Cây Rau quả | Vien Khoa Hoc Ky Thuat Nong Nghiep Mien Nam D7LPV9TD8EGAR21

Cây Rau quả | Vien Khoa Hoc Ky Thuat Nong Nghiep Mien Nam D7LPV9TD8EGAR21 tài liệu, giáo án, bài giảng , luận văn, luận...

VIỆN KHOA HỌC NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM PHÂN LẬP, TUYỂN CHỌN VÀ ĐỊNH DANH VI KHUẨN PHÂN GIẢI XENLULO TỪ CÀNH THANH LONG Nguyễn Thị Ngọc Trúc Viện Cây ăn miền Nam TÓM TẮT Nghiên cứu với tiêu đề “Phân lập, tuyển chọn định danh vi khuẩn phân giải xenlulo từ cành long” thực với mục đích phân lập chọn lọc dịng vi khuẩn tiềm có khả phân giải xenlulo Có 85 dịng vi khuẩn phâ giải xenlulo phân lập từ tỉnh Đồng sông Cửu Long Trong đó, dịng BL18 có khả phân hủy CMC cao Có 11 dịng có khả phân hủy giấy lọc “Whatman No.1” Dòng VL33 thể khả phân hủy cành long cao (62,57%) Hệ enzyme VL33 bao gồm enzyme khác nhau, endoglucanase, exoglucanase β-glucosidase Trong đó, endoglucanase thể khả phân hủy CMC cao ngày thứ sau ủ, exoglucanase thể khả phân hủy xenlulo cao vào ngày thứ sau ủ β-glucosidase thể khả phân hủy vào ngày thứ sau ủ Nghiên cứu đặc điểm hình thái, sinh hóa sinh học phân tử, kết luận dịng VL33 có tên Bacillus subtilis Từ khóa: Bacillus subtilis, cellulase, cellulose, degrading, pitaya I ĐẶT VẤN ĐỀ Thanh long loại ăn quan Việt Nam Theo Nguyễn Trịnh Nhất Hằng ctv (2014) diện tích trồng long nước đạt 28700 với tổng sản lượng thu 640 ngàn đem nguồn ngoại tệ từ xuất lên đến 78,9 triệu USD Thanh long đem lại thu nhập cao cho người nơng dân Bình Thuận, Long An, Tiền Giang nhiều tỉnh thành khác Tuy nhiên, nay, cành long thải bỏ với thành phần xenlulo vấn đề nan giải cho bà nơng dân ngun nhân gây ô nhiễm vườn lây lan mầm bệnh từ cành hư thối Mặt khác, nguồn hữu vơ có lợi cho trồng sử dụng cách Việc sử dụng vi khuẩn phân giải xenlulo nhà khoa học giới Việt Nam nghiên cứu Ở Ấn Độ, B.C Behera ctv (2014) phân lập vi khuẩn phân giải xenlulo từ đất rừng Đước xác định lồi Micrococcus spp., Bacillus spp., Pseudomonas spp., Ở Trung Quốc, Yan Ling Liang ctv (2011) phân lập 22 dòng vi khuẩn phân hủy xenlulo Ở Việt Nam, Hà Thanh Toàn ctv (2011), Võ Văn Phước Quệ Cao Ngọc Điệp (2011), Lê Phạm Tường Anh (2012) nghiên cứu vi khuẩn phân giải xenlulo chưa có nghiên cứu vi khuẩn phân giải xenlulo từ cành long Do đó, việc nghiên cứu phân lập loài vi khuẩn phân hủy cành 972 long thải bỏ thành phân bón hữu vi sinh vơ cấp thiết cho ngành trồng long II VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP 2.1 Vật liệu: Đề tài thực phịng thí nghiệm Vi sinh, Viện Ăn Miền Nam Thời gian thực từ tháng năm 2014 đến tháng năm 2015 Mẫu vật: Vi khuẩn phân lập từ cành long Cành long thu từ tỉnh Đồng sông Cửu Long: Tiền Giang, Long An, Bến Tre, Bạc Liêu, Vĩnh Long 2.2 Phương pháp: Phân lập vi khuẩn có khả phân giải xenlulo: theo Cao Ngọc Điệp, 2011 Đánh giá khả phân giải bột cành long dòng vi khuẩn: Bột cành long chuẩn bị sẵn cách xay cành long khô máy xay sinh tố Chuẩn bị 33 bình tam giác mơi trường khống (100ml/bình tam giác 300ml), tiến hành cân 1g bột cành long cho vào bình tam giác đem hấp khử trùng Tiến hành chủng vi khuẩn vào bình tam giác đặt vào máy lắc (150 vòng/phút/37oC/10 ngày) Các dòng vi khuẩn chủng nuôi môi trường CMC ngày sau chủng với thể tích 1% Chỉ tiêu theo dõi: Phần trăm trọng lượng bột cành long hao hụt đo cách lấy sản phẩm sau 