Xây dựng tiêu chuẩn dược liệu lá cây Mật gấu

Xây dựng tiêu tiêu chuẩn lá cây lá đắng (mật gấu miền nam) goomg những nội dung sau: 1. Tổng quan về thực vật 2. Đối tượng và phương pháp nghiên cứu 3. Kết quả nghiên cứu 4. Xây dựng tiêu chuẩn dược liệu 5. Kết luận và kiến nghị

TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA DƯỢC XÂY DỰNG TIÊU CHUẨN DƯỢC LIỆU LÁ CÂY LÁ ĐẮNG (Vernonia amygdalina Del., Asteraceae) GVHD: Sinh viên thực hiện: Lớp: CẦN THƠ - THÁNG 12 NĂM 2017 MỤC LỤC ĐẶT VẤN ĐỀ Chương I TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 TỔNG QUAN VỀ THỰC VẬT HỌC: 1.1.1 Tên khoa học vị trí phân loại: 1.1.3.Nguồn gốc phân bố sinh thái 1.1.4.Mô tả thực vật 1.1.5 Phân biệt Lá đắng số loại khác: 1.2 TỔNG QUAN VỀ THÀNH PHẦN HÓA HỌC 1.2.1 Flavonoid 1.2.2 Sesquiterpene lactone 1.2.3 Saponin 1.2.4 Các thành phần khác 1.3 TÁC DỤNG DƯỢC LÝ 11 1.3.1 Tác dụng kháng sinh, kháng khuẩn, chống sốt rét ký sinh trùng 11 1.3.2 Tác dụng chống oxy hóa 11 1.3.3 Tác dụng hạ đường huyết chống tiểu đường 12 1.3.4 Tác dụng kháng viêm 12 1.3.5 Tác dụng chống ung thư 12 1.3.6 Tác dụng công dụng khác cúa Lá đắng sử dụng dân gian 12 1.3.7 Đặc tính gây độc Lá đắng 13 1.4 CÁC CHẾ PHẨM 15 Chương II: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 16 2.1.NGUYÊN VẬT LIỆU 16 2.1.1 Đối tượng nghiên cứu 16 2.1.2 Hóa chất 16 2.1.3 Máy móc thiết bị nghiên cứu 16 2.2 NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 16 2.2.1 Nội dung nghiên cứu 16 2.2.2 Phương pháp nghiên cứu 17 Chương III KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 28 3.1 ĐẶC ĐIỂM THỰC VẬT: 28 3.1.1 Đặc điểm hình thái: 28 i 3.1.2 Kiểm nghiệm vi học: 29 3.2 PHÂN TÍCH THÀNH PHÂN HĨA HỌC: 36 3.2.1 Phân tích sơ thành phần hóa học: 36 3.3 KIỂM NGHIỆM BẰNG SẮC KÝ LỚP MỎNG 43 3.3.1 Sắc ký lớp mỏng saponin: 43 Chương IV: XÂY DỰNG TIÊU CHUẨN DƯỢC LIỆU LÁ CÂY LÁ ĐẮNG 45 4.1 TÊN GỌI 45 4.2 BỘ PHẬN DÙNG 45 4.3 MÔ TẢ 45 4.4 VI PHẪU 45 4.5 BỘT 46 4.6 ĐỊNH TÍNH 46 4.7 CHẾ BIẾN 48 4.8 BẢO QUẢN 48 Chương V KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 49 5.1 KẾT LUẬN 49 5.2 KIẾN NGHỊ 49 TÀI LIỆU THAM KHẢO 50 ii DANH MỤC CÁC BẢNG Chương I TỔNG QUAN TÀI LIỆU Bảng 1.1: Tổng hợp số đặc điểm hình thái ba loại thảo dược Bảng 1.2 Thành phần hóa học dinh dưỡng Lá đắng 10 Bảng 1.3 Một số công dụng khác Lá đắng 14 Chương II ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU Bảng 2.1 Một vài loại thuốc thử dùng vết cho sắc ký lớp mỏng 26 Chương III KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU Bảng 3.1 Kết sắc ký saponin 44 iii DANH MỤC CÁC HÌNH Chương I TỔNG QUAN TÀI LIỆU Hình 1.1 Sơ đồ phân loại thực vật Lá đắng .3 Hình 1.2 Hình vẽ nhánh Lá đắng có hoa Hình 1.3 Hoa thức hoa đồ Hình 1.4 Cấu trúc ba flavon thuộc nhóm flavonoid Hình 1.5 Cơng thức cấu tạo sesquiterpene lactone Hình 1.6 Cấu trúc Vernonioside .9 Hình 1.7 Sản phẩm Trà Lá đắng Đức Thịnh 15 Hình 1.8 Sản phẩm Đường huyết Vĩnh Xuân 15 Hình 1.9 Sản phẩm viên Giải độc rượu .15 Chương II ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU Hình 2.1 Sơ đồ phương pháp nhuộm kép son phèn-lục iod .19 Hình 2.2 Sơ đồ tóm tắt quy trình chuẩn bị loại dịch chiết 22 Chương III KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU Hình 3.1 Thân Lá đắng 28 Hình 3.2 Lá Lá