một số phát hiện mới hiện nay, các nhà nghiên cứu đã kết luận thuốc lá giàu protein, hydratcacbon, chất béo và vitamin
- Protit thuốc lá chứa nhiều axit amin quan trọng, tính chất bổ dưỡng vượt cả Phomat Protein trong sữa [5]
2.1.6 Tình hình sản xuất thuốc lá nguyên liệu
Thuốc lá nguyên liệu tham gia thương mại trên thế giới chủ yếu được sản xuất ở các vùng từ 45° vĩ Bắc đến 30° vĩ Nam Diện tích trồng thuốc lá trên thế giới trong những năm gần đây luôn duy trì ở mức khoảng 3,5 triệu ha [55]
Trang 8Bảng 2.1 Sản lượng các dạng thuốc lá nguyên liệu chủ yếu của thế giới giai đoạn 2004 - 2008 PVT: ngan tan Nam Vang say Burley Oriental Nau Tong 2004 3757,1 886,4 350,9 195,9 5190,3 2005 4035,6 771,8 353,1 181,9 5342,4 2006 3948,5 725,3 268,5 182/1 5124,4 2007 3872,6 620,6 237,0 185,5 4915,7 2008 4185,9 743,5 259,0 184.3 5372,7
Số liệu ở bảng 2.1 cho thấy sản lượng các dạng thuốc lá chính của thế giới những năm qua tương đối ôn định, mặc dù ngành công nghiệp thuốc lá ở
các nước chịu nhiêu ap lực
Hiện nay, thuốc lá được trồng ở nhiều địa phương trong cả nước (27/64 tỉnh, thành phố) [7] với 3 chủng loại thuốc lá vàng sấy, nâu và burley trong đó thuốc lá vàng sấy là loại nguyên liệu được trồng nhiều nhất ở nước ta hiện nay
chiếm tỷ trọng đến 90% sản lượng thuốc lá nguyên liệu sản xuất nội địa
Các địa phương trông thuốc lá vàng sẵy chủ yếu hiện nay là Cao Bang,
Lạng Sơn, BắcKạn, Gia Lai, Đắklăk, Tây Ninh, Ninh Thuận, Phú Yên Tổng
điện tích trồng thuốc lá vàng sấy trên cả nước hiện dao động ở khoảng 14 - 16 ngàn ha với sản lượng hàng năm ước đạt từ 22 - 26 ngàn tấn Tại khu vực
phía Bắc, năng suất đạt 1,5 - 1,8 tân/ha Năng suất bình quân tại các tỉnh phía
Trang 9Bang 2.2 Tình hình sản xuat TLNL vang say của Việt Nam 2006 — 2008 Năm 2006 2007 2008 TT Địađểm DT SL NS DT SL NS DT SL NS I Phia Bac 5.875 8.912 1,52 5.615 8.737 1,56 7.066 11.144 1,58 H PhaNam 9683 17.184 1,77 7.564 13.725 1,81 6.165 11.229 1,82 Tổng/TB 15.558 26.096 1,68 13.18 22462 1,70 1323 22.373 1,69
Số liệu bảng trên cho thấy sản lượng thuốc lá nguyên liệu vàng sấy trong nước trong những năm qua tương đối ôn định Theo đánh giá của các chuyên gia, nguyên liệu thuốc lá vàng sấy của nước ta hiện nay có chất lượng tương đối tốt, có thé thay thế được nguyên liệu Trung Quốc Vì vậy việc phát triển sản xuất thuốc lá nguyên liệu vàng sấy trong nước phục vụ cho nhu cầu tiêu đùng nội địa là một việc làm cần thiết trong giai đoạn hiện nay Nó vừa giúp cho ngành sản xuất thuốc lá trong nước chủ động được nguồn nguyên liệu đầu vào vừa tạo công ăn việc làm cho một bộ phận đông đảo bà con nông dân, tăng nguồn thu ngân
sách và tiết kiệm được nguồn ngoại tỆ cho nhà nước
2.2 Chuyển gen ở thực vật - cơ sở khoa học của dề tài 2.2.1 Khái niệm chuyén gen
Kỹ thuật chuyển gen là kỹ thuật đưa một hay nhiều gen lạ đã được thiết
kế ở dạng DNA tái tổ hợp vào tế bào chủ của cây trồng nói riêng và của các
sinh vật nói chung (vi sinh vật, động vật, ) làm cho gen lạ có thể tồn tại ở
dạng plasmit tái tô hợp hoặc gắn vào bộ gen tế bào chủ Trong tế bào chủ, các gen này hoạt động tông hợp nên các protein đặc trưng dẫn tới việc xuất hiện các đặc tính mới của cơ thể chuyển gen [3], [12]
Trang 10trạng nhất định, khả năng phiên mã, dịch mã và khả năng di truyền Thông qua chuyển gen, các nhà sinh lý, hoá sinh và di truyền có thể nghiên cứu các quá trình điều khiển, thể hiện và ảnh hưởng của các yếu tố di truyền và ngoại cảnh lên hoạt động của gen
2.2.2 Các phương pháp chuyển gen cho cây trông
Có nhiều phương pháp chuyến gen vào thực vật nhưng có thê phân loại thành hai nhóm phương pháp chính: phương pháp chuyên gen gián tiếp và phương pháp chuyền gen trực tiếp
- Phương pháp chuyển gen nhờ kỹ thuật xung điện - Phương pháp chuyển gen nhờ vi tiêm
- Phương pháp chuyển gen trực tiếp qua Ống phản - Chuyển gen nhờ súng bắn gen
- Chuyển gen nhờ silicon carbide - Chuyển gen nhờ virus
- Chuyển gen nhờ vi khuẩn Agrobacterium
Trang 11Phương pháp này đã khắc phục được những hạn chế chủ yếu của các phương pháp chuyển gen trực tiếp như: thường thu nhận được cây trồng có nhiều bản sao của một gen dẫn tới sự “nhiễu gen” và không bền vững của gen trong thực vật, tần số chuyên gen thấp, kết quả có thể thu được những cây mang thé kham nghĩa là chỉ mang gen ở một số vị trí trên cây
Đặc biệt là khi nhược điểm của 4 tumerfaciens chi chuyén gen trén cay
hai lá mầm được khắc phục, việc chuyển gen vào cây một lá mầm trở thành
hiện thực và được ứng dụng thành công thì phương pháp chuyên gen nhờ vi khuan Agrobacterium ngay cang gay được sự quan tâm va dần trở thành một phương pháp chuyển gen được ưu tiên lựa chọn của các nhà khoa học và các nhà chọn tạo giống trên thế giới
* Đặc điểm chung của vi khuẩn A tumefuciens
Agrobacterium 1a cac vi khuẩn đất nhuộm gram (-) gây ra các triệu chứng bệnh ở cây khi xâm nhiễm qua vết thương
