Phân lập, tuyển chọn và ứng dụng vi khuẩn phân giải Keratin trong chăn nuôi

CHƢƠNG 1. GIỚI THI U 1.1 Lý do chọn đề tài, lĩnh vực nghiên cứu Hàng năm, ngƣời d n Việt Nam tiêu thụ hàng triệu tấn th t gia súc, gia cầm đƣợc nuôi trong nƣớc và nhập khẩu Tính đến tháng 10 năm 2016, th t tr u đạt 86,6 nghìn tấn, tăng 1% so với c ng thời điểm năm trƣớc; sản lƣợng th t bò đạt 308,6 nghìn tấn, tăng 3,1%; sản lƣợng th t heo đạt 3,7 triệu tấn, tăng 5%; sản lƣợng th t gia cầm đạt 961,6 nghìn tấn, tăng 5,9% (Tổng cục thống kê Việt Nam, 2016) Tƣơng ứng với số lƣợng đó là hàng ngàn tấn lông gia súc, gia cầm thải loại ra môi trƣờng mà chƣa có biện pháp xử lý hiệu quả Tính đến tháng 12/2016, cả nƣớc có trên 28.000 điểm giết mổ gia súc, gia cầm ( ục Thú y, 2016) Mặc d từ năm 2005, nhà nƣớc đã ban hành nhiều văn bản về quy hoạch x y dựng các điểm giết mổ gia súc, gia cầm tập trung ác t nh cũng ch đạo đẩy mạnh quy hoạch, x y dựng các cơ sở giết mổ tập trung trên đ a bàn Tuy nhiên, cho đến nay mô hình này vẫn chƣa đƣợc triển khai mạnh ở các t nh; các cơ sở giết mổ nhỏ l vẫn còn chiếm ƣu thế Tại các cơ sở này do chƣa có quy trình xử lý chất thải, g y ô nhi m môi trƣờng trầm trọng, làm ảnh hƣởng đến các ngành sản xuất khác và sức khỏe của ngƣời d n sống quanh đó Với nguồn chất thải này, ph n và nƣớc thải có thể đƣợc xử lý b ng hầm biogas tạo khí gas để phục vụ sinh hoạt. Do lông gia súc và lông gia cầm có thành phần chính là keratin, rất khó ph n hủy (Gupta and Ramnani, 2006), lại chiếm t lệ khá lớn trong nguồn rác thải từ các lò giết mổ nên mức độ ô nhi m càng nghiêm trọng Vì vậy, việc tìm ra cách để xử lý chất thải lông tại các lò mổ gia súc gia cầm là rất cần thiết. Hiện nay, chất thải chứa keratin thƣờng đƣợc xử lý b ng các phƣơng pháp chôn và đốt, g y ô nhi m đất, mạch nƣớc ngầm và không khí (Nguy n Đình Quyến và Trần Th Lan Phƣơng, 2001). Trong keratin chứa những acid amin quan trọng có thể sử dụng làm thức ăn cho gia súc, ph n hữu cơ, gas sinh học (Nguy n Thu Hiền và ctv., 2013) Tuy nhiên, phƣơng pháp vật lý hay hóa học hiện đang đƣợc sử dụng trong các quy trình chế biến d làm phá hủy những acid amin, tiêu thụ rất nhiều năng lƣợng và tạo ra những chất g y ô nhi m cho môi trƣờng (Matikevičienė et al., 2009) o đó, tìm ra một phƣơng pháp hiệu quả để xử lý chất thải keratin là một vấn đề có ý nghĩa quan trọng đối với ngành chăn nuôi do vừa có thể tạo ra những sản phẩm có giá tr kinh tế, lại vừa có thể xử lý hiệu quả chất thải lông gia súc, gia cầm Trong những năm gần đ y, biện pháp xử lý lông gia súc, gia cầm b ng phƣơng pháp sinh học rất đƣợc quan t m và chú trọng Trên