10 ngày ủ sấy khơ 105 oC tính phần trăm khối Hội thảo Quốc gia Khoa học Cây trồng lần thứ hai lượng hao hụt công thức: % khối lượng hao hụt = (khối lượng ban đầu - khối lượng lúc sau)/khối lượng ban đầu x 100 Đánh giá khả phân giải cành long khô dòng vi khuẩn: Cành long chặt thành đoạn ngắn khoảng -5 cm sau sấy khơ 105oC, cân trọng lượng cho vào bình tam giác chuẩn bị sẵn mơi trường khống Tiến hành khử trùng bình tam giác chủng vi khuẩn vào nghiệm thức với tỉ lệ 1% Đặt bình tam giác chủng vi khuẩn vào máy lắc với tốc độ 150 vòng/phút/30oC/10 ngày Chỉ tiêu theo dõi: Phần trăm trọng lượng cành long hao hụt đo cách sấy sản phẩm sau ủ 105oC Phần trăm khối lượng hao hụt tính theo cơng thức: % khối lượng hao hụt = (khối lượng ban đầu – khối lượng lúc sau)/khối lượng ban đầu x 100 Đánh giá khả phân giải cành long tươi dòng vi khuẩn: Cành long sau tỉa bỏ, chặt khúc ngắn từ – cm Cành sau chặt thành đoạn ngắn cân trọng lượng Sau cho vào bình 10 lít tiến hành phun dịch tăng sinh chủng vi khuẩn thí nghiệm chuẩn bị trước ngày lên cành long Bình thí nghiệm đậy khơng kín đảm bảo cho khơng khí lưu thơng vào bình Sau 10 ngày ủ tiến hành lấy tiêu khối lượng hao hụt Chỉ tiêu theo dõi: Phần trăm khối lượng cành long hao hụt đo cách sấy sản phẩm sau phân giải 105oC Phần trăm khối lượng hao hụt tính theo cơng thức:% khối lượng hao hụt = (khối lượng ban đầu – khối lượng lúc sau)/khối lượng ban đầu x 100 Khảo sát khả tổng hợp endoglucanse, exoglucanase β‐ glucosidases dòng vi khuẩn phân giải xenlulo Tiến hành khảo sát thời điểm 2, 4, 6, 8, 10 ngày sau chủng Khảo sát hoạt tính hệ enzyme cellulase gồm: endoglucanases, exoglucanases β-glucosidases (theo YungChung Lo et al (2009) Định danh vi sinh vật tuyển chọn thực cơng ty Nam Khoa, TP Hồ Chí Minh với qui trình sau: Ly trích ADN dịng vi khuẩn có khả phân giải mạnh chất cành long Tiến hành dòng vi khuẩn có khả phân giải chất cành long Nuôi vi khuẩn ống nghiệm chuẩn bị sẵn môi trường LB lỏng ủ 24 h nhiệt độ 30 oC Chuyển dung dịch nuôi vi khuẩn sang eppendorf ml ly tâm 13.000 vòng/phút phút để thu sinh khối vi khuẩn Loại bỏ hết dung dịch môi trường nuôi vi khuẩn eppendorf, thêm 250 µl dung dịch TE (pH 8) làm tan sinh khối vi khuẩn Sau thêm 50 µl dung dịch SDS 10% để loại bỏ protein vi khuẩn Bổ sung thêm µl protein K (10 mg/ml) ủ tiếp 65 oC 20 phút (cứ phút đảo ngược eppendor khảo sát hoạt tính endoglucanase mạnh vào ngày thứ nuôi cấy, Arun et al (2007) khảo sát hai dòng vi khuẩn Bacillus subtilis CY5 Bacillus circulans TP3 cho hoạt tính enzyme (cellulase nói chung) cao vào ngày thứ sau ủ (Bacillus subtilis CY5 hoạt tính cellulase >30 U/ml, Bacillus circulans TP3 hoạt tính enzyme >25 U/ml), Saraswati Bai et al., (2012) khảo sát hệ enzyme dòng vi khuẩn phân lập cho thấy hoạt tính cellulase mạnh vào ngày thứ sau ủ Enzyme exoglucanases (Hình 6b) cho hoạt tính phân giải ngày khảo sát khác biệt có ý nghĩa, hoạt tính mạnh vào ngày thứ 6, tương tự với nghiên cứu Võ Văn Phước Huệ Cao Ngọc Điệp (2011) giảm dần đến ngày 10 nhiên hoạt tính enzyme cao hơn, đạt mức 2,05±0,06 U/ml 0,47±0,11 U/ml Enzyme thứ hệ enzyme cellulase enzyme βglucosidase (Hình 6c) kết thống kê cho thấy hoạt tính ngày khảo sát khác biệt 979 VIỆN KHOA HỌC NƠNG NGHIỆP VIỆT NAM có ý nghĩa, cho thấy hoạt tính enzyme mạnh vào ngày thứ đạt 2,03±0,12 U/ml, nghiên cứu Võ Văn Phước Quệ Cao Ngọc Điệp (2011) hoạt tính enzyme đạt cao vào ngày thứ nhiên hoạt tính thấp hơn, hoạt tính enzym ngày khảo sát thứ 10 giảm xuống 1,04±0,14 Từ kết khảo sát hệ enzym nhận thấy ngày đầu enzyme endoglucanase sinh chủ yếu (a) góp phần phân cắt ngẫu nhiên cấu trúc xenlulo cành long Sau đến ngày thứ enzyme exoglucanase sản xuất nhiều để phân cắt sản phẩm ngắn đường (được giải phóng từ trình phân cắt enzyme endoglucanase) cuối enzyme β-glucosidase sinh nhiều vào ngày thứ để phân cắt sản phẩm từ hai enzyme trước để tạo phân tử đường đơn (b) (c) Hình 6: Hoạt tính enzyme cellulase mơi trường chất bột cành long (a): enzyme endoglucanase, (b) enzyme exoglucanase, (c): enzyme β-glucosidase 3.4 Kết định danh vi sinh vật tuyển chọn Kết giải trình tự gen 16S rARN với chiều dài 481 nu Trình tự gen 16S rARN Blast ngân hàng liệu NCBI cho kết đồng hình 100% với dịng Bacillus subtilis Kết phù hợp với nghiên cứu Yu et al (2012) cho Bacillus subtilis phân lập từ đất, xác bã hữu cơ, phân động vật Kết khảo sát đặc điểm sinh hóa vi khuẩn có tế bào hình que, Gram dương, có bào tử, hiếu khí, dương tính với thuốc thử catalase có khả di động kết phù hợp với nghiên cứu Bharat Pokhrel et al (2014), Shafaat et al (2011) Bên cạnh Kinsella et al (2010) báo cáo dòng Bacillus subtilis có khả ức chế vi sinh vật gây bệnh có khả sinh chất kháng sinh Kết 980 góp phần giải thích khả phân giải cành long tươi dòng VL33 khơng sụt giảm so với dịng vi khuẩn khác thí nghiệm Nhiều nghiên cứu chứng minh Bacillus subtilis có khả sinh nhiều enzyme ngoại bào chẳng hạn amylase (Shafaat et al., 2011, Shinsaku Hayashida et al., 1988), cellulase (Dinesh Choudhary, 2013, Yin et al., 2010, Arun et al., 2007), βmannanase xylanase (Chartchai et al., 1999) Đặc biệt Yu et al., (2012) cho vi khuẩn Bacillus subtilis có khả sản xuất loại enzyme CMCase, FPCase, Avicelase xylanase β-glucosidase cho khả phân giải nhiều loại chất khác kể tinh thể xenlulo Kết phù hợp với kết khảo sát hệ enzyme cellulse dòng vi khuẩn VL33 cho kết bao gồm loại enzyme hệ enzyme cellulase Hội thảo Quốc gia Khoa học Cây trồng lần thứ hai IV KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 4.1 Kết luận Đề tài phân lập 85 dịng vi khuẩn có khả phân giải xenlulo từ cành long phân hủy tỉnh: Bạc Liêu, Bến Tre, Long An, Tiền Giang Vĩnh Long Trong có hai mươi tám dòng vi khuẩn (BL18, BL20, BL22, BL24, BL40, BTG2, BTG5, BTG6, BTG8, BT27, LA23, LA26, LA32, LA34, LA36, LA41, TG1A, TG2B, TG9, TG12A, TG38A, VL1, VL11, VL24, VL27, VL33, VL34 VL37) có khả phân giải CMC mơi trường thạch 60% Các dịng vi khuẩn BL18, BL20, BTG2, BTG8, LA23, LA26, LA32, LA34, LA36, LA41, TG12A, VL1, VL24, VL33, VL34 VL37) cho khả phân giải chất bột cành long 75% Các dòng vi khuẩn BL18, BTG2, BTG8, LA32, LA34, LA41, VL1, VL24, VL33 LA26 cho kết phân giải giấy lọc Whatman No.1 từ 54,6-62,5% Dòng vi khuẩn VL24, VL33, LA34 BL18 cho khả phân giải bột cành long mơi trường lỏng từ 53,03-58,20% Dịng vi khuẩn VL33 cho khả phân giải cành long tươi điều kiện phịng thí nghiệm lên đến 62,57% Dịng vi khuẩn VL33 có khả sinh ba loại enzyme hệ enzyme cellulase endoglucanase, exoglucanase βglucosidase Kết định danh dựa trình tự 16S rARN cho thấy dòng vi khuẩn VL33 đồng hình 100% với vi khuẩn Bacillus subtilis 4.2 Đề nghị Tối ưu hóa