Trong chi Agrobacterium thì A tumerƒfaciens được sử dụng nhiều nhất cho việc chuyển gen Phán loại khoa học: CHỚI Bacteria Ngành: Proteobacteria Lớp: Alpha Proteobacteria Bộ: Rhizobiales Họ: Rhizobiaceae Chi: Agrobacterium Loài: A tumefaciens
Danh phap khoa hoc: Agrobacterium tumefaciens (Smith & Townsend, 1907) [52]
Trang 12dụng bộ máy thực vật để biểu hiện các gen này dưới dạng hợp chất dinh dưỡng cho ching A tumerfaciens sé tao ra cac khéi u thực vật gần điểm tiếp nối giữa rễ và thân, gây ra những nốt sin 6 cay (bénh mun cay - crown gall disease), khi
đó các tế bào khối u & thyc vat cé gin mét doan DNA ti vi khuan Khi phan
tích khối u cho thấy trong khối u có sự hình thành một số vật chất mới như:
nopaline, octopine goi chung 1a opine Cac chat này không hề có trước đó và không hề có ở cây trồng thông thường Như vậy vi khuẩn đã truyền vào cây qua vết thương một tác nhân gây bệnh cho cây và tác nhân này có bản chất là vật chat di truyền T-DNA region Cytokinin border catabolism
Qua nghiên cứu người ta kết luận rằng tác nhân gây u này chinh 1a Ti- plasmit có trong vi khuẩn 4 Ømerƒfaciens Ti-plasmit này có đặc điểm chung như sau:
T1-plasmit là một plasmit được cầu tạo bao gồm một phân tử DNA kép, vòng tròn lớn có kích thước 200 kb, có khả năng tái bản độc lập với sự tái bản
cua DNA nhiém sac thé cua vi khuan
Trang 13Trên Ti-plasmit có đoạn T-DNA được giới han bang bo phai (right border) va bo trai (left border) co trinh tự nucleotid tương tự nhau T-DNA là đoạn nucleotit có kích thước 25 kb và mang hai loại gen: loại gen gây ung thư (oncogenic gene), loại này mã hoá cho một enzyme liên quan tới tổng hợp các auxin, cytokinin và hình thành khối u; loại thứ hai liên quan tới tổng hợp opine Doan nay được gọi là T-DNA (Tumor DNA) vì đây là đoạn sẽ được chuyển vào tế bào thực vật gắn vào bộ NST và gây ra bệnh u Trên Ti-plasmit còn có vùng vử-' chứa các gen chịu trách nhiệm hoạt động lây nhiễm, chuyển nạp và tiêu hoá opine [13 |
Khi cây nhiễm bệnh, do T-DNA nạp vào trong bộ gen của cây chủ bắt
đầu hoạt dong va san sinh ra auxin, cytokinin va opine, toan b6 sinh trudng cua cay bi rỗi loạn, các tế bào phân chia vô tổ chức và tạo ra các khối u Opine được vi khuẩn sử dụng như một loại thức ăn, nhờ gen chuyển hoá
opine trén Ti-plasmit
Quá trình chuyền nạp của vi khuẩn:
Thực vật khi bị thương sẽ tiết ra các chất độc vết thương có bản chất
phenol: acetosyringon va hydroxyacetosyringon Các chất này sẽ thu hút vi khuẩn tập trung vào vùng bị thương đồng thời chúng hoạt hoá các gen ở vùng
vir la E, D, C, G, B, A, F va tạo ra các protein tương ứng Các protein này có
hai chức năng chính: cắt đứt bờ phải và bờ trái để giải phóng đoạn T-DNA,
bao bọc và vận chuyển đoạn T-DNA vào tế bào thực vật và tiếp cận với
genom cây chủ
Quá trình chuyển T-DNA tt vi khudn A tumerfaciens sang té bao cay
chủ được thực hiện bởi hoạt động của các gen vir A, B, C, D, E, G, F Cac
Trang 14màng tế bào để đáp ứng sự trao đổi chất của vết thương trên cây Protein ƒr A tự photphoryl hoá đồng thời làm cho protein Vir G duoc photphoryl hoá
(Jin va CS 2001) va kich hoat sao m& cua cac gen vir B, C, E, F, G, H (Ziemienowcz 2001) N Ti | /⁄ — TDNMA | ti Be — Phải | poems WINN VirD1/D2 Y 4 } _ ——~ stra ——®= HD Virb2 VirE2 c eins —_ £ Thức hopper 1 WirD4aT4ass Fénh chora thank thuc => -_ = — — = —#œ 8Ñ _— ss SSS = eS => = vce ( (ƒ@H mnmmaaifr =) | N \ Ñ Agrobacterium — \ Té bao thive vat
Hinh 2.2 Mé hinh chuyén gen gián tiép nho Agrobacterium
(1) Agrobacterium nhận dạng và tấn công tế bào chủ;(2) Tổ hợp tín hiệu VirA/VirG của
Agrobacterium cam nhén nhitng tin hiệu thực vật đặc trưng, (3) Sự hoạt hoá của vùng gen
vir; (4) T-DNA được tách ra khỏi Ti-plasmit nhờ phức hợp protein VirDD;, (53) Sự tạo thành phức hợp VirD›;-DNA (phức hợp-†] chưa thành thục), cung voi mét vai protein Vir khác, đi vào nguyên sinh chất tế bào chủ; (6) Sự kết hợp của VirE› với sợi-T tạo thành phức hợp-T thành thục đi xuyên qua nguyên sinh chất tế bào chủ; (7) Phức hợp-T thành
thục chủ động di vao nhdn té bao chi; (8) T-DNA bi hấp dẫn tới vị trí hợp nhất; (9) T-
DNA tach khỏi các protein bảo vệ; (10) T-DNA hợp nhất vào bộ gen chủ
Tiếp đó các protein được mã hoá bởi vi D, vir E thực hiện chức năng
giải phóng sợi T-DNA Protein D; cắt T-DNA tại vị trí 5” của bờ phải và 3° của bờ trái và giải phóng sợi T-DNA Protein E; bảo vệ T-DNA khỏi sự phân giải của enzyme nuclease trong cây (Deng và cs 1998) Đồng thời thực hiện chic nang nay co cac protein Vir C;, Vir C 2 co tác dụng tắng cường viỆc giải phong T-DNA
Trang 15Sự chuyén phic hop T-DNA do operon vir B dam nhiệm Vir B có chức năng tạo kênh xuyên qua màng tế bào giúp chuyén soi don T-DNA vao
nhân tế bào Đồng thoi protein Vir By, Vir B,; cé hoat tinh ATPase cung cấp
năng lượng cho vận chuyển T-DNA (Zhu và cs 2000)
Như vậy, thực chất đã có một hệ thống chuyển gen của vi khuẩn đất vào cây trồng tôn tại trong tự nhiên
