PHƯƠNG PHÁP NHUỘM ĐẶC BIỆT LẤY MÁU CHIẾT XUẤT HUYẾT THANH CÁCH PHA LOÃNG HUYẾT THANH

Buổi PHƯƠNG PHÁP NHUỘM ĐẶC BIỆT LẤY MÁU CHIẾT XUẤT HUYẾT THANH CÁCH PHA LOÃNG HUYẾT THANH BS Trần Minh Anh Đào BM Vi sinh NHA BÀO • Vi khuẩn có khả hình thành cấu trúc nghỉ gọi là: nội bào tử hay nha bào • Mỗi tế bào làm phát sinh nội bào tử • Những vi khuẩn có khả sinh nha bào thuộc giống: Bacillus, Clostridium, Desulfotomaculum, Sporolactobacillus, Sporosarcina, … Thermoactinomyces, NHA BÀO • Bào tử nằm giữa, đầu mút hay gần đầu nút tùy theo lồi Vị trí hình thái nội bào tử (1, 2: Bào tử khơng làm biến dạng tế bào nằm tâm hay lệch tâm; 3-6: Bào tử làm biến dạng tế bào đầu, tâm, nằm lệch tâm hay bên) NHA BÀO Trong nhóm Clostridium có bốn vi khuẩn chủ yếu gây bệnh cho người: o C botulinum: sinh độc tố thức ăn, vết thương gây bệnh độc thịt o C difficile: mầm bệnh hội ruột (phát triển có điều kiện điều trị kháng sinh) →viêm đại tràng màng giả NHA BÀO o C perfringens, ban đầu có tên C welchii, nguyên nhân gây loạt hội chứng khác nhau, từ ngộ độc thức ăn bệnh hoại thư sinh Loài sản sinh độc tố ruột huyết gây bệnh nhuyễn thận cừu dê.Lợi ích C perfringens thay nấm men phương pháp bánh mì muối o C tetani, gây bệnh uốn ván NHA BÀO Bào tử: • vi khuẩn dinh dưỡng→1 bào tử • Bào tử hình thành: Vi khuẩn ẩn (gần khơng hoạt động theo năm-hàng chục năm) • Cấu tạo bào tử: Lớp áo: Protein sừng không thấm nước, tránh bị tác động tia cực tím, enzym (lyzozyme, protease, ) Lớp vỏ: peptidoglycan có phân tử calcium dipicolinate (DPA-Ca) →lớp vỏ cứng NHA BÀO Bào tử: • Cấu tạo bào tử: Lớp vỏ: o canxi giúp DNA bào tử DNA ban đầu tác động bất lợi từ bên ngồi o có tính thấm cao với nước →loại bỏ nước khỏi tế bào →kháng nhiệt, kháng xạ, ức chế hoạt động enzym bên lõi NHA BÀO Chuẩn bị: a Dụng cụ, thiết bị: - Phiến kính (slide), KHV quang học sáng, dầu soi kính - Đèn cồn, nước cất, que cấy đầu vòng, giấy lọc, cốc bese 500ml, giá đỡ, chậu rửa, bếp điện b Vật liệu, hóa chất: - Mẫu giống: Các loài vi khuẩn: Bacillus subtilis; Clostridium pasteurianum nuôi cấy tuần tuổi ống thạch nghiêng, mẫu sinh thiết nghi nhiễm vi khuẩn có nội bào tử NHA BÀO Chuẩn bị: b Vật liệu, hóa chất: - Thuốc nhuộm: + Dung dịch lục malachite 5% Hòa tan malachite vào cồn 950, khuấy cho tan, sau nhỏ thuốc nhuộm vào ly thủy tinh màu tối có nút mài + Dung dịch safranin O 2,5%, trước dùng pha với nước cất theo tỉ lệ 1:5 (vol/vol) để có dung dịch 0,5% Hoặc chuẩn bị sẵn dung dịch Fuchsin ziehl: fuchsin kiềm 