điều kiện ni cấy vi khuẩn VL33 để đạt hoạt tính phân giải xenlulo cao Khảo sát khả kháng nấm Neoscytalidium dimiditatum dòng vi khuẩn phân lập Khảo sát khả phân giải cành long dòng vi khuẩn VL33 điều kiện đồng ứng dụng sản xuất chế phẩm sinh học xử lý cành long thải bỏ TÀI LIỆU THAM KHẢO Arun K RAY, Abhinanda Bairagi, Keka Sarkar Ghosh, and Sukanta K Sen, 2007 Optimization of fermentation conditions for cellulase production by bacillus subtilis CY5 and Bacillus circulans TP3 isolated from fish gut Acta Ichthyologica Et Piscatoria, 37(1): 47–53 Behera B.C., Parida S., Dutta S.K., Thatoi H.N., 2014 Isolation and identification of xenlulo degrading bacteria from mangrove soil of Mahanadi River Delta and their cellulase production ability American Journal of Microbiological Research, 2(1): 41-46 Bharat Pokhrel, Binod Bashyal, Rubin Thapa Magar, 2014 Production, purification and characterization of cellulase from Bacillus subtilis isolated from soil European Journal of Biotechnology and Bioscience, 2(5): 31-37 Bichet-Hebe I., Pourcher A M., Sutra L., Comel C., and Moguedet G., 1999 Detection of a whitening fluorescent agent as an indicator of white paper biodegradation: a new approach to study the kinetics of xenlulo hydrolysis by mixed cultures Journal of Microbiological Methods, 37: 101–109 Cao Ngọc Điệp, 2011 Vi sinh vật NXB Đại Học Cần Thơ Chartchai Khanongnuch, Saisamorn Lumyong, Toshihiko Ooi and Shinichi Kinoshita, 1999 A non-cellulase producing strain of Bacillus subtilis and its potential use in pulp biobleaching Biotechnology Letters, 21: 61–63 Dinesh Choudhary, 2013 Characterization of cellulase from Bacillus subtilis N15 Master thesis Thapar University Punjab, India Hà Thanh Toàn, Cao Ngọc Điệp, Trần Lê Kim Ngân, Nguyễn Thu Phướng, Mai Thu Thảo, Bùi Thế Vinh 2008 Phân lập vi khuẩn phân giải xenlulo, tinh bột protein nước rỉ từ bãi rác Thành phố Cần Thơ Tạp chí Nơng Nghiệp 10 (2008) Nhà Xuất Bản Đại Học Cần Thơ Hatami S., Alikhani H.A., Besharati H., Salehrastin N., Afrousheh M and Yazdani Jahromi Z., 2008 Investigation on aerobic cellulolytic bacteria in some of north forest and farming soils American-Eurasian Journal Agricultural and Environmental, 3(5): 713-716 Kinsella K, Schulthess CP, Morris TF, Stuart JD., 2010 Rapid quantification of Bacillus subtilis antibiotics in the rhizosphere Soil Biology and Biochemistry, 42:1009-1192 981 VIỆN KHOA HỌC NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM 10 Lê Phạm Tường Anh 2012 Nghiên cứu ứng dụng vi sinh vật phân giải xenlulo giúp xử lý bã mía để ni trồng nấm Linh chi Luận văn Thạc sỹ ngành Công nghệ sinh học, Đại học Cần Thơ 11 Nguyen Trinh Nhat Hang, Nguyen Van Hoa, Nguyen Minh Chau and Woo Nang Chang, (2014) Research strategies to increase sustainable production of dragon fruit and passion fruit Workshop on increasing production and market access for tropical fruit in southeast asia 2014: 91-95 12 Pratima Gupta, Kalpana Samant and Avinash Sahu, 2012 Isolation of cellulose degrading bacteria and determination of their cellulolytic potential International Journal of Microbiology, 2012: 1-10 Shafaat S, Akram M, Rehman A., 2011 Isolation and characterization of a thermostable α-amylase from Bacillus subtilis African Journal Microbiology, 5: 3334-3338 13 Shinsaku Hayashida, Yuji