thế giới hiện có rất nhiều công trình nghiên cứu ph n giải keratin b ng vi sinh vật và đã ph n lập đƣợc rất nhiều loài vi sinh vật có khả năng ph n giải keratin nhƣ vi khuẩn, nấm mốc, xạ khuẩn (Sangali and randelli, 1999). Các phƣơng pháp chế biến bột lông vũ thủy phân b ng cách chủng vi khuẩn nhƣ Bacillus licheniformis PWD-1 đã cải thiện đƣợc tăng trƣởng của gà (William et al., 1991). Tuy nhiên, mỗi loài vi sinh vật có những điều kiện thuận lợi cho sự sinh trƣởng và phát triển khác nhau Nếu điều kiện thay đổi bất lợi g y ảnh hƣởng xấu đến vi sinh vật khiến cho vi sinh vật chết hoặc ngừng phát triển, còn nếu điều kiện thuận lợi vi sinh vật sẽ sinh trƣởng và phát triển tốt (Nguy n L n ũng và ctv., 2012) Vì vậy, khảo sát những điều kiện thuận lợi cho sự sinh trƣởng và phát triển của những chủng vi khuẩn ph n giải keratin đã đƣợc ph n lập có ý nghĩa quan trọng trong việc sử dụng những chủng vi khuẩn này vào xử lý keratin trong thực tế với hiệu quả cao nhất Điều này càng giúp việc ứng dụng biện pháp sinh học sử dụng vi khuẩn thuận lợi hơn trong việc chế biến lông gia súc gia cầm làm thành phần bổ sung trong thức ăn gia súc gia cầm từ đó giảm đƣợc ô nhi m môi trƣờng, n ng cao giá tr dinh dƣ ng của sản phẩm protein và hiệu quả về kinh tế hơn so với các phƣơng pháp vật lý và hóa học hính vì vậy, việc ph n lập, tuyển chọn và nghiên cứu quy trình nuôi cấy ph hợp cho các chủng vi khuẩn có khả năng ph n hủy lông gia súc gia cầm để tận dụng nguồn chất thải này sẽ tạo ra những sản phẩm có giá tr cao, đồng thời góp phần giải quyết hiệu quả bài toán xử lý môi trƣờng với giá thành thấp Ở Việt Nam, những năm gần đ y ch mới có một vài nghiên cứu về một số chủng vi sinh vật có khả năng ph n giải keratin từ chất thải lông gia cầm. Nguy n Đình Quyến và Trần Th Lan Phƣơng (2001) đã tiến hành phân lập đƣợc từ đất ở cơ sở giết mổ gia cầm 7 chủng xạ khuẩn và 15 chủng Bacillus có hoạt tính phân giải casein; trong đó 5 chủng xạ khuẩn và 2 chủng Bacillus có khả năng giải lông gà mạnh. Nguy n Huy Hoàng và ctv. (2010) cũng đã tiến hành phân lập các chủng vi khuẩn Bacillus, Chryseobacterium,… có khả năng thủy ph n lông vũ từ một số v ng đất khác nhau ở phía Bắc Việt Nam- vùng khí hậu khá khác biệt với miền Nam Việt Nam. Những nghiên cứu này vẫn còn đang trong giai đoạn khảo sát đặc tính các chủng vi sinh vật phân lập đƣợc, chƣa thấy có công bố ứng dụng các vi sinh vật này Hơn nữa, miền Nam Việt nam chiếm ƣu thế trên cả nƣớc về sự phát triển của chăn nuôi Điều này kéo theo số lƣợng lông gia súc gia cầm thải ra lớn, đồng thời nhu cầu thức ăn chăn nuôi bổ sung đạm cho vật nuôi cũng cao Xuất phát từ thực tế trên, đề tài ―Phân lập, tuyển chọn và ứng dụng vi khuẩn phân giải keratin trong chăn nuôi‖ đƣợc tiến hành.

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƢỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ QUÁCH TH TH NH T M PH N LẬP, TUYỂN CHỌN VÀ ỨNG DỤNG VI KHUẨN PH N GIẢI KER TIN TRONG CHĂN NUÔI LUẬN ÁN TIẾN SĨ Chuyên ngành: VI SINH VẬT HỌC Mã ngành: 62 42 01 07 CHUYÊN ĐỀ NGHIÊN CỨU SINH HÂN CẦN THƠ, 2017 MỤC LỤC Trang LỜI ÁM ƠN ii TÓM LƢỢ iii ABSTRACT v DANH SÁCH HÌNH xii ANH SÁ H ẢNG xiv ANH MỤ TỪ VIẾT TẮT xix hƣơng GI I THI U 1.1 Lý chọn đề tài, lĩnh vực nghiên cứu 1.2 Mục tiêu đề tài 1.3 Nội dung nghiên cứu Những đóng góp đề tài CHƢƠNG TỔNG QUAN T I LI U 2.1 Sơ lƣợc chất thải lông 2.2 Sơ lƣợc keratin 2.3 ác phƣơng pháp ph n giải keratin 2.3.1 Phƣơng pháp lý hóa 2.3.2 Phƣơng pháp sinh học 2.4 Keratinase chế ph n giải keratin vi khuẩn 12 2.6 Vi khuẩn ph n giải keratin 13 2.6.1 Tình hình nghiên cứu giới 13 Tình hình nghiên cứu nƣớc 18 2.7 ác yếu tố ảnh hƣởng đến khả ph n giải keratin, tạo keratinase mật số vi khuẩn ph n giải keratin 18 Ảnh hƣởng chất dinh dƣ ng môi trƣờng nuôi cấy 19 Ảnh hƣởng nhiệt độ pH 22 vii 2.7.3 Ảnh hƣởng thời gian nuôi cấy 24 2.8 Nhu cầu dinh dƣ ng gia cầm 25 2.8.1 Nhu cầu protein 25 2.8.2 Nhu cầu lƣợng 27 2.8.3 Nhu cầu chất xơ 27 2.8.4 Ảnh hƣởng phần protein lên suất sinh trƣởng chất lƣợng th n th t gà 28 2.9 ột lông gia cầm (bột lông vũ) 29 HƢƠNG VẬT LI U V PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN ỨU 33 3.1 Sơ đồ khối tổng quát nội dung luận án 33 3.2 Nội dung 1: Khảo sát thực trạng chất thải lông sở giết mổ gia súc gia cầm thành phố ần Thơ, Vĩnh Long Đồng Tháp 34 3 Nội dung 2: Ph n lập, tuyển chọn nhận diện vi khuẩn hiếu khí ph n giải keratin mạnh từ chất thải chăn nuôi chế biến gia súc, gia cầm .34 3.3.1.Vật liệu 34 3.3 Phƣơng pháp nghiên cứu 37 3.3 Ph n tích thống kê nội dung nghiên cứu 45 3.4 Nội dung Ảnh hƣởng điều kiện môi trƣờng nuôi cấy đến phát triển, khả ph n hủy lông hàm lƣợng protein chủng sàng đƣợc tuyển từ Thí nghiệm Thí nghiệm 45 3.4 Vật liệu 45 3.4 Phƣơng pháp nghiên cứu 45 3.4.3 Ph n tích thống kê nội dung nghiên cứu 49 3.5 Ủ lông gia cầm với chủng vi khuẩn Bacillus megaterium K79 49 Nội dung 4: Nghiên cứu ứng dụng chủng vi khuẩn ph n hủy mạnh lông gia cầm đƣợc tuyển chọn để chế biến lông gà thành thức ăn bổ sung protein cho gà th t 51 3.6 Vật liệu thí nghiệm 51 3.6 Phƣơng pháp thí nghiệm 55 3.6 ác ch tiêu theo d i 56 3.6 Ph n tích hóa học 59 viii 3.6.5 Ph n tích thống kê nội dung 60 HƢƠNG KẾT QUẢ V THẢO LUẬN 61 4.1 Nội dung 1: Khảo sát trạng chất thải