Dựa vào cơ chế này con người lợi dụng vi khuẩn đất để chuyển các gen mong muốn cho mình trên cơ sở thiết kế lại hệ thông Ti-plasmit của vi khuẩn sao cho vẫn đảm bảo được chức năng chuyển gen nhưng không mang các gen gây độc cho cây
Người ta đã tạo ra các dạng vector mới để chuyển gen là những vector liên hợp (co-intergrate vector) và vector nhị thể (binary vector) [3], [4]
Hệ thống vector liên hợp (co-integrate vector) là kết quả của sự liên hợp hai loại plasmit: Ti-plasmit đã loại trừ vùng gen gây khối u và gen tạo các hợp chất opine nhung van git lai ving vir va ving bo trai, bờ phải Thay vào những gen
bị cắt bỏ là đoạn tương đồng với một đoạn trên plasmit thứ hai (plasmit trung
gian) để phục vụ cho việc liên hợp hai loại plasmit Plasmit trung gian là một plasmit tách dòng từ vi khuẩn E.coi và có thê tái sinh được ở Agrobacterium Plasmit này có chứa vùng gắn gen cần chuyền nạp, các gen chỉ thị phục vụ việc
chọn lọc và có mặt đoạn tương đồng Khi cho tương tác hai loại plasmit nay với
nhau chúng sẽ liên hợp qua sự trao đổi chéo giữa hai đoạn tương đồng và hình thành nên vector liên hợp Vector liên hợp này năm trong vi khuẩn 4 tumefaciens va hoat d6ng theo co ché chuyển gen thông thường của vi khuẩn đất Do tần số đưa plasmit trung gian từ E.coli sang Agrobacterium rat thấp (10 7-10) nên vector này ít được sử dụng (John Draper, 1882)
Trang 16dong tir E.coli trong do co thiét ké ving bo trái và bờ phải, nằm giữa chúng là các gen chỉ thị và vùng gắn gen can chuyển Plasmit thứ hai là Ti-plasmit cai
tiến: toàn bộ vùng T-DNA và vùng bờ trái và bờ phải bị cắt bỏ chỉ giữ lại
vùng wử, plasmit này được gọi là plasmit hỗ trợ Hệ thống vector này cũng hoạt động theo cơ chế chuyển gen của vi khuẩn đất 4grobacterium một cách rất hữu hiệu (Nguyễn Quang Thạch và cộng sự, 2005) [12]
Thiết kế vector
Các nghiên cứu về vi khuẩn Agrobacterium va khả năng tự nhiên của chúng trong việc biến đổi vật chất sinh học của các tế bào thực vật bị nhiễm đã giúp các nhà khoa học thiết kế được những phân tử giúp chuyên gen mong
muốn vào tế bào thực vật: T-DNA được giới hạn hai đầu bởi vùng biên (T-
DNA borders), phần còn lại trong vùng biên sẽ không có chức năng øì trong quá trình chuyển gen Nhờ vậy, có thể loại bỏ khả năng gây hại của T-DNA bằng cách thay các gen tao khéi u (oncogenes) nam trong hai đầu vùng biên
bằng các øen mong muốn Khi các oncogene bị loại bỏ, tế bào hoặc mô thực
vật chuyển gen sẽ phát triển bình thường và trong hầu hết các trường hợp, cho cây hữu thụ Quá trình tổng hợp opine sử dụng các nguyên liệu của cây làm ảnh hưởng đến năng suất cuối cùng nên trong quá trình thiết kế cũng loại bỏ các gen tông hợp opine Ti-plasmit có kích thước lớn (200 - 800 kb) nên những đoạn DNA không cần thiết cũng phải được cắt bỏ để chèn vào đoạn DNA mục tiêu Ngồi ra, Ti-plasmit khơng tự tái bản trong #.coii nên cần được bổ sung thêm gốc tái bản của E.coi¡ Cuối cùng, cần bố sung các gen chỉ
thị để chọn lọc cay va vi khuẩn
Các phân tử DNA kỹ thuật di truyền này được gọi chung là các vector Như vậy, cấu trúc của một vector chuyên gen bao gồm:
Trang 17* Ving két thuc (terminator)
* Vùng gắn gen chuyén vao (MCS)
* Vùng chứa gen chọn lọc (để tách các tế bào chuyến gen)
* Vùng chứa các gen báo cáo để biết được các gen chuyển vào có thành công không (gzs, gƒ? - gen phát huỳnh quang)
Quy trinh chuyén gen nho vi khuan A tumefaciens nhw sau: Bước 1: Thiét ké vector mang gen
Bước 2: Nhân dòng vector nhé vi khuan E.coli
Buéc 3: Chuyén vector tai t6 hop vao A tumerfacien
Bước 4: Lay nhiễm A tumerfaciens chira gen bién nap véi té bao, mé thực vật để tiễn hành quá trình chuyển gen sang mô, tế bào đích
Bước 5: Chọn lọc các mô, tế bào được biến nạp thành công Bước 6: Tái sinh mô, tế bào biến nạp thành cây hoàn chỉnh
Sau đó, từ những cây chuyển gen thu được cần đánh giá sự ổn định di truyền qua các thế hệ, sử dụng phương pháp lai hữu tính để thu được con cái mang gen mong muốn Đồng thời đánh giá tác động của cây chuyên gen dé đưa ra sản xuất và cung cấp cho thị trường [13]
Công nghệ sinh học phát triển đã tạo điều kiện để các nhà khoa học tiếp
tục nghiên cứu chọn tạo giỗng kháng sâu bằng cách chuyển gen mã hoá các đặc tính mong muốn vào cây trồng
Trang 18được thương mại hoá Năm 1998, lần đầu thành công việc chuyển đồng thời 10 gen vào một cây Toàn cầu có 48 giống cây chuyên gen được phép thương mại hoá (trong đó Mỹ có 35 giống) [38] Năm 1999, chuyển gen cho lúa có giá trị dinh dưỡng cao hơn Diện tích trồng cây chuyến gen trên toàn cầu lớn
hơn 40 triệu ha [11] Năm 2006 được ghi nhận là nắm đầu tiên của thập niên
thứ hai của việc thương mại hóa cây trồng chuyển gen 2006 - 2015 Năm 2006, diện tích toàn cầu cây trồng chuyền gen tiếp tục tăng cao vượt ngưỡng 100 triệu ha (250 triệu mẫu Anh), khi lần đầu tiên hơn 10 triệu nông dân (10,3
triệu) tại 22 nước canh tác cây chuyển gen, cao hơn so với 90 triệu ha và 8,5
triệu nông đân tại 21 nước năm 2005 Tỷ lệ chấp nhận cao chưa từng thấy là minh chứng cho sự thật và sự tin tưởng của hàng triệu nông dân nhỏ và lớn vào cây trồng chuyển gen ở các nước công nghiệp và đang phát triển [51]
Năm 2007, Hoa Ky, Ac-hen-ti-na, Brazil, Canada, Ấn Độ va Trung
Quốc tiếp tục là những nước trồng cây công nghệ sinh học (CNSH) chủ yếu trên thế giới Hoa Kỳ là nước có diện tích canh tác cây trồng cây CNSH dẫn đầu thế giới, tuy nhiên tỉ lệ diện tích đất trồng cây CNSH của Hoa Kỳ so với toàn cầu đang giảm đo điện tích canh tác cây trồng CNSH trên toàn cầu ngày
một mở rộng [5 Ì |
Tám nước dẫn đầu trồng hơn l1 triệu ha, sắp xếp theo diện tích giảm dan
la Hoa Kỳ (62,5 triệu ha), Ac-hen-ti-na (2l triệu ha), Brazil (15,8 triệu ha), Ấn Độ (7,6 triệu ha), Canada (7,6 triệu ha), Trung Quốc (3,8 triệu ha),
Paraguay (2,7 triệu ha) và Nam Phi (1,§ triệu ha)
Đậu tương CNSH là giống cây chính được trồng trong năm 2008 với diện tích 65,8 triệu ha, chiếm 53% diện tích đất trồng cây CNSH trên toàn cầu, tiếp theo là ngô CNSH (37,3 triệu ha, chiếm 30%), bông CNSH (15,5
triệu ha, chiếm 12%) và cải canola chuyển gen (5,9 triệu ha, chiếm 5% điện
Trang 19Hiện nay đã có 25 quốc gia cho phép trồng cây CNSH và 30 quốc gia khác đã cho phép nhập khẩu các sản phẩm CNSH sử dụng làm thực phẩm và thức ăn chăn nuôi, đưa tổng số nước phê chuẩn cây trồng cây CNSH lên 55 nước Diện tích trồng tăng 74 lần từ năm 1996 đến nay đã khiến cây CNSH nhanh chóng trở thành công nghệ cây trông được ứng dụng nhanh nhất
Trị giá toàn cầu của thị trường cây trồng sinh học trong năm 2008 là 7,5 tỷ USD với tổng giá trị tích luỹ đạt 50 tỷ USD từ năm 1996 đến 2008 [51] 2.3 Giới thiệu chung về Bacilus thuringensis (BQ
2.3.1 Lịch sử phát hiện độc tổ Bt
Shigetane Isiwata, nha sinh hoc người Nhật Bản đã phát hiện ra vi
khuẩn này năm 1901 từ âu trùng tăm bị bệnh
Sau d6, Emst Berliner (1911) di phan lap vi khuẩn này từ ấu trùng Ephetia kuniella bị bệnh và đặt tên là Bacillus thuringensis (B0, (vi khuẩn đất điển hình được phân lập ở vùng Thuringia, Đức)
Đến năm 1915, Berliner đã phát hiện sự có mặt của tính thê trong Bt nhưng hoạt tính của chúng chưa được xác định
Bang phan loai Br: [56] GIỚI: Eubacteria Ngành: Firmicutes Lớp: Bacilli Bo: Bacillales Ho: Bacillaceae Chi: Bacillus Loai: thuringensis
Bi là vi khuẩn được phân lập từ đất, có khả năng sinh ra các protein thể
Trang 20kỷ 50, các nhà khoa học mới phát hiện ra cẫu trúc tinh thể của các độc tô gây tê liệt bộ máy tiêu hố của cơn trùng (Steinhaus, E.A, 1951) [44]
Hannay (1953) [31] đã phát hiện ra cấu trúc của các tinh thể gây độc
cho côn trùng và đặt tên là nội độc tố ö Một số loài vi khuẩn khác cũng có khả năng sinh ra các nội độc tố gây chết các loại côn trùng thuộc bộ cánh vảy,
cánh cứng và bộ hai cánh Chúng được sử dụng để sản xuất thuốc trừ sâu sinh học trong suốt 40 thập kỷ qua (Lambert và Peferoen, 1992) Đã có 67 chế phẩm Z/ được đăng ký với trên 450 công thức khác nhau (Shewry và Gutteridge, 1992) [54]
Gen mã hoá nội độc tô đã được nhân vô tính từ thập kỷ 80 (Schnepf và Whitley, 1981) [43], được chuyển vào cây thuốc lá và cây cà chua (Barton và
cs, 1987; Vaeck va cs, 1987) dé biéu hién tinh khang c6n tring [54]
Từ đó cho đến nay có rất nhiều thành tựu nghiên cứu về cây chuyển gen cũng như các độc tố điệt côn trùng
2.3.2 Các loại protein độc tỗ của Bt + Phân loại:
Trang 21Ngày nay các gen mã hoá cho protein nội độc tố (gồm 140 gen đã được công bố) được xếp chung vào nhóm có khả năng diệt ấu trùng các bộ canh vay (Lepidoptea), hai canh (Diptera) va canh cirng (Coleoptera)
+ Co ché tac động của nội độc t6 Bt
Các protein dạng tinh thé sé hoa tan trong ruột của côn trùng có pH cao (môi trường kiềm), giải phóng ra các protein gọi là nội độc tơ ư (Hoftey, H và Whiteley, H.R, 1989) [33]
Mục tiêu chính của độc tố Z là ruột giữa của côn trùng (Knowels,
1994) [34], [35] Các tiền độc tố không hoạt động cho đến khi chúng bị hoà tan bởi các enzyme phân giải protein trong ruột côn trùng (ToJo và Aljawa,
1983; Gill va cs, 1992; Lee va cs, 1992; Milne va Kaplan, 1993) [29], [37], [39], [46] Các độc tô gan vào chất nhận đặc hiệu ở trong màng của tế bảo
biểu mô trụ Sau khi gắn vào chất nhận, độc tô sẽ chèn vào màng nguyên sinh của tế bào để gây tổn thương cho côn trùng Sau khi găn với tế bào biểu mô ruột giữa, chuỗi xoăn kép có thể xâm nhập vào màng và hình thành kênh trao
đổi ion (Knowels va Dow, 1993) [34] Sw hình thành độc tố sẽ tạo thành các
lỗ thủng trên màng tế bào biểu mô và làm mất cân băng trao đôi ion nhanh chóng Sự hình thành các kênh ion này phá huy thé mang (English va Slatin, 1992) [23], làm hoại tử ruột giữa, thoái hoá màng và biểu mô, cuối cùng là nhiễm trùng vi khuẩn sau khi côn trùng chết Theo Knowles và Dow (1993)
[34] độc tố 8 làm ngừng các kênh bơm ion K+ khiến các tế bào trụ bị trương lên và phá huỷ tính thấm thấu Sự ngắt quãng của toàn bộ ruột đã làm côn trùng chết đói hoặc nhiễm trùng đường tiêu hoá
+ Phân loại:
Theo Estruch va cs 1996; Warren 1997; Chen va cs 2003 [19], [24], [25], [26] [49] thì các protem sinh dưỡng diệt côn trùng được chia thành 2 nhóm
Trang 22Nhóm liên hợp vi17 và vi›2 đặc hiệu với côn trùng bộ cánh cứng
Nhóm viø3 đặc hiệu với côn trùng bộ cánh vay
+ Cơ chế tác động cia VIP
Theo Wu và cs, 1997 [50] thì protein ƒ7» cũng hoạt động trong ruột giữa của côn trùng Chúng gắn với chất nhận đặc hiệu và chèn vào màng ruột giữa
của côn trùng và tạo thành các kênh ion, lam mat cân bằng sự trao đôi chất và
gây tê liệt bộ máy tiêu hóa của côn trùng (Crickmore và cs, 1998) [21] 2.4 Một số thành tựu chuyển gen vào cây thuốc lá trên thế giới
Cây thuốc lá chuyển gen kháng chất diệt cỏ được tiến hành tại Mỹ và Pháp năm 1986 Cây thuốc lá là đối tượng được chuyên gen kháng sâu đầu tiên
vào năm 1987 (Barton va cs, 1987; Fischoff va cs, 1987; Vaeck va cs, 1987)
[28] Trung Quốc là quốc gia đã thương mại hóa cây thuốc lá chuyển gen kháng bệnh (kháng virus khảm lá thuốc lá), kháng sâu (Zhao Rong min, Yang Ying Chang va cs, 1993) Wong và cs (1992) cũng đã tạo được cây thuốc lá chuyển gen cryIA(c) mRNA có độc tố cao gấp 10 - 20 lần so với cây thuốc lá chuyển gen dung CaMV35S promoter, ham lượng protein độc tố thu được chiếm gần 1% lượng protein hoà tan tổng số trong lá Gen czy/1!7 cũng được chuyển vào cây thuốc lá và cây khoai tây để kháng sâu Colorado potato beetle (Leptinotarsa decemlineata) (Perlak va cs, 1993) [40] Gen cry1A(b) va crylA(c) cing dugc chuyên vào cây để phòng trừ côn trùng cánh vảy (Van der Salm va CS, 1994) 100% sau xanh (H virescens, H zea va S exigua) chết khi ăn lá của cây thuốc lá thuốc lá được chuyên gen cry24a2 (Kota va cs, 1999) [36] Selvapandian va cs (1998) chuyển gen cry1Ja5 vào thuốc lá và cũng thể hiện tính kháng sâu xanh (H armigera ) tương đương với gen cryl Á(b) hoặc crwy1A(c)
Trang 232.5 _ Tình hình nghiên cứu về cây thuốc lá chuyển gen trong nước
Chủ trương của Việt Nam là cho phép trồng cây biến đổi gen và đây mạnh việc phát triển loại thực vật, động vật này [53] Mới đây nhất, Thủ tướng chính phủ đã ký quyết định đồng ý về Chương trình trọng điểm và ứng dụng CNSH trong lĩnh vực NN - PTNT đến năm 2020
Do hệ thống tái sinh cây thuốc lá tương đối đơn giản và thời gian phân hóa từ mô đến cây hoàn chỉnh khá ngăn nên trong những nghiên cứu về chuyên gen các nhà khoa học thường chọn cây thuốc lá là cây mô hình vì vậy những nghiên cứu về chuyển gen trên cây thuốc lá đã được tiến hành từ khá sớm
Nguyên Liên Chi va cs (1989) [6] đã chuyển thành công gen kháng kanamycin vào mô thuốc lá (N.£abacum) bằng vi khuẩn A.tumefaciens Tran Phương Liên và cs (1994) [10] cũng công bố kết quả nghiên cứu biến nạp một số gen chọn lọc vào các dòng thuốc lá bằng cách sử dụng Ti-plasmit vector Nguyễn Đức Thành và cs (1994) [11] đã tiễn hành nghiên cứu chuyển gen lục lạp thuốc lá Trần Đăng Kiên và cs (1999) [8] đã nghiên cứu phương pháp biến nạp gen tạo giống thuốc lá có khả năng kháng sâu bệnh, trong đó đã xác định được mô lá là bộ phận tốt nhất biến nạp, nồng độ kanamycine (kan) 30 - 50 mg/1 là tốt nhất cho quá trình sàng lọc mẫu sau biến nạp, đã tạo ra vector chứa gen Br la Ti-plasmit/cry IA(c)//NOS, d& tao được chủng A tumefacciens chita plasmit vector pCAMBIA 1300:UBI - cry IA(c) NOS Vt Thị Bản va cs (2007) [2] đã tiến hành nghiên cứu chọn tạo giống thuốc lá vàng sây kháng bệnh virus TMV (bệnh khảm lá) và đã chuyển được gen CP mã hóa vỏ virus gây bệnh khám lá thuốc lá vào giống thuốc lá K326 và giỗng C 9-1, thé hiện tính kháng bệnh TMV ở thế hệ Tụ
Trang 243 VAT LIEU, NOI DUNG VA PHUONG PHAP NGHIEN CUU
3.1 Vật liệu, hoá chất, thiết bị 3.1.1 Vat liệu
- Vật liệu thực vật: Giống thuốc lá K326 là giống thuốc lá nhập nội và đã được công nhận giống quốc gia, có một số đặc điểm chính như sau:
Chiều cao trung bình: 160 - 175cm; thời gian sinh trưởng: 120 ngày;
thời gian ra nụ 10%: 53 ngày; năng suất khô: 1,8 - 2,3 tan/ha; chat lượng tốt
Hiện nay diện tích thuốc lá giống K326 chiếm khoảng 40% điện tích cây trồng thuốc lá trên cả nước
- Các vật liệu khác:
+ Cac plasmit
Plasmit Kích thước (bp) Đặc tính Nơi cung cấp
pCR® 2.1-TOPO 3900 Ampiciline hang Invitrogen
Kanamycine
pBIi21 13000 Kanamycine Phong CNTBTV
+ Nguôn gen vip3A
+ Ching khuan: Ching DH5a (E.coli) va C58 (A tumerfaciens) 3.1.2 Hoá chất, thiết bi
- Cac enzyme gidi han: BamHI, Sacl, EcoRI
- Enzyme T4 ligase; T4 kinase do hing Fermentas cung cap
- Các hoá chất khác: thang marker chuẩn, agarose, phenol, chloroform,
kanamycine và các hoá chất thông dụng khác - Thiết bị máy móc:
Trang 253.2 Dia diém va théi gian
- Dia diém: Phòng Công nghệ tế bào thực vật - Viện Công nghệ Sinh học
- Thời gian: từ tháng 8 năm 2008 đến tháng 9 năm 2009 3.3 Phương pháp nghiên cứu
3.3.1 Phương pháp thiết kế vector chuyỄn gen - Môi trường nuôi cấy LB (Luria and Betani) Yeast extract 5g1 Trypton 10 g/l NaCl 10 g/l Bacto agar(cho môi trường đặc) 15g/l pH 7
- Phương pháp nuôi cấy:
