Xây dựng tiêu chuẩn dược liệu lá cây Mật gấu

Xây dựng tiêu tiêu chuẩn lá cây lá đắng (mật gấu miền nam) goomg những nội dung sau: 1. Tổng quan về thực vật 2. Đối tượng và phương pháp nghiên cứu 3. Kết quả nghiên cứu 4. Xây dựng tiêu chuẩn dược liệu 5. Kết luận và kiến nghị

TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA DƯỢC

XÂY DỰNG TIÊU CHUẨN DƯỢC LIỆU

MỤC LỤC

ĐẶT VẤN ĐỀ 1

Chương I TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2

1.1 TỔNG QUAN VỀ THỰC VẬT HỌC: 2

1.1.1 Tên khoa học và vị trí phân loại: 2

1.1.3.Nguồn gốc và phân bố sinh thái 3

1.1.4.Mô tả thực vật 4

1.1.5 Phân biệt cây Lá đắng và một số loại cây khác: 5

1.2 TỔNG QUAN VỀ THÀNH PHẦN HÓA HỌC 7

1.2.1 Flavonoid 7

1.2.2 Sesquiterpene lactone 7

1.2.3 Saponin 8

1.2.4 Các thành phần khác 9

1.3 TÁC DỤNG DƯỢC LÝ 11

1.3.1 Tác dụng kháng sinh, kháng khuẩn, chống sốt rét và ký sinh trùng 11

1.3.2 Tác dụng chống oxy hóa 11

1.3.3 Tác dụng hạ đường huyết và chống tiểu đường 12

1.3.4 Tác dụng kháng viêm 12

1.3.5 Tác dụng chống ung thư 12

1.3.6 Tác dụng và công dụng khác cúa lá Lá đắng được sử dụng trong dân gian 12

1.3.7 Đặc tính gây độc của lá cây Lá đắng 13

1.4 CÁC CHẾ PHẨM 15

Chương II: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 16

2.1.NGUYÊN VẬT LIỆU 16

2.1.1 Đối tượng nghiên cứu 16

2.1.2 Hóa chất 16

2.1.3 Máy móc và thiết bị nghiên cứu 16

2.2 NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 16

2.2.1 Nội dung nghiên cứu 16

2.2.2 Phương pháp nghiên cứu 17

Chương III KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 28

3.1 ĐẶC ĐIỂM THỰC VẬT: 28

3.1.2 Kiểm nghiệm vi học: 29

3.2 PHÂN TÍCH THÀNH PHÂN HÓA HỌC: 36

3.2.1 Phân tích sơ bộ thành phần hóa học: 36

3.3 KIỂM NGHIỆM BẰNG SẮC KÝ LỚP MỎNG 43

3.3.1 Sắc ký lớp mỏng saponin: 43

Chương IV: XÂY DỰNG TIÊU CHUẨN DƯỢC LIỆU LÁ CÂY LÁ ĐẮNG 45 4.1 TÊN GỌI 45

4.2 BỘ PHẬN DÙNG 45

4.3 MÔ TẢ 45

4.4 VI PHẪU 45

4.5 BỘT 46

4.6 ĐỊNH TÍNH 46

4.7 CHẾ BIẾN 48

4.8 BẢO QUẢN 48

Chương V KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 49

5.1 KẾT LUẬN 49

5.2 KIẾN NGHỊ 49

TÀI LIỆU THAM KHẢO 50

DANH MỤC CÁC BẢNG Chương I TỔNG QUAN TÀI LIỆU

Bảng 1.1: Tổng hợp một số đặc điểm hình thái của ba loại thảo dược 6 Bảng 1.2 Thành phần hóa học và dinh dưỡng của lá Lá đắng 10 Bảng 1.3 Một số công dụng khác của lá Lá đắng 14

Chương II ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

Bảng 2.1 Một vài loại thuốc thử dùng hiện vết cho sắc ký lớp mỏng 26

Chương III KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU

Bảng 3.1 Kết quả sắc ký saponin 44

DANH MỤC CÁC HÌNH

Chương I TỔNG QUAN TÀI LIỆU

Hình 1.1 Sơ đồ phân loại thực vật cây Lá đắng 3

Hình 1.2 Hình vẽ nhánh cây Lá đắng có hoa 5

Hình 1.3 Hoa thức và hoa đồ 5

Hình 1.4 Cấu trúc của ba flavon thuộc nhóm flavonoid 7

Hình 1.5 Công thức cấu tạo của các sesquiterpene lactone 8

Hình 1.6 Cấu trúc của các Vernonioside 9

Hình 1.7 Sản phẩm Trà Lá đắng Đức Thịnh 15

Hình 1.8 Sản phẩm Đường huyết Vĩnh Xuân 15

Hình 1.9 Sản phẩm viên Giải độc rượu 15

Chương II ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU Hình 2.1 Sơ đồ phương pháp nhuộm kép son phèn-lục iod 19

Hình 2.2 Sơ đồ tóm tắt quy trình chuẩn bị các loại dịch chiết 22

Chương III KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU Hình 3.1 Thân cây Lá đắng 28