đắng 28 Hình 3.3 Vi phẫu gân Lá đắng 29 Hình 3.4 Sơ đồ cấu tạo vi phẫu gân Lá đắng 30 Hình 3.5 Vi phẫu Lá đắng 30 Hình 3.6 Sơ đồ cấu tạo bó dẫn .31 Hình 3.7 Tinh thể canxi oxalate hình cầu gai 31 Hình 3.8 Phiến Lá đắng .32 Hình 3.9 Vi phẫu cuống 32 Hình 3.10 Bột Lá đắng 33 Hình 3.11 Các cấu tử quan sát bột Lá đắng 33 Hình 3.12 Các cấu tử quan sát bột Lá đắng 34 Hình 3.13 Các cấu tử quan sát bột Lá đắng 35 Hình 3.14 Phản ứng định tính carotenoid (+) 36 Hình 3.15 Phản ứng định tính Triterpene tự (+) .37 Hình 3.16 Phản ứng định tính alkaloid với thuốc thử (+) 38 Hình 3.17 Phản ứng định tính tannin với FeCl3 (+) .38 Hình 3.18 Phản ứng định tính tannin với gelatin muối (+) 39 Hình 3.19 Phản ứng định tính saponin (+) 39 Hình 3.20 Phản ứng định tính alkaloid với thuốc thử (+) 40 Hình 3.21 Phản ứng định tính acid hữu (+) 41 Hình 3.22 Quy trình chuẩn bị mẫu thử sắc ký lớp mỏng Lá đắng 43 Hình 3.23 Bản sắc ký saponin sau soi UV 254 UV 365 43 Hình 3.24 Bản sắc ký saponin sau nhúng thuốc thử VS 44 iv ĐẶT VẤN ĐỀ Vào đầu năm 2017, có hàng loạt thơng tin Lá đắng (có tên gọi khác: Lá đắng thuốc du nhập vào nước ta khoảng mươi năm trở lại đây) phản ảnh nỗi hoang mang như: “Cây Lá đắng bị thổi phòng cơng dụng gây hiểm họa chết người”, “Sùng bái mù quáng Lá đắng, nhiều người trả giá đắt: trụy mạch, tai biến suốt đời…” hay “Lầm tưởng tai hại cách sử dụng Lá đắng”… Các báo nêu quan điểm “cây Lá đắng sản phẩm phường kinh doanh…bịa đặt đủ điều để chơi trò bán buôn” Đồng thời, phê phán “Một số lương y đăng đàn trả lời Lá đắng mà không qua thực tế lâm sàng… tung hô thái để biến người bệnh vừa mồi vừa vật thí nghiệm”[8] Trái ngược với báo đăng, theo TS Võ Văn Chi tổng kết cho biết nhiều cơng trình nghiên cứu giới chứng minh nhiều hoạt tính sinh học kháng khuẩn, kháng nấm, kháng ký sinh trùng, diệt sán côn trùng, kháng sốt rét, kháng ung thư tác dụng gây độc tế bào, chống gây đột biến, chống thụ tinh, chống đông máu huyết khối, giảm đau hạ sốt, chống viêm, chống oxy hóa, bảo vệ gan, trị đái tháo đường, v.v… Đặc biệt lồi có khơng có chất độc hại Người ta khuyến khích sử dụng với lợi ích sức khỏe cách an tồn.[8] Ngồi ra, dựa theo tài liệu tham khảo giới, Lá đắng nghiên cứu thành phần hóa học nêu cơng dụng loại Nhưng nghiên cứu Lá đắng Việt Nam thưa vắng Từ lí trên, với mong muốn tìm hiểu rõ dược liệu Lá đắng xây dựng sơ tiêu chuẩn cho dược liệu này, góp phần nhận thức dược liệu, đảm bảo tính an tồn hiệu dược liệu giới thiệu số chế phẩm từ dược liệu dành người tiêu dùng Từ đó, tơi định tiến hành nghiên cứu “Xây dựng tiêu chuẩn dược liệu Lá đắng (Vernonia amygdalina Del., Asteraceae) Chương I TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 TỔNG QUAN VỀ THỰC VẬT HỌC: 1.1.1 Tên khoa học vị trí phân loại: 1.1.1.1 Tên[11][24][14]: Tên khoa học: Vernonia amygdalina Delile Danh pháp đồng nghĩa: Gymnanthemum amygdalium Tên Việt Nam: Lá Đắng, Lá đắng Tên địa số nước Châu Phi: Grawa (Amharique), Ewuro (Yoruba), Etidot (Ibibio), Onubu (Igbo), Ityuna (Tiv), Oriwo (Edo), Chusar-doki (Hausa), Mululuza (Luganda), Labwori ( Acholi), Olusia (Luo) Ndoleh (CameroonTên tiếng Anh: Bitter leaf Tên Trung Quốc: Ikaruga Tên Malaysia: South Africa leaf 1.1.1.2 Phân loại thực vật[24]: Giới: Plantae Ngành:Angiosperms Bộ: Asterales Họ: Asteraceae Chi: Vernonia Lồi: Vernonia amygdalina Hình 1.1 Sơ đồ phân loại thực vật Lá đắng 1.1.3.Nguồn gốc phân bố sinh thái[11][23]: Vernonia amygdalina loài mọc dại bao gồm tới 1000 loài phân bố nhiều quốc gia nhiệt đới (có đến 500 lồi Châu Phi (từ Guinee đén Somalie phía nam tới miền đơng bắc Nam Phi) Châu Á; khoảng 300 loài Mexico, Trung Mỹ Nam Mỹ) Ở nước ta thống kê 35 loài Tên Vernonia nhà thực vật học Đức Schreber (1739-1810) đặt để tôn vinh nhà thực vật học Anh William Vernon (1680-1711) du khảo thu mẫu Bắc Mỹ Tên loài amygdalina nhà thực vật học Pháp Delile (1778-1850) dùng với ý nghĩa có trạng thái hạnh nhân, liên hệ vị đắng với hạnh nhân Ở Việt Nam loại du nhập vào khoảng mươi năm gần Cây loài sống lâu năm dễ dàng phát triển môi trường khác nhau, tất loại đất Nhưng môi trường phát triển tốt nơi có ánh sáng mặt trời đầy đủ, mơi trường ẩm ướt, đất giàu mùn 1.1.4.Mô tả thực vật[5][23]: Thân: thân bụi nhỏ, dạng mọc thẳng đứng, chiều cao dao động tùy vào môi trường phát triển từ 1,5-3m, cao tới 7m hay hơn, đường kính thân dạng bụi từ 2-4cm, có thân đạt đến 40cm đường kính loại nhỏ, phân nhánh thường phân nhánh cành gốc, vỏ màu nâu xám xanh, thơ, láng, nứt nẻ, có lơng mịn phần Lá: mọc so le, biến đổi hình dạng kích thước, khơng kèm, cuống từ 0,2-4cm dài, phiến hình bầu dục elip đến hình trái xoan ngược, kích thước 415 (28)cm x 1-4 (15)cm , hình nêm tròn đáy nhọn mũi, bìa phiến có rang cưa mịn, có láng bóng uốn lượn nhẹ, có lơng mịn thường láng, gân có hình lơng chim Phát hoa: Hoa đầu đính thành chùm tụ tán, dạng tán kép, cuống hoa đầu ngắn, có lơng, tổng bao hình trụ rộng thành hình elip, loạt bắc nhỏ từ 25-30 xếp 4-5 hàng, dài 0,4-0,6 cm, bị đè dẹp, có màu xanh nâu đỉnh, vòng dài vòng ngồi Hoa: hoa lưỡng tính, đầu hoa có 11-35 hoa, hình chng rộng 0,2-0,5cm, đế hoa nhỏ dài 0,2-0,5cm, màu trắng kem, có mùi thơm Bộ nhị: dài 4,5-5mm, với nhị, nhị dài 11-14,5mm, bao phấn dính thành ống dài 3-4mm, bao phấn thn dài hình elip, kích thước 2-2,5 x 0,5-0,9 mm, dính Bộ nhụy: nhụy gồm nỗn dính tạo thành bầu ơ, chứa nỗn, đính nỗn gốc, bầu nhụy màu trắng, hình trụ, dài khoảng 2-4mm, đỉnh bầu có đĩa mật hình mâm màu vàng nhạt, vòi nhụy dạng sợi, màu trắng, dài 8mm, phía tách mang đầu nhụy, đầu nhụy dạng sợi dài 2-3mm Quả: Quả bế hình elip thn dài, 3-4 x 0,5-1mm, có 10 gân, túm lơng với sợi lơng cứng loe đầu Hình 1.2 Hình vẽ nhánh Lá đắng có hoa Hình 1.3 Hoa thức hoa đồ 1.1.5 Phân biệt Lá đắng số loại khác: Cây Lá đắng, Kim thất tai Lá đắng miền bắc loại thảo dược sử dụng nhiều dân gian để chữa bệnh Tuy nhiên, vị đắng công dụng ba loại thảo dược mà nhiều người bị nhầm lẫn, dẫn đến nhiều trường hợp sử dụng sai loại thuốc khiến cho việc điều trị khơng có kết quả, đơi gây hại đến sức khỏe người bệnh Bảng xin tổng hợp số đặc điểm hình thái ba loại thảo dược để người dân dễ dàng phân biệt nhận dạng: Ống chứng TT Mayer TT Bouchardat Hình 3.16 Phản ứng định tính alkaloid với thuốc thử (+) (Các ống 2, xuất tủa làm đục dung dịch) Định tính tannin Cách tiến hành: Lấy 2ml dịch chiết cho vào chén sứ, bốc tới cắn Hòa tan cắn với 4ml nước bếp cách thủy Lọc, chia dịch chiết vào hai ống nghiệm a Ống nghiệm 1: Pha loãng 0,5ml dịch chiết với 1ml nước cất Thêm 2-3 giọt thuốc thử FeCl3 5% lắc Nếu dung dịch có màu xanh đen hay xanh rêu: Có polyphenol Kết quả: Dung dịch có màu xanh đen  có polyphenol Ơng chứng Ống thử Hình 3.17 Phản ứng định tính tannin với FeCl3 (+) (Dung dịch có màu xanh đen) b Ống nghiệm thứ 2: Thêm vào dịch lọc giọt dung dịch gelatin muối, lắc đều, so sánh với ống chứng chứa dịch chiết ban đầu Nếu có tủa bơng trắng: có tannin Kết quả: Có tủa bơng trắng có tannin 38 Ống chứng Ống thử Hình 3.18 Phản ứng định tính tannin với gelatin muối (+) (Có tủa bơng trắng) Định tính saponin Cách tiến hành: Lấy 5ml dịch chiết cồn cho vào chén sứ, cô bếp cách thủy tới cắn Hòa cắn 5ml cồn 25% bếp cách thủy, lọc vào ống nghiệm Thêm 5ml nước lắc mạnh theo chiều dọc ống Nếu có bọt bền: có saponin Kết quả: Có bọt xuất bền 15 phút Ống chứng Ống thử Hình 3.19 Phản ứng định tính saponin (+) (Có bọt bền) 39 3.2.1.3 Xác định chất tan dịch chiết nước: Định tính alkaloid Cách tiến hành: lấy khoảng 10ml dịch nước cho vào bình lắng gạn 50ml, kiềm hóa dịch chiết tới pH 10 dung dịch NH 4OH 10% chiết ether ethylic chloroform (10ml x lần) Gộp chung rửa lớp dung môi hữu với 10ml nước cất Lắc lớp ether với dung dịch H2SO4 2% (2ml x lần) Chia dung dịch acid vào ống nghiệm nhỏ Định tính alkaloid thuốc thử: Mayer, Dragendorff, Bouchradat - Thuốc thử Mayer: Các alkaloid cho tủa vơ định hình màu trắng hay vàng ngà - Thuốc thử Bouchardat: Các alkaloid cho tủa màu nâu đến nâu đen - Thuốc thử Dragendorff: Các alkaloid cho tủa màu đỏ cam đến đỏ Kết quả: xuất tủa vàng ngà với thuốc thử Mayer, màu đỏ nâu với thuốc thử Bouchardat màu đỏ cam với Drangendroff Thuốc thử Mayer Thuốc thử Bouchardat Thuốc thử Drangendroff Hình 3.20 Phản ứng định tính alkaloid với thuốc thử (+) (Có xuất tủa) Định tính acid hữu Lấy 2ml dịch chiết cho vào ống nghiệm Pha loãng với 1ml nước thêm vào dung dịch tinh thể natri carbonat Nếu có bọt khí nhỏ sủi lên từ tinh thể Na2CO3: có acid hữu Kết quả: xuất bọt khí lên từ tinh thể Na2CO3 40 Hình 3.21 Phản ứng định tính acid hữu (+) (Có bọt khí lên từ tinh thể Na2CO3 đáy ống nghiệm) 41 Kết định tính sơ thành phần hóa học Nhóm hợp chất Thuốc thử Cách thực Phản ứng dương tính Chất béo Carotenoid Tinh dầu Nhỏ dd lên giấy H2SO4 Bốc tới Vết mờ Xanh dương hay xanh lục ngã xanh dương Có mùi thơm Triterpenoid tự Liebermam – Burchard Đỏ nâu-tím, lớp có màu xanh lục Alkaloid Thuốc thử chung alkaloid Mở vòng lacton KOH 10% Mg/HCL đđ Kết tủa Thuốc thử vòng lacton HCL KOH HCL/to Dung dịch FeCl3 Tím Đỏ Xanh Đỏ Xanh rêu xanh đen (polyphenol) Courmarin Anthraglycosid Flavonoid Glycosid tim Anthocyanosid Proanthocyanidin Tannin Trong môi tường kiềm Dung dịch kiềm có màu hồng tới đỏ Dung dịch có màu hồng tới đỏ Dung dịch gelatin muối Tủa trắng (Tamin) Triterpenoid thủy phân Liebermam – Burchard Đỏ nâu - tím, lớp có màu xanh lục Saponin Lắc mạnh dung dịch nước Có bọt Acid hữu Chất khử Hợp chất polyrounic Na2CO3 TT Fehling Pha loãng với cồn 90o Sủi bọt Tủa đỏ gạch Tủa trắng – vàng nâu Kết định tính dịch chiết Kết Dịch chiết cồn Dịch chiết nước định tính Dịch K.Thủy Thủy K.Thủy Thủy chung ether phân phân phân phân Khơng ++ Có Nghi +/ngờ Có +++ nhiều Có +++ +++ nhiều Không Không Nghi +/ngờ Không Không Không Không Có +++ nhiều ++ Có N/A Có ++++ +++ nhiều ++ Có Khơng Khơng Ghi chú: Khơng có (-); Nghi ngờ (+/-); Có (+); Có (++); Có nhiều (+++); Có nhiều (++++); N/A: Khơng có liệu Có thể có phản ứng khơng thực Khơng có mặt nhóm có hợp chất dung dịch chiết 42 3.3 KIỂM NGHIỆM BẰNG SẮC KÝ LỚP MỎNG Nhóm hoạt chất định hướng cho sắc ký lớp mỏng: saponin Mẫu thử chuẩn bị theo sơ đồ trình hình Dược liệu (3g) Ethanol 30ml/BM: 50-60oC, 30 phút Dịch cồn (15ml) 10ml HCl 10%/BM: 50-60oC Cơ 50%, thêm 20ml nước Lắc PE 15ml x lần Mẫu thử Hình 3.22 Quy trình chuẩn bị mẫu thử sắc ký lớp mỏng Lá đắng 3.3.1 Sắc ký lớp mỏng saponin: 3.3.1.1 Điều kiện sắc ký: Mẫu thử: mẫu thử đảm bảo tỉ lệ thích hợp chất tan dung mơi (1:10; g/ml), dịch chấm hòa thêm giọt methanol Pha tĩnh: mỏng tráng sẵn Merck silica gel 60 F254 2,5 x 10 cm Pha động: Cyclohexan : ethylacetat (4:6), phát thuốc thử VS 3.3.1.2 Kết quả: Kết sắc ký saponin trình hình , hình bảng UV 254 UV 365 Hình 3.23 Bản sắc ký saponin sau soi UV 254 UV 365 43 Hình 3.24 Bản sắc ký saponin sau nhúng thuốc thử VS Vết Chiều cao vết (cm) 0,7 1,4 1,7 4,8 5,6 Rf 0,09 0,18 0,22 0,61 0,72 Bảng 3.1 Kết sắc ký saponin Nhận xét: Tổng cộng có vết 44 Chương IV: XÂY DỰNG TIÊU CHUẨN DƯỢC LIỆU LÁ CÂY LÁ ĐẮNG 4.1 TÊN GỌI Tên thông thường: Lá đắng Tên khác: Mật gấu, Bitter leaf Tên khoa học: Vernonia amygdaline Del., Asteraceae 4.2 BỘ PHẬN DÙNG Lá Lá đắng dùng phơi khơ bóng râm dùng tươi Vernonia amygdaline Del., họ Cúc (Asteraceae) Lá Lá đắng thu hái quanh năm 4.3 MÔ TẢ Cây bụi thân gỗ, cao từ 1,5 – 3m, thân có tiết diện tròn, thân già màu xám nâu có nốtt sần, thân non màu xanh có lông mịn bao phủ Lá mọc đơn mọc cách, kèm, phiến hình trứng hay hình elip có rang cưa mịn hay nhẵn, đầu nhọn dài 4-20cm, rộng 2-10cm, mặt có màu đậm mặt dưới, gân hình lơng chim, mặt dưới, vị đắng, có mùi đặc trưng Hoa mọc đầu cành thành chùm tụ tán, có loạt bắc nhỏ từ 25-30 xếp 4-5 hàng, bị đè dẹp, có màu xanh nâu đỉnh, hoa lưỡng tính, đầu hoa có 11-35 hoa, hình chng, màu trắng kem, có mùi thơm Quả bế hình elip thn dài, 3-4 x 0,5-1mm, có 10 gân, túm lơng với sợi lông cứng loe đầu 4.4 VI PHẪU Vi phẫu gân giữa: Mặt lồi cao, đỉnh, mặt phình tròn Biểu bì gồm lớp tế bào sống hình chữ nhật hay bầu dục kích thước khơng Lơng che chở đa bào Mơ dày mơ dày góc, 3-5 lớp tế bào hình đa giác, kích thước gần Mơ mềm đạo tế bào hình tròn có kích thước to Bó dẫn gồm 6-8 bó libe gỗ Gỗ trong, mạch gỗ hình tròn, bầu dục, thường xếp thành dãy; mơ mềm gỗ tế bào hình đa giác, vách cellulose Libe ngoài, 2-3 lớp tế bào sát gỗ hình chữ nhật, xếp xun tâm, lớp phía ngồi tế bào hình đa giác nhỏ, xếp lộn xộn Có tinh thể canxi oxalate hình cầu gai nằm rãi rác Phiến lá: Biểu bì lớp tế bào hình bầu dục kích thước khơng biểu bì có lơng che chở đa bào Lỗ khí tập trung mặt Có mang túi tinh dầu 45 Vi phẫu cuống lá: Tương tự vi phẫu gân 4.5 BỘT Bột Lá đắng khô màu xanh đen, có mùi thơm đặc trưng, vị đắng Soi kính hiển vi có cấu tử phổ biến như: lông che chở đa bào, mảnh mô mềm, mảnh mạch điểm, tinh thể canxi oxalat hình cầu gai 4.6 ĐỊNH TÍNH Bằng phản ứng hóa học: Định tính Carotenoid: Lấy khoảng 5ml dịch ether cho vào chén sứ, bốc nhẹ đến cắn (và gần khơng mùi thơm dịch chiết có tinh dầu) Thêm vào cắn vài giọt dung dịch SbCl3 (khan) bão hòa chloroform, thực hai phản ứng: Phản ứng với thuốc thử Carr – Price cho màu xanh chuyển sang màu đỏ Phản ứng với acid sulfuric đặc cho màu xanh dương đậm hay màu xanh lục sau chuyển sang màu xanh dương Định tính triterpenoid: Lấy khoảng 5ml dịch chiết ether cho vào chén sứ, bốc tới cắn Hòa tan cắn với 0,5ml anhydrid acetic thêm vào dung dịch 0,5ml chloroform Chuyển dung dịch vào ống nghiệm nhỏ, khô Dùng pipet Pasteur thêm cẩn thận 1-2ml H2SO4 đđ lên thành ống nghiệm để nghiêng cho acid chảy xuống đáy ống nghiệm Nơi tiếp xúc lớp dung dịch có màu đỏ nâu hay đỏ đến tím, lớp dung dịch phía chuyển thành màu xanh lục hay tím Định tính alkaloid Lấy khoảng 5ml dịch cồn cho vào chén sứ, bốc tới cắn Hòa cắn 24ml dung dịch acid hydroclorid 5% Chia dung dịch acid vào ống nghiệm nhỏ Nhỏ vào ống nghiệm thứ thuốc thử Mayer, ống nghiệm thứ hai thuốc thử Bouchardat, dung dịch hai ơng nghiệm bị đục có tủa Định tính tannin Lấy 2ml dịch chiết cho vào chén sứ, bốc tới cắn Hòa tan cắn với 4ml nước bếp cách thủy Lọc, chia dịch chiết vào hai ống nghiệm a Ống nghiệm 1: Pha loãng 0,5ml dịch chiết với 1ml nước cất Thêm 2-3 giọt thuốc thử FeCl3 5% lắc đều, dung dịch có màu xanh đen hay xanh rêu 46 b Ống nghiệm thứ 2: Thêm vào dịch lọc giọt dung dịch gelatin muối, lắc đều, có tủa bơng trắng Định tính saponin Lấy 5ml dịch chiết cồn cho vào chén sứ, cô bếp cách thủy tới cắn Hòa cắn 5ml cồn 25% bếp cách thủy, lọc vào ống nghiệm Thêm 5ml nước lắc mạnh theo chiều dọc ống, có bọt xuất bền Định tính alkaloid Cách tiến hành: lấy khoảng 10ml dịch nước cho vào bình lắng gạn 50ml, kiềm hóa dịch chiết tới pH 10 dung dịch NH 4OH 10% chiết ether ethylic chloroform (10ml x lần) Gộp chung rửa lớp dung môi hữu với 10ml nước cất Lắc lớp ether với dung dịch H2SO4 2% (2ml x lần) Chia dung dịch acid vào ống nghiệm nhỏ Định tính alkaloid thuốc thử: Mayer, Dragendorff, Bouchradat - Thuốc thử Mayer: cho tủa vơ định hình màu trắng hay vàng ngà - Thuốc thử Bouchardat: cho tủa màu nâu đến nâu đen - Thuốc thử Dragendorff: cho tủa màu đỏ cam đến đỏ Định tính acid hữu Lấy 2ml dịch chiết cho vào ống nghiệm Pha loãng với 1ml nước thêm vào dung dịch tinh thể natri carbonat Có bọt khí nhỏ sủi lên từ tinh thể Na2CO3 Bằng định sắc ký lớp mỏng: Bảng mỏng: silica gel 60 F254 Merck 2.5 x 10cm Dung môi khai triển: cyclohexan : ethylacetat với tỷ lệ 4:6 Dung dịch thử: Lấy 3g dược liệu khô, chiết với 30ml ethanol đun cách thủy 30 phút, nhiệt độ:50-60oC Lấy 15ml dịch chiết cho vào bình nón 100ml, thêm 10ml acid hydroclorid 10%, đun cách thủy 30 phút, 50% thêm 20ml nước Để nguội, cho hỗn hợp vào bình lắng gạn chiết ether ethylic (15ml x lần) Lấy 5ml cho vào chén sứ, bốc tới cắn hòa tan lại giọt methanol Cách tiến hành: Chấm chấm lên mỏng chuẩn bị, chấm khoảng 10µl, chấm tay, vết chấm tròn Khai triển với dung môi lấy mỏng ra, để khô Bản mỏng sắc ký saponin nhúng thuốc thử vanillin-sulfuric, sấy khô bếp điện Khi soi đèn UV 365 mỏng phải cho tối thiểu vết màu đỏ Rf 0,09; 0,18 0,61 47 4.7 CHẾ BIẾN Rửa tươi, dùng lấy tươi rửa phơi khơ bóng râm nắng nhẹ Có thể cắt xay nhỏ để dễ bảo quản 4.8 BẢO QUẢN Để nơi sẽ, khô ráo, thống mát Tránh mối mọt hay trùng 48 Chương V KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 5.1 KẾT LUẬN Sau thời gian khảo sát phân tích Lá đắng (Vernonia amygdalina Del.), thực số công việc sau:  Xác định đặc điểm thực vật: xây dựng hoàn chỉnh