1g, phenol 5g, ethanol, 90% 10 ml, nước cất 200 ml (hòa tan fuchsin với ethanol; hòa tan phenol với nước cất sau trộn lại) NHA BÀO Nguyên tắc nhuộm: • Khi dùng thuốc nhuộm có hoạt tính mạnh lục malachite với tiêu có đun nóng 5- 10 ph, thuốc xâm nhập vào nội bào tử làm chúng nhuộm màu lục Khi rửa vết bôi nước cất tế bào dinh dưỡng bị màu bào tử giữ màu lục Khi nhuộm bổ sung đỏ safranin hay fuchsin làm phần bao quanh bào tử bắt màu phân biệt (màu đỏ hồng) XOẮN KHUẨN Phương pháp nhuộm: • Làm phết vi khuẩn để khô không khí • Phủ dung dòch Rouge lên miếng lam để 30'' (lặp lại - lần) • Rửa lam cồn tuyệt đối (3') Hơ qua lửa cho khô • Phủ dung dòch Tannic acid lên - hơ lửa cho bốc khói (30'') - để nguội • Rửa nước thường rửa lại DW XOẮN KHUẨN Phương pháp nhuộm: • Phủ dung dòch AgNO3 để vài giây bỏ, phủ dung dòch AgNO3 lên hơ lửa miếng lam bốc khói màu nâu óng ánh kim loại (30'') • Rửa nước - để khô - xem vật kính dầu Kết quả: Leptospira có màu nâu đen màu nâu vàng XOẮN KHUẨN * Phương pháp violet de gentian Thuốc nhuộm: • Dung dịch A: mercurochrome 2% ( mercurochrome 2g + 100 nước cất vừa đủ) • Dung dịch B:violet de gentian 1% ( violet de gentian g + 100 nước cất vừa đủ) Cách nhuộm: • Tiêu để khơ tự nhiên, khơng cố định • Nhỏ dung dịch A, hơ nóng vừa bốc ngưng - lập lại vòng phút Rửa nước ,vẩy để khơ • Nhỏ dung dịch B, hơ nóng vừa bốc ngưng - lập lại phút.Rửa nước ,vẩy XOẮN KHUẨN * Phương pháp nhuộm âm Vật liệu, hố chất: •         Mực tàu •         Metanol •         Dung dịch safranin 0,5% XOẮN KHUẨN * Phương pháp nhuộm âm Các bước tiến hành  • Lấy vi khuẩn hoà vào giọt nước phiến kính • Nhỏ thêm giọt mực tàu, trộn Dùng cạnh lamen dàn mỏng vết bôi, làm khô khơng khí • Cố định vết bơi cách nhỏ metanol lên vết bơi, giữ phút • Thêm dung dịch Safranin 0,5% lên vết bôi để rửa metanol, sau giữ 30 giây để nhuộm lại, rửa nước, thấm khơ • Soi kính: dùng vật kớnh du 100ì XON KHUN Phng phỏp nhum õm Kết quả: • Nền vi trường màu đen, tế bào màu đỏ, vỏ nhầy màu hồng Strep pneumonia; Klebsiella spp   KHÁNG NGUYÊN-KHÁNG THỂ  Lấy máu để chiết xuất huyết Chuẩn bị dụng cụ Cách lấy máu: Lấy từ – ml máu chiết huyết Quay ly tâm Tủ ấm/ tủ lạnh KHÁNG NGUYÊN-KHÁNG THỂ KHÁNG NGUYÊN-KHÁNG THỂ  Lấy máu để chiết xuất huyết Chú ý: Khi chiết xuất huyết tránh làm vỡ hồng cầu (tránh tạo bọt) Lấy máu thời gian bệnh → ∆ xác KHÁNG NGUYÊN-KHÁNG THỂ Phản ứng ngưng kết Thời điểm lấy máu Kết (+) Thương hàn Tuần thứ bệnh (ngày7-10) ≥1/100 Lần 2: lần 1=4:1 Weil-Felix Sốt mò oLần 1: