SỰ THAY đổi đáp ỨNG ĐỒNG HÓA CARBON TRONG QUANG hợp KHI THIẾU ALTERNATIVE OXIDASE AOX1A với sự GIA TĂNG NỒNG độ CO2 ở cây ARABIDOPSIS THALIANA

SỰ THAY ĐỔ I ĐÁ P Ứ NG ĐỒ NG HÓ A CARBON TRONG QUANG HỢ P KHI THIẾ U ALTERNATIVE OXIDASE AOX1A VỚ I SỰ GIA TĂNG NỒ NG ĐỘ CO Ơ CÂY ARABIDOPSIS THALIANA Anthony Gandin, Claire Duffes, David A Day and Asaph B Cousins Tóm tắt Ở thực vật bậc cao, chuỗi chuyền điện tử ti thể (mETC) tồn đường nonphosphorylating alternative, đường bao gồm alternative terminal oxidase (AOX) Hoạt động đường xen kẽ (alternative Pathway) đề xuất “bể” (act as a sink) để tiêu hao lượng dư thừa, làm giảm tối thiểu tác động stress oxi hóa làm tối ưu hóa quang hợp việc đáp ứng với điều kiện sống thay đổi Mơ hình biểu gen gen AOX điều kiện khác mô tả rõ, đặc biệt việc đáp ứng với điều kiện stress ánh sáng nhiệt độ Thêm vào đó, chuỗi chuyền điện tử ti thể đề xuất có vai trò quan trọng để tránh trạng thái khử mức lục lạp làm cân lượng ngăn thực chức quang hợp, quang hô hấp hô hấp (avoiding chloroplast over-reduction and balancing energy partitioning among photosynthesis, photorespiration and respiration) Tuy nhiên, vai trị việc tối ưu hóa đồng hóa carbon quang hợp chưa sáng tỏ Vì vậy, đáp ứng quang hợp đường AOX bị gián đoạn nghiên cứu đối tượng Arabidopsis thaliana với đột biến T-DNA aox1a (T-DNA mutant aox1a) (SALK_084897) Phân tích trao đổi khí cho thấy tỉ lệ đồng hóa CO2 thực (hay có tác giả dịch “thuần”) (A) (net CO assimilation rate) dạng đột biến aox1a thấp so với dạng hoang dại (WT) điều kiện nồng độ CO cao (tức stress nồng độ CO2) Sự giảm A kèm với giảm xuống tỉ lệ chuyền điện tử tối đa hiệu suất lượng tử PSII (maximum electron transport rate and quantum yield of PSII) áp lực kích thích lên PSII làm diệu khơng quang hóa (higher excitation pressure on PSII and non-photochemical quenching) mức cao Đột biến aox1a cho thấy tỉ lệ tái tạo thấp ribulose 1,5-bisphosphate lượng ribulose 1,5-bis-phosphate diện thấp nồng độ CO cao nên có giới hạn lượng ATP chu trình Calvin– Benson Ngồi ra, hoạt động malate–oxaloacetate shuttle (hoạt động chuyển đổi malate thành oxaloacetate) thấp dạng đột biến so với dạng WT Những kết chứng tỏ AOX có vai trị quan trọng việc tối ưu hóa tỉ lệ đồng hóa carbon quang hợp đáp ứng với gia tăng nồng độ CO thông qua hoạt động làm cân tỉ lệ NAD(P)H/ATP tỉ lệ tái tạo ribulose 1,5-bisphosphate lục lạp Giới thiệu mETC bao gồm bốn phức hợp protein lớn: (i) bơm proton NADH dehydrogenase (phức hợp I), (ii) succinate dehydrogenase (phức hợp II), (iii) Cytbc complex (phức hợp III) and a Cytc oxidase (phức hợp IV) Kết dòng electron qua phức hợp I, III IV hình thành khuynh độ điện hóa proton xun màng (electrochemical proton gradient across the inner mitochondrial membrane) Điều kích hoạt phức hợp ATP-synthase (complex V) chuyển ADP thành ATP Bên cạnh chuỗi chuyền điện tử ti thể “cổ điển” (classis mETC), ti thể thực vật cịn sỡ hữu vài đường non-phosphorylating (có thể hiểu đường khơng có tạo nên ATP), bao gồm: alternative terminal oxidase (AOX; Finnegan et al 2004, McDonald 2008), type-II NAD(P)H dehydrogenases [NAD(P)H-DHs; Rasmusson et al 2004] uncoupling protein (UCP; Picault et al 2004) [(uncoupling protein protein thuộc màng ti thể, protein phá hủy khuynh độ proton trước cung cấp lượng cho phosphoryl hóa oxi hóa (oxidative phosphorylation)] AOX khơng nhạy với cyanide (chất cảng hô hấp ức chế phức hợp Cytc oxidase-phức hợp IV) oxi hóa ubiquinol khử oxygen thành nước mà không chuyển proton xuyên màng (nên không tạo khuynh độ proton xuyên màng ) Con đường xen kẽ không qua phức hợp chuyển proton III, IV oxi hóa NAD(P)H với mức độ bảo tồn lượng khác (varying levels of energy conservation) chuyển electron (tức chuyển vào chất nhận oxygen) giúp trì trạng thái cân lượng tế bào Ở Arabidopsis có năm gen mã hóa cho AOX xác định là: AOX1a – d AOX2 Sự biểu họ gen AOX thể mô xác định giai đoạn phát triển cụ thể (Thirkettle-Watts et al 2003) Thêm vào đó, biểu gen AOX vài thành phần xen kẽ hô hấp (alternative respiratory components) (tức protein AOX nằm xen vào màng ti thể xen phức hợp tham gia chuyển electron màng ti thể - hình minh họa powerpoint) tăng cường có điều kiện stress (Clifton et al 2005) Ví dụ, Clifton et al (2005) chứng minh đồng biểu AOX (AOX1a) thành phần khác alternative pathways, gen NAD(P)H-DH (NDB2) điều kiện stress khác nhau, điều cho thấy thành phần thành phần tham gia hình thành non-phosphorylating pathway NAD(P)H oxidation để giảm tối thiểu tác dụng stress oxi hóa Thêm vào đó, “năng suất”, hoạt động biểu AOX (AOX capacity, activity and expression) thể vài loài khác cảm ứng bỡi phần lớn tress phi sinh học lạnh (Armstrong et al 2008, Watanabe et al 2008), hạn hán (Bartoli et al 2005, Giraud et al 2008), giới hạn nitrogen phosphate (Gonza`Lez-Meler et al 2001, Sieger et al 2005, Escobar et al 2006) điều kiện stress cảm ứng với dạng oxy hoạt tính (reactive oxygen speciesinducing stress conditions) (Maxwell et al 1999), cho thấy vai trò quan trọng AOX việc tối ưu hóa trao đổ chất điều kiện môi trường thay đổi Gần hơn, người ta biểu profile gen AOX hàm lượng hoạt động AOX thể đáp ứng mạnh mẽ với điều kiện cường độ ánh sáng cao, cho thấy có chức liện kết với trao đổi chất lục lạp (chloroplast metabolism) (Ribas-Carbo et al 2000, Yoshida and Noguchi 2009) Mơ hình biểu gen AOX miêu tả kỹ điều kiện sinh trưởng khác nhau, đặc biệt đáp ứng với stress ánh sáng nhiệt độ; nhiên, vai trị AOX việc trì hoạt động đồng hóa carbon quang hợp chưa sáng tỏ (Vanlerberghe et al 2009, Millar et al 2011) Ngồi vai trị cụ thể tỏa nhiệt (Wagner et al 2008) vai trị chung góp phần giúp mETC tránh trạng thái khử mức hình thành dạng oxi hoạt tính đáp ứng với điều kiện stress lạnh (McIntosh et al 1999, Umbach et al 2005), AOX giữ vai trị oxi hóa carbohydrates dư thừa (Lambers 1982, Gandin et al 2009) Hơn nữa, AOX giúp tránh thiết hụt adenylate (muối andenylic acid) cho q trình hơ hấp điều kiện có giới hạn phosphate (Parsons et al 1999) làm giảm lượng chất khử dư thừa điều kiện thiếu hụt nitrate (Escobar et al 2006) Các đột biến chức hô hấp sử dụng chất ức chế protoplasts chứng minh chức “đầy đủ” mETC cần thiết cho việc trì trình trao đổi chất khác quang hợp (Padmasree et al 2002) Bên cạnh đó, alternative pathways of mETC [AOX, NAD(P)H-DH or UCP] oxi hóa lượng chất chử dư thừa tạo q trình quang hợp hay oxi hóa glycine quang hô hấp (photorespiratory glycine oxidation) (Svensson and Rasmusson 2001, Sweetlove et al 2006) Ngoài ra, tương tác mETC với hoạt động biến dưỡng quang hợp quang hô hấp thông qua việc tạo ATP cần cho tạo sucrose đề ngh (Kro ămer et al 1993) Vai trũ ca ti thể việc trì trạng thái cân oxi hóa khử tế bào chứng minh qua nghiên cứu có sử dụng chất ức chế hô hấp (Zhang et al 1996) hay đột biến phức hợp I (Zhang et al 1996) cho thấy hoạt động điển hình mETC có biến đổi Tương tác ti thể lục lạp giúp tránh khỏi tượng khử mức trì cân lượng ngăn thực chức quang hợp, quang hô hấp hô hấp đáp ứng với điều kiện gia tăng ánh sáng (Florez-Sarasa et al 2011, Yoshida et al 2011a), lạnh (Fiorani et al 2005) hay khô hạn (Giraud et al 2008) Tuy nhiên chứng cho khía cạnh cịn hoi (Noguchi and Yoshida 2008) Ở đây, chúng tơi nghiên cứu đáp ứng đồng hóa carbon quang hợp đột biến aox1a (SALK_084897) TDNA mô tả trước (Giraud et al 2008, Watanabe et al 2008, Yoshida et al 2011a) [nguyên văn: “Here we investigate the response of photosynthetic carbon metabolism in the previously characterized aox1a (SALK_084897) T-DNA plants (Giraud et al 2008, Watanabe et al 2008, Yoshida et al 2011a)”] Đồng thời, tiến hành đo trao đổi khí, đo phát huỳnh quang diệp lục tố a sử dụng phân tích sinh hóa phân tích biến dưỡng để làm rõ ảnh hưởng thiếu AOX1A lên quang hợp tương tác ti thể - lục lạp Ngoài ra, khác biệt nhiệt độ nồng độ oxy nghiên cứu để xác định vai trò AOX1A cân lượng quang hợp quang hô hấp Chúng chứng minh thành phần mETC (tức AOX1A) góp phần trì tối ưu tỉ lệ đồng hóa CO quang hợp điều kiện nồng độ CO2 cao Kết Thông số tăng trưởng (Growth parameters) Tổng sinh khối chồi hai dạng đột biến (aox1a) hoang dại (WT) khác biệt có ý nghĩa điều kiện tăng trưởng chúng tơi thí nghiệm (Bảng 1) Bên cạnh đó, diện tích lá, kích thước rosette (sự xếp theo kiểu vòng tròn lá), số lượng SLA (specific leaf area) khơng có khác biệt có ý nghĩa (Bảng 1) Tuy nhiên tỉ lệ C/N dạng đột biến aox1a cao so với dạng WT Đồng hóa carbon hiệu suất quang hóa (Carbon assimilation and photochemical efficiency) Đo đạt đáp ứng quang hợp nồng độ CO cao tiến hành ba điều kiện áp suất riêng phần khác O (46, 184 368 mbar pO2) tương ứng với ba mức nhiệt độ khác (15, 25 35 0C) (Fig 1) Ở nồng độ CO thấp, đáp ứng tỉ lệ quang hợp (net assimilation rate) (A) với nồng độ CO nội bào (Ci) khơng có khác biệt dạng đột biến dạng WT dù điều kiện áp suất riêng phần O hay nhiệt độ Tuy nhiên, điều kiện nồng độ CO cao áp suất 368 and 184 mbar pO2, A dạng đột biến (ĐB) thấp dạng WT điều kiện 25 35 0C 150C khơng (Fig 1) Ở điều kiện nồng độ CO cao, áp suất 46 mbar pO2 25 0C, A dạng ĐB thấp dạng WT (Fig 1F) 15 350C khơng (Fig 1C, I) Thêm vào đó, A dạng đột biến thường thấp điều kiện nồng độ CO cao so với Mơ hình A nghiên cứu điều kiện pO2 nhiệt độ nêu (tức mô hình nghiên cứu nhóm nhà khoa học đưa trước đó) Sự ức chế tỉ lệ đồng hóa CO thực (net CO2 assimilation rate, ∆A) 250C dạng ĐB diễn mạnh 35 0C so với dạng WT (Fig 2) Ở 15 0C khơng có khác biệt có ý nghĩa ức chế ∆A dạng ĐB A dạng ĐB không bị ảnh hưởng bỡi pO2 25 350C (Fig 2) Hơn nữa, độ dẫn khí (gs) điều kiện nồng độ cao CO nhiệt độ 350C cao hẳn 15 25 0C; nhiên, gs hai dạng ĐB WT tương tự dù điều kiện pO2 hay nhiệt độ (Bảng 2) (điều cho thấy độ dẫn khí trường hợp khơng ảnh hưởng đến tỉ lệ đồng hóa CO2 thực ) Hình Net CO2 assimilation rate (A) as a function of intercellular CO concentration (Ci) in wild-type (filled circles) and aox1a (open squares) Arabidopsis thalianameasured at 35 0C (A– C), 250C (D–F) and 150C (G–I) and at an oxygen partial pressure of 368 (A, D, G), 184 (B, E, H) and 46 mbar (C, F, I) The modeled response of A to C i (dashed line) was estimated according to von Caemmerer (2000) with a V cmax of 81 mmol m–2s–1, Jmax of 138 mmol m–2s–1 and day respiration (Rd) of 1,2 mmol m–2s–1 at 250C and 184 mbar pO2 The temperature dependency was calculated using the methods and kinetic constants developed by Bernacchi et al (2001) Shown are the means±SE of measurements made on 5–6 plants Tỷ lệ carboxyl hóa tối đa Rubisco (the maximum Rubisco carboxylation rates) (V cmax) tính tốn từ đường cong tương quan A–C i (A–Ci curves) cao nhiệt độ tăng pO2 giảm (Bảng 2) Ngược lại, tỉ lệ chuyển điện tử tối đa (the maximum electron transport rate) (Jmax) điểm bù CO2 (compensation point) (Γ) tăng tỉ lệ với nhiệt độ pO (Bảng 2) Vcmax Γ không khác biệt dạng ĐB WT dù nhiệt độ hay pO2 nào; nhiên, Jmax thấp cách có ý nghĩa dạng ĐB so với WT tất điều kiện khảo sát Ở dạng ĐB WT, hiệu suất quang hóa PSII (hay hiệu suất lượng tử; quantum yield of PSII) (фPSII) tăng với Ci Ci tăng đến khoảng 250 mbar nồng độ cao CO2 фPSII dạng ĐB lại thấp dạng WT (Fig 3a) Áp lực kích thích lên PSII (1 – qP) (excitation pressure on PSII) làm diệu khơng quang hóa (non-photochemical quenching) (NPQ) điều kiện nồng độ CO2 cao dạng ĐB cao so với dạng WT (Fig 3b, c) hiệu suất tối đa PSII (Fv/Fm= 0.815±0.002) không đổi hai dạng ĐB WT Thêm vào đó, hơ hấp tối (Rd) tăng tỉ lệ với nhiệt độ khơng có khác biệt có ý nghĩa hai dạng ĐB WT (Fig 4) Tuy nhiên, tỷ lệ carboxyl hóa (carboxylation rate) Rubisco (vc) tỉ lệ tái tạo ribulose 1,5-bisphosphate (RuBP) (rate of ribulose 1,5-bisphosphate regeneration)[ ước lượng từ kết đo trao đổi khí (estimated from measurements of gas exchange) phát huỳnh quang diệp lục tố a (Chla fluorescence)] dạng ĐB thấp nồng độ CO2 cao so với dạng WT giá trị mơ hình Caemmerer (modeled values - modeling according to von Caemmerer, 2000) (Fig 5) Hình Difference in net CO2 assimilation rate (∆A) measured at high CO2 concentration between the WT and aox1a as a function of oxygen concentration and temperature ∆A was calculated as the mean of A in WT minus the mean of A in the mutant above 930 mbar CO Shown are the means ± SE of measurements made on 5–6 plants Results of two-way ANOVA are indicated as *P