liệu hình ảnh đặc điểm hình thái vi học Lá đắng (Vernonia amygdalina Del.), xác định cấu tử đại diện cho bột Cấu tử đặc trưng, dễ quan sát nhận biết  Phân tích sơ thành phần hóa học: kết Lá đắng chứa chủ yếu nhóm hợp chất: saponin, alkaloid, triterpenoid, tannin, acid hữu Các vết chấm sắc ký lớp mỏng cho độ phân tách tốt  Tiêu chuẩn dược liệu dược xây dựng dựa phương pháp đơn giản, hóa chất nguyên liệu dễ tìm 5.2 KIẾN NGHỊ Do thời gian thực có hạn, số hạn chế khách quan nên chưa thu hái mẫu hoa Lá đắng để hồn thiện nội dung mơ tả cách xác khách quan Bên cạnh đó, flavonoid thành phần quan trọng có nhiều công dụng y học Nên kiến nghị tiếp tục thu thập mẫu hoa Lá đắng kết hợp nghiên cứu phương pháp định tính flavonoid Lá đắng, tiến đến việc xây dựng tiêu chuẩn mỏng có flavonoid, góp phần hồn chỉnh tiêu chuần Lá đắng 49 TÀI LIỆU THAM KHẢO TÀI LIỆU TIẾNG VIỆT [1] Bộ môn Dược liệu, trường Đại học Nam Cần Thơ (2017), Phương pháp nghiên cứu dược liệu, Khoa Y-Dược trường Đại học Nam Cần Thơ [2] Bộ môn Dược liệu, trường Đại học Nam Cần Thơ (2014), Thực hành Thực vật dược, Khoa Y-Dược trường Đại học Nam Cần Thơ [3] Nguyễn Thị Trang (2017), Nghiên cứu đặc điểm thực vật thành phần hóa học Lá đắng, Trường Đại học Dược Hà Nội [4] Trần Nguyễn Anh Thư cộng (2015), Xây dựng tiêu chuẩn dược liệu thân cây, vỏ lựu, Trường Đại học Y Dược Cần Thơ [5] Lê Thị Mi Chi cộng (2016), Khảo sát sơ thành phần hóa học, đặc điểm vi phẫu hình thái Lá đắng, tạp chí Khoa học Công nghệ Đại học Đà Nẵng [6] Đỗ Tất Lợi (2006), Cây thuốc vị thuốc Việt Nam, NXB Y học, NXB Thời Đại, Hà Nội [7] Phan Thị Kim Phượng (2014), Nghiên cứu thành phần hợp chất hữu Kim Thất Tai – Gynura auriculata Cass., họ Cúc (Asteraceae)., tạp chí Khoa học Trường Đại học An Giang [8] Phan Cơng Tuấn (2017), Nói thêm Lá đắng, báo Đà Nẵng [9] Phan Cồn Tuấn (2014), Lá Đắng giải rượu, Bệnh viện Y học cổ truyền Đà Nẵng [10] Trần Văn Năm (2016), Tác dụng Lá đắng (cây Lá đắng), Bệnh viện Y học Dân tộc, Hồ Chí Minh [11] Võ Văn Chi (2016), Cây Lá đắng, tạp chí Cây thuốc quý TÀI LIỆU TIẾNG ANH [12] Egharevba, Clement & Erharuyi, Osayemwenre & Imieje, Vincent & Ahomafor, Joy & Akunyuli, Christopher & Adeyanju Udu-Cosi, Anthony & Theophilus, Onyekaba & Osakue, James & Ali, Iftikhar & Falodun, Abiodun (2014) Significance of Bitter Leaf (Vernonia Amagdalina) In Tropical Diseases and Beyond: A Review 50 [13] Alara, Oluwaseun & Nour, Abdurahman & Abdul mudalip, Siti kholijah & Olalere, Olusegun (2017) PHYTOCHEMICAL AND PHARMACOLOGICAL PROPERTIES OF Vernonia amygdalina: A REVIEW Journal of Chemical Engineering and Industrial Biotechnology [14] Oyeyemi, Ifeoluwa & Akinlabi, Akinbiyi & Aderiike, Adewumi & Aleshinloye, Abimbola & Oyeyemi, Oyetunde (2017) Vernonia amygdalina: a folkloric herb with anthelminthic properties Beni-Suef University Journal of Basic and Applied Sciences [15] Alara, Oluwaseun & Nour, Abdurahman & Olalere, Olusegun (2017) Ethanolic extraction of flavonoids, phenolics and antioxidants from Vernonia amygdalina leaf using twolevel factorial design Journal of King Saud University - Science [16] Alara, Oluwaseun & Hamid Abdurahman, Nour & Olalere, Olusegun (2017) Optimization of microwave-assisted extraction of total flavonoids and antioxidants from