Khuẩn giữ trong glycerol được lẫy ra cấy lỏng trên môi trường LB có bỗ sung kháng sinh thích hợp Nuôi lắc 200v/p ở 37°C qua đêm Sau đó cây ria trên
đĩa petri chứa LB đặc có kháng sinh, nuôi ở nhiệt độ và thời gian thích hợp
- Giữ chủng:
Bồ sung glycerol vô trùng đến nồng độ cuối cùng là 15% vào 0,5 - 1ml dịch vi khuẩn lỏng mới nuôi qua đêm, trộn đều và bỏ nhanh vào nitơ lỏng và
Trang 26Dung dich II: - 0,2 N NaOH - 1% SDS Dung dich III: - 60 ml kali acetate 5M - 28,5 ml H,O
Dung môi loại protein:
- Phenol : chloroform : 1soamyl alchohol (25:24:1) - chloroform : isoamyl alchohol (24:1)
- TE 0,01M pH 8,0 b/ Quy trinh:
- Cay chuyén mét khuan lac £.coli vao 3 ml LB lỏng có bố sung kháng sinh chon loc, lac qua dém & 37°C, 200 v/p
- Chuyển 2 ml dịch nuôi cấy vào các éng Eppendorf loai 2 ml va dem ly tâm 8000 v/p, 5phút, 4°C để thu tế bào
- Cặn được hoà trong 100 kh] dung dịch I
- Bồ sung ngay 200 1 dung dịch II, đảo nhẹ nhàng - Bồ sung tiếp 150 yl dung dich III, dao nhe nhang
- Thém 550 pl dung dich Phenol : chloroform : isoamyl alchohol (25 : 24 : 1), dao nhe nhang
- Ly tâm 12.000 víp, 4ˆC, 15 phút
- Chuyên dịch nổi sang ống Eppendorf mới và chiết tiếp bang chloroform : isoamyl alchohol (24:1)
- Bé sung lml côn tuyệt đối và 10 ul 3M Sodium acetate, để lạnh -20°C
trong 3 giờ sau đó ly tâm 12.000v/p trong 15 phút để thu DNA
- Rửa cặn bằng 0,2 ml cồn 70%, ly tâm 12.000 v/p trong 5 phút, làm
Trang 27- B6 sung RNase vao mẫu đến nông độ cuối cùng là 100 ug/ml, ủ mẫu ở 37C trong 1 giờ, chiết lại băng chloroform : isoamyl alchohol (24:1) và tủa bằng cồn 100%
- Điện di trên gel agarose 0,8% để xác định độ sạch của DNA
Các đoạn DNA có khối lượng và điện tích khác nhau được tách ra khi
di chuyển từ cực âm sang cực dương trong cùng điện trường có điện thế và cường độ thích hợp
a Hoá chất sử dụng: Agarose 0,8%, dung dịch đệm TAE 1X (Tris HCl,
EDTA .); Ethidium bromide (EtBt) 10mg/ml, dém tra mau 10X b Quy trinh:
- Chuan bi gel agarose: cho 0,8 g agarose vao 100 ml dung dich TAE 1X, lắc đều và đun cho agarose tan hoàn toàn, để nguội đến khoảng 50 - 60°C, đô dung dịch vào khay điện di có cài sẵn răng lược, để gel đông cứng, rút lược và đặt bản gel vào bề điện di, đỗ đung dịch TAE ngập bản gel từ 1 - 2 mm
- Tra mẫu và điện di: mẫu DNA được trộn với đệm tra mẫu 10X theo tỷ lệ 1: 10, mix đều và tra vào giếng, chạy điện di với thang DNA chuẩn để xác
định trọng lượng phân tử DNA
- Nhuộm bản gel: bản gel được lẫy ra khỏi khuôn, ngâm 20 - 40 phút trong dung dịch nước có chứa EtfBt, rửa lại bằng nước và quan sát dưới ánh sáng tử ngoại 254 nm trên máy soi DNA, ảnh được chụp bằng máy soi gel
a Dụng cụ và hố chất:
- Cột thơi gel; eppendorf; tip các loại
Trang 28b Tién hanh:
Dién di trén gel agarose, nhudm, soi trén ban soi UV va cat lay doan
gel chứa đoạn DNA quan tâm cho vào ống eppendorf Bổ sung dung dich QG theo tỷ lệ 1V„a„ : 3Vọoc và ủ trong 50”C trong 15 phút Sau khi gel tan hoàn toàn chuyển hỗn hợp dung dịch lên cột thôi gel, ly tâm cực đại trong 1 phút và loại bỏ dịch chảy qua cột Bồ sung 500 pl dung dich QG, ly tâm 1 phút Bỗ sung tiếp 750 ul dung dịch PE vào cột, để ở nhiệt độ phòng 5 phút Sau đó ly
tâm cực đại 1 phút, đỗ dịch chảy qua cột, ly tâm bố sung 1 phút để loại bỏ hết
PE Cuối cùng hoà tan DNA trong 30 - 50 ul nước cất
Các vector được xử lý với enzyme giới hạn theo phản ứng: + Với một enzyme Thành phần Thể tích (n1 ) - H2O 5,5 - Dém 10X riéng cua enzyme 1,0 - DNA plasmit 3,0 - Enzyme (10 U/l) 0,5 - Téng thé tich phan tmg 10,0 + Với hai enzyme Thành phần Thể tích (w1 ) - H2O 5,0 - Đệm 10X chung tối ưu cho hai enzyme 1,0 - DNA plasmit 3,0 - Enzyme 1 (10U/1) 0,5 - Enzyme 2 (10U/I) 0,5 - Tông thể tích phản ứng 10,0
Trang 29Đoạn DNA cần nỗi ghép và vector đã được mở vòng được trộn lẫn với nhau theo tỷ lệ 3 : 1 về số lượng phân tử T4 ligase được cho vào phản ứng với nồng độ 1 đơn vị/10u1 phản ứng Hỗn hợp phán ứng được trộn theo thứ tự: Thành phần Thé tich (ul ) - H20 1,5 - Dém T4 ligase 10X 1,5 - Doan gen can gan 7,0 - Vector đã mở vòng 3,0 -TATP 1,0 - T4 ligase 1,0 - Tổng thể tích 15,0
Phản ứng được ủ qua đêm ở 14°C
Biến nạp plasmit tái tổ hợp vào tế bào khả biến E.coli DH5a được tiến hành theo Cohen và cộng sự (1972).Vi khuẩn đưới tác dụng của hoá chất
hoặc điện trường trở nên xốp, mỏng hơn và tạo các lỗ cho các phân tử ADN
có thé chui vào
a Chuẩn bị tế bào khả biến:
Chủng khuẩn được cấy ria trên môi trường LB đặc và nuôi qua đêm ở 37°C, sau đó lây một khuẩn lạc đơn cây vào 3 ml môi trường LB lỏng, lắc 200 víp ở 37°C qua đêm Chuyển 0,5 ml dịch khuẩn sang 50 ml môi trường LB lỏng,
nuôi lắc 200 v/p, 37°C khoảng 3 giờ cho đến khi OD ssœmạ đạt từ 0,6 - 0,8 thi chuyên dịch nuôi cấy sang ống ly tâm đã giữ lạnh trên đá và ly tâm 6000 v/p, 10
phút Thu cặn và hoà nhẹ nhàng trong 0,7 - 1,5 ml CaCl , 0,1M Chia vào mỗi
Trang 30môi trường nuôi cấy và các thể biến nạp được phát hiện trên môi trường thích hợp Cấy trải lên đĩa môi trường LB không có kháng sinh để kiểm tra