Hình 3.2 Lá cây Lá đắng 28

Hình 3.3 Vi phẫu gân giữa lá Lá đắng 29

Hình 3.4 Sơ đồ cấu tạo vi phẫu gân giữa lá cây Lá đắng 30

Hình 3.5 Vi phẫu lá Lá đắng 30

Hình 3.6 Sơ đồ cấu tạo bó dẫn 31

Hình 3.7 Tinh thể canxi oxalate hình cầu gai 31

Hình 3.8 Phiến lá cây Lá đắng 32

Hình 3.9 Vi phẫu cuống lá 32

Hình 3.10 Bột lá cây Lá đắng 33

Hình 3.11 Các cấu tử quan sát được trong bột lá Lá đắng 33

Hình 3.12 Các cấu tử quan sát được trong bột lá Lá đắng 34

Hình 3.13 Các cấu tử quan sát được trong bột lá cây Lá đắng 35

Hình 3.14 Phản ứng định tính carotenoid (+) 36

Hình 3.15 Phản ứng định tính Triterpene tự do (+) 37

Hình 3.16 Phản ứng định tính alkaloid với thuốc thử (+) 38

Hình 3.17 Phản ứng định tính tannin với FeCl3 (+) 38

Hình 3.18 Phản ứng định tính tannin với gelatin muối (+) 39

Hình 3.19 Phản ứng định tính saponin (+) 39

Hình 3.20 Phản ứng định tính alkaloid với thuốc thử (+) 40

Hình 3.21 Phản ứng định tính acid hữu cơ (+) 41

Hình 3.22 Quy trình chuẩn bị mẫu thử sắc ký lớp mỏng lá Lá đắng 43

Hình 3.23 Bản sắc ký saponin sau khi soi UV 254 và UV 365 43

Hình 3.24 Bản sắc ký saponin sau khi nhúng thuốc thử VS 44

ĐẶT VẤN ĐỀ

Vào đầu năm 2017, có hàng loạt thông tin về cây Lá đắng (có tên gọi khác: cây

Lá đắng là cây thuốc mới du nhập vào nước ta trong khoảng mươi năm trở lại đây)

chết người”, “Sùng bái mù quáng cây Lá đắng, nhiều người trả giá đắt: trụy mạch, tai biến suốt đời…” hay “Lầm tưởng tai hại về cách sử dụng cây Lá đắng”… Các bài báo trên đều nêu ra quan điểm rằng “cây Lá đắng là sản phẩm của phường kinh doanh…bịa đặt đủ điều để chơi trò bán buôn” Đồng thời, phê phán “Một số lương

y đăng đàn trả lời cây Lá đắng mà không qua thực tế lâm sàng… tung hô thái quá

để biến người bệnh vừa là con mồi vừa là vật thí nghiệm”[8]

Trái ngược với những gì các bài báo đã đăng, theo TS Võ Văn Chi đã tổng kết cho biết nhiều công trình nghiên cứu trên thế giới đã chứng minh nhiều hoạt tính sinh học của cây này như kháng khuẩn, kháng nấm, kháng ký sinh trùng, diệt sán và côn trùng, kháng sốt rét, kháng ung thư và tác dụng gây độc tế bào, chống gây đột biến, chống thụ tinh, chống đông máu và huyết khối, giảm đau và hạ sốt, chống viêm, chống oxy hóa, bảo vệ gan, trị đái tháo đường, v.v… Đặc biệt loài cây này có

ít hoặc không có chất độc hại Người ta khuyến khích sử dụng cây này với lợi ích sức khỏe một cách an toàn.[8]

Ngoài ra, dựa theo các tài liệu tham khảo trên thế giới, cây Lá đắng đã được nghiên cứu về thành phần hóa học cũng như nêu ra công dụng của loại cây này Nhưng các bài nghiên cứu về cây Lá đắng ở Việt Nam vẫn còn thưa vắng Từ những

lí do trên, với mong muốn tìm hiểu rõ hơn về dược liệu lá cây Lá đắng cũng như xây dựng sơ bộ các tiêu chuẩn cho dược liệu này, góp phần nhận thức đúng về dược liệu, đảm bảo tính an toàn và hiệu quả của dược liệu và giới thiệu một số chế phẩm từ dược liệu dành người tiêu dùng Từ đó, tôi quyết định tiến hành nghiên cứu “Xây dựng tiêu chuẩn dược liệu lá cây Lá đắng (Vernonia amygdalina Del., Asteraceae)

Chương I TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 TỔNG QUAN VỀ THỰC VẬT HỌC:

1.1.1 Tên khoa học và vị trí phân loại:

1.1.1.1 Tên[11][24][14]:

Danh pháp đồng nghĩa: Gymnanthemum amygdalium

Tên bản địa ở một số nước Châu Phi: Grawa (Amharique), Ewuro (Yoruba), Etidot (Ibibio), Onubu (Igbo), Ityuna (Tiv), Oriwo (Edo), Chusar-doki (Hausa), Mululuza (Luganda), Labwori ( Acholi), Olusia (Luo) và Ndoleh (CameroonTên tiếng Anh: Bitter leaf

Tên Trung Quốc: Ikaruga

Tên Malaysia: South Africa leaf

1.1.1.2 Phân loại thực vật[24]:

Hình 1.1 Sơ đồ phân loại thực vật cây Lá đắng

1.1.3.Nguồn gốc và phân bố sinh thái[11][23]:

Vernonia amygdalina là loài cây mọc dại bao gồm tới 1000 loài phân bố ở

nhiều quốc gia nhiệt đới (có đến 500 loài ở Châu Phi (từ Guinee đén Somalie về phía nam tới miền đông bắc của Nam Phi) và Châu Á; khoảng 300 loài ở Mexico, Trung

Mỹ và Nam Mỹ) Ở nước ta đã thống kê được 35 loài

Tên Vernonia do nhà thực vật học Đức Schreber (1739-1810) đặt để tôn vinh

nhà thực vật học Anh William Vernon (1680-1711) đã du khảo và thu mẫu ở Bắc

Mỹ

Tên loài amygdalina do nhà thực vật học Pháp Delile (1778-1850) dùng với ý

nghĩa là có trạng thái hạnh nhân, có thể là do liên hệ vị đắng của cây với hạnh nhân

Ở Việt Nam đây là loại cây mới được du nhập vào khoảng mươi năm gần đây Cây là loài sống lâu năm và dễ dàng phát triển ở những môi trường khác nhau, trên tất cả các loại đất Nhưng môi trường phát triển tốt nhất là những nơi có ánh sáng mặt trời đầy đủ, môi trường ẩm ướt, đất giàu mùn

1.1.4.Mô tả thực vật[5][23]:

Thân: thân bụi hoặc cây nhỏ, dạng cây mọc thẳng đứng, chiều cao cây dao

động tùy vào môi trường phát triển từ 1,5-3m, có thể cao tới 7m hay hơn, đường kính thân cây đối với dạng cây bụi từ 2-4cm, có thân đạt đến 40cm đường kính đối với loại cây nhỏ, cây rất phân nhánh và thường phân nhánh ở cành gốc, vỏ cây màu nâu xám hoặc xanh, thô, láng, nứt nẻ, có lông mịn ở phần ngọn