lông gia súc, gia cầm Thành phố ần Thơ, Vĩnh Long Đồng Tháp 61 4.1.1 Kết khảo sát 61 ách xử lý chất thải lông sở giết mổ 63 4.2 Nội dung 2: Ph n lập, tuyển chọn nhận diện vi khuẩn hiếu khí ph n giải keratin mạnh từ chất thải chăn nuôi chế biến gia súc, gia cầm 64 Kết ph n lập, tuyển chọn nhận diện số chủng vi khuẩn có khả ph n giải keratin lông gia cầm từ chất thải chăn nuôi chế biến gia cầm 64 2 Kết ph n lập, tuyển chọn nhận diện số chủng vi khuẩn có khả ph n giải keratin lông gia súc từ chất thải chăn nuôi chế biến gia súc 70 Kết ph n lập số chủng vi khuẩn ch u nhiệt có khả ph n giải keratin 77 4.2.4 Kết đ nh danh chủng vi khuẩn ph n giải keratin mạnh 84 425 y phát sinh loài mối tƣơng quan trình tự 16S rRNA vi khuẩn ph n giải keratin 91 Nội dung 3: Kết ảnh hƣởng điều kiện môi trƣờng nuôi cấy đến phát triển khả ph n giải keratin số chủng vi khuẩn 95 Kết khảo sát ảnh hƣởng nhiệt độ pH đến phát triển khả ph n hủy lông chủng vi khuẩn ph n giải keratin mạnh 95 Kết khảo sát ảnh hƣởng nồng độ d ch vi khuẩn đƣa vào đến phát triển khả ph n hủy lông chủng vi khuẩn Bacillus megaterium K79 chủng vi khuẩn Brevibacillus parabrevis Kr110 103 4.3.3 Kết khảo sát ảnh hƣởng nguồn dinh dƣ ng chứa carbon đến phát triển khả ph n hủy lông chủng vi khuẩn Bacillus megaterium K79 chủng vi khuẩn Brevibacillus parabrevis Kr110 106 ix 4.3.4 Ảnh hƣởng nguồn dinh dƣ ng chứa nitơ đến phát triển, khả ph n hủy lông gia súc hàm lƣợng protein hòa tan chủng vi khuẩn Bacillus megaterium K79 chủng vi khuẩn Brevibacillus parabrevis Kr110 110 Ảnh hƣởng thời gian đến ph n hủy sợi lông nguyên chủng vi khuẩn Bacillus megaterium K79 Brevibacillus parabrevis Kr110 115 4.4 Tiềm ứng dụng chủng VK ph n giải keratin luận án 117 4.5 Phƣơng thức bảo quản giống – chủng vi khuẩn ph n giải keratin 119 4.6 Kiểm tra tính ổn đ nh hoạt tính sinh học chủng VK đ nh danh 119 4.7 Nội dung 3: Nghiên cứu ứng dụng dòng vi khuẩn ph n hủy mạnh lông gia cầm đƣợc tuyển chọn để chế biến lông gia cầm thành thức ăn bổ sung protein cho gà th t 120 4.7.1 Tính an toàn sinh học chủng Bacillus megaterium K79 120 4.7.2 Sử dụng chủng Bacillus megaterium K79 để ủ lông gia cầm thành thức ăn bổ sung protein cho gà ta thả vƣờn 121 4.7.3 Kết kiểm tra Salmonella, Coliforms E.coli bột lông sinh học thu đƣợc từ lông gia cầm ph n hủy chủng vi khuẩn K79 122 4.7.4 Thành phần hóa học giá tr dinh dƣ ng bột lông sinh học thu đƣợc từ lông gia cầm đƣợc ph n hủy chủng vi khuẩn K79 122 Kết thí nghiệm nuôi gà 125 HƢƠNG KẾT LUẬN V ĐỀ NGH 131 KẾT LUẬN 131 ĐỀ NGH 131 T I LI U THAM KHẢO PHỤ LỤ Hình ảnh làm thí nghiệm;- ác phƣơng pháp thực hiện; - anh sách 35 nhóm vi khuẩn hệ thống ph n loại Bergey; - Hoạt độ keratinase, tỷ lệ ph n hủy lông gia súc, arcsin tỷ lệ ph n hủy lông gia súc chủng vi khuẩn ph n giải keratin; - Mẫu phiếu điều tra tình hình chất thải sở giết mổ gia súc – gia cầm; - Kết đo O 26 mẫu NA ly trích đƣợc x PHỤ LỤ Khảo sát yếu tố môi trƣờng ảnh hƣởng đến phát triển, tỷ lệ ph n hủy lông hàm lƣợng protein hòa tan chủng vi khuẩn K79 Kr 110 PHỤ LỤ Thí nghiệm nuôi gà PHỤ LỤ Kết giải trình tự gen 16s RNA số chủng vi khuẩn đại diện chủng vi khuẩn ph n giải keratin mạnh PHỤ LỤ Thống kê tỷ lệ ph n hủy lông hoạt độ keratinase 429 chủng vi khuẩn đ a đƣợc ph n lập PHỤ LỤ Thống kê khảo sát yếu tố môi trƣờng ảnh hƣởng đến phát triển, tỷ lệ ph n hủy lông hàm lƣợng protein hòa tan chủng VK K79 VK Kr110 PHỤ LỤ Thống kê thí nghiệm nuôi gà PHỤ LỤ TIÊU HUẨN VI T NAM T VN 7136:2002 PHỤ LỤ TH ÔN G TƢ 14 /2011/TT-BNNPTNT xi DANH SÁCH HÌNH Trang Hình 2.1: ấu trúc keratin Hình 2.2: ấu trúc keratinase 10 Hình 2.3: Khuẩn lạc Streptomyces sp 14 Hình 2.4 a Hình chụp (SEM) Fervidobacterium islandicum AW-1 b Sự ph n hủy cọng lông gà nguyên F islandicum AW-1 17 Hình 5: Ảnh hƣởng thời gian nuôi cấy đến ph n huỷ lông phát triển Bacillus megaterium 24 Hình 1: Sơ đồ nghiên cứu 33 Hình 2: Sơ đồ kiểm tra khả ch u nhiệt chủng vi khuẩn ph n lập 40 Hình 3: Sơ đồ ph n nhóm vi khuẩn Gram dƣơng Gram âm 41 Hình 3.4: Ph n nhóm vi khuẩn hình cầu hình que vi khuẩn Gram âm 42 Hình 3.5: Ph n nhóm vi khuẩn hình cầu hình que vi khuẩn Gram dƣơng 42 Hình 3.6: hu kỳ gia nhiệt phản ứng P R 44 Hình 7: Quy trình tăng sinh khối vi khuẩn ph n hủy chất chứa keratin 49 Hình 8: Quy trình xử lý chất thải chứa keratin làm thức ăn chăn nuôi 50 Hình 4.1: hủng VK K14 đƣợc tuyển chọn 69 Hình 4.2: Đặc điểm hình thái chủng vi khuẩn đ a đƣợc ph n lập 85 Hình 4.3: Kết chạy điện di sản phẩm P R gel agarose 26 chủng vi khuẩn đƣợc tuyển chọn 87 Hình 4.4: Đa dạng loài chủng vi khuẩn ph n giải keratin đƣợc tuyển chọn 92 Hình 4.5: y phát sinh loài thể mối liên hệ di truyền chủng vi khuẩn đ a ph n giải keratin tốt với chủng vi khuẩn có Gen ank (N I) dựa vào trình tự 16S rRNA 93 Hình 4.6: Ảnh hƣởng nhiệt độ pH đến mật số vi khuẩn, khả ph n hủy bột lông gia cầm hàm lƣợng protein hòa tan chủng vi khuẩn Bacillus megaterium K79 97 xii Hình 7: Mối tƣơng quan pH mật số vi khuẩn chủng K79 98 Hình 8: Mối tƣơng quan pH tỷ lệ ph n hủy lông chủng K79 98 Hình 9: Mối tƣơng quan pH hàm lƣợng protein hòa tan chủng K79 98 Hình 10: Ảnh hƣởng nhiệt độ pH đến mật số vi khuẩn, khả ph n hủy bột lông gia súc hàm lƣợng protein hòa tan chủng Brevibacillus parabrevis Kr110 102 Hình 4.11: Ảnh hƣởng nồng độ d ch vi khuẩn đƣa vào đến hiệu suất ph n hủy bột lông gia cầm hàm lƣợng protein chủng VK K79 104 Hình 12: Ảnh hƣởng nồng độ d ch vi khuẩn đƣa vào đến hàm lƣợng protein hòa tan, phát triển khả ph n hủy lông gia súc chủng vi khuẩn Brevibacillus parabrevis Kr110 105 Hình 13: Ảnh hƣởng nguồn dinh dƣ ng chứa carbon đến phát triển khả ph n hủy lông gia cầm chủng vi khuẩn Bacillus megaterium K79 107 Hình 14: Ảnh hƣởng nguồn dinh dƣ ng chứa carbon đến phát triển, khả ph n hủy lông gia súc hàm lƣợng protein hòa tan chủng vi khuẩn Brevibacillus parabrevis Kr110 109 Hình 15: Ảnh hƣởng nguồn dinh dƣ ng chứa nitơ đến mật số vi khuẩn, tỷ lệ ph n huỷ lông gia cầm hàm lƣợng protein hòa tan chủng Bacillus megaterium K79 111 Hình 16: Ảnh hƣởng nguồn dinh dƣ ng chứa nitơ nồng độ đến phát triển, khả ph n hủy lông gia súc hàm lƣợng protein hòa tan vi khuẩn Brevibacillus parabrevis Kr110 114 Hình 4.17: Sợi lông gà nguyên sau 10 tuần nghiệm thức 115 Hình 4.18: (A) hất thải lông gia cầm; ( ) Lông gia cầm trƣớc ủ ( ) lông gia cầm sau ủ 10 tuần với chủng K79 đ a ( ) sản phẩm bột lông sinh học thu đƣợc 121 Hình 19: Gà thí nghiệm nghiệm thức L5 lúc 14 tuần tuổi 130 Hình PL4.1: Sắc phổ chuỗi trình tự gen 16S rRNA chủng K14 Hình PL4.2: Sắc phổ chuỗi trình tự gen 16S rRNA chủng K15 Hình PL4.3: Sắc phổ chuỗi trình tự gen 16S rRNA chủng K79 Hình PL4.4: Sắc phổ chuỗi trình tự gen 16S rRNA chủng Kr110 Hình PL4.5: Sắc phổ chuỗi trình tự gen 16S rRNA chủng V18 xiii Hình PL4.6: Sắc phổ chuỗi trình tự gen 16S rRNA chủng Vc39 Hình PL4.7: Sắc phổ chuỗi trình tự gen 16S rRNA chủng Vc71 xiv D NH SÁCH BẢNG Trang ảng 1: Ảnh hƣởng nguồn dinh dƣ ng chứa carbon đến ph n hủy lông gia cầm Bacillus megaterium F7-1 20 ảng 2: Ảnh hƣởng nguồn dinh dƣ ng chứa nitơ đến ph n hủy lông gia cầm Bacillus megaterium F7-1 21 ảng 3: Ảnh hƣởng thời gian nuôi cấy đến mức độ phát triển số chủng Bacillus môi trƣờng nuôi cấy 25 ảng 4: Nhu cầu acid amin gà th t giai đoạn 26 ảng 5: Thành phần hóa học bột lông vũ 31 ảng 6: So sánh tỷ lệ tiêu hóa acid amin thật bột lông vũ với số thực liệu d ng cho gia cầm 32 ảng 1: Số lƣợng mẫu thu đƣợc sở giết mổ Vĩnh Long, thành phố ần Thơ Đồng Tháp 35 ảng 2: ác thiết b , dụng cụ hóa chất đƣợc d ng nội dung nghiên cứu 35 ảng 3: Môi trƣờng ph n lập VK ph n hủy lông gia cầm môi trƣờng tách ròng (MT1) 36 ảng 4: Môi trƣờng tăng sinh d ng cho VK ph n hủy lông gia cầm (MT2) 36 ảng 5: Môi trƣờng ph n lập VK ph n hủy lông gia súc môi trƣờng tách ròng (MT3) 36 ảng 6: Môi trƣờng tăng sinh d ng cho VK ph n hủy lông gia súc (MT4) 36 ảng 7: Thành phần phản ứng P R 43 ảng 8: Thành