b Biến nạp DNA plasmit vào tế bảo khả biến Z co1¡ bằng sốc nhiệt - Bồ sung 5 HI ADN plasmit tiếp vào ống eppendorf chứa sẵn 100 HI tế bào khả biến đã để trên đá 30 phút, giữ trên đá 30 phút
- Sốc nhiệt ở 42°C trong 90 giây rồi chuyển ngay sang giữ trong đá 5 phút - Bồ sung 0,5 ml môi trường SOC, nuôi lắc 200 v/p ở 37°C trong 1 gid - Cay trai địch tế bào lên trên đĩa LB đặc có bố sung kháng sinh thích hợp và nuôi qua đêm 6 37°C
3.3.2 Phương pháp chuyển vector tái tô hợp vào tế bào A tumefaciens bằng
xung điện
- Chuẩn bị tế bào 4 ø6mefäciens khả biến trong các cuvet đã khử trùng - Đặt các ống cuvet đã khử trùng vào đá
- Bố sung 5 pl plasmit tai t6 hop vao 100 pl dung san tế bao A tumefaciens kha bién
- Đảo nhẹ, đặt trong đá trong 5 phút, chuyển dich sang 6ng cuvet méi - Xung điện: 2,5kw; 25 wF va 400 © trong 4 - 5 us
- Chuyén ngay ống dịch vào đá, sau 5 phút, bố sung 1 ml môi trường YEP, mix nhẹ và chuyển các tế bảo sang ống eppendorf 2ml, nuôi lắc trong 28°C trong 1 giờ
- Cây trải 100 Hl tế bào vào đĩa chứa môi trường chọn lọc và nuôi từ
Trang 313.3.3 Phương pháp chuyển gen vào thuốc lá thông qua A tumefaciens (theo
Topping, 1998 )
Các môi trường sử dụng trong nuôi cấy cây thuốc lá chuyển gen
Môi trường Thành phần cơ bản
MS Môi trường cơ bản MS (Murashige & Skoog 1962) Tái sinh chồi (GM) MS + 1 mg/l BAP + 30g/1 Sacrose + 8§g/1 agar pH = 5,8
Ra rễ (RM) MS + 0,1 mg/l IBA + 30g/l Sacrose + 8g/l agar pH = 5,8
Chon loc chéi (GM Kan 50) GM +400 mg/l cefo + 50 mg/l kant 8g/l agar pH = 5,8 Chon loc cay (RM Kan 50) RM +400 mg/1 cefo + 50 mg/l kan + 8g/l agar pH =5,8
Quy trình tái sinh cây thuốc lá từ mảnh lá
Mánh lá thuốc lá Môi trường tái sinh đa
(MS) chéi (GM)
Môi trường trấu cát Môi trường ra rễ
(1:1) (RM)
Ching vi khuan A.tumerfaciens co chita vector quan tam bao quan trong glycerol trong điều kiện lạnh sâu (-80°C) được cấy sang môi trường LB lỏng có bô sung kháng sinh, nuôi lắc 200 v/p trong điều kiện 37°C qua đêm, sau đó cây vạch trên môi trường LB đặc có kháng sinh thích hợp, nuôi trong điều kiện tối,
28°C trong 2 ngày Chọn một khuẩn lạc tròn, đều, đứng độc lập để cây chuyển
Trang 32Tu nhitng cay thuốc lá invitro, chọn những lá bánh tẻ, cắt các mảnh lá
có kích thước khoảng lcm” và đặt trong môi trường tái sinh đa chồi (GM) trong 2 ngày
Sau 2 ngày nuôi cảm ứng trên GM, các mảnh lá được chuyển sang môi trường MS lỏng (khoảng 5 ml), đỗ dịch huyền phù vi khuẩn vào bình chứa các mảnh lá và lắc nhẹ nhàng Sau 10 phút gắp các mảnh lá lên giấy thấm vô trùng, thắm khô và cây lên môi trường GM, đồng nuôi cấy 2 ngày, sau đó cây chuyển các mẫu sang môi trường tái sinh đa chồi chọn lọc GM Kan 30
Từ những cụm chéi tai sinh trên môi trường chọn lọc, chọn những cụm
chồi phân hoá mạnh, tách các cụm chổi có kích thước khoảng 0,5 - 1cm” cấy chuyển sang môi trường tái sinh đa chồi có bố sung kháng sinh thích hợp để
tiếp tục chọn lọc chồi tái sinh
Từ những cụm chéi phan hoa manh, chon tach nhitng chéi độc lập, có 2
- 3 lá phân hoá rõ ràng, dài từ 2 - 3 cm cấy sang môi trường ra rễ chọn lọc (RM Kan 50) Sau 3 tuần, từ những cây tái sinh hoàn chỉnh và phát triển tốt trên môi trường ra rễ chọn lọc tiếp tục cây chuyển sang môi trường ra rễ chọn lọc lần 2 dé thu cây hoàn chỉnh
Từ những dòng trên môi trường ra rễ chọn lọc những dòng sinh trưởng phát triển mạnh, cao 5 - 7 cm để ra cây vào giá thé trau : cát (tỉ lệ 1:1)
Sau 14 ngày chuyển các dòng vào chậu đất trong nhà lưới 3.3.4 Phân tích cây chuyển gen bằng kỹ thuật PCR
Trang 33a Hoa chat str dung:
Thanh phan dung dich dém Shorty buffer: 1 a FY NS b Quy trinh 0,2 M Tris - HCl, pH = 9,0 0,4 M LiCl 25 mM EDTA 1% SDS Nước de lon - Nghién mau 14 trong Eppendorf loai 2 ml bamg Nito long thanh dang bot min - Bé sung 500 pl dich dém “Shorty buffer” - Ly tâm 13.000 víp trong 10 phút - Hut 350 yl dich néi chuyển sang Eppendorf loại 1,5 ml có chứa sẵn 35 wl iso-propanol
Trang 34- Thanh phan 1 phản ứng PCR Thanh phan Thẻ tích (ul) Nước cất hai lần 10,3 Dém (10X) 2,0 MgCl, 2,0 dNTPs 1,6 Tag polymerase 0,5 Primer F 0,8 Primer R 0,8 DNA mau 2,0 Tổng 20,0 - Chương trình thực hiện phản ứng PCR Bước Phan tng Nhiệt độ °C) Thờigian Chu kỳ 1 Biểntính 94 3 phút Từ bước 2 2 Biếntính 94 * đến bước 4 3 Bắt cặp * * thực hiện 35
4 Kéo dài 72 * chu kỳ
5 _ Hoàn tất kéo dài 72 10 phút
6 Kết thúc phản ứng 4 00
Ghi chú: *các thông số thay đổi theo cặp môi đặc hiệu
Các thí nghiệm được bố trí ngẫu nhiên hoàn toàn, lặp lại 3 lần, mỗi thí
Trang 353.4 Các chỉ tiêu theo dõi
5° số mảnh lá tái sinh đa chồi
Tỷ lệ mánh lá tái sinh da chdi (%) = x 100
5 sô mảnh lá biên nạp 3: sô cụm chôi tiệp tục tái sinh đa chôi
Ty 16 cum chéi tai sinh (%) = x 100
Trang 364 KET QUA VA THAO LUAN
4.1 Thiết kế vector pBI121 mang gen vip3A
Để tạo cây thuốc lá chuyên gen mang gen vip3A, việc thiết kế vector mang gen vip3A dé chuyển vào cây trồng là một bước quan trọng trong toàn bộ quá trình tạo cây chuyển gen BamHI Sacl ` San pham PCR vip3A / BamH] Sacl + fs [ew [30s] Bam HI & Sacl BamHI! , Sacl "mm = vite | BamHI Sacl `