Lá: lá mọc so le, rất biến đổi về hình dạng và kích thước, không lá kèm, cuống

từ 0,2-4cm dài, phiến lá hình bầu dục elip đến hình trái xoan ngược, kích thước

4-15 (28)cm x 1-4 (4-15)cm , hình nêm hoặc tròn ở đáy nhọn ở mũi, bìa phiến có những rang cưa mịn, có khi láng bóng hoặc uốn lượn nhẹ, có lông mịn nhưng thường láng, gân lá có hình lông chim

Phát hoa: Hoa đầu được đính thành chùm tụ tán, dạng tán kép, cuống hoa đầu

ngắn, có lông, tổng bao hình trụ rộng ra thành hình elip, một loạt những lá bắc nhỏ

từ 25-30 lá xếp 4-5 hàng, dài 0,4-0,6 cm, bị đè dẹp, có màu xanh hơi nâu ở đỉnh, vòng trong dài hơn vòng ngoài

Hoa: hoa lưỡng tính, đầu hoa có 11-35 hoa, hình chuông rộng 0,2-0,5cm, đế

hoa nhỏ dài 0,2-0,5cm, màu trắng kem, có mùi thơm

Bộ nhị: dài 4,5-5mm, với 5 chỉ nhị, chỉ nhị dài 11-14,5mm, bao phấn dính nhau

thành ống dài 3-4mm, bao phấn thuôn dài hình elip, kích thước 2-2,5 x 0,5-0,9 mm, dính nhau ở đuôi

Bộ nhụy: bộ nhụy gồm 2 lá noãn dính nhau tạo thành bầu dưới 1 ô, mỗi ô chứa

1 noãn, đính noãn gốc, bầu nhụy màu trắng, hình trụ, dài khoảng 2-4mm, trên đỉnh bầu có đĩa mật hình mâm màu vàng nhạt, vòi nhụy dạng sợi, màu trắng, dài 8mm, phía trên tách ra mang 2 đầu nhụy, đầu nhụy dạng sợi dài 2-3mm

Quả: Quả bế hình elip thuôn dài, 3-4 x 0,5-1mm, quả có 10 gân, túm lông với

những sợi lông cứng loe ra ở đầu

Hình 1.2 Hình vẽ nhánh cây Lá đắng có hoa

Hình 1.3 Hoa thức và hoa đồ

1.1.5 Phân biệt cây Lá đắng và một số loại cây khác:

Cây Lá đắng, cây Kim thất tai và cây Lá đắng miền bắc đều là những loại thảo dược được sử dụng rất nhiều trong dân gian để chữa bệnh Tuy nhiên, do vị đắng và công dụng của ba loại thảo dược này mà hiện nay rất nhiều người bị nhầm lẫn, dẫn đến nhiều trường hợp sử dụng sai loại thuốc khiến cho việc điều trị không có kết quả, đôi khi còn gây hại đến sức khỏe của người bệnh

Bảng dưới đây xin tổng hợp một số đặc điểm hình thái của ba loại thảo dược

để người dân dễ dàng phân biệt và nhận dạng:

Bảng 1.1: Tổng hợp một số đặc điểm hình thái của ba loại thảo dược

Đặc điểm

nhận dạng Lá đắng Kim thất tai[7] Lá đắng miền

bắc[6]

Tên khác Mật gấu Bầu đất, Tam thất

giả, rau Tàu bay

Hoàng liên ô rô, Thập đại công lao, Hoàng mộc

Cây thân bụi lớn, cao 4-6m, gỗ màu

vàng

Lá

Lá mọc so le, có lá kèm, dài 4-15(28)

cm, đầu nhọn bầu phía cuống, có răng cưa mịn hoặc không, gân lá hình lông chim

Lá có phiến thon ngược, đầu tà, đáy

từ từ hẹp, mỏng, gân phụ 5 – 7 cặp, gân tam cấp mảnh, bìa có răng thưa, đáy cuống có tai cao 5 mm, dạng lá

bẹ

Lá kép dìa lẻ, dài 30cm có hai gai nhỏ ở cuống lá, 5-

7 lá chét hình trứng, đầu nhọn cuống tròn, có rang cưa sắc nhọn

Hoa

Hoa đầu được đính thành chùm tụ tán, dạng tán kép, cuống hoa đầu ngắn, có lông Hoa lưỡng tính, đầu hoa có 11-

35 hoa, màu trắng kem, có mùi thơm

Phát hoa ở ngọn, dài 20 cm, ít hoa đầu, cọng dài, tổng bao cao 1,2 – 1,5 cm, lá hoa 1 hàng, hoa ống cả, màu đỏ cam, bế quả có lông mào

do tơ mịn trắng

Hoa màu vàng nhạt, lá đài 9 xếp thành 3 lớp mỗi lớp 3 Bầu hình nón phình ở giữa

Quả

Quả bế hình elip thuôn dài, 3-4 x 0,5-1mm, quả có 10 gân, túm lông với những sợi lông cứng loe ra ở đầu

Quả mọng màu xanh, hình cầu

Bộ phận

1.2 TỔNG QUAN VỀ THÀNH PHẦN HÓA HỌC

1.2.1 Flavonoid

Flavonoid là một nhóm hợp chất tự nhiên được tìm thấy trong lá cây Lá đắng

dưới dạng phenolid Chúng chịu trách nhiệm về màu sắc, mùi vị, bảo vệ các

protein và enzyme, đồng thời ngăn ngừa sự oxi hóa các chất béo Trong các nghiên

cứu ban đầu, đã xác định được trong lá cây Lá đắng nhóm flavonoid có ba flavon

là luteolin, luteolin 7-O-β-glucuronoside và luteolin7-O-β-glucoside.[13]

Luteolin 7-O-glucuronide

Hình 1.4 Cấu trúc của ba flavon thuộc nhóm flavonoid

1.2.2 Sesquiterpene lactone

Đây một nhóm các hợp chất được tìm thấy nhiều trong họ Asteraceae Chúng

có hoạt tính kháng khuẩn, chống nấm, kháng viêm… Hầu hết các sesquiterpene

lactone trong cây Lá đắng được phân lập từ lá, bao gồm: vernolide, vernolepin,

vernodalin, hydroxyvernolide, vernodalol, vernomygdin, vernomenin,

4,15-dihydrovernodalin[3]