phần hóa học thực liệu d ng thí nghiệm 52 ảng 9: ông thức phối hợp, thành phần hóa học giá tr dinh dƣ ng phần thí nghiệm gà giai đoạn 5-10 tuần tuổi 53 ảng 10: ông thức phối hợp, thành phần hóa học giá tr dinh dƣ ng nghiệm thức thí nghiệm gà giai đoạn 11-14 tuần tuổi 54 ảng 11: Bố trí thí nghiệm 55 ảng 12: L ch tiêm vaccine phòng bệnh 56 xv Số kết dƣơng tính h số1) MPN ấp hạng2) số mẫu đƣợc thử 10 Giới hạn tin cậy1)3) ≥ 95% ≥ 99% 1 0,72 2 1 0,12 1,70 0,05 2,50 1,1 0 3 0,4 1 0,74 1 1 0,13 2,00 0,06 2,70 1 1,1 3 2 0,4 3,5 0,2 4,6 1,1 2 1 0,4 3,5 0,2 4,6 1,5 3 3 0,5 3,8 0,2 5,2 1,6 3 3 0,5 3,8 0,2 5,2 0 0,92 1 1 0,15 3,50 0,07 4,60 1,4 1 1 0,4 3,5 0,2 4,6 2 2,0 3 3 0,5 3,8 0,2 5,2 1,5 1 1 0,4 3,8 0,2 5,2 1 2,0 2 1 0,5 3,8 0,2 5,2 2 2,7 3 3 0,9 9,4 0,5 14,2 2 2,1 1 1 0,5 4,0 0,2 5,6 2 2,8 2 0,9 9,4 0,5 14,2 2 3,5 0 0 0,9 9,4 0,5 14,2 2,9 2 0,9 9,4 0,5 14,2 3,6 3 3 0,9 9,4 0,5 14,2 0 2,3 1 1 0,5 9,4 0,3 14,2 3,8 1 1 0,9 10,4 0,5 15,7 6,4 3 2 1,6 18,1 1,0 25,0 4,3 1 1 0,9 18,1 0,5 25,0 1 7,5 1 1 1,7 19,9 1,1 27,0 12 2 36 44 3 16 0 3 38 52 9,3 1 1 1,8 36,0 1,2 43,0 15 1 1 38 52 2 21 1 1 40 56 3 29 3 2 99 152 239 3,5 0,2 4,6 Số kết dƣơng tính h số1) MPN ấp hạng2) số mẫu đƣợc thử Giới hạn tin cậy1)3) 10 ≥ 95% ≥ 99% 3 24 1 1 99 152 3 46 1 1 198 283 3 110 1 1 20 400 10 570 3 > 110 1) Xem tài liệu tham khảo [3] 2) Xem bảng A 3) Giới hạn tin cậy cho bảng ch giá tr trung bình nh m cung cấp số ý tƣởng ảnh hƣởng sai lệch thống kê kết quả, có nguồn sai lệch khác mà quan trọng Bảng – Các cấp hạng Cấp hạng 1) Đ nh nghĩa Khi số lƣợng vi khuẩn mẫu b ng số MPN đƣợc tìm thấy, kết n m số có khả cao thu đƣợc Hầu nhƣ ch có 5% khả thu đƣợc kết nhỏ giá tr nhỏ cấp hạng Khi số lƣợng vi khuẩn mẫu thử b ng số MPN tìm đƣợc, kết số khả thu đƣợc số có khả xẩy nhỏ cấp hạng 1, nhƣng tối đa ch có 1% khả thu đƣợc kết thấp kết nhỏ xảy cấp hạng Khi số lƣợng vi khuẩn mẫu thử b ng số MPN tìm đƣợc, kết số có khả thu đƣợc giá tr nhỏ cấp hạng 2, nhƣng tối đa ch có 0,1% khả thu đƣợc kết nhỏ giá tr nhỏ cấp hạng Khi số lƣợng vi khuẩn mẫu thử b ng số MPN tìm đƣợc, kết số có khả thu đƣợc giá tr nhỏ cấp hạng h có 0,1% khả thu đƣợc kết cấp hạng này, nhƣ sai sót 1) Trƣớc bắt đầu thử cần phải đ nh chọn cấp hạng nào, tức ch có cấp hạng 1, chí 1, Việc đ nh sở để chọn kết quan trọng, ch kết cấp hạng hầu hết cấp hạng đƣợc chấp nhận Kết cấp hạng đƣợc coi đáng nghi ngờ 240 PHỤ LỤC B (Quy đ nh) GI I HẠN TIN ẬY ĐỐI V I Ƣ TÍNH SỐ LƢỢNG NHỎ KHUẨN LẠ Giới hạn tin cậy mức 95% số khuẩn lạc đƣợc giữ lại ƣớc tính nhỏ 15 đƣợc cho bảng Bảng B – Các giới hạn tin cậy Số lƣợng vi sinh vật Giới hạn tin cậy mức 95% ƣới Trên