Sơ đô 4.1: Sơ đồ thiết kế vector pBI12l mang gen vip3A
Gen vip thudc nhóm gen m4 hoa protein Vip (vegetative insecticidal protein) (protein có trọng lượng phan tir 80 - 90 kDa) xuất hiện trong pha sinh trưởng sinh dưỡng và sinh sản của chu trình phát triển của vi khuẩn Bi, gay
Trang 37độc với hầu hết côn trùng bộ cánh vảy (Lepidoptea), ngoài ra còn gây độc đối với một số côn trùng bộ cánh cứng (Coleoptera) và hai cánh (Diptera) Trong nhóm gen vip thì gen v3A được đặc biệt quan tâm nghiên cứu vì chúng mã
hóa cho các protemn có hoạt lực diệt sâu mạnh cùng với phô hoạt động rộng
Protein ƒj;3A có thể kháng cả một số côn trùng thuộc bộ cánh vảy mà protein Cry hầu như không có tác dụng
Gen sử dụng trong thí nghiệm là kết quả phân lập của nhóm nghiên
cứu thuộc Phòng công nghệ tế bào thực vật - Viện công nghệ sinh học Gen
mã hóa cho prote1n có kích thước 2369 bp, mã hoá 793 axít amin, được công bố trên ngân hàng gen quốc tế (mã số AJ971413)
4.1.1 Thiết kế môi
Đề nhân thành công một gen, điều kiện đầu tiên là có cặp mỗi đặc hiệu
của gen đó Cặp môi đặc hiệu V2.1 và V2.2 được thiết kế để nhân gen vip3A dựa trên cơ sở trình tự gen v¿z3A đã được công bố (phụ lục 2) Ngồi ra mơi V2.3 được thiết kế thêm để kiểm tra sự có mặt của gen vip3A trong cây sau khi chuyển gen Các môi này có những trình tự và thông số cần thiết thể hiện trên bảng 4.1 Bảng 4.1 Trình tự và những thông số liên quan của cặp môi nhân gen vip3A STT Trình tự mỗi Tm %GC_ Vitri gan V2.1 5'-GCGGATCCATGAACAAGAATAATACTAA-3' 61°C 42/8 1-20 V22 5-CGGAGCTCTTACTTAATAGAGCATCGTA-3' 625°C_ 42/8 2350-2370 V23 5'-GGAGAGCCATCCTTTTTTACTT-3 55% 40,9 579-605
Trang 38GGATCC: diém cat cua enzyme gidi han BamHI GAGCTC: điềm cắt của enzyme giới hạn Søcl
4.1.2 PCR nhân đoạn gen vip3A và tỉnh sạch sản phẩm PCR
Theo lý thuyết, nếu ta cung cấp cặp môi đặc hiệu thì sẽ nhân chính xác
được đoạn gen nằm giữa hai mồi đó Cặp mồi được thiết kế để nhân toàn bộ
gen vi;3A có kích thước 2370 bp, nếu phan tng PCR xảy ra đặc hiệu thì theo lý thuyết sẽ thu được băng duy nhất có kích thước khoảng 2,4 kb
Kết quả điện di sản phẩm PCR cho thấy đoạn DNA mã hoá protein Vip3A đã được nhân lên một cách đặc hiệu, chỉ tạo ra một sản phẩm duy nhất có kích thước khoảng 2,4 kb, phù hợp với kích thước gen vi3A dự kiến Sản phẩm PCR sau đó được tỉnh sạch theo bộ Kit théi gel (Gel purification Kit) của hãng Bioneer và điện di kiểm tra sản phẩm sau khi tinh sạch Kết quả được thê hiện trên hình 4.1 2,5 kb 2,0 kb 2,4 kb Hình 4.1: Kết quá điện di tỉnh sạch sản phẩm PCR nhân gen vip3A 1: marker
2: Tĩnh sạch sản phẩm PCR nhân gen vip3A
Trang 39vạch phụ chứng tỏ sản phẩm sau tinh sạch đạt yêu cầu để dùng cho các thí nghiệm tiếp theo
4.1.3 Ghép nỗi đoạn gen vip3A vào vector tách dòng
Sản phẩm tinh sach PCR được gắn trực tiếp vào vectơ tách dong pCR® 2.1-TOPO cua hang Invitrogen duoc cung cấp ở dạng mạch thắng có bazo thiamin nhô ra ở đầu 3' Do đặc tính của Taq - polymerase nén san pham PCR có đến hơn 70% là có thêm bazo Adenin ở đầu 3' do vậy việc liên kết giữa gen và vector có hiệu quả cao Phản ứng nối ghép được ủ qua đêm ở nhiệt độ 14°C dé thu plasmit tái tổ hợp
4.1.4 Bién nap plasmit tai t6 hợp vào tế bào khả biến E.coli DH5u
Sản phẩm của phản ứng ghép nối được biến nạp vào tế bào khả biến E.coli ching DH5a theo phương pháp sốc nhiệt (Cohen và cộng sự, 1972), sau đó được cấy trải trên môi trường LB đặc có bổ sung ampicillin (100 g/l), X- gai (100 g/l) và chất cảm tng IPTG 0,1M, nuôi qua đêm Kết quả được
thể hiện trên hình 4.2
Hình 4.2 : Két qua bién nap plasmit tai t6 hop vao té bao kha bién E.coli DHSa
Trên đĩa nuôi cây thu được cả khuân lạc xanh va khuân lạc trang
Khuẩn lạc xanh là do trong vector pCRỞ 2.1-TOPO có chứa gen /zcZ, nếu
Trang 40hoạt động bình thường sẽ tổng hợp enzyme f - galactosidase va dưới sự cảm ứng của IPTG chuyền hoá cơ chất X - gal thành hợp chất có màu xanh Đó là những vi khuẩn không có đoạn DNA ngoại lai chèn vào Khuẩn lạc trắng là do gen /acZ đã bị đoạn gen DNA ngoại lai chèn vào giữa nên không tổng hợp được enzyme j - galactosidase và đây có thê là những khuẩn lạc có thê chứa plasmit tái tổ hợp
4.1.5 Chọn lọc plasmit tải tổ hợp
Việc kiểm tra xem các khuẩn lạc có chứa các plasmit tái tổ hợp hay không là việc rất quan trong để chọn vật liệu chính xác cho các thí nghiệm tiếp theo
Chọn ngẫu nhiên 10 dòng khuẩn lạc trắng, nuôi lỏng và tách chiết DNA
plasmit, điện di trên agarose 0,8%%, sau đó cắt kiểm tra bằng hai enzyme
BamHI và SacI Kết quả điện đi sản phẩm cắt thể hiện trong hình 4.3 1L ?2 3) 4á 5 ( 7 5 9) M1 D 1 F =—— _“_—= i ee ee ere od —— Hình 4.3: Kết quả điện di sản phẩm cắt plasmit 1: Marker
2 - 11: Các plasmit tách từ khuẩn lạc trắng duoc cat bang BamHI va Sacl
12: Plasmit túch từ khuẩn lạc xanh được cắt bằng EcoRI
13: Plasmit tách từ khuẩn lạc trắng đối chứng không cắt