Vernonia amygdalina leaf using response surface methodology Food and Bioproducts Processing [17] Adiukwu, Paul & Bonsu, Martina & Ben, Inemesit & Peprah, Paul & Mensah-Kane, Paapa & Jato, Jonathan & Nambatya, Grace (2017) Ultraviolet spectroscopic evaluation of bioactive saponin fraction from the aqueous extract of Vernonia amygdalina [Asteraceae] leaf International Journal of Biological and Chemical Sciences [18] Alara, Oluwaseun & Hamid Abdurahman, Nour & Abdul mudalip, Siti kholijah & Olalere, Olusegun (2017) Characterization and effect of extraction solvents on the yield and total phenolic content from Vernonia amygdalina leaves Journal of Food Measurement and Characterization [19] Alara, Oluwaseun & Nour, Abdurahman & Abdul mudalip, Siti kholijah & Olalere, Olusegun (2017) Effect of Drying on Free Radicals Scavenging of Vernonia amygdalina Leaf growing in Malaysia Journal of King Saud University - Science [20] Luo, Xuan & Jiang, Yan & R Fronczek, Frank & Lin, Cuiwu & Izevbigie, Ernest & Lee, Ken (2011) Isolation and structure determination of a sesquiterpene lactone (vernodalinol) from Vernonia amygdalina extracts Pharmaceutical biology [21] Adetunji Onasanwo, Samuel & Tolulope Oyebanjo, Oyetola & Ajayi, Abayomi & Adebukola Olubori, Mujeedat (2017) Mechanisms of action of the anti-nociceptive and antiinflammatory effects of leaf extract of Vernonia amygdalina Journal of Intercultural Ethnopharmacology [22] Ijeh, Ifeoma & Ejike, Chukwunonso (2011) Current perspectives on the medicinal potentials of Vernonia amygdalina Del Journal of Medicinal Plants Research [23] Bhattacharjee, Bandana & Lakshminarasimhan, P & Bhattacharjee, Avishek & Agrawala, D.K & Pathak, M.K (2013) Vernonia amygdalina Delile (Asteraceae) – An African medicinal plant introduced in India Zoos' Print Journal 51 [24] The Plant List (2010) “Vernonia amygdalina” [25] Jisaka M., H Ohigashi, T Takagaki, H Nozaki, T Tada, M Hiroto, R Irie, M.A Huffman, T Nishida, M Kagi and K Koshimizu (1992), “Bitter steroid glucosides, vernoniosides A1, A2, A3 and related B1 from a possible medicinal plant - Vernonia amygdalina used by wild chimpanzees”, Tetrahedron vol.48, pp.625 –632 [26] Jisaka M., H Ohigashi, K Takegawa, M Hirota, R Irie, M.A Huffman and K Koshmizu (1993), “Steroid gluccosides from Vernonia amygdalina, a possible chimpanzee medicinal plant”, Phytochemistry vol.34, p.409 –413 [27] Ohigashi, H (1994), “Toward the chemical ecology of medicinal plant use in chimpanzees: The case of Vernonia amygdalina Del., a plant used by wild chimpanzees, possibly for parasite-related diseases”, Journal of Chemical Ecology 20, p 541 –553 52 ... chuẩn cho dược liệu này, góp phần nhận thức dược liệu, đảm bảo tính an toàn hiệu dược liệu giới thiệu số chế phẩm từ dược liệu dành người tiêu dùng Từ đó, tơi định tiến hành nghiên cứu Xây dựng. .. sát bột dược liệu[ 1] Mỗi dược liệu có đặc điểm mơ học đặc trưng, chúng thể phần qua đặc điểm bột dược liệu Những đặc điểm dùng để phân biệt dược liệu với dược liệu khác Khảo sát bột dược liệu kính... sản xuất dược liệu chế phẩm từ dược liệu, để chiết xuất tinh chế cao chiết dược liệu, kiểm soát bảo đảm chất lượng dược liệu chế phẩm từ dược liệu hay phân lập chất tinh khiết từ dược liệu, người