Hình 1.6 Cấu trúc của các Vernonioside

1.2.4 Các thành phần khác

Theo Igile et al., 1994; Alabi and Amusa, 2005; Owu et al., 2008 đã chỉ ra rằng lá cây Lá đắng giàu các chất protein, chất béo, chất xơ, acid amin, các vitamin

và khoáng chất

Bảng 1.2 Thành phần hóa học và dinh dưỡng của lá Lá đắng

Tuy nhiên, các thành phần dinh dưỡng của lá cây Lá đắng có những điểm khác nhau nhất định theo từng nghiên cứu, điều này có thể do vị trí địa lý khác nhau, di truyền, môi trường, điều kiện thu hoạch và sinh thái của cây

lá khô)

Thành phần

Hàm lượng (mg/100g lá khô)

(mg/100g) 1,84 Casein

hydrolasate (mg/100g)

96,99 Nicotinamide

(mg/100g) 1,65

1.3 TÁC DỤNG DƯỢC LÝ

1.3.1 Tác dụng kháng sinh, kháng khuẩn, chống sốt rét và ký sinh trùng

Chiết xuất lá cây Lá đắng đã cho thấy khả năng năng ức chế chống Staphylococcus epidermidis, Staphylococcus aureus, Escherichia coli, và Pseudomonas aeruginosa[13] Chiết xuất methanol 60% của lá cho hoạt tính kháng khuẩn chống lại Bacillus subtilis, viêm phổi Klebsiella, P aeruginosa, Proteus vulgaris, Shigella dysenteriae và S aureus[22] Trong một nghiên cứu khác, ethanol

và dung dịch nước của lá Lá đắng đã cho thấy giá trị ức chế MIC trên Streptococcus mutans cao hơn ở mức 25 và 55mg/ml tương ứng[15]

Cả hai hoạt chất vernolide và vernodalol được phân lập từ lá cây Lá đắng cho thấy hoạt tính chống lại các vi khuẩn Gram dương Bacillus cereus, S epidermidis,

S aureus, Micrococcus kristinae và Streptococcus pyrogens và Salmonella pooni Gram âm, nhưng cả hai không có hoạt động chống lại Gram âm E coli, Serratia marcescens, P aeruginosa và K pneumonae Ngoài ra, sự hiện diện của vernolide

và vernodalol cũng cho thấy hiệu quả chống nấm cao hơn Penicillium notatum và Aspergillus flavus với giá trị LC50 là 0.4 mg/ml[13]

Chiết xuất từ lá cây Lá đắng có tác dụng chống sốt rét đối với Plasmodium berghei kháng thuốc ở chuột, kết quả là giảm 67% và 53,5% ký sinh trùng sau 4 ngày điều trị Các sesquiterpene lactones được cô lập đã được báo cáo cho thấy tính chống co thắt với IC50 <4 μg / ml, làm giảm co giật đối với chuột nhiễm Plasmodium falciparum lên đến 73%[22]

Thêm vào đó, chiết xuất lá cây Lá đắng đã được thử nghiệm trên các giai đoạn khác nhau ở các loài giun sán và cho ra hiệu quả trên một số giai đoạn cụ thể của một số loài Nghiên cứu trên in vitro sử dụng Leishmania aethiopica cho thấy amastigotes nhạy cảm với dịch chiết hơn promastigotes, nó cũng cho thấy dịch chiết chloroform có tác dụng diệt kí sinh trùng mạnh hơn dịch chiết methanol Thêm nữa, các báo cáo cũng chỉ ra rằng dịch chiết lá cây Lá đắng có tác dụng chống lại sán máng Những điều này thể hiện rõ ràng rằng lá cây Lá đắng có thể rất hữu ích trong việc chống lại kí sinh trùng trên người[14]

1.3.2 Tác dụng chống oxy hóa

Chất chiết xuất từ cây Lá đắng đã được nghiên cứu và cho thấy tác dụng chống oxy hóa bằng cách lấy đi các gốc tự do trong tế bào Các chiết xuất từ lá cây Lá đắng cho thấy khả năng làm giảm đáng kể các malondialdehyde (MDA) của sự oxy hóa

do streptozotocin gây ra ở chuột bị tiểu đường Tác dụng chống oxy hóa của chiết xuất lá cây Lá đắng được cho là do có sự hiện diện của flavonoid (Luteolin 7-O- β- glucuronoside và Luteolin 7-O-olucoside), đặc biệt là Luteolin được khẳng định là một chất chống oxy hóa mạnh hơn cả BHT Phân tích sinh hóa chiết xuất lá Lá đắng

trong ruột chuột cho thấy mức tăng đáng kể các chất chống oxy hóa như: superoxide dismutase, catalase, glutathione, và MDA[13][15][16]

1.3.3 Tác dụng hạ đường huyết và chống tiểu đường

Các nghiên cứu cho thấy rằng chiết xuất nước từ cây Lá đắng làm giảm lượng đường trong máu, giảm nồng độ triglyceride huyết thanh và nồng độ c-LDL, bình thường hóa cholesterol trong những con chuột mắc bệnh do streptozocin gây ra Trong một nghiên cứu khác về chiết xuất từ lá cây Lá đắng trên những con chuột bị bệnh đái tháo đường, kết quả cho thấy rằng sự giảm glucose máu có thể liên quan đến sự hiện diện của chất phytochemicals, vitamin và các chất dinh dưỡng khác trong chiết xuất[13][3]

1.3.4 Tác dụng kháng viêm

Một nghiên cứu cho thấy chiết xuất methanol của lá Lá đắng (được chiết bằng máy quay chân không ở 40oC – MAVA) làm giảm đáng kể tình trạng viêm sau khi tiêm Carrageenan để kích ứng viêm MAVA (200mg/kg) làm giảm lượng bạch cầu thâm nhập, điều này đã được chứng minh thông qua tổng số bạch cầu trong dịch và phân tích mô học khi kết hợp với Indomethacin (5mg/kg)[21][13]

1.3.5 Tác dụng chống ung thư

Ung thư vú là nguyên nhân đứng thứ hai thế giới gây tử vong ở phụ nữ Chiết xuất lá cây Lá đắng đã được báo cáo rằng gây ức chế sự gia tăng của MCF-7 và MDA-MB-231 liên quan đến việc kích thích chu trình tế bào giai đoạn G1/S, cụ thể

tế bào bị bắt giữ trong các tế bào MCF-7, nhưng không có trong MDA-MB-231 tế bào cho khoảng 70% trường hợp ung thư vú được chẩn đoán bằng ER-α Người ta cho rằng các coumarins, flavonoid, lactones sesquiterpene và edotides là các chất tạo ra khả năng chống ung thư trong loài cây này Bên cạnh đó Owoeye và cộng sự

2010 cũng đã báo cáo sự có mặt của epivernodalol trong chiết xuất methanolic của

lá cây Lá đắng có hoạt tính chống lại dòng tế bào mỡ hạch HT-144 Dịch chiết của choloroform, butanol, ethyl acetat, hexan của lá cây Lá đắng ức chế sự phát triển tế bào ung thư vú ở người ngay cả ở nồng độ 0,1mg/ml Ở nồng độ 1mg/ml, tỉ lệ ức chế lên đến 98% với một số phần của dịch chiết[13][3][22]

Vernodalin và vernomygdin đã được báo cáo là có hoạt tính chống u tế bào ung thư vòm họng KB, L-1210, epivernodalol chống lại ung thư da ác tính dòng tế bào HT-144 ở người[14]

1.3.6 Tác dụng và công dụng khác cúa lá Lá đắng được sử dụng trong dân gian

Cây Lá đắng là loài cây mọc tự nhiên, việc sử dụng loại cây này để trị bệnh ở các loài động vật hoang dã đã được ghi nhận Không chỉ có động vật, ngày nay người dân ở các quốc gia trên thế giới cũng ưa chuộng sử dụng cây Lá đắng, mà bộ phận dùng là lá một cách hữu hiệu (bảng 1.3)

1.3.7 Đặc tính gây độc của lá cây Lá đắng

Dịch chiết nước của lá cây Lá đắng được báo cáo là có độc tính thực vật Bụi

từ lá khô của lá cây Lá đắng được báo cáo có hiệu lực diệt côn trùng, chống lại một

số loài ấu trùng[22]

Cộng hòa dân

chủ Congo

Tiêu chảy, kiết lỵ, viêm dạ dày, sốt rét, viêm gan, nhiễm giun[11]

Ghana Sốt rét, sốt, táo bón, loét dạ dày, loét, nhiễm trùng đường hô

hấp trên, viêm da, tiểu đường, cao huyết áp[11]

Đau dạ dày, rối loạn tiêu hóa, vệ sinh răng miệng, ngứa, nhiễm

ký sinh trùng, nấm ngoài da, sốt thương hàn, đau đầu, tiểu đường, táo bón, sốt rét, cải thiện sữa mẹ[11]

Cameroon Sốt rét, bệnh giun sán, bệnh tiểu đường, ung thư, ký sinh trùng

đường ruột[11][14]

Uganda

Co giật, ho, đau tử cung, co tử cung, xử lý sót nhau, và chảy máu sau sinh, kinh nguyệt không đều hay đau bụng kinh, nhiễm trung do vi khuẩn và nấm[11]

Rwanda Tiêu chảy, viêm dạ dày-ruột, viêm gan, kiết lỵ, sốt rét, nhiễm

giun.[14]

Tanzania Rắn cắn, sốt, đau dạ dày, món khai vị[11][14]

Ấn Độ Đái tháo đường[11]

Trung Quốc

Viêm phổi, cổ họng sưng đau, viêm gan, viêm dạ dày, bệnh trĩ sưng đau, đau thần kinh do phong thấp, cao huyết áp, đái tháo đường, mỡ máu cao[11]

Malaysia Bệnh tiểu đường, cao huyết áp, tăng lưu lượng máu giảm[14]

Việt Nam

Bệnh tiểu đường, cao huyết áp, giải rượu, rối loạn lipit máu, ho, tăng tiết sữa cho con bú, thảy độc cho cơ thể, bảo vệ gan thận, giảm đau, chống mẩn ngứa, chống ung thư[8][9][10]

1.4 CÁC CHẾ PHẨM

Trà cây Lá đắng Đức Thịnh với thành phần từ lá cây Lá đắng, dây khổ qua

rừng và dây thìa canh có tác dụng rất tốt cho bệnh tiểu đường, bệnh cao huyết áp, giúp tăng cường hệ miễn dịch, kích thích tiêu hóa và giúp ngủ sâu giấc

Hình 1.7 Sản phẩm Trà Lá đắng Đức Thịnh

Đường huyết Vĩnh Xuân với nguyên liệu là cao Lá đắng, cao Dây Thìa Canh,

Thiên Hoa Phấn có công dụng giúp hạ đường huyết và cholesterol, lipit trong máu

Hỗ trợ điều trị bệnh tiểu đường, ngăn ngừa biến chứng về tim mạch, huyết áp cao, thần kinh ngoại biên do tiểu đường gây ra

Hình 1.8 Sản phẩm Đường huyết Vĩnh Xuân

Viên Giải độc rượu có thành phần như Sơri, Nhàu, Lá đắng, Cát Căn, Hoàng

Liên với công dụng giúp giải rượu, giải độc tố của rượu và bảo vệ tế bào gan tránh

sự tổn thương do uống nhiều bia rượu Hỗ trợ miễn dịch và tăng cường sức đề kháng, giúp ngăn ngừa các biến chứng do rượu bia

Chương II: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1.NGUYÊN VẬT LIỆU

2.1.1 Đối tượng nghiên cứu

Lá của cây Lá đắng được thu hái ở

Mẫu nghiên cứu hóa học được phơi khô tự nhiên trong bóng râm, bảo quản ở nơi khô ráo thoáng mát