Teramoto, And Takehiro Inoue, 1988 Production and characteristics of raw-potato-starch-digesting o-Amylase from Bacillus subtilis 65 Applied and environmental microbiology, 54(6): 15161522 14 Tittsler, R.P and Sandholzer L A., 1936 The use of semi-solid agar for the detection of bacterial motility Journal of Bacteriology, 31: 575-580 15 Võ Văn Phước Quệ Cao Ngọc Điệp, 2011 Phân lập nhận diện vi khuẩn phân giải cellulose Tạp chí Khoa học, 18a: 177-184 16 Wen-Jing Lu, Hong-Tao Wang, Shi-Jian Yang, Zhi-Chao Wang, and Yong-Feng Nie, 2005 Isolation and characterization of mesophilic cellulose-degrading bacteria from flower stalks-vegetable waste cocomposting system The Journal of General and Applied Microbiology, 51: 353–360 17 Yin LJ, Lin HH, and Xiao ZR, (2010) Purification and characterization of a cellulase from Bacillus subtilis YJ1 Journal of Marine Science and Technology, 18: 466– 471 18 Yu-Kyoung Kim, Shin-Chan Lee, Young-Yun Cho, Hyun-Jeong Oh and Young Hwan Ko, 2012 Isolation of Cellulolytic Bacillus subtilis Strains from Agricultural Environments International Scholarly Research Microbiology, 2012: 1-9 19 Yung-Chung Lo, Ganesh D Saratale, WenMing Chen, Ming-Der Bai, Jo-Shu Chang, 2009 Isolation of cellulose-hydrolytic bacteria and applications of the cellulolytic enzymes for cellulosic biohydrogen production Enzyme and Microbial Technology, 44: 417–425 20 Yang Ling Liang, Zheng Zhang, Min Wu and Jia Xun Feng, 2014 Isolation, screening and identification of cellulolytic bacteria from natural reserves in the subtropical region of china and optimization of cellulose production by Paenibacillus terrae ME27-1 BioMed Research International Volume 2014 (2014), Article ID 512497 ABSTRACT Isolation, screening and identification the cellulose degrading bacteria from pitaya clades Nguyen Thi Ngoc Truc The study was carried out to aim at isolating and selecting the potential cellulose degrading bacteria There were 85 clones of cellulose degrading bacteria were isolated, which were collected from provines in MeKong Delta Clone BL18 exhibited its highest CMC degrading capacity There were 11 clones have ability degrading filter paper “Whatman No.1” Clone VL33 showed the highest capacity in pytaya clades degrading (62.57%) The enzyme system of VL33 clone included different enzymes viz endoglucanase, exoglucanase and β-glucosidase Endoglucanase, exoglucanase and β-glucosidase showed the highest degrading CMC capacity at 4th day, 6th day and 8th day, respectively By study of morphology characteristics combined with biochemical characteristic and molecular biology, the clone VL33 was identified as Bacillus subtilis Keywords: Bacillus subtilis, cellulase, cellulose, degrading, pitaya Người phản biện: PGS TS Phạm Văn Toản 982 ...Hội thảo Quốc gia Khoa học Cây trồng lần thứ hai lượng hao hụt công thức: % khối lượng hao hụt = (khối lượng ban đầu -... β-glucosidases (theo YungChung Lo et al (2009) Định danh vi sinh vật tuyển chọn thực cơng ty Nam Khoa, TP Hồ Chí Minh với qui trình sau: Ly trích ADN dịng vi khuẩn có khả phân giải mạnh chất... βglucosidase (Hình 6c) kết thống kê cho thấy hoạt tính ngày khảo sát khác biệt 979 VIỆN KHOA HỌC NƠNG NGHIỆP VIỆT NAM có ý nghĩa, cho thấy hoạt tính enzyme mạnh vào ngày thứ đạt 2,03±0,12 U/ml, nghiên