Mẫu nghiên cứu hình thái và giải phẫu được sử dụng ngay khi còn tươi và chụp hình lưu mẫu

2.1.2 Hóa chất

Ether etylic, cồn, methanol, HCl, chloroform, H2SO4, than hoạt tính, anhydrid acetic , thuốc thử Valse-Mayer, thuốc thử Bouchardat, thuốc thử Drangendroff, thuốc thử xanhthydrol, thuốc thử VS, KOH 10%, NaOH 10%, bột kim loại Mg, FeCl3 5%, gelatin muối, NH4OH 10%, Fehling A, Fehling B, Na2CO3, cyclohexan, ethylacetat

2.1.3 Máy móc và thiết bị nghiên cứu

_ Kính hiển vi quang học

_ Máy UV-vis

_ Cân điện tử

_ Nồi đun cách thủy

_ Các dụng khác có kích thước khác nhau: ống nghiệm, pipet, đũa thủy tinh, kẹp ống nghiệm, bình lắng gạn, bình nón có nút mài, cốc thủy tinh, phễu, mặt kính đồng hồ, chén sứ, ống đong…

2.2 NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.2.1 Nội dung nghiên cứu

2.2.1.1 Nghiên cứu về thực vật

_ Mô tả đặc điểm hình thái mẫu nghiên cứu

_ Làm vi phẫu lá và quan sát, mô tả đặc điểm vi phẫu qua kính hiển vi

_ Làm tiêu bản giọt ép soi bột và mô tả đặc điểm bột qua kính hiển vi

2.2.1.2 Nghiên cứu về thành phần hóa học

_ Định tính các nhóm chất chính trong lá bằng phương pháp hóa học

_ Định tính saponin bằng phương pháp SKLM

_ Chuẩn bị chấm

_ Chạy sắc ký

_ Phát hiện vết bằng thiết bị UV…

2.2.2 Phương pháp nghiên cứu

2.2.2.1 Nghiên cứu đặc điểm thực vật

a) Phân tích hình thái

Quan sát và mô tả đặc điểm hình thái thực vật về: dạng sống, thân, lá(hình dạng phiến, chóp, gân, gốc, cuống, kích thước ), hoa(dạng cụm hoa, vị trí cụm hoa, kích thước, lá bắc, bộ nhị, bộ nhuỵ ), quả và hạt(hình dạng, màu sắc, kích thước )[4]

b) Kiểm nghiệm bằng phương pháp vi học

Kiểm nghiệm vi học là phương pháp hay dùng nhất để kiểm nghiệm dược liệu

là các bộ phận của cây thuốc Cơ sở của kiểm nghiệm vi học là dựa vào cấu tạo giải phẫu thực vật và một số phản ứng hóa thực vật Có hai phương pháp kiểm nghiệm

vi học thường được sử dụng, đó là khảo sát vi phẫu dược liệu và khảo sát bột dược liệu.[4]

Khảo sát vi phẫu dược liệu:[1]

Cấu tạo giải phẫu của các cơ quan thực vật là một đặc điểm quan trọng trong kiểm nghiệm dược liệu Hình dạng và các cấu trúc vi học của vách tế bào có ý nghĩa quan trọng nhất trong khảo sát vi học Vì vậy khi quan sát các mẫu, người ta thường loại bỏ tế bào chất, nhuộm màu màng tế bào để việc quan sát được dễ dàng hơn Tiêu bản vi phẫu thực vật được chuẩn bị qua các giai đoạn:

1 Chọn mẫu: Có thể dùng mẫu tươi hay khô Nếu là mẫu khô nên

ngâm mềm trước khi cắt Mẫu được chọn phải chính xác, có tính đại diện, không quá già hoặc quá non

2 Cắt vi phẫu: Cắt bằng tay với lưỡi lam để được lát cắt thật mỏng

để nhuộm Nếu mẫu nhỏ thì cắt cả tiết diện, nếu mẫu có kích thước to thì cắt phần đại diện Mẫu cắt là lá thường lấy đoạn 1/3 gân giữa kể từ nơi tiếp giáp với cuống và một phần phiến lá ở hai bên

Phân loại: Có 2 loại phẫu thức được dùng trong kiểm nghiệm dược liệu:

- Phẫu thức ngang: thông dụng nhất Lát cắt nằm trong mặt phẳng vuông góc với trục của mẫu cắt

- Phẫu thức dọc: thường để quan sát ống tiết hay ống nhựa mủ Lát cắt nằm trong mặt phẳng song song với trục mẫu cắt Lát cắt có thể đi qua trục tâm (cắt xuyên tâm) hay song song với trục tâm (cắt tiếp tuyến)

3 Nhuộm vi phẫu: Có nhiều phương pháp và hóa chất để nhuộm

tế bào thực vật, ở đây ta dùng phương pháp nhuộm kép carmin – lục iod (nhuộm kép son phèn – lục iod)

Hóa chất sử dụng: (cách pha tham khảo Dược diển Việt Nam 4, phụ lục 2.1.)

- Dung dịch Javel 50% dùng để loại bỏ tế bào chất

- Dung dịch cloral hydrat 50%, dùng làm sáng tiêu bản và tẩy sạch tinh bột

- Dung dịch acid acetic 1% dùng để trung hòa nước Javel còn lại

- Dung dịch KOH hay NaOH 5% tăng cường tẩy tế bào chất, dùng khi mẫu có quá nhiều tinh bột

- Dung dịch lục iod 0,1% để nhuộm xanh màng tế bào có suberin hay lignin

- Dung dịch đỏ carmin 1% (son phèn) dùng để nhuộm hồng màng cellulose

- Nước cất

Cách nhuộm: Tiến hành tuần tự như sau: (sơ đồ hình 1.8)

1 Ngâm lát cắt vào dung dịch Javel 15-30 phút (cho đến khi lát cắt trở nên trắng), rửa bằng nước cất nhiều lần

2 Ngâm lát cắt vào dung dịch acid acetic 1-3% trong 2 phút để tẩy Javel còn sót lại Rửa bằng nước cất

3 Ngâm tiếp lát cắt vào dung dịch cloral hydrat 50% (nếu thấy lát cắt chưa thật trắng và trong) khoảng 10-15 phút Rửa bằng nước cất

4 Ngâm vào dung dịch lục iod từ 5-10 giây, Rửa bằng nước cất

5 Ngâm tiếp vào dung dịch son phèn khoảng 15-30 phút Rửa bằng nước cất đến khi dịch rừa hết màu

Hình 2.1 Sơ đồ phương pháp nhuộm kép son phèn-lục iod

Vi phẫu sau khi nhuộm xong có thể ngâm vào nước cất hay dung dịch glycerin 30% Quan sát dưới kính hiển vi và vẽ hình hoặc chụp bằng máy ảnh

Khảo sát bột dược liệu[1]

Mỗi dược liệu đều có những đặc điểm mô học đặc trưng, chúng được thể hiện một phần qua đặc điểm bột dược liệu Những đặc điểm này dùng để phân biệt dược liệu này với dược liệu khác

Khảo sát bột dược liệu bằng kính hiển vi nhằm mục đích tìm ra những đặc điểm

vi học đặc trưng của bột dược liệu giúp cho việc định danh, xác định độ tinh khiết của dược liệu, phân biệt với dược liệu dễ nhầm lẫn và phát hiện sự giả mạo nếu có

Cấu tạo vi phẫu và bột của cùng một bộ phận dược liệu có liên quan chặt chẽ với nhau, bổ sung cho nhau Do đó khi soi bột nên cắt nhuộm vi phẫu trước để có thể nhận dạng các thành phần trong bột dược liệu dễ dàng và chính xác

1 Chuẩn bị bột để soi: Lấy bột cần khảo sát cắt nhỏ và sấy ở nhiệt

(rây mịn) Phần còn lại trên rây được tán hoặc xay tiếp cho đến khi tất cả dược liệu trở thành bột mịn Chú ý không được bỏ qua phần còn lại trên rây

và không nên sấy ở nhiệt độ quá cao có thể làm nát hoàn toàn các mô, tế bào khi xay, tán, khiến cho không thể nhận dạng cấu tử dù bằng kính hiển vi.Trước khi soi kính hiển vi phải quan sát bột bằng cảm quan (màu sắc, mùi

vị, độ mịn, nhám, xơ…) để có thêm yếu tố kiểm nghiệm Đặc điểm một số loại bột của các bộ phận dùng khác nhau như bôt lá thường có màu xanh lục tới xanh nâu Cấu tử thường gặp: biểu bì mang khí khổng, lông che chở, lông tiết, tinh thể calci oxalat, các mạch gỗ như mạch vạch, mạch xoắn…

2 Cách lên tiêu bản bột soi: Cho một giọt nước cất vào giữa phiến

kính, dùng que sạch trộn đều bột, lấy một ít bột cho vào giữa giọt chất lỏng, khuấy nhẹ để phân tán bột và đậy lá kính lại Lấy ngón tay trỏ di nhẹ trên lá kính để các phần tử của bột tách rời nhau và phân tán đều Loại bỏ phần bột

và nước thừa nằm ngoài lá kính bằng giấy thấm, lau sạch mặt trên phiến kính

và lá kính trước khi soi kính hiển vi

chúng trong dược liệu Công việc này được gọi là phân tích thành phần hóa thực vật

Việc phân tích thành phần hóa thực vật thường được tiến hành theo 2 bước:

- Phân tích sơ bộ: các chất trong nguyên liệu thực vật được phân thành một

vài phân đoạn đơn giản bằng cách sử dụng các quy trình chiết đơn giản, trong những điều kiện nhất định (dung môi, pH, môi trường…) Định tính nhanh các nhóm hợp chất trong các phân đoạn bằng một số thuốc thử định tính chung

- Định tính xác định: dùng các quy trình chiết đặc hiệu hơn, nhiều phản ứng

đặc hiệu hơn để xác nhận sự có mặt của nhóm hợp chất

a) Phân tích sơ bộ thành phần hoá thực vật:

Quy trình dùng để xác định nhanh một số nhóm hợp chất thường gặp trong nguyên liệu thực vật bằng các phản ứng hóa học dựa trên nguyên tắc:

_ Phân tách hỗn hợp các chất trong nguyên liệu thành những phân đoạn đơn giản (thường phân tách theo độ phân cực các chất)

_ Dùng các phản ứng hóa học đặc trưng (phản ứng màu, phản ứng kết tủa) để phát hiện các nhóm hợp chất có trong dịch chiết Yêu cầu phản ứng phải đặc hiệu, nhạy, dễ phát hiện và không hay ít chịu ảnh hưởng bởi sự có mặt của các nhóm hợp chất khác có trong môi trường phản ứng Có nhiều quy trình phân tích sơ bộ thành phần hóa thực vật khác nhau được sử dụng Quy trình lâu đời nhất của Stas-Otto Các quy trình khác: quy trình phân tích của Puri (Hungari), Schreiber (Đức) và I Ciuley (Rumani)…

Trong nghiên cứu này, sử dụng quy trình phân tích cải tiến và sửa đổi từ Ciuley

vì có nhiều ƣu điểm: xác định được nhiều nhóm hợp chất, tiến hành không quá phức tạp, có thể tiến hành trong một khoảng thời gian ngắn (1 buổi) với một lượng nguyên liệu nhỏ (5-25 g)

Nguyên tắc của phương pháp Ciuley cải tiến:

_ Chiết tách hỗn hợp các chất có trong nguyên liệu thực vật thành 3 phân đoạn theo độ phân cực tăng dần: kém phân cực, phân cực trung bình và phân cực mạnh bằng cách chiết nguyên liệu lần lượt với các dung môi: ether ethylic (hay PE), ethanol (hay methanol) và nước

_ Xác định các nhóm hợp chất trong dịch chiết bằng các phản ứng đặc trưng

b) Cách tiến hành cụ thể

Bước 1: Chuẩn bị các dịch chiết

- Dịch chiết ether: chiết 10-25 g bột dược liệu bằng diethyl ether trong Soxhlet

hay lắc trong một bình nón 10-20 phút cho tới khi bốc hơi dịch chiết không còn cắn Gộp lại, lọc và cô đến khi còn khoảng 50ml

- Dịch chiết cồn: bã dược liệu tiếp tục chiết bằng cồn cao độ (hay methanol)

20-30 phút trên bếp cách thủy 2-3 lần Gộp lại, lọc và cô đến khi còn khoảng 50ml Một phần dịch chiết được thủy phân để định tính các aglycon Lấy 15ml dịch chiết cồn thêm 10ml acid hydrochloric 10% và đun 30 phút, cô còn 50%, thêm 20ml nước

Để nguội, lắc với ether ethylic (15ml x 3 lần) và đem định tính aglycon

- Dịch chiết nước: bã dược liệu tiếp tục chiết nóng với nước trên bếp cách thủy

sôi Gộp lại, lọc và cô đến khi còn khoảng 50ml Một phần dịch chiết nước được thủy phân để định tính các aglycon Lấy 15ml dịch chiết nước thêm 10ml acid hydrochloric 10% và đun 30 phút Để nguội, lắc phân bố với ether ethylic (15ml x 3 lần) và dùng dịch này để đinh tính aglycon

Hình 2.2 Sơ đồ tóm tắt quy trình chuẩn bị các loại dịch chiết.

Bước 2: Xác định các nhóm hợp chất

1 Xác định các nhóm hợp chất trong dịch chiết ether:

- Chất béo: nhỏ dịch chiết lên giấy mỏng, làm bay hơi PE, nếu có vết trong mờ

→ có chất béo

- Tinh dầu: bốc hơi dịch chiết trên chén sứ, nếu có mùi thơm, cho thêm vài giọt

cồn, bốc hơi hết cồn, nếu cắn có mùi thơm → có tinh dầu

- Carotenoid: bốc hơi dịch chiết trên chén sứ đến cắn rồi thực hiện hai phản

ứng: Phản ứng với thuốc thử Carr – Price cho màu xanh chuyển sang màu đỏ Phản

ứng với acid sulfuric đặc cho màu xanh dương đậm hay màu xanh lục sau đó chuyển sang màu xanh dương → có carotenoid

- Triterpenoid tự do: bốc hơi dịch chiết trên chén sứ đến cắn rồi thực hiện phản

ứng Liebermann – Burchard Nếu lớp phân cách có màu đỏ nâu – tím và vòng màu lục hay tím khuếch tán lên → có triterpenoid dạng tự do

- Alkaloid: bốc hơi dịch chiết trên chén sứ đến cắn rồi hoà tan cắn trong nước

acid, thực hiện phản ứng với thuốc thử chung alkaloid Nếu có tủa → có alkaloid

- Coumarin: bốc hơi dịch chiết đến cắn, hòa tan cắn trong cồn 70o rồi chia đều

vào 2 ống nghiệm Thêm vào ống 1 0,5ml KOH 10%, ống 2 4ml nước cất rồi đun cách thủy 2 ống trong 2-3 phút Bổ sung nước cất vào ống 1 cho bằng ống 2 Nếu dịch trong ống 1 trong hơn ống 2 → có coumarin Lấy dịch ống 1 chia vào 2 ống nghiệm 1a và 1b, cho vào ống 1a 4ml nước cất, ống 1b 0,5ml HCl 10% và nước cất đến ngang bằng ống 1a, lắc đều hai ống Nếu dịch trong ống 1a trong hơn dịch trong ống 1b → có coumarin

- Anthraquinon: thực hiện phản ứng Borntrager Nếu dung dịch kiềm có màu

đỏ → có anthraquinon

- Flavonoid: bốc hơi dịch chiết trên chén sứ đến cắn hoà tan cắn trong cồn, thực

hiện phản ứng cyanidin Nếu dung dịch có màu đỏ → có flavonoid [1]

2 Xác định các nhóm hợp chất trong dịch chiết cồn:

- Alkaloid: bốc hơi dịch chiết trên chén sứ đến cắn, hoà tan trong cồn, thực hiện

phản ứng với thuốc thử chung alkaloid Nếu có tủa → có alkaloid

- Coumarin: bốc hơi dịch chiết đến cắn, hòa tan cắn trong cồn 70% rồi chia đều

vào 2 ống nghiệm Thêm vào ống 1 0,5ml KOH 10%, ống 2 4ml nước cất rồi đun cách thủy 2 ống trong 2-3 phút Bổ sung nước cất vào ống 1 cho bằng ống 2 Nếu dịch trong ống 1 trong hơn ống 2 → có coumarin Lấy dịch ống 1 chia vào 2 ống nghiệm 1a và 1b, cho vào ống 1a 4ml nước cất, ống 1b 0,5ml HCl 10% và nước cất đến ngang bằng ống 1a, lắc đều hai ống Nếu dịch trong ống 1a trong hơn dịch trong ống 1b → có coumarin

- Glycosid tim: bốc hơi dịch chiết đến cắn, cho phản ứng với thuốc thử

Raymond – Marthoud và Xanthydrol Nếu cho màu tím với thuốc thử Raymond – Marthoud và màu đỏ với Xanthydrol → có glycosid tim

- Flavonoid (γ – pyron): thực hiện phản ứng cyanidin Nếu dung dịch có màu

đỏ → có flavonoid (γ – pyron)

- Flavonoid (proanthocyanidin): đem dịch chiết cồn đun cách thuỷ với HCl

10% Nếu có màu đỏ → có Flavonoid (proanthocyanidin)

- Flavonoid (anthocyanidin): thêm vào dịch chiết cồn vài giọt HCl 10%, rồi vài

giọt KOH 10% Nếu dung dịch chuyển sang màu đỏ với HCl và màu xanh với KOH

→ Flavonoid (anthocyanidin).

- Tannin: thực hiện phản ứng với dung dịch FeCl3 và dung dịch gelatin muối

Nếu cho màu xanh rêu hay xanh đen với FeCl3, tủa bông với gelatin muối → có tannin

- Saponin: bốc hơi dịch chiết đến cắn, rồi hoà tan cắn trong nước và lắc mạnh

Nếu có bọt bền trên 15 phút → có saponin